Name: Wytwarzanie ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-16T23:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40 z komórek PBMC przy użyciu ligandu CD40 i interleukiny-4. Ta technika pozwala badać funkcje limfocytów B niezależne od przeciwciał.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Protokół generowania ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD40 z PBMC jest podzielony na dwie części: część A przedstawia przygotowanie komórek NIH/3T3 wykazujących ekspresję liganda CD40, które posłużą jako przytwierdzone do płytki komórki karmidła. Część B opisuje właściwą hodowlę CD40-B.
A. Przygotowanie komórek karmionek (tCD40L NIH/3T3)
tCD40L NIH/3T3 to adherentna linia komórkowa fibroblastów mysich, która nigdy nie powinna osiągnąć pełnej konfluencji. W związku z tym komórki należy pasażować dwa razy w tygodniu. Nie zaleca się hodowli trwającej powyżej 6 tygodni.
<ol>
 <li>Usunąć stare podłoże z kultury pierwotnej za pomocą sterylnej pipety i przemyć komórki 10 mL 1x PBS. Po przemyciu odessać PBS.</li>
 <li>Dodać 4 mL Trypsyny/EDTA do kolby o powierzchni 75 cm2 na 5-10 minut w temperaturze 37°C. Delikatnie opukać kolbę, aby odczepić komórki.</li>
 <li>Dodać 10 mL podłoża typu dzikiego i delikatnie wymieszać.</li>
 <li>Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 50 mL sterylną pipetą i odwirować komórki przy 225 x g przez 5 min.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 10 mL podłoża typu dzikiego. Policzyć liczbę komórek w aliquocie zawiesiny komórkowej i przygotować trzy probówki 50 mL z odpowiednią liczbą komórek:
 <ol>
 <li>1,5 x 106 komórek do subkultury</li>
 <li>0,2 x 106 komórek/studzinkę do naświetlania wykorzystywanego w kulturze komórek CD40-B</li>
 <li>pozostałą część do zamrożenia (jeśli jest wymagane).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Odwirować komórki przy 225 x g przez 5 min.</li>
 <li>Usunąć nadsącz.
 <ol>
 <li>Do subkultury: resuspendować 1,5 x 106 komórek w 10 mL podłoża typu dzikiego w kolbie do hodowli komórkowej o powierzchni 75 cm2 (gęstość komórek 1,5 x 105 komórek/mL), dodać G-418 [0,7 mg/mL] i inkubować komórki w 37°C przy 5 % CO2. Przesiewać komórki dwa razy w tygodniu.</li>
 <li>Do kultury komórek CD40-B: wymagane jest 1,2 x 106 komórek na jedną płytkę 6-studzienkową. Resuspendować komórki w podłożu typu dzikiego w gęstości 0,1 x 106 komórek/mL i naświetlić dawką 78 Gy. Przenieść po 2 mL zawiesiny komórkowej do każdej studzienki i inkubować w 37°C przy 5 % CO2. Przygotowanych płytek użyć do stymulacji komórek B, gdy komórki tCD40L NIH/3T3 będą przylegać (minimum 4 godziny: sprawdzić adhezję pod mikroskopem; nie czekać więcej niż 24 h przed rozpoczęciem stymulacji komórek B). (Kontynuować z punktem B.)</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
B. Hodowla limfocytów B z CD40
I. Przygotowanie PBMC do stymulacji CD40 (dzień 0):
Uwaga: przed kontynuacją należy upewnić się, że komórki karmione (feeder cells) przylegają do podłoża. Zawsze należy dodawać świeże roztwory interleukiny-4 oraz cyklosporyny A do pożywki wzrostowej bezpośrednio przed użyciem.
<ol>
 <li>Przygotować PBMC, świeże lub odpowiednio rozmrożone. Resuspendować PBMC dwukrotnie w 50 mL 1x PBS w celu ich przemycia i odwirować pierwszy raz przy 265 x g przez 7 min, a drugi raz przy 190 x g przez 7 min, aby usunąć pozostałe komórki. Odpić nadsącz i resuspendować komórki w 20 mL PBS. Określić liczbę komórek w alikwocie zawiesiny komórkowej.</li>
