Name: Używanie kraba podkowiastego, Limulus polyphemus, w badaniach nad wzrokiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Poznaj techniki elektrofizjologiczne w badaniach nad wzrokiem u kraba podkowiastego Limulus polyphemus. Metody obejmują rejestrację elektroretinograficzną, nerwu wzrokowego i wewnątrzsiatkówkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Birgit Werner za pomoc w przygotowaniu niniejszego artykułu wideo. Badania te zostały sfinansowane z grantu NSF CAREER Award.

Część 1: Przygotowanie eksperymentalne
Procedury eksperymentalne przeprowadzane na krabach podkowiastych zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) na Uniwersytecie Bostońskim. Zwierzęta są pozyskiwane z Marine Biological Labs (Woods Hole, MA) lub od innego dostawcy i utrzymywane w napowietrzanym zbiorniku z wodą słoną w pomieszczeniu z regulowanym cyklem światła i ciemności. Reżim oświetlenia jest istotny dla synchronizacji zegara okołodobowego kraba oraz codziennego przełączania oka między stanem dziennym a nocnym. Bezpośrednio przed rozpoczęciem wszelkich procedur inwazyjnych zwierzę jest schładzane w wiadrze z lodem przez 10-15 minut, aż do spowolnienia jego ruchów, a następnie unieruchamiane na drewnianej platformie za pomocą dwóch śrub ze stali nierdzewnej wkręconych w prosomę i dwóch w opistosomę. Platforma jest dociążona od spodu granitem, aby zatonęła w wodzie. Po zakończeniu eksperymentów terminalnych zwierzę jest uśmiercane poprzez ponowne zanurzenie w zawiesinie lodowej i zniszczenie mózgu, znajdującego się nad otworem gębowym, za pomocą skalpela.
Część 2: Roztwory
Roztwór Ringera dla Limulus składa się z 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9,52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21,05 mM MgSO4, 50μM TES, 50μM HEPES oraz 10ml/L mieszaniny Pen-Strep (penicylina-streptomycyna, 10000 units/ml).
Część 3: Rejestracja elektroretinogramu
Narzędzia potrzebne do tej procedury obejmują śrubokręt, wazelinę, roztwór Ringera, pipetę transferową, zieloną diodę LED, komorę rejestracyjną, śruby ze stali nierdzewnej oraz patyczek kosmetyczny.
<ol><li>Do rejestracji ERG wykorzystuje się wykonaną ręcznie komorę (Rysunek 1A). Korpus komory jest zaprojektowany tak, aby utrzymywać rezerwuar z roztworem soli w kontakcie z okiem. Pokrywa zawiera drut z chlorku srebra służący do połączenia przewodzącego roztworu z wzmacniaczem oraz mały otwór dostosowany do rozmiaru diody LED. Najlepiej sprawdza się ultrajasna dioda LED z maksimum emisji w okolicach 520nm.</li>
<li>Na początku dolną część komory pokrywa się wazeliną i mocuje nad okiem za pomocą dwóch śrub.</li>
<li>Następnie komorę wypełnia się roztworem soli i zamyka pokrywą.</li>
<li>Po zamocowaniu komory kraba umieszcza się w klatce nieprzepuszczającej światła, w zbiorniku wypełnionym wodą morską tak, aby skrzela były zanurzone.</li>
<li>Kabel diody LED wprowadza się do pokrywy komory.</li>
<li>Przewód sygnałowy przypina się do drutu z chlorkiem, a przewód referencyjny do jednej z wszczepionych śrub.</li>
<li>Oba przewody podłącza się do stopnia wejściowego wysokoimpedancyjnego wzmacniacza różnicowego (X-cell 3x4, FHC Inc) w celu wzmocnienia sygnału, a filtr wzmacniacza ustawia się na przepuszczanie częstotliwości poniżej 10Hz.</li>
<li>Wyjście ze wzmacniacza kieruje się do oscyloskopu w celu wizualizacji oraz do karty akwizycji danych w celu analizy komputerowej i zapisu.</li>
<li>Po zakończeniu konfiguracji drzwi klatki zostają zamknięte, aby zablokować dostęp światła z pomieszczenia do zwierzęcia.</li>
<li>Dane są zbierane za pomocą dedykowanego programu napisanego w LabView. Program generuje błyski diody LED, rejestruje wywołany sygnał ERG i mierzy amplitudę odpowiedzi szczyt-szczyt. Wybór paradygmatu błysków zależy od celu eksperymentu. Na przykład krótki (100ms) impuls 5V przykładany do diody LED co 10 minut pozwala uniknąć efektów adaptacji do światła podczas monitorowania zmian dobowych w czułości oka.</li></ol>
Część 4: Rejestracja z nerwu wzrokowego
Narzędzia niezbędne do przeprowadzenia tej procedury obejmują śrubokręt, nić, trepan, roztwór Ringera, kleszczyki kostne, nożyczki Vanasa, komorę rejestracyjną, pęsetę zakrzywioną, cienkie sondy igłowe, tępy skalpel, nożyczki chirurgiczne oraz elektrodę ssącą.
<ol>
<li>Do rejestracji odpowiedzi nerwu wzrokowego wykorzystywana jest komora wykonana ręcznie (Rycina 1B). Wnętrze komory stanowi otwarta studzienka o średnicy 2 cm, która w dolnej ściance posiada cienki, półkolisty otwór szczelinowy, umożliwiający wprowadzenie nerwu i jego odizolowanie od otaczających tkanek.</li>
<li>Przed przymocowaniem komory między mięśnie zawiasowe do serca wprowadza się igłę o rozmiarze 16G i odprowadza z organizmu zwierzęcia ok. 20 cc krwi. Wykrwawienie nie jest konieczne, ale ułatwia dysekcję nerwu wzrokowego.</li>
<li>Położenie nerwu wzrokowego określa się poprzez narysowanie na karapaksie lekko zakrzywionej linii między okiem bocznym a środkowym.</li>
<li>Następnie w karapaksie wycina się otwór okrągły za pomocą trepanu. Otwór ma taką samą średnicę jak studzienka komory. Środek otworu znajduje się 2-3 cm przed okiem bocznym i nieco grzbietowo względem linii, tak aby nerw biegł wzdłuż brzusznej części studzienki.</li>
<li>Tkankę łączną usuwa się do momentu, aż nerw będzie w pełni widoczny i wolny od tkanek otaczających i podścielających.</li>
