Wytwarzanie ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40

Cześć, nazywam się Alexander Shiku Van Hagen. Jestem członkiem Laboratorium Immunologii i Immunologii Transportowej w Szpitalu Uniwersyteckim w Kolonii. W tym filmie pokażemy, w jaki sposób możemy wygenerować ludzkie limfocyty B aktywowane CD 40 z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.

Jednym z głównych zainteresowań naszego laboratorium jest badanie niezależnych od przeciwciał funkcji komórek BB. Poza rolą producentów przeciwciał, limfocyty B odgrywają ważną rolę jako komórki prezentujące antygen zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i w chorobach autoimmunologicznych. Po aktywacji limfocyty B mogą nabywać silne zdolności antygenowe i immunostymulacyjne, zwłaszcza gdy są aktywowane przez CD 40.

Płyta CD 40. Aktywowane limfocyty B mają kilka zalet w porównaniu z komórkami dendrytycznymi. Można je łatwo rozbudować stosunkowo niskim kosztem z niewielkich ilości krwi obwodowej, nawet od pacjentów z rakiem.

Teraz nasza doktorantka, Tanya Leic i nasz technik LER, przedstawią Ci krok po kroku, jak generować ludzkie limfocyty B aktywowane CD 40 z krwi obwodowej. Cześć, nazywam się Tanya Livi. Jestem doktorantem i chcę Ci pokazać, jak generować ludzkie limfocyty B aktywowane CD 40.

Ta procedura została zoptymalizowana w naszym laboratorium. Główne kroki to najpierw przygotowanie ogniw zasilających. Dlatego używamy ludzkich komórek N IH 33 transfekowanych ligandem CD 40, które są napromieniane 78 szarymi i posiewane na sześciodołkowych płytkach.

Po drugie, rozpoczynamy hodowlę ludzkich CD 40, aktywowanych limfocytów B z oczyszczonego PBMC, które są traktowane ludzką interleukiną cztery i cyklosporyną, a następnie komórki te są siane na komórkach fety na płytkach sześciodołkowych. Procedurę tę powtarza się w siódmym dniu, a następnie co trzy do czterech dni do 14 dnia hodowli komórkowej. Aby uzyskać wysoce czyste ludzkie limfocyty B aktywowane CD 40, rozpoczynamy wytwarzanie komórek B aktywowanych CD 40 za pomocą świeżo oczyszczonego lub odpowiednio przemyślanego ludzkiego PBMC.

Najpierw myjemy pbmc dwa razy, a następnie ponownie zawieszamy ogniwa w 50 mililitrach PBS. Obracaj PBMC przez siedem minut z prędkością 1300 obr./min, co odpowiada 260 5G. Ten samochód, supinat i smar, zawieszają komórki ponownie w 50 mililitrach PBS ponownie obraca się w dół przez siedem minut przy 1100 obr./min, co odpowiada 190 G. Ta karta supinuje ponownie w celu określenia liczby komórek reus.

Zawieś PBMC w 20 mililitrach PBS, dokładnie wymieszaj komórki przez wirowanie i określ liczbę komórek. Odkręć wymaganą ilość PBMC dla kultury CD 40 B przez pięć minut przy 1200 obr./min, co odpowiada 220 5G. Używając płytki sześciodołkowej, potrzebujesz cztery razy 10 do sześciu komórek na dołek plus 24 razy 10 do sześciu komórek na płytkę.

Następnie ponownie zawiesić PBMC raz od 10 do sześciu komórek na mililitr w pożywce hodowlanej CD 40 B. Uzupełnij zawiesinę komórkową świeżą ludzką IL four w stężeniu 50 jednostek na mililitr do stymulacji i cyklosporyną A w stężeniu punktu OH 63 mikrogramy na mililitr, aby zahamować wzrost komórek T. Teraz zawiesina PBMC jest gotowa do stymulacji ligandem CD 40.

Zgodnie z naszą wiedzą, obecnie nie jest dostępny funkcjonalny ligand SOMAL CD 40 klasy GMP. Dlatego używamy ludzkich limfocytów Ti-trzech transfekowanych przez ligand CD 40 NIH, aby stymulować przeżycie, różnicowanie i proliferację komórek, ponieważ linia komórkowa NIH trzy T trzy może przetrwać w hodowli przez kilka miesięcy. Utrata ekspresji liganda CD 40 musi być regularnie wykluczana przez fakty.

Transfekowany ligand CD 40, NIH trzy trzy jest adhezyjną linią komórkową i jest hodowany w temperaturze 37 stopni z 5% CO2 w pożywce selekcyjnej, którą uzupełnia się G 4 1 8 w stężeniu oh 0,7 miligrama na mililitr. Ta przylegająca linia komórkowa fibroblastów nigdy nie powinna stać się całkowicie zlewająca i powinna być dzielona dwa razy w tygodniu Aby podzielić przylegające komórki, zassaj pożywkę raz za pomocą 10 mililitrów PBS, delikatnie obracając. Ponownie odessać pożywkę i dodać cztery mililitry tripsin EDTA do kolby o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych.

