In vivo (in vivo) Ca2+- Obrazowanie neuronów ciała grzyba podczas uczenia węchowego u pszczoły miodnej
18 sierpnia 2009
Pszczoły mogą być uwarunkowane paradygmatem pożądawczego uczenia się węchu (PER-conditioning). Wykorzystując zapachy jako bodźce, ustaliliśmy metodę, w której rejestruje się zachowanie, podczas gdy jednocześnie obrazowanie wapnia służy do pomiaru aktywności wywołanej zapachem w neuronach ciała grzyba in vivo.
Ta procedura rozpoczyna się od umieszczenia pszczoły w komorze nagrywającej. Z torebki głowy usuwa się fragment naskórka, który barwi wybrane struktury w mózgu. Sygnały wapniowe w barwionych neuronach są rejestrowane in vivo przy użyciu zestawu obrazowania szerokokątnego.
Podczas obrazowania pszczoła może być stymulowana zapachami lub dostarczaniem sacharozy do anteny. W ten sposób pszczoła może zostać uwarunkowana do wydłużenia trąbki w odpowiedzi na zapach. Odpowiedź na wyprost trąbki jest monitorowana za pomocą zapisów elektromiogramu z mięśnia M 17.
Po eksperymencie obrazowym mózg jest poddawany sekcji w celu dokładniejszego zbadania zabarwionych struktur za pomocą mikroskopu konfokalnego. Cześć, jestem Melanie z laboratorium rdo Mansela. Cześć, jestem Anya również z Mansel Lab.
Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę obrazowania wapnia in vivo i ciała grzyba pszczoły miodnej. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania kodowania węchowego i uczenia się związanej z nim plastyczności w mózgu pszczoły miodnej. Więc zacznijmy.
Zacznij od złapania zbieraczki pszczół miodnych przy wejściu do ula, a następnie unieruchom go, schładzając na lodzie. Następnie zamontuj pszczołę na komorze nagraniowej z pleksi. Użyj twardego wosku o niskiej temperaturze topnienia, aby przymocować oczy i klatkę piersiową do ściany.
Wszystkie rozbijają szklaną kapilę na końcówce, aby uzyskać średnicę 10 mikronów. Przykryj końcówkę kapilary pastą d składającą się z mieszaniny dekstryny URA two i utrwalanej dekstryny Rodin w proporcji 10 do jednego. Przygotowana kapilara zostanie użyta do barwienia.
Aby rozpocząć procedurę barwienia, najpierw unieruchom czułki za pomocą koane. Otwórz torebkę głowy nad mózgiem, usuwając kawałek naskórka i popychając gruczoły i tchawicę na boki, umożliwiając dostęp do ciała grzyba. Użyj kawałka papieru, aby wchłonąć limfę hemo wewnątrz torebki głowy.
Aby zabarwić neurony ciała grzyba, wstrzyknij naczynia włosowate do somy lub regionu dendrytycznego neuronów. Następnie przywróć naskórek na kapsułce głowy i poluzuj antenę. Na koniec nakarm pszczołę 30% roztworem sacharozy i przechowuj ją w styropianowym pudełku przykrytym mokrym ręcznikiem kuchennym przez co najmniej cztery godziny lub noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza.
Po zakończeniu przygotowania B możemy rozpocząć obrazowanie in vivo. Na początek użyj gąbki przymocowanej do komory nagrywającej, aby zapobiec przemieszczaniu się pszczoły, dociskając ją do brzucha. Teraz przymocuj anteny pszczoły za pomocą ioane, aby zapobiec poruszaniu się mózgu z powodu pompowania przełyku.
Wytnij małe nacięcie w naskórku nad obrąbkiem i ostrożnie wyciągnij przełyk i otaczające go stałe struktury i przykryj je dwoma składnikami: silikonem. Następnie za pomocą igły wykonaj otwory do wprowadzenia drutu elektrodowego służącego do rejestrowania elektrogramów z mięśnia kątomierza wargi sromowej. Usuń naskórek, tchawicę i gruczoły nad mózgiem.
Użyj kawałka papieru, aby wchłonąć hemo wewnątrz kapsułki głowy, aby zapisać elektrogramy z M 17. Wstrzyknij drut miedziany w mięsień w pobliżu części gębowej. Wstrzyknąć elektrodę masową do oka.
Teraz napełnij kapsułkę na głowę dwuskładnikowym silikonem. Upewnij się, że mózg jest całkowicie zakryty. Umieść pszczołę na stoliku mikroskopu i umieść kroplę wody na powierzchni silikonu.
Zanurz obiektyw zanurzeniowy mikroskopu w kropli, a następnie skup się na neuronach etapowych. Po zakończeniu przygotowań do obrazowania in vivo możemy teraz opisać stymulację zapachową i rejestrację sygnału. Aby dostarczyć pszczołom bodźce zapachowe, używamy sterowanego komputerowo, specjalnie zbudowanego olfaktometru, który rozcieńcza substancje zapachowe w stałym strumieniu powietrza.
