Name: In vivo (in vivo) Ca2+- Obrazowanie neuronów ciała grzyba podczas uczenia węchowego u pszczoły miodnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia w ciele grzyba pszczoły miodnej podczas uczenia węchowego. Technika ta pozwala rejestrować aktywność neuronów w czasie rzeczywistym i badać neuronalne podstawy pamięci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest finansowana przez DFG.

Przygotowanie pszczół i wypełnianie wsteczne
<ol>
<li>Odłowić pszczoły miodne zbieraczki przy ulu i schłodzić na lodzie w celu unieruchomienia.</li>
<li>Umieścić je w pleksiglasowych komorach rejestracyjnych3. Przymocować oczy i klatkę piersiową do ścianek komory rejestracyjnej za pomocą twardego wosku o niskiej temperaturze topnienia.</li>
<li>Wytworzyć kapilary szklane, zgodnie z powszechną praktyką w elektrofizjologii, i przełamać je na końcach, aby uzyskać średnicę otworu ok. 10μm. Końcówkę kapilary pokryć pastą barwiącą. Pasta barwiąca składa się z mieszaniny dekstranu Fura-2 i dekstranu tetrametylorodaminy wiązanej lizyną w stosunku 10:1.</li>
<li>W celu przeprowadzenia procedury barwienia unieruchomić czułki za pomocą minutiae lub n-eikozanu. Usunąć fragment kutykuli nad mózgiem i odsunąć gruczoły oraz tchawki na bok, aby uzyskać dostęp do ciał grzybowych.</li>
<li>Wprowadzić kapilary do somy lub regionu aksonalnego neuronów ciał grzybowych. Można to wykonać ręcznie lub przy użyciu mikromanipulatora. Następnie przytwierdzić fragment kutykuli z powrotem do torebki głowy i zwolnić czułki.</li>
<li>Nakarmić pszczoły 30% roztworem sacharozy przed umieszczeniem ich w nawilżonym pojemniku na co najmniej cztery godziny lub na całą noc w temperaturze 20°C.</li>
</ol>
Obrazowanie in vivo
<ol>
<li>Unieruchom pszczołę, np. za pomocą małego kawałka gąbki docisniętej do odwłoka i przymocowanej klipsem lub taśmą do komory rejestracyjnej.</li>
<li>Aby zapobiec przemieszczaniu się mózgu wynikającemu z pompowania przełyku, wykonaj niewielkie nacięcie w kutykuli nad labrum, a następnie ostrożnie wyciągnij przełyk wraz z otaczającymi go strukturami stałymi, aby napiąć go bez uszkodzenia przełyku4. Przykryj dwuskładnikowym silikonem.</li>
<li>Wykonaj otwory igłą i wprowadź elektrody druciane do rejestracji M17.</li>
<li>Usuń fragment kutykuli, tchawki oraz gruczoły znajdujące się nad mózgiem. Odsącz hemolimfę z wnętrza torebki głowowej za pomocą kawałka papieru.</li>
<li>Wypełnij torebkę głowową dwuskładnikowym silikonem. Ważne jest, aby mózg był całkowicie przykryty.</li>
<li>Umieść pszczołę na stole mikroskopu i nanieś kroplę wody na powierzchnię silikonu, aby zanurzyć w niej obiektyw imersyjny mikroskopu. Ustaw ostrość na zabarwionych neuronach.</li>
</ol>
Stymulacja zapachowa i rejestracja sygnałów
Olfaktometr: Używamy sterowanego komputerowo, zbudowanego na zamówienie urządzenia do stymulacji, czyli „olfaktometru”, zgodnie z opisem Galizii i Vettera3. Zapachy są rozcieńczane w stałym strumieniu powietrza skierowanym w stronę czułków. Pojedynczy bodziec składa się z 3s impulsu zapachowego 0,2ml powietrza nasyconego zapachem. Protokół stymulacji można ustawić w oprogramowaniu do rejestracji TILLVision. Mikroskop i zestaw obrazujący: Używamy mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss. Obrazy są rejestrowane w temperaturze 25°C z częstotliwością próbkowania 5 Hz przy użyciu urządzenia obrazującego TILL-Photonics zamontowanego na mikroskopie. Sygnały wapniowe są rejestrowane za pomocą obiektywu imersyjnego Olympus X60, 0,9 W z kamerą Imago CCD (640X480 pikseli, bining 4X na chipie do 160X120 pikseli). Fura-2 jest wzbudzany monochromatycznym światłem o długości fali 340 i 380nm w celu przeprowadzenia pomiarów ratiometrycznych. Fluorescencja jest wykrywana przez lustro dichroiczne 410nm i filtr długoprzepustowy 440nm. Parametry rejestracji są ustawiane w oprogramowaniu do zapisu. Każdy pomiar trwa 10s, a czas ekspozycji dla obu długości fal można dostosować do intensywności barwienia w każdym preparacie. Rejestracja M17: Mięsień protraktor labium (M17) jest rejestrowany pozakomórkowo w celu monitorowania odpowiedzi behawioralnych związanych z uczeniem się, tj. PER 5, 6. Wprowadź miedziany drut do mięśnia w pobliżu części gębowych. Wprowadź elektrodę uziemiającą do oka. Potencjały mięśniowe są wzmacniane przez zbudowany na zamówienie przedwzmacniacz, digitalizowane i zapisywane na komputerze. Początek bodźca jest wyzwalany przez olfaktometr.