 <li>Odwirować wymaganą liczbę komórek przy 225 x g przez 5 min. Dla płytki 6-dołkowej wymagane jest 4 x 106 komórek / dołek, zatem 24 x 106 komórek na płytkę.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i resuspendować PBMC w stężeniu 1 x 106 komórek/mL w pożywce hodowlanej CD40-B, świeżo uzupełnionej o 50 U/mL interleukiny-4 jako czynnika wzrostu oraz 0,63 μg/mL cyklosporyny A, aby zapobiec namnażaniu się limfocytów T (Podane stężenia odnoszą się do jednego mL pożywki hodowlanej!).</li>
 <li>Usunąć nadsącz z płytki 6-dołkowej, w której wcześniej inkubowano komórki tCD40L NIH/3T3.</li>
 <li>Przemyć przylegające komórki tCD40L NIH/3T3 najpierw 2 mL PBS na dołek, a w drugim kroku 2 mL pożywki piorzącej CD40-B.</li>
 <li>Ostrożnie dodać 4 mL zawiesiny PBMC (1 x 106 komórek/mL) do każdego dołka płytki 6-dołkowej.</li>
 <li>Inkubować komórki w temperaturze 37°C przy 5 % CO2.</li>
 <li>W 7. dniu przeprowadzić pasaż komórek (Kontynuować zgodnie z punktem 3.2.).</li>
</ol>
II. Rekultywacja komórek CD40-B (dzień 7, a następnie co 3-4 dni):
<ol>
 <li>Zebrać skupiska komórek CD40-B z płytki 6-dołkowej, resuspendując je za pomocą pipety 10 mL, a następnie przenieść je do probówki 50 mL.</li>
 <li>Wirować z prędkością 225 x g przez 7 minut i całkowicie zastąpić nadsącz medium do mycia CD40-B. Podczas liczenia komórek w alikwocie, wirować komórki z prędkością 225 x g przez 5 minut. Resuspender komórki CD40-B w medium hodowlanym CD40-B do stężenia 1 x 106 komórek/mL.</li>
 <li>Do medium dodać świeże roztwory interleukiny-4 w stężeniu 50 U/mL oraz cyklosporyny A w stężeniu 0,63 μg/mL.</li>
 <li>Usunąć nadsącz z płytki 6-dołkowej, w której wcześniej inkubowano komórki tCD40L NIH/3T3.</li>
 <li>Przemyć komórki adherentne, stosując najpierw 2 mL PBS na dołek, a w drugim kroku 2 mL medium do mycia CD40-B.</li>
 <li>Ostrożnie dodać 4 mL (1 x 106 komórek/mL) zawiesiny CD40-B do każdego dołka płytki 6-dołkowej.</li>
 <li>Inkubować płytki w temperaturze 37°C przy 5 % CO2.</li>
 <li>Powtarzać pasażowanie komórek co 3-4 dni, aby po łącznie 14 dniach uzyskać wysoko oczyszczone ludzkie komórki B aktywowane przez CD40.</li>
</ol>
C. Rozwiązywanie problemów – co zrobić, jeśli komórki CD40-B nie rosną?
<ol>
 <li>Czy sprawdzono ekspresję liganda CD40 w komórkach karmicielkach?</li>
 <li>Czy komórki karmicielki unieruchomione na płytce, użyte do stymulacji, nie są starsze niż 24h?</li>
 <li>Czy możliwe jest zanieczyszczenie mycoplasmas?</li>
 <li>Czy roztwór interleukiny-4 użyty do suplementacji był świeżo rozmrożony i posiadał odpowiednią aktywność biologiczną?</li>
 <li>Czy cyklosporyna A została dodana w odpowiednim stężeniu?</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig1tmb.jpg" border="0" alt="Analiza cytometrii przepływowej: markery CD, intensywność fluorescencji; wykresy przedstawiają badanie aktywacji komórek odpornościowych." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.
<img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig2tmb.jpg" border="0" alt="Schemat cytometrii przepływowej FACS: wykres SSC vs FSC, histogram ekspresji CD154, intensywność fluorescencji." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig2.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107, 2786-2789 (2006).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).</li>