<li>Nitkę nici zapętla się wokół nerwu i przeciąga do komory przez otwór w dnie. Przez ten sam otwór nerw jest delikatnie wprowadzany do komory poprzez pociąganie za nitkę. Jednocześnie studzienka komory jest wkładana do otworu. Następnie komorę przytwierdza się do karapaksu za pomocą śrub, a studzienkę wypełnia się roztworem Ringera.</li>
<li>Po przymocowaniu komory zwierzę umieszcza się w nieprzepuszczającej światła klatce w zbiorniku wypełnionym wodą morską tak, aby woda zakrywała skrzela.</li>
<li>Studzienkę ogląda się pod stereomikroskopem (SMZ-168, Jed Pella Inc), a wokół otworu w dnie układa się watę, aby zapobiec wyciekowi krwi do wnętrza komory oraz wyciekowi soli fizjologicznej na zewnątrz.</li>
<li>Pozostałą tkankę łączną wokół nerwu usuwa się za pomocą precyzyjnych nożyczek i pęsety, a komorę ponownie wypełnia się świeżym roztworem Ringera.</li>
<li>Wykonuje się nacięcie w naczyniu krwionośnym otaczającym nerw, a przez ten otwór nerw jest ostrożnie odsłaniany z osłonki na całej jego długości przy użyciu precyzyjnych nożyczek, pęsety i sond igłowych.</li>
<li>Za pomocą sondy oddziela się niewielki pęczek włókien i przecina go na końcu najdalej oddalonym od oka w celu rejestracji włókien aferentnych lub na końcu najbliższym oku w celu rejestracji włókien eferentnych. Na filmie przecinany jest koniec przeznaczony do rejestracji włókien aferentnych.</li>
<li>Do rejestracji nerwu wzrokowego używa się mikroelektrody ssącej (A-M Systems Inc) wypełnionej roztworem Ringera. Końcówkę elektrody dopasowuje się do pęczka nerwowego poprzez wypalanie końcówki kapilary borokrzemowej o średnicy 1 mm.</li>
<li>Końcówkę elektrody opuszcza się do studzienki komory za pomocą manipulatora manualnego (WPI Inc), a przecięty pęczek włókien jest zasysany do końcówki. Ssanie jest generowane przez strzykawkę Gilmont połączoną z elektrodą za pomocą rurki.</li>
<li>Złącze BNC służy jako przewód sygnałowy, a drut z chlorkiem srebra owinięty wokół elektrody w celu redukcji szumów stanowi przewód referencyjny. Oba przewody są podłączone do stopnia wejściowego wzmacniacza różnicowego w celu wzmocnienia sygnału i filtrowania szumów (X-cell 3x4, FHC Inc). Wyjście wzmacniacza jest przesyłane do oscyloskopu w celu wizualizacji oraz do karty akwizycji danych w celu analizy komputerowej i zapisu.</li>
<li>Dane są gromadzone za pomocą dedykowanego programu napisanego w LabView. Program steruje bodźcami świetlnymi za pomocą cyfrowego procesora wideo (Bits++, Cambridge Research Systems Inc) i współpracuje z cyfrowym dyskryminatorem impulsów (APM, FHC Inc), który rejestruje serie impulsów. Światło może być dostarczane do pojedynczych komórek w oku za pomocą światłowodowego światłowodu lub do całego oka za pomocą sterowanego komputerowo wyświetlacza wideo.</li>
</ol>
Część 5: Rejestracja wewnątrzsiatkówkowa
Narzędzia niezbędne do przeprowadzenia tej procedury obejmują śrubokręt, platformę z lucytu w kształcie litery L z gwintowanymi otworami na śruby, uchwyt mikroelektrody z pipetą szklaną, śruby ze stali nierdzewnej, pęsetę oraz precyzyjny skalpel.
<ol>
<li>Do rejestracji odpowiedzi wewnątrzkomórkowych wykorzystuje się ręcznie wykonaną płytkę lucytową z przygotowanymi otworami na śruby. Rozmieszczenie otworów umożliwia montaż zmotoryzowanego mikromanipulatora (PPM5000, WPI Inc). Płytkę mocuje się do zwierzęcia za pomocą dwóch śrub bocznych i jednej górnej.</li>
<li>Po przymocowaniu płytki zwierzę umieszcza się w nieprzepuszczalnej dla światła klatce, w zbiorniku wypełnionym wodą morską ponad skrzela.</li>
<li>Mikropozycjoner przykręca się do płytki, ustawiając jego ruchome ramię nad okiem.</li>
<li>Partię szklanych mikropipet wyciąga się z borokrzemianowego szkła o średnicy zewnętrznej 1 mm, a końcówki wypełnia się roztworem 3M KCl poprzez działanie kapilarne, umieszczając mikropipety w małej fiolce z tym roztworem.</li>
<li>Pozostałą część pipet wypełnia się ręcznie roztworem soli i umieszcza w uchwycie elektrody.</li>
<li>Uchwyt elektrody jest połączony z głowicą wzmacniacza wewnątrzkomórkowego (IR-283, Cygnus Technology Inc) zamocowaną do ramienia mikropozycjonera.</li>
<li>Niewielki fragment siatkówki (~1mm2) odsłania się poprzez wycięcie warstwy rogówki za pomocą żyletki.</li>
<li>Na odsłoniętą siatkówkę nanosi się kroplę roztworu Ringera, aby zapobiec wysychaniu, a następnie wprowadza końcówkę mikropipety przez otwór do tkanki siatkówki.</li>
<li>W momencie wprowadzenia końcówki do roztworu uruchamia się tryb wstrzykiwania prądu we wzmacniaczu wewnątrzkomórkowym i mierzy impedancję elektrody. Mikropipety o impedancji poza zakresem 20-70 MW są odrzucane. Te znajdujące się w tym zakresie są przesuwane o mikrokroki i wprowadzane do komórek poprzez elektroniczne lub mechaniczne wibrowanie końcówki pipety.</li>
<li>W oku można napotkać trzy typy komórek. Komórki retinularne wykazują jedynie odpowiedź depolaryzującą na światło, komórki ekscentryczne wykazują serię potencjałów czynnościowych nałożonych na odpowiedź depolaryzującą, a komórki pigmentowe nie wykazują żadnej odpowiedzi na światło.</li>
<li>Dane są zbierane za pomocą dedykowanego programu napisanego w Labview. Program steruje bodźcami świetlnymi poprzez cyfrowy procesor wideo (Bits++, Cambridge Research Systems). Bodźce są dostarczane do wkłutych komórek za pomocą światłowodu lub wyświetlacza wideo. Odpowiedzi napięciowe obserwuje się na oscyloskopie, a następnie program digitalizuje je i przesyła do komputera.</li>
