Name: Tworzenie mysich eksperymentalnych tętniaków aorty brzusznej za pomocą elastazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-23T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj metodę tworzenia tętniaków aorty brzusznej u myszy za pomocą elastazy trzustkowej. Technika ta umożliwia badanie patobiologii tętniaka przy użyciu myszy transgenicznych i z nokautem genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana z grantu SCCOR „AAA Disease: Mechanisms, Stratification, and Treatment” (P50 HL083800-03) przekazanego przez National Institutes of Health

<ol>
<li>Myszy są znieczulane wziewnie izofluranem w stężeniu 2,0-3,0 ml/L.</li>
<li>Brzuch jest golony i odkażany alkoholem oraz betadyną.</li>
<li>Mysz jest ułożona na plecach w polu operacyjnym.</li>
<li>Chirurg zakłada sterylne rękawiczki, a używane narzędzia zostały wysterylizowane w sterylizatorze koralikowym.</li>
<li>Wykonuje się długie cięcie wzdłuż linii środkowej brzucha. Treść jamy brzusznej jest odsuwana na zewnątrz za pomocą sterylnej gazy w celu odsłonięcia aorty brzusznej.</li>
<li>Aorta brzuszna jest izolowana od poziomu lewej żyły nerkowej do miejsca rozwidlenia.</li>
<li>Odgałęzienia aorty brzusznej są odsłaniane i podwiązywane szwem 10-0. Wszystkie odgałęzienia aorty w odległości 1,0 cm od rozwidlenia zostają podwiązane.</li>
<li>Tymczasowe ligatury jedwabne 6.0 są umieszczane wokół proksymalnej i dystalnej części aorty.</li>
<li>W miejscu rozwidlenia, za pomocą igły 30G, wykonuje się aortotomię.</li>
<li>Rurka polietylenowa (PE-10) zwężana termicznie jest wprowadzana przez aortotomię i mocowana wiązaniem.</li>
<li>Przy użyciu worka z solą fizjologiczną zawieszonego na wysokości 136 cm w celu skalibrowania ciśnienia do 100 mmHg, aorta jest napełniana solą fizjologiczną zawierającą 4,5 U/mL świńską elastazę trzustkową typu I. Podczas 5-15 minutowej perfuzji elastazą aorta zazwyczaj rozszerza się do 150-170% swojej pierwotnej średnicy.</li>
<li>Następnie usuwa się cewnik perfuzyjny, a aortotomię zamyka się szwem 10-0, aby uniknąć zwężenia.</li>
<li>Po zamknięciu aortotomii usuwa się ligaturę dystalną.</li>
<li>Jeśli z naprawionej aortotomii nie występuje krwawienie lub jest ono minimalne, usuwa się ligaturę proksymalną. Rozszerzona aorta natychmiast napełnia się krwią.</li>
<li>Jelita są wprowadzane z powrotem do jamy brzusznej, a ranę zamyka się dwuwarstwowo szwem nylonowym / polipropylenowym 6-0.</li>
<li>Na ranę nakłada się 0,25% krople bupiwakainy (około jednej kropli na każdy centymetr długości cięcia), a podskórnie podaje się jedną dawkę karprofenu (5 mg/kg).</li>
<li>Mysz jest umieszczana w ciepłym miejscu i zazwyczaj budzi się w ciągu 15 minut.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1280/fig1280.png" alt="Progresja AAA indukowanego elastazą; etapy eksperymentalne przedstawione na zdjęciach chirurgicznych; rozwój tętniaka." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">     Rysunek 1.Reprezentatywny wynik AAA indukowanego elastazą.