<li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> Blood. 85, 1903-1912 (1995).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99, 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15, 955-965 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td colspan="4">A. Przygotowanie pożywek:</td></tr><tr><td colspan="4">1. Pożywka dla komórek feeder typu dzikiego</td></tr><tr><td>DMEM-Ham&amp;rsquo;s / F12</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (365 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (10%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (10 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna (15 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Pożywka do selekcji komórek feeder</td></tr><tr><td>DMEM-Ham&amp;rsquo;s / F12</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (365 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (10%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (10 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna (15 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>G-418 (0,7 mg/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Pożywka do przemywania CD40-B</td></tr><tr><td>IMDM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (584 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (25 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna (15 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Pożywka hodowlana CD40-B</td></tr><tr><td>IMDM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (584 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (25 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna (15 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rh Transferryna (50 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rh Insulina (5 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB-Humanserum (10%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">B. Odczynniki różnorodne:</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM / Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>PAA Laboratories</td><td>Nr kat.: E15-813</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Invitrogen</td><td>REF 21980-032</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco&amp;rsquo;s (10x)</td><td>PAA Laboratories</td><td>Nr kat. H15-011</td><td></td></tr><tr><td>AB-Human Serum</td><td>Invitrogen</td><td>Nr kat. 34005100</td><td></td></tr><tr><td>holo-Transferryna ludzka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr kat. T0665</td><td></td></tr><tr><td>Insulina ludzka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr kat. I2643</td><td></td></tr><tr><td>Gencin&amp;#174;</td><td>Delta Select</td><td>Nr art. 7395800</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka interleukina-4</td><td>Immunotools</td><td>Nr kat. 11130045</td><td></td></tr><tr><td>Cyklosporyna A</td><td>Novartis AG</td><td>Nr kat. NDC 0078-0109-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza Inc.</td><td>Nr kat. DE14-802C</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>PAA Laboratories</td><td>Nr kat. S11-001</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan G-418</td><td>PAA Laboratories</td><td>Nr kat. P02-012</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>REF 15400-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">C. Materiały różnorodne:</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne końcówki do pipet</td><td>Sarstedt Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Nalge Nunc international</td><td>Nr kat. 140675</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>Nr kat. 352070</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>Nr kat. 83.1813.002</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie ludzkich limfocytów b aktywowanych cd40