Analiza danych
<ol>
<li>W trakcie eksperymentu: Rejestracje sygnału wapniowego są przesyłane do komputera i zapisywane. Oprogramowanie rejestrujące TILLVision umożliwia wstępną inspekcję sygnałów, taką jak obliczenie stosunku długości fal (340nm/380nm) oraz obliczenie deltaF (odjęcie linii bazowej).</li>
<li>Przetwarzanie obrazów jest wykonywane za pomocą programów napisanych w języku IDL. Oblicz stosunek sygnałów Ca2+ z pomiarów 340nm i 380nm dla każdego piksela. Wyznacz fluorescencję tła (F) poprzez uśrednienie klatek przed bodźcem i odejmij ją od sygnału ratiometrycznego (deltaF).</li>
<li>W celu zdefiniowania obszaru zainteresowania (ROI): Oblicz średnią z klatek podczas podawania bodźca i zastosuj filtr dolnoprzepustowy (3X3px). Przekształć skalę szarości w skalę pseudokolorów. Wyznacz aktywność w strukturach neuronalnych jako punkty aktywności na obrazach w pseudokolorach i zdefiniuj je jako ROI.</li>
<li>Oblicz dynamikę czasową obszarów aktywnych poprzez uśrednienie pikseli w ROI we wszystkich klatkach, bez stosowania filtrowania lub korekcji.</li>
</ol>
Analiza morfologiczna i rekonstrukcja
Wraz z dekstranem Fura-2 wypełniamy neurony utrwalnym barwnikiem – dekstranem rhodaminą („mini ruby”). Oba barwniki mają tę samą masę cząsteczkową, zatem powinny znajdować się w tych samych miejscach w neuronach. Obrazowanie w szerokim polu zapewnia bardzo ograniczoną rozdzielczość przestrzenną, dlatego zaleca się badanie zabarwionych struktur po zakończeniu eksperymentu przy użyciu konfokalnej mikroskopii skaningowej.
<ol>
<li>Po pomiarach fizjologicznych wypreparować mózgi i utrwalić.</li>
<li>Przepłukać w PBS, przeprowadzić stopniowe odwodnienie w etanolu i przejaśnić w salicylanie metylu.</li>
<li>Do mikroskopii konfokalnej zatopić mózg w salicylanie metylu.</li>
<li>Stosujemy mikroskop Leica TCS SP2. Długość fali wzbudzenia wynosi 543nm.</li>
<li>Skanujemy mózg za pomocą obiektywu z imersją powietrzną lub olejową i porównujemy zabarwione struktury z danymi obrazowymi.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Jeśli barwienie i przygotowanie przebiegły pomyślnie, sygnał w skali kolorów sztucznych, na przykład w neuronach zewnętrznych płata alfa ciała grzybiastego, może wyglądać jak na rysunku 1. Odpowiedź behawioralną (PER) można obliczyć jako częstotliwość impulsów podczas stymulacji minus częstotliwość impulsów przed stymulacją (rysunek 2). Obarwione struktury można zbadać bardziej szczegółowo przy użyciu mikroskopu konfokalnego (rysunek 3).
<img src="/files/ftp_upload/1353/figure1_new.png" alt="Układ obrazowania neuronalnego; obszary fluorescencyjne; analizy aktywności mózgu; wykres odpowiedzi sensorycznej; bodziec." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Reprezentatywne sygnały obrazowania wapnia (stymulacja heptanalem). A: Obrazowany obszar mózgu pszczoły. B: Surowy obraz fluorescencyjny widziany przez obiektyw zanurzeniowy X20 przy długości fali wzbudzenia 380nm; płat alfa ciała grzybowatego zaznaczony fioletem. Barwnik wstrzyknięto do brzuszno-bocznego brzegu płatów alfa w celu zabarwienia neuronów zewnętrznych. C: Obraz w fałszywych kolorach pochodzący z uśrednionego sygnału deltaF (340/380) podczas trwostyczego bodźca; płat alfa zaznaczony fioletem, wybrany obszar ROI zaznaczony czernią. D: Dynamika czasowa sygnału wapnia w odpowiedzi na stymulację zapachową, uśredniony sygnał z obszaru ROI wskazanego w C. E: Dynamika czasowa sygnału wapnia w odpowiedzi na stymulację sacharozą odpowiednio ipsilateralnej i kontralateralnej anteny w odniesieniu do ROI wskazanego w C.
<img src="/files/ftp_upload/1353/figure2_new.png" alt="Wykres odpowiedzi anteny owada, ekspozycja na zapach, elektrofizjologia, analiza sygnałów sensorycznych." data-altupdatedat="1787630408000"> Rysunek 2: Reprezentatywna odpowiedź M17. Po warunkowaniu węchowym pszczoła wysuwa trąbkę, gdy zapach jest prezentowany bez nagrody. Czerwona linia oznacza bodziec zapachowy. Wstawka: PER pszczoły miodnej.
<img src="/files/ftp_upload/1353/figure3_new.png" alt="Obraz mikroskopowy przekroju tkanki nerwowej; analiza struktury komórek; skala 100µm." data-altupdatedat="1787630408000"> Rycina 3: Reprezentatywny stos obrazów. Po zakończeniu eksperymentu obrazowania dokonano sekcji mózgu. Neuron z ryciny 1 został przeskanowany za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem imersyjnym olejowym X20; płat alfa zaznaczono kolorem fioletowym.

