Generowanie ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40

Witajcie, nazywam się Alexander Shiku Van Hagen. Jestem pracownikiem Laboratorium Immunologii i Immunologii Transportu w Szpitalu Uniwersyteckim w Kolonii. W tym filmie pokażemy Państwu, w jaki sposób można wygenerować ludzkie B komórki aktywowane CD 40 z mononuklearnych komórek krwi obwodowej.

Jednym z głównych obszarów zainteresowań naszego laboratorium jest badanie funkcji limfocytów B niezależnych od przeciwciał. Poza rolą producentów przeciwciał, limfocyty B pełnią istotną funkcję komórek prezentujących antygen zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i w przebiegu chorób autoimmunologicznych. Po aktywacji limfocyty B mogą nabyć silne zdolności prezentowania antygenów oraz właściwości immunostymulujące, zwłaszcza gdy są aktywowane poprzez CD 40.

CD 40. Aktywowane limfocyty B wykazują szereg zalet w porównaniu z komórkami dendrytycznymi. Mogą być one łatwo namnażane przy stosunkowo niskich kosztach z niewielkich ilości krwi obwodowej, nawet od pacjentów z nowotworami.

Teraz nasza doktorantka, Tanya Leic, oraz nasz technik LER, przedstawią Państwu instrukcję krok po kroku, jak wygenerować ludzkie limfocyty B aktywowane przez CD 40 z krwi obwodowej. Dzień dobry, nazywam się Tanya Livi. Jestem doktorantką i chciałabym zaprezentować Państwu sposób generowania ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD 40.

Procedura ta została zoptymalizowana w naszym laboratorium. Głównym etapem jest przygotowanie komórek karmicieli. W tym celu wykorzystujemy ludzkie komórki NIH 33 przetransfekowane ligandem CD 40, które poddajemy napromieniowaniu dawką 78 gray, a następnie wysiewamy na płytki sześcio-dołkowe.

W drugiej kolejności rozpoczynamy hodowlę ludzkich, aktywowanych CD 40 limfocytów B z oczyszczonych PBMC, które poddaje się działaniu ludzkiej interleukiny 4 oraz cyklosporyny A; następnie komórki te wysiewa się na płytki sześcio-dołkowe. Procedurę tę powtarza się w siódmym dniu, a następnie co trzy do czterech dni aż do 14. dnia hodowli komórkowej. Aby uzyskać wysoką czystość ludzkich, aktywowanych CD 40 limfocytów B, generowanie tych komórek rozpoczynamy z wykorzystaniem świeżo oczyszczonych lub odpowiednio rozmrożonych ludzkich PBMC.

W pierwszej kolejności PBMCs poddajemy dwukrotnemu przemyciu, resuspendując komórki w 50 ml PBS. PBMCs wirujemy przez siedem minut przy 1300 RPM, co odpowiada 260 ×g. Po odlaniu supernatantu i usunięciu warstwy tłuszczowej, komórki ponownie resuspendujemy w 50 ml PBS i ponownie wirujemy przez siedem minut przy 1100 RPM, co odpowiada 190 ×g. Po ponownym odlaniu supernatantu przystępujemy do oznaczenia liczby komórek.

Resuspenduj PBMC w 20 mililitrach PBS, dokładnie wymieszaj komórki za pomocą wirówki vorteksowej i określ liczbę komórek. Odwiruj wymaganą ilość PBMC do hodowli CD 40 B przez pięć minut przy 1200 RPM, co odpowiada 220 5G. W płytce sześciodołkowej należy zastosować 4 × 10⁶ komórek na dołek, co daje łącznie 24 × 10⁶ komórek na płytkę.

Następnie resuspender PBMC w stężeniu 1×10⁶ komórek na ml w pożywce hodowlanej CD 40 B. Uzupełnić zawiesinę komórkową świeżą ludzką IL-4 w stężeniu 50 jednostek na ml w celu stymulacji oraz cyklosporyną A w stężeniu 0,63 µg/ml, aby zahamować proliferację limfocytów T. Zawiesina PBMC jest teraz gotowa do stymulacji ligandem CD 40.

Z tego, co nam wiadomo, obecnie nie jest dostępny funkcjonalny ligand CD 40 SOMAL o jakości GMP. W związku z tym wykorzystujemy komórki NIH 3T3 przetransfekowane ludzkim ligandem CD 40 w celu stymulacji przeżycia, różnicowania i proliferacji komórek, ponieważ linia komórkowa NIH 3T3 może przeżyć w hodowli przez kilka miesięcy. Utratę ekspresji ligandu CD 40 należy regularnie wykluczać poprzez testy.

Linia komórek przylegających NIH 3T3 z transfekcją ligandu CD40 jest hodowana w temperaturze 37°C przy 5% CO2 w pożywce selekcyjnej uzupełnionej o G418 w stężeniu 0,7 mg/mL. Ta adherentna linia fibroblastów nie powinna osiągać pełnej konfluencji i powinna być pasażowana dwa razy w tygodniu. Aby rozdzielić komórki przylegające, należy odessać pożywkę, przemyć raz 10 mL PBS i delikatnie zakręcić kolbą. Ponownie odessać pożywkę i dodać 4 mL trypsyny EDTA w kolbie o powierzchni 75 cm².