Generation of Human CD40-activated B cells

Komórki B aktywowane przez CD40 (komórki CD40-B) zostały zidentyfikowane jako alternatywne źródło immunostymulujących komórek prezentujących antygen (APC) w immunoterapii nowotworów 1-3. W porównaniu do komórek dendrytycznych (DC), które są najlepiej poznanymi APC, komórki CD40-B posiadają kilka odrębnych właściwości biologicznych i technicznych. Podobnie jak DC, komórki B wykazują zwiększoną ekspresję MHC i cząsteczek kostymulujących (Rys. 1b), posiadają silną zdolność migracyjną i efektywnie prezentują antygeny komórkom T po stymulacji interleukiny-4 oraz ligandem CD40 (CD40L). Jednak w przeciwieństwie do niedojrzałych lub dojrzałych DC, komórki CD40-B wykazują pełną triadę homingu do węzłów chłonnych, składającą się z CD62L, CCR7/CXCR4 oraz antygenu funkcji leukocytarnej-1 (LFA1, CD11a/CD18), niezbędną do migracji do wtórnych narządów limfatycznych (Rys. 1a) 3. Komórki CD40-B mogą być bez trudności generowane z bardzo małych ilości krwi obwodowej, które mogą być następnie namnażane in vitro do bardzo dużych ilości wysoko oczyszczonych komórek CD40-B (&gt;109 komórek na pacjenta), zarówno od zdrowych dawców, jak i od pacjentów onkologicznych (Rys. 1c,d) 1,4. 
W niniejszym protokole demonstrujemy sposób otrzymywania w pełni aktywowanych komórek CD40-B z ludzkich PBMC. Kluczowymi cząsteczkami dla hodowli komórkowej są ligand CD40, interleukina-4 (IL-4) oraz cyklosporyna A (CsA), które są uzupełniane w 3-4 dniowym cyklu hodowli. Do celów laboratoryjnych stymulacja CD40 jest zapewniana przez komórki NIH/3T3 wykazujące ekspresję rekombinowanego ludzkiego ligandu CD40 (tCD40L NIH/3T3) 5. Aby uniknąć kontaminacji komórkami nietransfekowanymi, należy regularnie sprawdzać ekspresję ludzkiego ligandu CD40 na transfektantach (Ryc. 2). 
Po 14 dniach hodowle komórek B CD40 składają się w ponad 95% z czystych limfocytów B, a ekspansja komórek B CD40 przez okres ponad 65 dni jest często możliwa bez utraty ich funkcji. 1, 4Komórki B wykazujące ekspresję CD40 efektywnie pobierają, przetwarzają i prezentują antygeny komórkom T 6Nie tylko one torują drogę na&#970;ve, ale także zwiększyć liczbę komórek T pamięci 7,8Aktywowane CD40 limfocyty B mogą być wykorzystywane do badania aktywacji, różnicowania i funkcji limfocytów B. Ponadto stanowią one obiecujące narzędzie w przypadku szczepień terapeutycznych lub profilaktycznych przeciwko nowotworom. 9.

W tym filmie przedstawiamy generowanie oraz ekspansję ex vivo ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD40 (CD40-B) z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) poprzez stymulację ligandem CD40 oraz interleukiną-4.

Generowanie ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40

Komórki B aktywowane CD40 (komórki CD40-B) zostały zidentyfikowane jako alternatywne źródło immunostymulujących komórek prezentujących antygen (APC) w leczeniu nowotworów...