<ol><li>Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representations+of+odors+and+odor+mixtures+visualized+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain.</a> Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).</li>
<li>Rehder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+honeybee%27s+proboscis+reflex+by+electromyiographic+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings.</a> J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience</a>. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).</li>
<li>Mauelshagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+olfactory+learning+paradigms+in+an+identified+neuron+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain.</a> J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).</li>
<li>Kuwabara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bildung+des+bedingten+Reflexes+von+Pavlovs+Typus+bei+der+Honigbiene+Apis+mellifica%2C+Hokaido+Univ%5BTitle%5D)+AND+%22Zool.+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ.</a> Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).</li>
<li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Psychology%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera.</a> Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).</li>
</ol>

W niniejszej prezentacji omówiliśmy wszystkie etapy badania sygnałów wapniowych in vivo u pszczoły miodowej. Zastosowaliśmy tę technikę w odniesieniu do neuronów ciał grzybkowatych, jednak obrazowanie można przeprowadzić na wszystkich neuronach, dla których możliwe jest opracowanie techniki barwienia. Skupiliśmy się na neuronach w drodze węchowej pszczoły miodowej. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane w ciemni. Układ jest oświetlony światłem o długiej fali, które wykracza poza zakres percepcji optycznej pszc...

<table><tbody><tr><td>twardy wosk o niskiej temperaturze topnienia Deiberit 502</td><td>Dr. B&amp;#246;hme Sch&amp;#246;ps Dental GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sól potasowa dekstranu FURA-2, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>F-3029</td><td>Chronić przed światłem.</td></tr><tr><td>dekstran tetrametylorodaminowy 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D-3312</td><td>Chronić przed światłem.</td></tr><tr><td>n-eikozan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21, 927-4</td><td></td></tr><tr><td>Klej Kwik Sil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>KWIK SIL</td><td></td></tr><tr><td>Układ obrazowania</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kamera CCD</td><td>Imago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CED</td><td>Texas Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo obrazowanie ca2+ neuronów ciał grzybowych podczas uczenia się zapachów u pszczoły miodnej