Inkubuj kolbę przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Wyjmij ponownie kolbę. Delikatnie postukaj w ścianki naczynia, aby odspoić komórki od tworzywa.

Następnie należy dodać 10 ml pożywki typu dzikiego, delikatnie zamieszać i przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml. Komórki NA eight three T three należy odwirować przez pięć minut przy 1200 RPM, co odpowiada 125×g. Osad komórkowy należy ostrożnie resuspendować w 10 ml pożywki typu dzikiego.

Wyznaczyć liczbę komórek dla trzeciej subkultury NIH 3T3 i resuspendować 1,5 × 10⁶ komórek feeder w 10 ml pożywki typu dzikiego. Przenieść je do kolby o powierzchni 75 cm² i dodać G 4 1 8 w stężeniu 0,7 mg/ml w celu selekcji przetransfekowanych komórek niosących geny oporności na neomycynę. Na koniec inkubować komórki feeder w temperaturze 37°C w 5% CO₂ w celu stymulacji CD 40 B.

Pozostałe komórki NI 8 3 3 poddaj dawce promieniowania letalnej w ilości 78 Gy, aby zahamować ich proliferację. Rozcieńcz napromieniowane komórki karmiące w medium typu wire, tak aby gęstość komórek wynosiła 0,1 × 10⁶ komórek/ml, i nanieś 2 ml na każdą studnię płytki 6-dołkowej. Pozostaw komórki na płytkach 6-dołkowych do ponownego przytwierdzenia przed zastosowaniem ich jako komórek karmiących, inkubując je przez 24 godziny w 37 °C i 5% CO2 w celu stymulacji limfocytów B ligandem CD 40.

Sprawdzić pod mikroskopem, czy wysiane dzień wcześniej komórki karmne przylegają do powierzchni. Jeśli komórki karmne przylegają, usunąć SUP natin z każdej studni i szybko je dwukrotnie wypłukać. Najpierw wypłukać każdą studnię dwiema mililitrami PBS, a następnie kolejnymi dwiema mililitrami.

Pożywka do przemywania CD 40 B do stymulacji zawiesiny PBMC. Przygotowana bezpośrednio przed użyciem z gęstością komórek 1 × 10⁶ komórek/ml w odniesieniu do komórek dokarmiających. W tym celu należy delikatnie przenieść 4 ml zawiesiny komórkowej do każdej z nich.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37°C w 5% CO2 w siódmej dobie. Komórki B CD40 mogą być poddawane pasażowaniu podczas pierwszego pasażu CD40 dla aktywowanych komórek B w siódmej dobie, a kolejne pasażowania należy przeprowadzać co trzy do czterech dni.

Gentlycznie zbierz skupione komórki z płytek 12-dołkowych za pomocą pipety 10 ml, zawieszając je w medium. Przenieś komórki CD 40 B do probówki 50 ml. Odwiruj komórki CD 40 B przez siedem minut przy 1200 RPM, co odpowiada 220 ×g.

Wymień pożywkę na pożywkę do płukania komórek B CD 40 i określ liczbę aktywowanych komórek B CD 40. Resuspenduj komórki B CD 40 w pożywce hodowlanej CD 40 B w stężeniu 1 × 10⁶ komórek/mL.

Następnie uzupełnij zawiesinę komórkową świeżym ludzkim IL-4 w stężeniu 50 units/mL oraz cyklosporyną A w stężeniu 0,63 µg/mL w celu stymulacji. Użyj naświetlanych komórek karmionek przygotowanych dzień wcześniej. Oczywiście bezpośrednio przed użyciem należy ponownie sprawdzić pod mikroskopem przyleganie naświetlanych komórek karmionek.

Jeśli komórki są adherentne, należy dwukrotnie szybko przemyć komórki karmne, podobnie jak poprzednio: raz za pomocą PBS, a następnie pożywką do płukania CD 40 B. Następnie należy ostrożnie nalać 4 ml zawiesiny CD 40 B o stężeniu 1×10⁶ komórek na ml do każdej studni płytki 6-dołkowej. Subkulturę powtarza się w identyczny sposób co trzy do czterech dni, dwa razy w tygodniu, aż do 14. dnia hodowli, aby uzyskać skupiska wysoko oczyszczonych ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD 40.

Na tym etapie komórki B CD 40 wykazują ekspresję cząsteczek kostymulujących, takich jak CD 80, CD 86, CD 83, cząsteczek MHC oraz tak zwanej triady homingu do węzłów chłonnych, obejmującej CD 62 ligand, CCR 7 i LFA 1, co można sprawdzić za pomocą przepływowej cytometrii w celu weryfikacji procesu generowania komórek. W przypadku problemów prosimy o zapoznanie się z wersją tekstową tego protokołu. Mamy nadzieję, że w przyszłości aktywowane CD 40 komórki B będą służyć jako istotne narzędzie w immunoterapii nowotworów.

Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.