Witajcie, nazywam się Alexander Shiku Van Hagen. Jestem pracownikiem Laboratorium Immunologii i Immunologii Transportu w Szpitalu Uniwersyteckim w Kolonii. W tym filmie pokażemy Państwu, w jaki sposób można wygenerować ludzkie B komórki aktywowane CD 40 z mononuklearnych komórek krwi obwodowej.Jednym z głównych obszarów zainteresowań naszego laboratorium jest badanie funkcji limfocytów B niezależnych od przeciwciał. Poza rolą producentów przeciwciał, limfocyty B pełnią istotną funkcję komórek prezentujących antygen zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i w przebiegu chorób autoimmunologicznych. Po aktywacji limfocyty B mogą nabyć silne zdolności prezentowania antygenów oraz właściwości immunostymulujące, zwłaszcza gdy są aktywowane poprzez CD 40.CD 40. Aktywowane limfocyty B wykazują szereg zalet w porównaniu z komórkami dendrytycznymi. Mogą być one łatwo namnażane przy stosunkowo niskich kosztach z niewielkich ilości krwi obwodowej, nawet od pacjentów z nowotworami.Teraz nasza doktorantka, Tanya Leic, oraz nasz technik LER, przedstawią Państwu instrukcję krok po kroku, jak wygenerować ludzkie limfocyty B aktywowane przez CD 40 z krwi obwodowej. Dzień dobry, nazywam się Tanya Livi. Jestem doktorantką i chciałabym zaprezentować Państwu sposób generowania ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD 40.Procedura ta została zoptymalizowana w naszym laboratorium. Głównym etapem jest przygotowanie komórek karmicieli. W tym celu wykorzystujemy ludzkie komórki NIH 33 przetransfekowane ligandem CD 40, które poddajemy napromieniowaniu dawką 78 gray, a następnie wysiewamy na płytki sześcio-dołkowe.W drugiej kolejności rozpoczynamy hodowlę ludzkich, aktywowanych CD 40 limfocytów B z oczyszczonych PBMC, które poddaje się działaniu ludzkiej interleukiny 4 oraz cyklosporyny A; następnie komórki te wysiewa się na płytki sześcio-dołkowe. Procedurę tę powtarza się w siódmym dniu, a następnie co trzy do czterech dni aż do 14. dnia hodowli komórkowej. Aby uzyskać wysoką czystość ludzkich, aktywowanych CD 40 limfocytów B, generowanie tych komórek rozpoczynamy z wykorzystaniem świeżo oczyszczonych lub odpowiednio rozmrożonych ludzkich PBMC.W pierwszej kolejności PBMCs poddajemy dwukrotnemu przemyciu, resuspendując komórki w 50 ml PBS. PBMCs wirujemy przez siedem minut przy 1300 RPM, co odpowiada 260 ×g. Po odlaniu supernatantu i usunięciu warstwy tłuszczowej, komórki ponownie resuspendujemy w 50 ml PBS i ponownie wirujemy przez siedem minut przy 1100 RPM, co odpowiada 190 ×g. Po ponownym odlaniu supernatantu przystępujemy do oznaczenia liczby komórek.Resuspenduj PBMC w 20 mililitrach PBS, dokładnie wymieszaj komórki za pomocą wirówki vorteksowej i określ liczbę komórek. Odwiruj wymaganą ilość PBMC do hodowli CD 40 B przez pięć minut przy 1200 RPM, co odpowiada 220 5G. W płytce sześciodołkowej należy zastosować 4 × 10⁶ komórek na dołek, co daje łącznie 24 × 10⁶ komórek na płytkę.Następnie resuspender PBMC w stężeniu 1×10⁶ komórek na ml w pożywce hodowlanej CD 40 B. Uzupełnić zawiesinę komórkową świeżą ludzką IL-4 w stężeniu 50 jednostek na ml w celu stymulacji oraz cyklosporyną A w stężeniu 0,63 µg/ml, aby zahamować proliferację limfocytów T. Zawiesina PBMC jest teraz gotowa do stymulacji ligandem CD 40.Z tego, co nam wiadomo, obecnie nie jest dostępny funkcjonalny ligand CD 40 SOMAL o jakości GMP. W związku z tym wykorzystujemy komórki NIH 3T3 przetransfekowane ludzkim ligandem CD 40 w celu stymulacji przeżycia, różnicowania i proliferacji komórek, ponieważ linia komórkowa NIH 3T3 może przeżyć w hodowli przez kilka miesięcy. Utratę ekspresji ligandu CD 40 należy regularnie wykluczać poprzez testy.Linia komórek przylegających NIH 3T3 z transfekcją ligandu CD40 jest hodowana w temperaturze 37°C przy 5% CO2 w pożywce selekcyjnej uzupełnionej o G418 w stężeniu 0,7 mg/mL. Ta adherentna linia fibroblastów nie powinna osiągać pełnej konfluencji i powinna być pasażowana dwa razy w tygodniu. Aby rozdzielić komórki przylegające, należy odessać pożywkę, przemyć raz 10 mL PBS i delikatnie zakręcić kolbą. Ponownie