In vivo (in vivo) Ca²⁺- Obrazowanie neuronów ciała grzyba podczas uczenia węchowego u pszczoły miodnej

Pszczoły mogą być uwarunkowane paradygmatem pożądawczego uczenia się węchu (PER-conditioning). Wykorzystując zapachy jako bodźce, ustaliliśmy metodę, w której rejestruje się zachowanie, podczas gdy jednocześnie obrazowanie wapnia służy do pomiaru aktywności wywołanej zapachem w neuronach ciała grzyba in vivo.

Ta procedura rozpoczyna się od umieszczenia pszczoły w komorze nagrywającej. Z torebki głowy usuwa się fragment naskórka, który barwi wybrane struktury w mózgu. Sygnały wapniowe w barwionych neuronach są rejestrowane in vivo przy użyciu zestawu obrazowania szerokokątnego.

Podczas obrazowania pszczoła może być stymulowana zapachami lub dostarczaniem sacharozy do anteny. W ten sposób pszczoła może zostać uwarunkowana do wydłużenia trąbki w odpowiedzi na zapach. Odpowiedź na wyprost trąbki jest monitorowana za pomocą zapisów elektromiogramu z mięśnia M 17.

Po eksperymencie obrazowym mózg jest poddawany sekcji w celu dokładniejszego zbadania zabarwionych struktur za pomocą mikroskopu konfokalnego. Cześć, jestem Melanie z laboratorium rdo Mansela. Cześć, jestem Anya również z Mansel Lab.

Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę obrazowania wapnia in vivo i ciała grzyba pszczoły miodnej. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania kodowania węchowego i uczenia się związanej z nim plastyczności w mózgu pszczoły miodnej. Więc zacznijmy.

Zacznij od złapania zbieraczki pszczół miodnych przy wejściu do ula, a następnie unieruchom go, schładzając na lodzie. Następnie zamontuj pszczołę na komorze nagraniowej z pleksi. Użyj twardego wosku o niskiej temperaturze topnienia, aby przymocować oczy i klatkę piersiową do ściany.

Wszystkie rozbijają szklaną kapilę na końcówce, aby uzyskać średnicę 10 mikronów. Przykryj końcówkę kapilary pastą d składającą się z mieszaniny dekstryny URA two i utrwalanej dekstryny Rodin w proporcji 10 do jednego. Przygotowana kapilara zostanie użyta do barwienia.

Aby rozpocząć procedurę barwienia, najpierw unieruchom czułki za pomocą koane. Otwórz torebkę głowy nad mózgiem, usuwając kawałek naskórka i popychając gruczoły i tchawicę na boki, umożliwiając dostęp do ciała grzyba. Użyj kawałka papieru, aby wchłonąć limfę hemo wewnątrz torebki głowy.

Aby zabarwić neurony ciała grzyba, wstrzyknij naczynia włosowate do somy lub regionu dendrytycznego neuronów. Następnie przywróć naskórek na kapsułce głowy i poluzuj antenę. Na koniec nakarm pszczołę 30% roztworem sacharozy i przechowuj ją w styropianowym pudełku przykrytym mokrym ręcznikiem kuchennym przez co najmniej cztery godziny lub noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Po zakończeniu przygotowania B możemy rozpocząć obrazowanie in vivo. Na początek użyj gąbki przymocowanej do komory nagrywającej, aby zapobiec przemieszczaniu się pszczoły, dociskając ją do brzucha. Teraz przymocuj anteny pszczoły za pomocą ioane, aby zapobiec poruszaniu się mózgu z powodu pompowania przełyku.

Wytnij małe nacięcie w naskórku nad obrąbkiem i ostrożnie wyciągnij przełyk i otaczające go stałe struktury i przykryj je dwoma składnikami: silikonem. Następnie za pomocą igły wykonaj otwory do wprowadzenia drutu elektrodowego służącego do rejestrowania elektrogramów z mięśnia kątomierza wargi sromowej. Usuń naskórek, tchawicę i gruczoły nad mózgiem.

Użyj kawałka papieru, aby wchłonąć hemo wewnątrz kapsułki głowy, aby zapisać elektrogramy z M 17. Wstrzyknij drut miedziany w mięsień w pobliżu części gębowej. Wstrzyknąć elektrodę masową do oka.

Teraz napełnij kapsułkę na głowę dwuskładnikowym silikonem. Upewnij się, że mózg jest całkowicie zakryty. Umieść pszczołę na stoliku mikroskopu i umieść kroplę wody na powierzchni silikonu.

Zanurz obiektyw zanurzeniowy mikroskopu w kropli, a następnie skup się na neuronach etapowych. Po zakończeniu przygotowań do obrazowania in vivo możemy teraz opisać stymulację zapachową i rejestrację sygnału. Aby dostarczyć pszczołom bodźce zapachowe, używamy sterowanego komputerowo, specjalnie zbudowanego olfaktometru, który rozcieńcza substancje zapachowe w stałym strumieniu powietrza.

Skierowana na antenę stymulacja zapachu polega na trzysekundowym impulsie powietrza nasyconego zapachem. Do obrazowania wapnia używamy zestawu do obrazowania fotonicznego TIL zamontowanego na mikroskopie fluorescencyjnym zes do rejestrowania obrazów w temperaturze pokojowej z częstotliwością próbkowania pięciu herców. Sygnały wapniowe są rejestrowane przez obiektyw zanurzeniowy Olympus X 60 0,9 W z kamerą CCD Ango, każdy pomiar trwa 10 sekund.

Potencjały mięśniowe są wzmacniane za pomocą wzmacniacza trawiastego oraz rejestrowane i digitalizowane za pomocą analogowego przetwornika cyfrowego. Nagrania z M 17 służą do monitorowania reakcji behawioralnych związanych z uczeniem się po zakończeniu rejestracji sygnału, możemy teraz przejść do analizy morfologicznej i rekonstrukcji. Ponieważ oba barwniki używane podczas zasypywania mają tę samą masę cząsteczkową.

Znajdują się one w neuronach. Obrazowanie szerokokątne ma ograniczoną rozdzielczość przestrzenną, dlatego do badania barwionych struktur używamy konfokalnej mikroskopii skaningowej. Po eksperymencie najpierw wypreparuj mózg i utrwal go przez noc w 4% formaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia, wypłucz go w PBS, a następnie odwodnij w krokach etanolu 10 minut w 50%70%90%99% i dwa razy po 10% Umieść mózg na rowkowanym szkiełku z przedmiotem z kroplą salicylanu metylu, Wsuń go, a następnie umieść na stoliku mikroskopu konfokalnego mikroskopu skaningowego.

Zeskanuj mózg za pomocą soczewki obiektywu powietrznego i zoomu cyfrowego od 1,1 do 1,2 w czterech mikrometrowych sekcjach optycznych. Tutaj widzimy reakcję zewnętrznych neuronów ciała grzyba na stymulację zapachową czułków zarejestrowaną przez obiektyw 60x i wizualizowaną w fałszywych kolorach. Czerwony kwadrat po lewej stronie reprezentuje trwałość bodźca zapachowego.

Po eksperymencie mózg jest preparowany, a struktury barwników są badane bardziej szczegółowo za pomocą mikroskopu konfokalnego przy 20-krotnym powiększeniu. Właśnie pokazaliśmy, jak obrazować neurony ciała grzyba u pszczoły miodnej podczas uczenia się węchu. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że eksperymenty z barwnikami wrażliwymi na światło muszą być wykonywane w ciemności.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach. Pa pa.