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Preparaty in vivo i semi-in vivo do obrazowania wapnia zostały opracowane w naszym laboratorium przez Joerges, Küttner i Galizii ponad dziesięć lat temu w celu pomiaru aktywności wywoływanej przez zapachy w płacie antennym1. Od tego czasu były one stale udoskonalane i stosowane w różnych neuropilach mózgu pszczoły. W niniejszym materiale opisujemy preparat obecnie stosowany w laboratorium do pomiaru aktywności neuronów ciał grzybkowatych z wykorzystaniem czułego na wapń barwnika sprzężonego z dekstranem (Fura-2). Barwienie neuronów ciał grzybkowatych przeprowadzamy drogą retrogradacyjną poprzez wstrzyknięcie barwnika do ich aksonów lub obszaru somy. Skupiamy się na ograniczeniu inwazyjności, aby uzyskać preparat, w którym nadal możliwe jest szkolenie pszczoły za pomocą warunkowania PER. Jesteśmy w stanie monitorować i kwantyfikować odpowiedź behawioralną poprzez rejestrację elektromiogramów z mięśnia kontrolującego PER (M17)2.
Po eksperymencie fizjologicznym obrazowane struktury są badane bardziej szczegółowo przy użyciu konfokalnej mikroskopii skaningowej w celu zidentyfikowania neuronów.

Pszczoły można poddać warunkowaniu w paradygmacie apetytywnego uczenia się węchowego (warunkowanie PER). Wykorzystując zapachy jako bodźce, opracowaliśmy metodę, w której rejestrowane jest zachowanie, przy jednoczesnym zastosowaniu obrazowania wapniowego w celu pomiaru aktywności wywołanej zapachem w neuronach ciała grzybowatego in vivo.

In vivo obrazowanie Ca2+ neuronów ciał grzybowych podczas uczenia się zapachów u pszczoły miodnej

Przygotowanie do obrazowania wapnia in vivo i semi-in vivo zostało opracowane w naszym laboratorium przez Joergesa, Küttnera i Galizię ponad dziesięć lat temu, aby...