Skierowana na antenę stymulacja zapachu polega na trzysekundowym impulsie powietrza nasyconego zapachem. Do obrazowania wapnia używamy zestawu do obrazowania fotonicznego TIL zamontowanego na mikroskopie fluorescencyjnym zes do rejestrowania obrazów w temperaturze pokojowej z częstotliwością próbkowania pięciu herców. Sygnały wapniowe są rejestrowane przez obiektyw zanurzeniowy Olympus X 60 0,9 W z kamerą CCD Ango, każdy pomiar trwa 10 sekund.
Potencjały mięśniowe są wzmacniane za pomocą wzmacniacza trawiastego oraz rejestrowane i digitalizowane za pomocą analogowego przetwornika cyfrowego. Nagrania z M 17 służą do monitorowania reakcji behawioralnych związanych z uczeniem się po zakończeniu rejestracji sygnału, możemy teraz przejść do analizy morfologicznej i rekonstrukcji. Ponieważ oba barwniki używane podczas zasypywania mają tę samą masę cząsteczkową.
Znajdują się one w neuronach. Obrazowanie szerokokątne ma ograniczoną rozdzielczość przestrzenną, dlatego do badania barwionych struktur używamy konfokalnej mikroskopii skaningowej. Po eksperymencie najpierw wypreparuj mózg i utrwal go przez noc w 4% formaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia, wypłucz go w PBS, a następnie odwodnij w krokach etanolu 10 minut w 50%70%90%99% i dwa razy po 10% Umieść mózg na rowkowanym szkiełku z przedmiotem z kroplą salicylanu metylu, Wsuń go, a następnie umieść na stoliku mikroskopu konfokalnego mikroskopu skaningowego.
Zeskanuj mózg za pomocą soczewki obiektywu powietrznego i zoomu cyfrowego od 1,1 do 1,2 w czterech mikrometrowych sekcjach optycznych. Tutaj widzimy reakcję zewnętrznych neuronów ciała grzyba na stymulację zapachową czułków zarejestrowaną przez obiektyw 60x i wizualizowaną w fałszywych kolorach. Czerwony kwadrat po lewej stronie reprezentuje trwałość bodźca zapachowego.
Po eksperymencie mózg jest preparowany, a struktury barwników są badane bardziej szczegółowo za pomocą mikroskopu konfokalnego przy 20-krotnym powiększeniu. Właśnie pokazaliśmy, jak obrazować neurony ciała grzyba u pszczoły miodnej podczas uczenia się węchu. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że eksperymenty z barwnikami wrażliwymi na światło muszą być wykonywane w ciemności.
Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach. Pa pa.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje warunkowanie pszczół z wykorzystaniem paradygmatu uczenia zapachowego o charakterze apetytywnym. Badacze rejestrują zachowanie, stosując obrazowanie wapniowe (Calcium Imaging) w celu pomiaru aktywności neuronalnej w ciałach grzybkowatych mózgu pszczoły.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Uczeniem się węchowe
Wstęp
- Pszczoły można uwarunkować do reagowania na konkretne zapachy.
- Obrazowanie wapniowe pozwala na obserwację aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym.
- Reakcja wysunięcia aparat ustny (proboscis extension response) jest powszechną miarą behawioralną w tego typu badaniach.
- Niniejsze badanie przyczynia się do zrozumienia neuronalnych mechanizmów uczenia się u owadów.
Cel badania
- Opracowanie metody rejestracji aktywności neuronalnej u pszczół podczas warunkowania węchowego.
- Zbadanie zależności między bodźcami zapachowymi a odpowiedziami neuronalnymi.
- Pogłębienie zrozumienia neuronalnych podstaw uczenia się i pamięci u pszczół.
Zastosowane metody
- Utrwalenie pszczoły w komorze rejestracyjnej w celu obserwacji.
- Usunięcie fragmentu kutykuli z torebki głowy w celu barwienia struktur mózgu.
- Wykorzystanie obrazowania szerokopolowego do rejestracji sygnałów wapniowych w neuronach.
- Stymulowanie pszczoły zapachami lub sacharozą w celu uwarunkowania odruchu wysuwania trąbki.
Główne wyniki
- Skuteczne warunkowanie pszczół w celu wywołania odruchu wysuwania trąbka w odpowiedzi na określone zapachy.
- Obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym ujawniło aktywność wywołaną zapachami w neuronach ciał grzybowych.
- Rejestracje elektromiograficzne potwierdziły wystąpienie odruchu wysuwania trąbka.
- Metoda ta pozwala na zrozumienie mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw uczenia się zapachowego.