</ol>
Część 6: Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywny zapis ERG przedstawiono na rysunku 2A. Kształt fali reprezentuje sumaryczną odpowiedź elektryczną na światło głównie fotoreceptorowych komórek retinularnych, ponieważ znacznie przewyższają one liczebnością komórki ekscentryczne i są z nimi sprzężone elektrycznie. W przeciwieństwie do ERG u ssaków, nie występują tutaj liczne komponenty fali pochodzące od różnych typów komórek siatkówki. Sprzężenie zwrotne rytmu okołodobowego z zegarem w mózgu Limulus moduluje właściwości fizjologiczne komórek siatkówki w cyklu dobowym, co powoduje zmienność amplitudy i przebiegu czasowego ERG w czasie (1). Jak pokazano na rysunku 2B, amplituda ERG jest najwyższa podczas subiektywnej nocy zwierzęcia, a najniższa podczas subiektywnego dnia.
Reprezentatywny zapis odpowiedzi pojedynczego włókna nerwu wzrokowego na światło przedstawiono na Rysunku 3. Komórki ekscentryczne zachowują się w podobny sposób, wykazując przejściowy wzrost częstotliwości wyładowań impulsowych, po którym następuje spadek do poziomu stabilnego. Spadek częstotliwości odzwierciedla połączone działanie adaptacji do światła oraz zależnej od impulsów samohamowania w komórkach ekscentrycznych (2). Inne wzorce impulsów, takie jak zależne od światła spadki częstotliwości, obserwuje się w mózgu Limulus, ale nie w oku (3).
Reprezentatywne zapisy odpowiedzi napięciowej komórki pigmentowej, komórki retinularnej oraz komórki ekscentrycznej na światło przedstawiono na Rysunku 4. Tylko dwa ostatnie typy komórek siatkówki są komórkami wzrokowymi. Amplituda i przebieg czasowy ich odpowiedzi zależą od jakości rejestracji oraz położenia elektrody wewnątrz komórki. Zazwyczaj elektroda penetruje komórki pigmentowe lub komórki retinularne ze względu na ich duży rozmiar i liczbę. W przypadku tych ostatnich rejestrowana jest przejściowa depolaryzacja, która zanika do poziomu stacjonarnego. Zanik ten wynika z adaptacji do światła w komórkach retinularnych (2). Jeśli elektroda wejdzie do komórki ekscentrycznej, w aksonie rejestrowane są duże potencjały czynnościowe (40-70mV), a w pobliżu somy małe potencjały czynnościowe nałożone na falę depolaryzacyjną (&lt;25mV).
<img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="Schemat elektrochemicznej diody LED; drut Ag/AgCl; widoki z góry/z boku; proces optyczny/elektrochemiczny." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 1"> Rycina 1. Schematy komór wykorzystywanych do rejestracji elektroretinogramu (A) oraz rejestracji z nerwu wzrokowego (B). Pasek odpowiada 7 mm w A i 5 mm w B.
<img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="Analiza aktywności neuronalnej, wykresy amplitudy w funkcji czasu, zmienność szczytowa, badanie elektrofizjologiczne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 2"> Rycina 2. Przykładowy zapis ERG u Limulus wywołany 100ms impulsem LED o napięciu 5V w ciemności (A) oraz fluktuacja amplitudy ERG od szczytu do szczytu w czasie w stałej ciemności (B). Ciemność wprowadzono w czasie wskazanym przez biały trójkąt. Wzrost amplitudy ERG w czasie wskazanym przez czarny trójkąt wynika z adaptacji do ciemności, która zwiększa czułość oka w ciemności. Następująca po tym cykliczna zmienność amplitudy ERG jest spowodowana wewnętrznym zegarem okołodobowym zwierzęcia. Punkty czasowe w B są rozmieszczone co 5min.
<img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="Wykres elektroencefalograficzny (EEG) pokazujący zmienność amplitudy sygnału neuronalnego w czasie." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 3"> Rycina 3. Przykładowy zapis odpowiedzi włókna nerwu wzrokowego na błysk światła skierowany na pojedynczy receptor ommatidialny. Kształt fali powyżej zapisu wskazuje czas trwania bodźca. Komórki ekscentryczne, których aksony tworzą włókna nerwowe, wykazują podobny wzorzec pobudzenia w warunkach oświetlenia zastosowanych w eksperymencie (błysk trwający 5sec w całkowitej ciemności). Kodowanie siatkówkowe za pomocą impulsów jest cechą, którą Limulus dzieli z ssakami, w przeciwieństwie do innych bezkręgowców.
<img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="Zapisy napięcia elektrofizjologicznego; panele (A-C); aktywność neuronów zarejestrowana przy różnych stymulacjach." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 4"> Rysunek 4. Przykładowe zapisy odpowiedzi napięciowej na światło trzech typów komórek występujących w boczny oku Limulus: komórki pigmentowej (A), komórki retinularnej (B) oraz komórki ekscentrycznej (C). Pierwsza komórka jest niewzrokowa. Dwie pozostałe ulegają depolaryzacji po błysku światła. Depolaryzacja jest największa w przypadku komórek retinularnych, ponieważ to one przetwarzają światło i przesyłają sygnał poprzez połączenia szczelinowe do komórki ekscentrycznej, przy pewnej utracie sygnału po drodze. W komórce ekscentrycznej widoczne są potencjały czynnościowe generowane przez akson, które nakładają się na depolaryzację z powodu wstecznej propagacji impulsów do somy. Amplituda potencjałów czynnościowych została zmniejszona na rysunku w celu lepszej widoczności potencjału depolaryzacyjnego. Potencjał spoczynkowy komórek wynosi -50mV.