Inkubować kolbę przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni w inkubatorze. Ponownie wyjąć kolbę. Użyj delikatnego stukania, aby odłączyć komórki od plastiku.

Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki typu dzikiego, delikatnie obróć i przenieś komórki do 50-mililitrowej probówki. Zakręć ośmioma trzema ogniwami T trzy przez pięć minut z prędkością 1200 obr./min, co odpowiada stu 20 5G. Ostrożnie ponownie zawieś bladowe ogniwa w 10-milimetrowym podłożu typu drut.

Określ liczbę komórek dla subkultury N IH trzy trzy i ponownie zawieś 1,5 razy 10 do sześciu komórek zasilających w 10-mililitrowej pożywce typu dzikiego. Przenieś je do kolby o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych i dodaj G 4 1 8 w stężeniu 0,7 miligrama na mililitr, aby wybrać transfekowane komórki, które są odporne na neomycynę. Geny ostatecznie inkubują komórki karmiciela w temperaturze 37 stopni w 5% CO2 w celu stymulacji CD 40 B.

Weź resztę komórek NI 8 3 3 i śmiertelnie napromieniuj je stopniem 78, aby powstrzymać ich proliferację. Rozcieńczyć napromieniowane ogniwa zasilające w podłożu drutowym o gęstości komórek oh 0,1 razy 10 do sześciu komórek na płytkę mililitrową, dwa mililitry na dołek na płytce sześciodołkowej. Pozwól komórkom na płytkach sześciodołkowych ponownie przylegać przed użyciem ich jako komórek zasilających, inkubując je przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni i 5% CO2 do stymulacji limfocytów bi ligandem CD 40.

Sprawdź pod mikroskopem, czy ogniwa podajnika posiane dzień wcześniej przylegają. Jeśli komórki zasilające przylegają, usuń natyn SUP z każdej studzienki i szybko umyj je dwa razy. Najpierw umyj każdą studzienkę dwoma mililitrami PBS, a następnie dwoma mililitrami.

CD 40 B Podłoże do prania Do stymulacji w zawiesinie PBMC. Przygotowany krótko wcześniej o gęstości komórek od jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr do komórek zasilających. W tym celu delikatnie przenieś do każdego z nich cztery mililitry zawiesiny komórek.

Dobrze inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni w 5% CO2 siódmego dnia. Komórki B CD 40 mogą być hodowane w pierwszej subkulturze CD 40. Aktywowane limfocyty B w siódmym dniu i kolejne subkultury co trzy do czterech dni.

Delikatnie zbierz zgrupowane komórki z sześciu 12 płytek firmy Resus, zawieszając je za pomocą 10-mililitrowej rury. Wyciągnij ogniwa CD 40 B w tubie o pojemności 50 mililitrów. Całkowicie zakręć ogniwami CD 40 B przez siedem minut z prędkością 1200 obr./min, co odpowiada 220 5G.

Zamień pożywkę na pożywkę myjącą CD 40 B i oznacz liczbę komórek w CD 40. Aktywowane limfocyty B. Ponownie zawiesić komórki B CD 40 raz 10 do sześciu komórek na mililitr w pożywce hodowlanej CD 40 B.

Następnie ponownie uzupełnij zawiesinę komórkową świeżą ludzką IL four w stężeniu 50 jednostek na mililitr i cyklosporyną A w stężeniu oh 0,63 mikrograma na mililitr w celu stymulacji. Uc, napromieniowane ogniwa zasilające przygotowane dzień wcześniej. Oczywiście napromieniowane ogniwa zasilające muszą być ponownie sprawdzone pod kątem przylegania pod mikroskopem bezpośrednio przed użyciem.

Jeśli przylegają, szybko umyj komórki podajnika dwa razy, tak jak wcześniej jeden raz za pomocą PBS. Innym razem z mediami myjącymi CD 40 B, a następnie ostrożnie odtwarzać cztery mililitry zawiesiny CD 40 B dostosowane do jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr w każdym dołku płytki sześciodołkowej. Subkultura jest powtarzana identycznie po trzech do czterech dniach dwa razy w tygodniu, aby uzyskać klastry komórek wysoce czystych ludzkich komórek B aktywowanych CD 40 w 14 dniu hodowli.

W tym momencie komórki B CD 40 wyrażają cząsteczki kostymulujące, takie jak cząsteczki MHC CD 80, CD 86, CD 83 oraz tak zwana triada naprowadzania węzłów chłonnych ligandu CD 62 ligandu CCR siedem i LFA jeden, które mogą być sprawdzane przez Fox podczas generowania W celu rozwiązania problemu. Proszę zapoznać się z tekstową wersją tego protokołu. Mamy nadzieję, że w przyszłości limfocyty B aktywowane CD 40 posłużą jako ważne narzędzie w immunoterapii nowotworów.

Powodzenia w eksperymentach.