<ol><li>Anidjar, S., Salzmann, J. L., Gentric, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase-induced+experimental+aneurysms+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Elastase-induced experimental aneurysms in rats.</a> Circulation. 82 (3), 973-973 (1990).</li>
<li>Pyo, R., Lee, J. K., Shipley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+of+matrix+metalloproteinase-9+%28gelatinase+B%29+suppresses+development+of+experimental+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms.</a> J Clin Invest. 105 (11), 1641-1641 (2000).</li>
<li>Carsten, C. G. 3rd, Calton, W. C., Johanning, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase+is+not+sufficient+to+induce+experimental+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Elastase is not sufficient to induce experimental abdominal aortic aneurysms.</a> J Vasc Surg. 33 (6), 1255-1255 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Wcześniejsze badania wskazały na znaczną zmienność między partiami w rozwoju AAA przy użyciu różnych komercyjnych preparatów elastazy3. Dlatego kluczowe jest monitorowanie partii produkcyjnych oraz stosowanie odpowiednich grup kontrolnych, aby udokumentować zdolność preparatu do indukowania AAA.
Co ciekawe, podatność na rozwój AAA w tym modelu zależy od użytej szczepu myszy3. Mysz wykorzystana w niniejszym materiale wideo należy do szczepu C57Bl/6, u którego przy zastoso...

<table><tbody><tr><td>Elastaza trzustkowa świńska typu I</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1250</td><td></td></tr><tr><td>rurki polietylenowe (PE-10)</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>CHANGE-A-TIP</td><td></td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>18010-00 (FST)</td><td>nóż do kauteryzacji</td></tr><tr><td>LEICA MZ6</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>stereomikroskop</td></tr><tr><td>LEICA DFC290HD</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>kamera USB</td></tr><tr><td>Image Pro Express wersja 6.0</td><td></td><td>Media Cybernetics Inc.</td><td></td><td>oprogramowanie</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie eksperymentalnych tętniaków aorty brzusznej u myszy z użyciem elastazy

Creation of Murine Experimental Abdominal Aortic Aneurysms with Elastase 

Przejściowa infuzja wewnątrzdzeniowa elastazy trzustkowej świni do odcinka podnerkowego aorty brzusznej jest najszerzej stosowanym modelem zwierzęcym tętniaka aorty brzusznej (AAA) od czasu, gdy została po raz pierwszy opisana u szczurów przez Anidjara i współpracowników.1 Uzasadnienie dla jej opracowania opierało się na zaobserwowanym w tętniakach AAA zaburzeniu struktury elastyny. Ten model szczurzy został zmodyfikowany w celu wywołania AAA w regionie podnerkowym aorty u myszy.2 Model ten pozwala na uzyskanie szerokiego wglądu w patobiologię AAA dzięki pojawieniu się licznych myszy transgenicznych i z nokautem genów. Ponadto stanowi on praktyczną platformę do testowania potencjalnych środków terapeutycznych na AAA. W tym filmie prezentujemy procedurę wywoływania AAA poprzez infuzję elastazy stosowaną w naszym laboratorium. 
Myszy znieczula się 2,5% izofluranem, a następnie w warunkach sterylnych wykonuje się laparotomię. Aortę brzuszną izoluje się przy użyciu stereomikroskopu operacyjnego (Leica). Po założeniu tymczasowych podwiązań wokół proksymalnego i dystalnego odcinka aorty, za pomocą czubka igły o rozmiarze 30G wykonuje się aortotomię w miejscu rozwidlenia. Przez miejsce aortotomii wprowadza się i mocuje segment rurki polietylenowej PE-10 o zwężonym termicznie końcu. Następnie światło aorty perfunduje się przez 5-15 minut pod ciśnieniem 100 mm Hg solą fizjologiczną zawierającą porcine pancreatic elastase typu I (4,5 U/mL; Sigma Chemical Co.). Po usunięciu cewnika do perfuzji miejsce aortotomii zszywa się, dbając o to, aby nie zwęzić światła naczynia.

W niniejszym filmie pokazano, jak indukować tętniaki aorty brzusznej (AAA) u myszy poprzez przejściową infuzję wewnątrznaczyniową elastazy trzustkowej pochodzenia świńskiego do odcinka podnerkowego aorty brzusznej. Model ten pozwala na uzyskanie szerokiego wglądu w patobiologię AAA dzięki dostępności licznych myszy transgenicznych i z nokautem genowym.

Wytwarzanie eksperymentalnych tętniaków aorty brzusznej u myszy z użyciem elastazy

Przejściowa wewnątrzświatowa infuzja elastazy trzustkowej pochodzenia świńskiego do odcinka podnerkowego aorty brzusznej jest najpowszechniej stosowanym modelem zwierzęcym ...