Procedura rozpoczyna się od unieruchomienia pszczoły w komorze rejestracyjnej. Z torebki głowy usuwa się fragment kutykuli, aby przeprowadzić barwienie wybranych struktur w mózgu. Sygnały wapniowe w zabarwionych neuronach są rejestrowane in vivo przy użyciu układu do obrazowania szerokopolowego.Podczas obrazowania pszczołę można stymulować zapachami lub podawaniem sacharozy na czułek. W ten sposób pszczoła może zostać uwarunkowana do wysuwania trąbki w odpowiedzi na dany zapach. Odpowiedź w postaci wysunięcia trąbki jest monitorowana za pomocą pomiarów elektromiograficznych z mięśnia M 17.Po eksperymencie obrazowania mózg zostaje wypreparowany w celu dokładniejszego zbadania barwionych struktur przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Cześć, jestem Melanie z laboratorium dr. Mansela. Cześć, jestem Anya, również z laboratorium Mansela.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę obrazowania wapnia in vivo w ciałach grzybieni pszczoły miodowej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania kodowania węchowego oraz plastyczności związanej z uczeniem się w mózgu pszczoły miodowej. Zacznijmy zatem.Rozpocznij od odłowienia pszczoły miodnej zbieraczki przy wylotku ula, a następnie unieruchom ją poprzez schłodzenie na lodzie. Następnie przymocuj pszczołę do pleksiglasowej komory rejestracyjnej. Użyj twardego wosku o niskiej temperaturze topnienia, aby przymocować oczy i tułów do ścianki.Odłam szklaną kapilarę na końcu, aby uzyskać średnicę 10 µm. Pokryj koniec kapilary pastą składającą się z mieszaniny w stosunku 10:1 URA two dextrin i fixable Rodin dextrin. Przygotowana kapilara zostanie użyta do barwienia.Aby rozpocząć procedurę barwienia, należy najpierw unieruchomić czułki za pomocą koane. Otwórz torebkę głowy powyżej mózgu, usuwając fragment kutykuli i odsuwając gruczoły oraz tchawki na boki, aby uzyskać dostęp do ciał grzybowych. Użyj kawałka papieru, aby wchłonąć hemolimfę znajdującą się wewnątrz torebki głowy.Aby zabarwić neurony ciał grzybowych, należy wprowadzić kapilarę do somy lub regionu dendrytycznego neuronów. Następnie należy przytwierdzić fragment kutykuli do kapsuły głowowej i poluzować antenę. Na koniec należy podać pszczole 30% roztwór sacharozy i przechowywać ją w styropianowym pudełku przykrytym wilgotnym ręcznikiem kuchennym przez co najmniej cztery godziny lub przez noc w temperaturze 20 °C.Po zakończeniu przygotowania pszczoły B możemy rozpocząć obrazowanie in vivo. Na początek, aby zapobiec poruszaniu się pszczoły, użyj gąbki przymocowanej do komory rejestracyjnej, dociskając ją do odwłoka. Następnie unieruchom czułki pszczoły za pomocą ioane, aby zapobiec przemieszczaniu się mózgu wywołanemu pompowaniem przełyku.Wykonaj niewielkie nacięcie w kutykuli nad labrum, a następnie ostrożnie wyciągnij przełyk wraz z otaczającymi go strukturami stałymi i pokryj je dwuskładnikowym silikonem. Następnie, za pomocą igły, wykonaj otwory do wprowadzenia elektrod drucianych służących do rejestracji elektrogramów z mięśnia protraktora labium. Usuń fragment kutykuli, tchawicę oraz gruczoły znajdujące się nad mózgiem.Użyj kawałka papieru, aby wchłonąć hemolimfę z wnętrza kapsuły głowowej w celu rejestracji elektrogramów z M 17. Wprowadź miedziany drut do mięśnia w pobliżu aparatów gębowych. Wprowadź elektrodę uziemiającą do oka.Następnie wypełnij torebkę głowy dwuskładnikowym silikonem. Upewnij się, że mózg jest całkowicie przykryty. Umieść pszczołę na stoliku mikroskopu i nanieś kroplę wody na powierzchnię silikonu.Zanurz obiektyw imersyjny mikroskopu w kropli, a następnie ustaw ostrość na neurony na preparacie. Po zakończeniu przygotowań do obrazowania in vivo możemy teraz opisać stymulację zapachową i rejestrację sygnałów. Aby dostarczyć bodźce zapachowe do pszczoły, używamy sterowanego komputerowo, zbudowanego na zamówienie olfaktometru do rozcieńczania substancji zapachowych w stałym strumieniu powietrza.Stymulacja zapachowa skierowana na czułek polega na podaniu trzyminutowego impulsu powietrza nasyconego zapachem. Do obrazowania wapnia wykorzystujemy układ obrazowania til photonics zamontowany na mikroskopie fluorescencyjnym zes, aby rejestrować obrazy w temperaturze pokojowej z częstotliwością próbkowania 5 Hz. Sygnały wapniowe są rejestrowane za pomocą obiektywu zanurzeniowego Olympus X 60 0,9 W i kamery Ango CCD; każdy pomiar trwa 10 s.Potencjały mięśniowe są wzmacniane za pomocą wzmacniacza Grass, a następnie rejestrowane i digitalizowane przy użyciu przetwornika analogowo-cyfrowego. Rejestracje z M 17 służą do monitorowania reakcji behawioralnych związanych z uczeniem się; po zakończeniu rejestracji sygnałów możemy przejść do analizy morfologicznej i rekonstrukcji. Ponieważ oba barwniki użyte podczas wstecznego wypełniania mają taką samą masę cząsteczkową.Są one współlokalizowane w neuronach. Obrazowanie szerokopolowe ma ograniczoną rozdzielczość przestrzenną, dlatego do badania barwionych struktur wykorzystujemy konfokalną mikroskopię skaningową. Po zakończeniu eksperymentu należy najpierw wypreparować mózg i utrwalić go przez noc w 4% formaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza; następnego dnia przepłukać go w PBS, a następnie odwodnić w etapach etanolowych: po 10 minut w 50%, 70%, 90% i 99% oraz dwukrotnie po 10 minut w 100%. Umieścić mózg na przedmiotowym szkiełku z rowkiem z kroplą salicylanu metylu, przykryć szkiełkiem nakrywkowym, a następnie umieścić preparat na stoliku konfokalnego mikroskopu skaningowego.Przeprowadź skanowanie mózgu przy użyciu obiektywu powietrznego i cyfrowym powiększeniu od 1,1 do 1,2, wykonując przekroje optyczne co cztery mikrometry. Tutaj widzimy odpowiedź zewnętrznych neuronów ciał grzybowych na stymulację zapachową czułków, zarejestrowaną przy użyciu obiektywu 60 x i przedstawioną w sztucznych kolorach. Czerwony kwadrat po lewej stronie reprezentuje czas trwania bodźca zapachowego.Po zakończeniu eksperymentu mózg zostaje wypreparowany, a zabarwione struktury są badane bardziej szczegółowo przy użyciu mikroskopu konfokalnego z powiększeniem 20x. Przedstawiliśmy zatem sposób obrazowania neuronów ciał grzybkowatych u pszczoły miodnej podczas uczenia się zapachowego. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że eksperymenty z użyciem barwników światłoczułych muszą być przeprowadzane w ciemności.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów. Do widzenia.

in-vivo-ca2-imaging-mushroom-body-neurons-during-olfactory-learning

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In vivo obrazowanie Ca2+ neuronów ciał grzybowatych podczas uczenia się węchowego u pszczół miodnych

Ten film opisuje obrazowanie in vivo wapnia w neuronach Drosophila za pomocą GCaMP. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak rejestrować zmiany we fluorescencji GCaMP z neuronów ciała grzyba podczas eksperymentu kondycjonowania węchowego.