odessać pożywkę i dodać 4 mL trypsyny EDTA w kolbie o powierzchni 75 cm².Inkubuj kolbę przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Wyjmij ponownie kolbę. Delikatnie postukaj w ścianki naczynia, aby odspoić komórki od tworzywa.Następnie należy dodać 10 ml pożywki typu dzikiego, delikatnie zamieszać i przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml. Komórki NA eight three T three należy odwirować przez pięć minut przy 1200 RPM, co odpowiada 125×g. Osad komórkowy należy ostrożnie resuspendować w 10 ml pożywki typu dzikiego.Wyznaczyć liczbę komórek dla trzeciej subkultury NIH 3T3 i resuspendować 1,5 × 10⁶ komórek feeder w 10 ml pożywki typu dzikiego. Przenieść je do kolby o powierzchni 75 cm² i dodać G 4 1 8 w stężeniu 0,7 mg/ml w celu selekcji przetransfekowanych komórek niosących geny oporności na neomycynę. Na koniec inkubować komórki feeder w temperaturze 37°C w 5% CO₂ w celu stymulacji CD 40 B.Pozostałe komórki NI 8 3 3 poddaj dawce promieniowania letalnej w ilości 78 Gy, aby zahamować ich proliferację. Rozcieńcz napromieniowane komórki karmiące w medium typu wire, tak aby gęstość komórek wynosiła 0,1 × 10⁶ komórek/ml, i nanieś 2 ml na każdą studnię płytki 6-dołkowej. Pozostaw komórki na płytkach 6-dołkowych do ponownego przytwierdzenia przed zastosowaniem ich jako komórek karmiących, inkubując je przez 24 godziny w 37 °C i 5% CO2 w celu stymulacji limfocytów B ligandem CD 40.Sprawdzić pod mikroskopem, czy wysiane dzień wcześniej komórki karmne przylegają do powierzchni. Jeśli komórki karmne przylegają, usunąć SUP natin z każdej studni i szybko je dwukrotnie wypłukać. Najpierw wypłukać każdą studnię dwiema mililitrami PBS, a następnie kolejnymi dwiema mililitrami.Pożywka do przemywania CD 40 B do stymulacji zawiesiny PBMC. Przygotowana bezpośrednio przed użyciem z gęstością komórek 1 × 10⁶ komórek/ml w odniesieniu do komórek dokarmiających. W tym celu należy delikatnie przenieść 4 ml zawiesiny komórkowej do każdej z nich.Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37°C w 5% CO2 w siódmej dobie. Komórki B CD40 mogą być poddawane pasażowaniu podczas pierwszego pasażu CD40 dla aktywowanych komórek B w siódmej dobie, a kolejne pasażowania należy przeprowadzać co trzy do czterech dni.Gentlycznie zbierz skupione komórki z płytek 12-dołkowych za pomocą pipety 10 ml, zawieszając je w medium. Przenieś komórki CD 40 B do probówki 50 ml. Odwiruj komórki CD 40 B przez siedem minut przy 1200 RPM, co odpowiada 220 ×g.Wymień pożywkę na pożywkę do płukania komórek B CD 40 i określ liczbę aktywowanych komórek B CD 40. Resuspenduj komórki B CD 40 w pożywce hodowlanej CD 40 B w stężeniu 1 × 10⁶ komórek/mL.Następnie uzupełnij zawiesinę komórkową świeżym ludzkim IL-4 w stężeniu 50 units/mL oraz cyklosporyną A w stężeniu 0,63 µg/mL w celu stymulacji. Użyj naświetlanych komórek karmionek przygotowanych dzień wcześniej. Oczywiście bezpośrednio przed użyciem należy ponownie sprawdzić pod mikroskopem przyleganie naświetlanych komórek karmionek.Jeśli komórki są adherentne, należy dwukrotnie szybko przemyć komórki karmne, podobnie jak poprzednio: raz za pomocą PBS, a następnie pożywką do płukania CD 40 B. Następnie należy ostrożnie nalać 4 ml zawiesiny CD 40 B o stężeniu 1×10⁶ komórek na ml do każdej studni płytki 6-dołkowej. Subkulturę powtarza się w identyczny sposób co trzy do czterech dni, dwa razy w tygodniu, aż do 14. dnia hodowli, aby uzyskać skupiska wysoko oczyszczonych ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD 40.Na tym etapie komórki B CD 40 wykazują ekspresję cząsteczek kostymulujących, takich jak CD 80, CD 86, CD 83, cząsteczek MHC oraz tak zwanej triady homingu do węzłów chłonnych, obejmującej CD 62 ligand, CCR 7 i LFA 1, co można sprawdzić za pomocą przepływowej cytometrii w celu weryfikacji procesu generowania komórek. W przypadku problemów prosimy o zapoznanie się z wersją tekstową tego protokołu. Mamy nadzieję, że w przyszłości aktywowane CD 40 komórki B będą służyć jako istotne narzędzie w immunoterapii nowotworów.Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