Ta procedura chirurgiczna stosowana do wytworzenia tętniaka aorty brzusznej rozpoczyna się od cięcia w linii pośrodkowej brzucha. Treść jamy brzusznej zostaje odsunięta, a wszystkie odgałęzienia aorty zostają podwiązane. Odcinek proksymalny i dystalny aorty zostają zawiązane.Serce nakłuwa się igłą, a następnie podaje się dużą ilość elastazy przez zwężaną termicznie rurkę polietylenową. Po zakończeniu podawania zamyka się autotomię AOR. Po usunięciu podwiązań aorta napełnia się krwią, a jamę brzuszną zamyka się.Następnie pozwala się myszy na rekonwalescencję, a tętniak ulegnie całkowitemu rozszerzeniu w ciągu 14 dni. Cześć, jestem Julian Asma z laboratorium Komórek Płodowych w Katedrze Medycyny Sercowo-Naczyniowej na Uniwersytecie Stanforda. Dzisiaj zaprezentuję procedurę indukowania eksperymentalnego tętniaka aorty brzusznej u myszy poprzez wstrzyknięcie elastazy.Stosujemy tę procedurę w laboratorium w celu badania PE tętnic brzusznych. Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć eksperymenty, wybierz odpowiednią mysz, na przykład mysz C 57 black six, i podaj jej izofluran drogą wziewną, aż zwierzę utraci przytomność. Należy pamiętać, że tempo wzrostu tętniaka będzie się różnić w zależności od szczepu myszy.Wyjąć znieczuloną mysz z komory i umieścić ją na odpowiednio oświetlonym stanowisku preparacyjnym. Ogolić sierść z brzucha od końca kości krzyżowej do nasady kończyn. Do usunięcia pozostałości włosów użyć kremu do depilacji.Przecieraj odsłoniętą skórę 70% alkoholem do momentu usunięcia całej sierści z ogolonego obszaru. Następnie przemyj skórę Betadyną co najmniej trzy razy, przecierając ją alkoholem pomiędzy kolejnymi aplikacjami. Teraz ułóż mysz na plecach w polu operacyjnym, aby utrzymać ją w stanie nieprzytomności.Podczas operacji umieść na nosie zwierzęcia rurkę, przez którą podawany jest izofluran z taką samą prędkością przepływu, jaka była stosowana do wprowadzenia w stan nieprzytomności. Elastazę przechowywano w lodzie, a następnie pobrano do strzykawki. Strzykawkę unieruchomiono zaciskiem obok pola operacyjnego i podłączono do niej cewnik.Ważne jest, aby końcówka cewnika pozostała sterylna, co osiąga się poprzez umieszczenie jej w sterylnej probówce. Przed rozcięciem myszy należy upewnić się, że zastosowana zostanie technika sterylna. Rozpocznij od założenia sterylnych rękawiczek.Narzędzia chirurgiczne, nożyczki, igłotrzymacze i pęsety muszą zostać zdezynfekowane przed operacją. Należy poświęcić chwilę na sprawdzenie przygotowań i spróbować wyeliminować wszelkie inne potencjalne źródła kontaminacji podczas zabiegu. Jeśli podczas procedury zostanie naruszona technika sterylna, należy ponownie wysterylizować narzędzie w sterylizatorze koralikowym.Po przygotowaniu wszystkich elementów rozpocząć operację od długiego cięcia pośrodkowego brzucha w obrębie jamy brzusznej. Przesunąć zawartość jamy brzusznej do wolnej przestrzeni brzusznej lub odsunąć ją poza obszar brzucha za pomocą sterylnej gazy, aby odsłonić aortę brzuszną. Następnie za pomocą pincety ostrożnie wyizolować aortę brzuszną od poziomu lewej żyły nerkowej do miejsca jej rozdwojenia.W przedstawionym przypadku występuje pojedyncza gałąź znajdującaca się powyżej miejsca ligacji