Wnioski
- Badanie przedstawia niezawodną metodę badania uczenia się zapachowego u pszczół.
- Obrazowanie wapniowe jest skuteczną metodą monitorowania aktywności neuronalnej podczas reakcji behawioralnych.
- Wyniki przyczyniają się do szerszego zrozumienia procesów uczenia się i pamięci u owadów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda umożliwia monitorowanie aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym w modelu zachowania owada, co wspiera mechanistyczną analizę ryzyka w badaniu ścieżek uczenia się węchowego. Zapewnia ona ilościowe i powtarzalne odczyty odpowiedzi neuronalnych na bodźce zapachowe, co może służyć do walidacji celów w neurofarmakologii. Podejście to łączy fenotypowanie behawioralne z obrazowaniem komórkowym, oferując wartość prognostyczną dla wczesnego etapu odkrywania związków wpływających na przetwarzanie sensoryczne i formowanie pamięci.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie dynamiki wapnia wywołanej zapachami ze specyficznymi populacjami neuronów w ciałach grzybopodobnych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez korelację aktywności neuronalnej z reakcją wysuwania trąbki jako odczytem behawioralnym.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie plastyczności obwodów neuronalnych podczas uczenia się asocjacyjnego.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość testu: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszego przesiewania związków poprzez ustanowienie protokołów stymulacji zapachowej i detekcji sygnału.
- Wyniki ilościowe: Umożliwienie standaryzowanego pomiaru przejściowych wzrostów stężenia wapnia jako zmiennej zależnej w analizie dawka-odpowiedź.
- Powtarzalność: Preparat semi-in vivo zapewnia spójne warunki obrazowania w kolejnych próbach, co wspiera niezawodność testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Zapewnia system istotny dla badanych chorób do studiowania konserwatywnych mechanizmów uczenia się i pamięci węchowej.
- Ciągłość translacyjna: Łączy pomiary aktywności neuronalnej w fazie odkryć z wynikami behawioralnymi, wspierając ekstrapolację na modele wyższego rzędu.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia wczesną ocenę wpływu związków na plastyczność neuronalną, zmniejszając ryzyko niepowodzenia w późniejszych etapach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od identyfikacji celu po optymalizację związku wiodącego, w szczególności w przypadku związków neuroaktywnych modulujących przetwarzanie sensoryczne i funkcje poznawcze.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolowanie odpowiedzi neuronalnych na konkretne substancje zapachowe, co pozwala wyjaśnić udział poszczególnych szlaków w procesie uczenia się.
- Przesiewanie: Dostarcza preparaty gotowe do analizy z mierzalnymi wynikami obrazowania wapnia w celu oceny wpływu związków na pobudliwość neuronalną.
- Analityka: Generuje szeregi czasowe danych o sygnale wapniowym oraz wyniki elektromiograficzne zachowania, co umożliwia korelację punktów końcowych fizjologicznych i behawioralnych.
- Badania translacyjne: Łączy obrazowanie neuronalne in vivo z warunkowaniem behawioralnym, wspierając dopasowanie translacyjnych biomarkerów dla fenotypów związanych z pamięcią.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do powtarzalnych sesji obrazowania, co pozwala na prowadzenie badań podłużnych nad dynamiką uczenia się i pamięci.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję niejednoznaczności w powiązaniach między aktywnością neuronalną a efektami behawioralnymi podczas paradygmatów uczenia się.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację dzięki stałym protokołom przygotowania i zsynchronizowanemu podawaniu bodźców, co zwiększa odtwarzalność wyników między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go, dostarczając wczesnych informacji o wpływie związków na plastyczność neuronalną, co ogranicza inwestycje w nieefektywne kandydaty.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków neuroaktywnych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o mierzalne efekty w obwodach neuronalnych związanych z uczeniem się.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z owadami, barwieniu neuronów oraz technikach rejestracji elektrofizjologicznej.
- Zależne od systemów mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej, olfaktometru do podawania zapachów oraz wzmacniaczy elektromiograficznych.
- Wymaga standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia spójności barwienia, procedur unieruchomienia oraz czasu podawania bodźców.
- W przypadku rozszerzenia metody na inne modele owadzie należy uwzględnić specyficzną dla gatunku neuroanatomię oraz wydajność barwienia.
- Ograniczenia praktyczne obejmują kwestie stosunku sygnału do szumu w obrazowaniu szerokopolowym oraz inwazyjność preparatyki torebki głowowej, co może wpływać na długoterminową żywotność.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Title
0:58
Introduction
1:25
Bee Preparation and Neuron Staining
4:28
In vivo Imaging
6:50
Odor Stimulation and Recording of Signals
8:00
Morphological Anaylsis and Reconstruction
9:24
Representative Calcium Imaging and Confocal Scanning Results
10:22
Conclusion