<ol><li>Barlow, R. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li>
<li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li>
<li>Snodderly, D. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li>
<li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+a+neural+code+for+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li>
<li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limulus+lateral+eye%3A+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li>
<li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li>
</ol>

Przedstawiliśmy sposób przeprowadzania rejestracji ERG, rejestracji z nerwu wzrokowego oraz rejestracji wewnątrzsiatkówkowych u krabów podkowiastych in vivo. Każda z technik rejestracji dostarcza innych informacji na temat neuronalnych podstaw widzenia, a dzięki dużym oczom i twardemu pancerzowi kraba wszystkie one mogą być wykorzystane do badania funkcji siatkówki u żywych zwierząt. Przy odpowiedniej konstrukcji elektrod aktywność nerwu wzrokowego można rejestrować nawet u zwierząt swobodnie zachowujących się w oceanie ...

<table><tbody><tr><td>LED</td><td>Źródło światła</td><td>Newark Inc</td><td>33C1292</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda ssąca</td><td>Elektroda</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz sygnałów pozakomórkowych XCell 3*4-Channel</td><td>Wzmacniacz</td><td>FHC, Inc.</td><td>40-40-8B</td><td></td></tr><tr><td>Rejestracja wewnątrzkomórkowa</td><td>Wzmacniacz</td><td>Cygnus</td><td>IR-283A</td><td></td></tr><tr><td>APM</td><td>Dyskryminator impulsów neuronalnych</td><td>FHC, Inc.</td><td>APM</td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>Tablica wideo</td><td>Cambridge Research Systems</td><td>Bits++</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator Piezopatch</td><td>Mikropozycjoner</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PPM5000</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator impulsów prostokątnych</td><td>Stymulator nerwu</td><td>Technologie traw</td><td>Model S48</td><td></td></tr><tr><td>P-97</td><td>Wytciągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara z borokrzemianowego szkła</td><td>Szkło elektrodowe</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Konie&amp;#8211; krab (&lt;em&gt;Limulus polyphemus&lt;/em&gt;)</td><td>Zwierzę</td><td>Marine Biological Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikroelektrod (mikropipet)</td><td>Wytokarka do szkła</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop z zoomem</td><td>Mikroskop</td><td>Jed Pella Inc.</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie kraba podkowiastego, limulus polyphemus, w badaniach nad wzrokiem

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Amerykański krab podkucie, Limulus Polyphemus, jest jednym z najstarszych stworzeń na Ziemi, a zwierzę to nadal odgrywa niezastąpioną rolę w badaniach biomedycznych. Nie tylko ich krew zawiera specjalne komórki, których naukowcy używają do wykrywania bakteriotoksyn w lekach, ale ich oczy zawierają również sieć neuronową, która dostarczyła wielu informacji na temat procesów fizjologicznych zachodzących w naszym systemie wzrokowym, takich jak adaptacja do światła i inhibicja boczna. Krab podkucie pozostaje atrakcyjnym modelem w badaniach nad wzrokiem, ponieważ zwierzę to jest duże i wytrzymałe jak na bezkręgowca, jego neurony siatkówkowe są duże i łatwo dostępne, system wzrokowy jest kompaktowy i szeroko przebadany, a zachowanie wizualne jest dobrze zdefiniowane. Ponadto struktura i funkcja oczu są modulowane na co dzień przez zegar okołodobowy w mózgu zwierzęcia. Krótko mówiąc, system wzrokowy krabów podkucie jest wystarczająco prosty, by można go było zrozumieć, a jednocześnie na tyle złożony, by był interesujący.
W tym filmie przedstawiamy trzy paradygmaty elektrofizjologiczne służące do badania neuronowych podstaw widzenia, które można przeprowadzić in vivo u Limulus. Są to: rejestracja elektroretinogramu, rejestracja z nerwu wzrokowego oraz rejestracja wewnątrzsiatkówkowa. Rejestracja elektroretinogramu (ERG) pozwala zmierzyć za pomocą elektrody powierzchniowej sumaryczną odpowiedź elektryczną wszystkich komórek oka na błysk światła. Można ją wykorzystać do monitorowania ogólnej wrażliwości oka przez dłuższy czas. Rejestracja z nerwu wzrokowego mierzy aktywność impulsową pojedynczych włókien nerwowych za pomocą zewnątrzkomórkowej mikroelektrody ssącej. Metoda ta pozwala badać sygnały wzrokowe przesyłane z oka do mózgu, a także sygnały zegara okołodobowego przesyłane zwrotnie z mózgu do oka. Rejestracja wewnątrzsiatkówkowa mierzy za pomocą mikroelektrody wewnątrzkomórkowej wahania napięcia indukowane światłem w poszczególnych komórkach oka. Może ona służyć do wyjaśniania mechanizmów komórkowych przetwarzania w siatkówce.

W tym filmie wykonujemy zapis elektroretinogramu, zapis z nerwu wzrokowego oraz zapis wewnątrzsiatkówkowy u amerykańskiego kraba podkowiasty, Limulus Polyphemus. Te paradygmaty elektrofizjologiczne mogą być wykorzystywane do badania neuronalnych podstaw widzenia w laboratoriach badawczych lub dydaktycznych.

Wykorzystanie kraba podkowiastego, Limulus Polyphemus, w badaniach nad wzrokiem

Amerykański krab podkowy, Limulus polyphemus, jest jednym z najstarszych stworzeń na Ziemi, a zwierzę to nadal odgrywa niezbędną rolę w ...