aorty, w związku z czym nie wymaga ona podwiązania. Jeśli między miejscami dystalnej i proksymalnej ligacji aorty znajdują się gałęzie aortalne, należy podwiązać gałęzie w odległości jednego centymetra od miejsca rozwidlenia za pomocą szwów 10-0. W miejscach proksymalnym i dystalnym aorty należy umieścić tymczasowe podwiązki z jedwabiu 6.0 w celu zatrzymania przepływu krwi.Następnie wykonaj autotomię w miejscu rozwidlenia. Rozpocznij od nakłucia rozwidlenia igłą o rozmiarze 30 G. Poprzez miejsce autotomii AOR można wprowadzić termicznie zwężaną rurkę polietylenową i zabezpieczyć ją węzłem.Za pomocą pęsety ostrożnie i delikatnie wprowadź rurkę do aorty. Należy uważać, aby nie uszkodzić warstwy śródbłonka, stosując ciśnienie 100 milliliters. Aortę przepłukano rtęcią z elastazą z worka z solą fizjologiczną zawieszonego na wysokości 136 centimeters.Upewnij się, że w probówce nie ma powietrza, w przeciwnym razie ciśnienie nie będzie dokładne. Sól fizjologiczna zawiera 4,5 jednostek na mililitr elastazy trzustkowej typu one pochodzenia świńskiego i powinna wypełnić aortę w ciągu od 5 do 15 minut.Podczas perfuzji aorta zazwyczaj rozszerza się do około 140% swojej pierwotnej średnicy. Po zakończeniu procesu należy usunąć kaniulę perfuzyjną i zamknąć autotomię aorty szwem o grubości 10 aught, aby uniknąć zwężenia. Po zamknięciu autotomii należy również usunąć ligaturę dystalną.Jeśli z naprawionej aortotomii występuje niewielkie krwawienie lub nie krwawi ona wcale, usuwa się ligaturę proksymalną. W przypadku wystąpienia krwawienia należy założyć dodatkowe tymczasowe ligatury nasączone 6.0 w częściach proksymalnej i dystalnej aorty oraz dodać jeden szew, aby całkowicie zamknąć aortotomię. Po usunięciu ligatury proksymalnej poszerzona aorta natychmiast wypełni się krwią.Po zakończeniu procedury na aorcie, wprowadź jelita z powrotem do jamy brzusznej. Jeśli zostały one odsunięte, jelita wsuną się jako jedna całość i nie ma potrzeby martwić się o ich ułożenie. Po umieszczeniu wszystkich organów na ich właściwych miejscach, ranę zewnętrzną można teraz zamknąć w dwóch warstwach, używając sześciu szwów z nylonu aut oraz polipropylenu.Następnie należy podać myszy znieczulenie miejscowe, na przykład jedną kroplę 0,25% boop ICAN na każdy centymetr nacięcia. Należy również podać jedną dawkę leku przeciwzapalnego Carin w dawce 5 mg/kg poprzez wstrzyknięcie podskórne. Zabieg chirurgiczny jest zakończony, a mysz należy umieścić w ciepłym miejscu, aby mogła odzyskać przytomność.Wybudzanie zazwyczaj następuje w ciągu 15 minut. Gdy mysz odzyska przytomność, zostaje umieszczona w pojedynczej klatce i monitorowana okresowo aż do pełnego powrotu do sprawności. Po zabiegu aorta zazwyczaj rozszerza się do około 140 do 160% jej pierwotnej średnicy.Tę początkową dylatację obserwuje się wraz ze stabilizacją do siódmego dnia. Gwałtowna dylatacja wtórna następuje między siódmym a 14. dniem. W 14. dniu tętniak można zaobserwować w aorcie podnerkowej.Właśnie pokazałem, jak indukować tętniaka aorty brzusznej za pomocą elastazy u myszy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uniknąć powstania skrzepów krwi wewnątrz aorty. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