Drosophila In Vivo (Drosophila) in vivo (Drosophila) Obrazowanie wapnia: metoda funkcjonalnego obrazowania aktywności neuronalnej

Ten film demonstruje metodę obrazowania wapnia in vivo za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u muszek. Przedstawia etapy przygotowania muszek do mikroskopii, przeprowadzania kondycjonowania węchowego i wizualizacji napływu wapnia wywołanego zapachem.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Ten film demonstruje szczegółowy protokół barwienia immunologicznego do wizualizacji defektów fenotypowych w ciałach grzybów zmutowanych mózgów Drosophila. Protokół polega na zastosowaniu przeciwciał przeciwko Fas2, białku biorącemu udział w prowadzeniu aksonów, które ułatwia prawidłowy rozwój morfologiczny i funkcjonalny ciała grzyba.

Wizualizacja neuronów ciała grzyba w mózgach Drosophila za pomocą barwienia immunologicznego

U pszczół miodnych ustalono jednoczesne zewnątrzkomórkowe długoterminowe zapisy z dwóch różnych neuropile mózgowych lub dwóch różnych dróg anatomicznych. Nagrania te pozwalają na badanie czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczego neuronu, jak i na poziomie zespołu u zachowującego się zwierzęcia.

Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Po ekspozycji na specyficzne stresory środowiskowe, nicień Caenorhabditis elegans przechodzi intensywną plastyczność fenotypową, aby wejść w odporne na stres stadium młodociane.  Przedstawiono metody kontrolowanej indukcji i obrazowania neuroplastyczności w okresie dauera.

In vivo (in vivo)Obrazowanie specyficznej dla Dauera przebudowy neuronów u C. elegans

Ten manuskrypt opisuje kilka protokołów podawania środków farmakologicznych pszczołom miodnym, w tym proste nieinwazyjne metody dla pszczół swobodnie latających, a także bardziej inwazyjne warianty, które pozwalają na precyzyjne, miejscowe leczenie krępowanych pszczół.

Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera

Aby przetestować hamujące działanie środków farmakologicznych na fosfolipazę C (PLC) w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej, przedstawiamy test biochemiczny do pomiaru aktywności PLC w tych regionach. Test ten może być przydatny do porównywania aktywności PLC między tkankami, a także wśród pszczół wykazujących różne zachowania.

Wykrywanie aktywności fosfolipazy C w homogenacie mózgu pszczoły miodnej

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Opisujemy tutaj metody indukowania i analizowania zależnej od doświadczenia węchowego przebudowy synaptycznych kłębuszków nerkowych płata czułkowego w mózgu młodocianych Drosophila.

Zależna od doświadczenia przebudowa połączeń synaptycznych neuronów czuciowych młodzieńczych neuronów czuciowych we wczesnym okresie życia

Istotną przeszkodą w badaniu aktywności komórkowej podczas procesów poznawczych, takich jak uczenie się i pamięć, jest stosowanie środków znieczulających do przygotowania obrazowania in vivo. Znieczulenie upośledza pamięć krótkotrwałą i funkcje poznawcze w wielu modelach, w tym u Drosophila. W pracy przedstawiono unikalną metodę przygotowania dorosłej Drosophila do obrazowania in vivo bez znieczulenia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie aktywności neuronalnej u nieznieczulonych dorosłych much Drosophila

Przedstawiamy protokoły obrazowania wapnia dla larwalnego neuronu węchowego Drosophila , wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchomienia. Ta metoda zwiększa stabilność, ułatwiając wiarygodne eksperymenty in vivo i ex-vivo . Niestandardowe skrypty R analizują sygnały wapnia, zapewniając efektywną platformę do szczegółowych badań neurofizjologicznych.

Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium

Poznaj metodę obrazowania wapnia w ciele grzyba pszczoły miodnej podczas uczenia węchowego. Technika ta pozwala rejestrować aktywność neuronów w czasie rzeczywistym i badać neuronalne podstawy pamięci.

In vivo obrazowanie Ca²⁺ neuronów ciał grzybowych podczas uczenia się zapachów u pszczoły miodnej

Przeglądaj więcej filmów