Witajcie, jestem Chris Paglia, dyrektor Laboratorium Przetwarzania Informacji Wizualnych w Departamencie Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Bostońskim. Cześć, jestem Jacque Liu, doktorantka w laboratorium dr. Paglii. Działania badawcze naszego laboratorium są skierowane na zrozumienie obliczeń neuronalnych, które umożliwiają zwierzętom widzenie.W badaniach tych wykorzystujemy jednego z najstarszych organizmów na Ziemi – amerykańskiego kraba podkowiasty. Zwierzęta te mogą być uznane za żywe skamieniałości, a mimo to wciąż odgrywają niezastąpioną rolę w badaniach biomedycznych.Nie tylko ich krew zawiera specjalne komórki, których naukowcy używają do wykrywania toksyn bakteryjnych w naszych lekach, ale ich oczy zawierają również sieć neuronalną, która dostarczyła wielu cennych informacji na temat funkcjonowania naszego systemu wzrokowego. Podstawy komórkowe procesów takich jak adaptacja do światła i inhibicja boczna zostały po raz pierwszy ujawnione w badaniach nad złożonymi oczami bocznymi tego zwierzęcia, a za tę pionierską pracę dr Keffer Hartline otrzymał Nagrodę Nobla w 1967 roku. Krab podkowa pozostaje atrakcyjnym modelem w badaniach nad wzrokiem, ponieważ zwierzę to jest duże i wytrzymałe jak na bezkręgowca, a jego neurony siatkówki są duże i łatwo dostępne.Ich układ wzrokowy jest kompaktowy i obszernie zbadany, a zachowania wzrokowe są dobrze zdefiniowane. Co więcej, struktura i funkcja oczu są modulowane w cyklu dobowym przez zegar biologiczny w mózgu zwierzęcia. Krótko mówiąc, układ wzrokowy paginate krabów podkowiastych jest na tyle prosty, by można go było zrozumieć, a jednocześnie na tyle złożony, by był interesujący.W tym filmie przedstawimy trzy paradygmaty eksperymentalne służące do badania podstaw neurologicznych widzenia, które można przeprowadzić in vivo z wykorzystaniem tego klasycznego modelu zwierzęcego. W badaniach nad widzeniem są to: rejestracja elektroretinogramu, rejestracja z nerwu wzrokowego oraz rejestracja wewnątrzsiatkówkowa. Kraby podkowiaste są utrzymywane w napowietrzanym zbiorniku z wodą słoną w pomieszczeniu poddanym regulowanemu cyklowi światła i ciemności.Przed rozpoczęciem którejkolwiek z tych technik rejestracji, zwierzęta chłodzono w wiaderku z lodem przez około 10 minut, a następnie przymocowano do drewnianej platformy, umieszczając dwie śruby ze stali nierdzewnej w prosomie i dwie w episomie. Platforma jest dociążona od spodu granitem, aby zatunęła w wodzie. Elektroretinogram lub ERG jest wykorzystywany do monitorowania czułości oka w czasie.Metoda ta mierzy całkowitą odpowiedź elektryczną wszystkich komórek w oku. Do wywołania błysku światła w tej procedurze niezbędne są: śrubokręt, wazelina, roztwór Ringera, pipeta, dioda LED, komora rejestracyjna, śruby ze stali nierdzewnej oraz patyczek higieniczny. Do pomiaru ERG wykorzystujemy własnej roboty komorę rejestracyjną.Korpus jest zaprojektowany tak, aby utrzymywać rezerwuar soli fizjologicznej w kontakcie z okiem. Powieka zawiera drucik z chlorku srebra służący do połączenia przewodzącego roztworu z wzmacniaczem oraz niewielki otwór o rozmiarze dopasowanym do diody LED przed montażem. Spód komory jest pokryty wazeliną.Następnie komory przymocowano do oka Horseshoe crab za pomocą dwóch śrub, wypełniono solą fizjologiczną i zamknięto nakrętkami. Zwierzę umieszczono w klatce nieprzepuszczającej światła w zbiorniku wypełnionym wodą morską tak, aby skrzela były zanurzone. Kabel LED włożono do pokrywy komory.Przewód sygnałowy przypina się do drutu w komorze, a przewód referencyjny do jednej z implantowanych śrub; oba przewody są podłączone do stopnia wejściowego wysokimpedyjnego wzmacniacza różnicowego w celu wzmocnienia sygnału i filtrowania szumów. Następnie zamyka się klatkę, aby zablokować dostęp światła pomieszczenia do zwierzęcia. Stopień wejściowy jest połączony ze wzmacniaczem, a filtry wzmacniacza ustawiono tak, aby przepuszczać częstotliwości poniżej około 10 hertz.Następnie sygnał trafia do oscyloskopu