creation-murine-experimental-abdominal-aortic-aneurysms-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wytwarzanie eksperymentalnych tętniaków tętnicy brzusznej u myszy z zastosowaniem elastazy

Modyfikacje histologiczne i biochemiczne po wykluczeniu endoprzeszczepu tętniaka są nadal niejasne. Opisujemy nowy model implantacji endprzeszczepu na tętniaku myszy. Dzięki analizie skrzepliny z utrzymującym się interfejsem krążącego krwiobiegu i bez niego oraz ocenie nowych biomateriałów wewnątrznaczyniowych, model ten pomoże lepiej zrozumieć patobiologię wykluczenia tętniaka wewnątrznaczyniowego.

Nowy mysi model wewnątrznaczyniowej naprawy tętniaka aorty

Opisujemy protokół chirurgiczny mający na celu konsekwentne wywoływanie silnych tętniaków aorty piersiowej u myszy. Zabieg polega na tym, że torakotomia lewa strona, odsłonięcie aorty piersiowej i umieszczenie gąbki nasączonej elastazą trzustkową świni na ścianie aorty.

Mysi model chirurgiczny miejscowego tętniaka aorty piersiowej wywołanego elastazą

Obecny protokół opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgiczną dla modelu AAA wywołanego elastazą poprzez bezpośrednie zastosowanie elastazy do przydanki podnerkowej aorty brzusznej u myszy.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej indukowany przez okołonaczyniowe zastosowanie elastazy

Ten manuskrypt przedstawia protokół tworzenia mysiego modelu tętniaka aorty brzusznej myszy przy użyciu chlorku wapnia i elastazy, łącząc zalety poprzednich metod modelowania. Model ten można wykorzystać do badania mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw tętniaków aorty brzusznej.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej za pomocą okołoprzybytkowego nacieku chlorku wapnia i elastazy

Ten protokół opisuje metodyczne podejście chirurgiczne do modelowania zaawansowanych tętniaków aorty brzusznej u myszy poprzez kombinację bezpośredniego stosowania elastazy do aorty podnerkowej i podawania ß-aminopropionitrylu przez wodę pitną.

Zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy poprzez połączenie miejscowej elastazy i doustnego ß-aminopropionitrylu

Niniejszy protokół opisuje standaryzowaną metodę chirurgiczną indukcji tętniaków szyjnych w modelu mysim poprzez pojedynczą operację chirurgiczną.

Model myszy powstawania tętniaka szyjnego

Ten protokół zapewnia powtarzalną i niezawodną metodę wywoływania tętniaków tętnicy brzusznej (TTB) u myszy C57BL/6 przy użyciu uczulenia elastyny i przynaczynowego stosowania elastazy, jako model TTB, który obejmuje komponent uczulenia immunologicznego.

Wiarygodne stworzenie modelu tętniaka tętnicy brzusznej u myszy przy użyciu uczulenia na elastynę i peryvaskularnej elastazy

Angiogeneza, czyli wypączkowanie naczyń krwionośnych z istniejącej sieci naczyniowej, wiąże się zarówno z procesami naturalnymi, jak i patologicznymi. W niniejszej pracy prezentujemy test pierścienia aorty, który umożliwia bezpośrednie dodawanie potencjalnych stymulatorów i inhibitorów angiogenezy do pierścieni aorty w hodowli. Wypączkowanie oraz wzrost nowych naczyń można ocenić poprzez inspekcję pierścieni aorty w okresie od 6 do 12 dni.

Test pierścienia aortalnego

Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy jest powszechnie stosowanym modelem eksperymentalnym do badania mechanizmów leżących u podstaw przerostu mięśnia sercowego i rozwoju niewydolności serca. W niniejszym materiale opisujemy procedury zwężania aorty w celu wywołania powtarzalnego stopnia przerostu serca u myszy.

Poprzeczne zwężenie aorty u myszy

Dysfunkcja kanału Kv jest związana z zaburzeniami rytmu serca. W celu zbadania mechanizmów molekularnych, które prowadzą do takich arytmii, stosujemy systematyczny protokół izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od myszy z nokautem podjednostki pomocniczej kanału Kv. Wyizolowane kardiomiocyty można następnie natychmiast wykorzystać do komórkowych badań elektrofizjologicznych, testów biochemicznych lub immunofluorescencyjnych (IF).

Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

Poznaj metodę tworzenia tętniaków aorty brzusznej u myszy za pomocą elastazy trzustkowej. Technika ta umożliwia badanie patobiologii tętniaka przy użyciu myszy transgenicznych i z nokautem genów.

Wytwarzanie eksperymentalnych tętniaków aorty brzusznej u myszy z użyciem elastazy

Przeglądaj więcej filmów