generation-of-human-cd40-activated-b-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wzmacnianie działania komórek B człowieka przez CD40

W tym filmie prezentujemy procedurę aktywacji CD40 i ekspansji mysich limfocytów B z splenocytów myszy C57BL/6, które mogą służyć jako model komórki prezentującej antygen (APC) do badania indukcji odporności.

Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

Opisano wydajny system analizy struktury i funkcji genu w kulturze ex vivo limfocytów B śledziony. Metoda ta wykorzystuje produkcję rekombinowanych retrowirusów w wolnej od komórek pomocniczych (helper-free), ekotropowej linii komórkowej pakującej. Osiągnięto stabilną, dziedziczną ekspresję badanego genu w pierwotnych limfocytach, co prowadzi do generowania przeciwciał powierzchniowych na komórkach B przechodzących rekombinację zmiany klasy.

Produkcja rekombinowanych retrowirusów i infekcja limfocytów B

Ten film demonstruje test in vitro do generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) z popularnych limfoidalnych komórek progenitorowych (CLP). Po jednoczesnej hodowli oczyszczonych CLP z napromieniowanymi γ komórkami zasilającymi w obecności liganda kinazy tyrozynowej-3 (FL) podobnego do Fms, CLP różnicują się w nieprzylegające pDC, których obecność potwierdza się za pomocą cytometrii przepływowej.

Wytwarzanie in vitro plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych

Ten film demonstruje test do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych CD8αβ+ pochodzących z indukowanych komórek macierzystych (iPSC) specyficznych dla antygenu nowotworowego. Specyficzne dla antygenu nowotworowego iPSC są hodowane na monowarstwie komórek zrębu i różnicowane w hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC). HPC są różnicowane w podwójnie dodatnie limfocyty T CD4 + CD8 + przy użyciu pożywki różnicowej. Komórki te są następnie stymulowane do generowania...

Generowanie pojedynczych dodatnich limfocytów T CD8 z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Tutaj opisujemy nowatorską metodę generowania specyficznych dla antygenu receptorów limfocytów T (TCR) poprzez parowanie TCRα lub TCRβ istniejącego TCR, posiadającego swoistość antygenową będącą przedmiotem zainteresowania, z komplementarnym półłańcuchem repertuaru obwodowych receptorów limfocytów T. Generowane de novo TCR zachowują swoistość antygenową z różnym powinowactwem.

Generowanie receptorów ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu de novo poprzez transdukcję retrowirusową centralnego hemiłańcucha

Tutaj pokazujemy, jak monocyty są izolowane przez magnetyczne oddzielanie kulek od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po odwirowaniu w gradionym gradifikacji gęstości ludzkiej krwi antykoagulowanej. Po inkubacji przez 5 dni ludzkie monocyty różnicują się w niedojrzałe komórki dendrytyczne i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych.

Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Opisujemy metodę produkcji ludzkich przeciwciał specyficznych dla interesującego nas antygenu, zaczynając od rzadkich limfocytów B krążących w ludzkiej krwi. Wytwarzanie tych naturalnych przeciwciał jest wydajne i szybkie, a uzyskane przeciwciała mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny.

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

Korzystając z wieloetapowych systemów hodowli, raportujemy in vitro model różnicowania komórek B do komórek plazmatycznych.

Model różnicowania in vitro ludzkich komórek B normalnej pamięci do długowiecznych komórek plazmatycznych

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Poznaj metodę wytwarzania ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40 z komórek PBMC przy użyciu ligandu CD40 i interleukiny-4. Ta technika pozwala badać funkcje limfocytów B niezależne od przeciwciał.

Generowanie ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40

Przeglądaj więcej filmów