w celu wizualizacji oraz do karty akwizycji danych w celu analizy komputerowej i zapisu. Używamy autorskiego programu napisanego w środowisku LabVIEW do sterowania stymulacją świetlną z diody LED oraz rejestracji sygnału ERG. Dioda LED jest wyzwalana impulsem o napięciu 5 V i czasie trwania 100 ms co 10 minut. Po lewej stronie wyświetlony jest przebieg ERG dla każdego błysku światła, a po prawej naniesiono amplitudę szczyt-szczyt kolejnych przebiegów błyskowych w celu śledzenia zmian w wrażliwości oka w czasie.Za pomocą rejestracji ERG można badać efekty adaptacji do światła oraz okołodobową modulację neuronalną. Oko przekazuje przekazy wizualne do mózgu oraz odpowiedzi impulsowe włókien nerwu wzrokowego. Zakodowane przekazy można badać poprzez pozakomórkową rejestrację z pojedynczych włókien nerwowych.W ramach tej metody można również badać sygnały zegara cyrkadiańskiego przekazywane z powrotem do oka. Narzędzia niezbędne do tej procedury obejmują śrubokręt, roztwór czyszczący, pęsety, nożyczki, komorę rejestracyjną, pęsetę zakrzywioną, cienką igłę sondy, tępy skalpel, nożyczki chirurgiczne oraz elektrodę sekcyjną. Komory rejestracyjne zaprojektowano z wypustką umożliwiającą zakotwiczenie nerwu; 20 mililitrów krwi można odprowadzić z konia, wbijając igłę o rozmiarze 16 gauge pomiędzy mięśnie zawiasowe a serce.Upuszczenie krwi nie jest konieczne, ale ułatwia wypreparowanie nerwu wzrokowego przy zwierzęciu unieruchomionym na platformie. Położenie nerwu wzrokowego określa się poprzez narysowanie lekko zakrzywionej linii na pancerzu między oczami bocznymi a środkowymi. Następnie w pancerzu wykonuje się okrągły otwór za pomocą igły.Otwór ma tę samą średnicę co dno komory. Środek otworu znajduje się około dwóch centymetrów przed boczny otwór oka i nieco grzbietowo względem linii, tak aby nerw biegł wzdłuż brzusznej części komory; usuwa się tkankę łączną pokrywającą, aż do momentu, gdy widoczna będzie pełna długość nerwu, a odsłonięty nerw zostanie uwolniony z otaczających go i podścielających go tkanek. Nitka zostaje owinięta wokół nerwu i wciągnięta do komory przez półkolisty otwór w dnie.Przez ten sam otwór nerw jest delikatnie wprowadzany do komory poprzez pociągnięcie za nić. W momencie wchodzenia nerwu do komory, jej dno jest wpychane w otwór, aby zminimalizować rozciąganie nerwu. Następnie komora zostaje przymocowana za pomocą dwóch śrub i wypełniona roztworem Ringera.Po przymocowaniu komory zwierzę umieszcza się w klatce o niskim przypływie w zbiorniku wypełnionym wodą morską tak, aby poziom wody zakrywał skrzela. Wnętrze komory ogląda się pod stereomikroskopem, a wokół otworu w dnie układa się watę, aby zapobiec wyciekowi krwi do wnętrza oraz wypływowi roztworu Ringera z komory. Komorę ponownie napełnia się świeżym roztworem Ringera.Pozostałości tkanki usuwa się za pomocą precyzyjnych nożyczek chirurgicznych i pęsety. W osłonce otaczającej nerw wykonuje się niewielkie nacięcie, a następnie za pomocą cienkiej sondy igłowej oddziela się nerw od osłonki. Osłonkę stopniowo rozwija się i usuwa, przecinając ją wzdłuż nerwu.Następnie za pomocą sondy oddziela się niewielki pęczek włókien od nerwu i przecina go na końcu najdalej oddalonym od oka w przypadku rejestracji włókien doprowadzających oraz na końcu najbliższym oka w przypadku rejestracji włókien odprowadzających. Do rejestracji wykorzystujemy elektrodę sekcyjną systemu AM wypełnioną roztworem Springera, która jest połączona drenikiem ze strzykawką Gilmana w celu wytworzenia ssania. Końcówka elektrody jest tworzona poprzez wypalanie końcówki kapilary z borokrzemianowego szkła o średnicy 1 mm. Połączenie A i B zapewnia przewód sygnałowy, a przewodem referencyjnym jest drut z chlorkiem srebra owinięty wokół elektrody w celu redukcji szumów.Końcówkę elektrody umieszcza się w komorze rejestracyjnej, a przecięty koniec pęczka nerwowego wciąga się do szklanej końcówki za pomocą ssania. Przewody sygnałowe i referencyjne podłącza się do stopnia wejściowego wzmacniacza różnicowego w celu wzmocnienia sygnału i filtrowania szumów. Wyjście wzmacniacza kieruje się do oscyloskopu w celu wizualizacji oraz do karty akwizycji danych w celu analizy komputerowej i zapisu.Do sterowania bodźcami świetlnymi wykorzystujemy autorski program napisany w środowisku LabVIEW, a do rejestracji serii potencjałów czynnościowych — cyfrowy dyskryminator impulsów. Do oświetlania pojedynczych komórek stosuje się światłowód, natomiast do stymulacji wzorcami w przypadku rejestracji z nerwu wzrokowego wykorzystywany jest sterowany komputerowo wyświetlacz wideo; umożliwia to badanie przesyłania sygnałów między oczami a mózgiem wewnątrzsiatkówkowo. Rejestracja polega na wprowadzeniu mikroelektrody bezpośrednio do komórek w oku i pomiarze wewnątrzkomórkowych fluktuacji napięcia wywołanych światłem.Narzędzia niezbędne do tej procedury obejmują śrubokręt oraz L-kształtną przezroczystą platformę. Gwintowane otwory na śruby, mikroelektrodę do umieszczenia nad elektrodą szklaną, śruby ze stali nierdzewnej, pęsetę i precyzyjny skalpel. Po unieruchomieniu kraba, zabezpieczeniu drzewa oraz drewnianej platformy, przezroczystą płytkę z fabrycznie przygotowanymi otworami na śruby przymocowuje się do nadgarstka za pomocą dwóch śrub z boku i jednej od góry.Zwierzę umieszcza się w klatce chroniącej przed światłem, w zbiorniku wypełnionym wodą morską powyżej poziomu skrzeli. Zmotoryzowany mikro pozycjoner zostaje przykręcony do podstawy za pomocą śrub, a ramię pozycjonera zostaje wyrównane nad okiem. Partia szklanych mikro pipet zostaje wykonana poprzez wyciąganie szkła krzemianowego o średnicy zewnętrznej 1 mm, a końcówki zostają wypełnione poprzez działanie kapilarne.Po umieszczeniu pipet w fiolce z 3 M roztworem chlorku potasu na kilka minut, pozostała część pipety jest napełniana ręcznie roztworem soli i wkładana do uchwytu mikroelektrody uprzednio napełnionego roztworem, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Następnie uchwyt elektrody jest wkładany do głowicy wzmacniacza wewnątrzkomórkowego przymocowanego do mikropozycjonera. Odcinek siatkówki zostaje odsłonięty poprzez ostrożne wycięcie niewielkiego, kwadratowego fragmentu grzbietowej części rogówki.Za pomocą skalpela nanosi się kroplę roztworu Ringera na odsłoniętą tkankę, aby zapobiec jej wysychaniu, a następnie przesuwa mikropipetę w kierunku siatkówki. W momencie, gdy końcówka pipety dotknie roztworu, aktywowany jest aktualny tryb wstrzykiwania wzmacniacza wewnątrzkomórkowego i mierzy się impedancję elektrody; mikropipety o impedancji spoza zakresu od 20 do 70 mega ohmów są odrzucane. Te mieszczące się w tym zakresie są przesuwane w stronę siatkówki w krokach o rozmiarze mikronów i wprowadzane do komórek poprzez elektroniczne wibrowanie końcówki; w celu wprowadzenia pipety do komórek stosuje się stymulację świetlną za pomocą światłowodu lub wyświetlacza wideo.W oku paginate kraba podkowiastego można napotkać trzy rodzaje komórek: komórki ularne, komórki ekscentryczne oraz komórki pigmentowe. Komórki ularne wykazują silną odpowiedź depolaryzacyjną na światło, komórki ekscentryczne wykazują serię potencjałów czynnościowych nałożonych na odpowiedź depolaryzacyjną, natomiast komórki pigmentowe nie wykazują żadnych odpowiedzi na światło. Odpowiedź jest obserwowana na oscyloskopie i rejestrowana za pomocą komputera podczas pomiarów wewnątrzretinalnych. Pozwala to na badanie komórkowych podstaw widzenia.Podsumowując, zaprezentowaliśmy sposób wykonywania zapisów elektroretinogramu, rejestracji z nerwu wzrokowego oraz zapisów wewnątrzsiatkówkowych u krabów podkowiastych in vivo. Metody te są powszechnie stosowane i dostarczają unikalnych informacji na temat mechanizmów neuronalnych przetwarzania informacji wzrokowej u krabów podkowiastych. Są one nie tylko proste do zastosowania w laboratorium badawczym, ale mogą zostać łatwo włączone do programu zajęć laboratoryjnych z neurofizjologii wzroku.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

using-the-horseshoe-crab-limulus-polyphemus-in-vision-research

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Za pomocą skorpiona morskiego, Limulus Polyphemus, w badaniach wzroku

Amerykański krab podkowy, Limulus polyphemus, jest prawdopodobnie najdogodniejszym źródłem dużych ilości krwi wśród wszystkich bezkręgowców. Krew ma prosty skład, z tylko jednym typem komórek w krążeniu ogólnym – amebocytem ziarnistym – oraz tylko trzema dominującymi białkami w osoczu: hemocyjaniną, białkami reaktywnymi C oraz α2-makroglobuliną. Krew pobierana jest z serca, a komórki krwi i osocze rozdziela się poprzez wirowanie.

Pobieranie krwi z amerykańskiego kraba podkowiastego, Limulus polyphemus

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Technika sekcji przedstawia enukleację oka myszy w celu utrwalenia tkanki do fenotypowania w badaniach wysokoprzepustowych.

Enukleacja oka myszy w celu zdalnego wysokoprzepustowego fenotypowania

Ten film demonstruje procedurę wewnątrzkomórkowego zapisu in vivo komórek fotoreceptorowych w oku motyla i określania czułości spektralnej poszczególnych typów komórek. Technika ta umożliwia badanie wrażliwości poszczególnych komórek fotoreceptorów na różne bodźce świetlne.

Wewnątrzkomórkowy zapis in vivo wrażliwości spektralnej komórek fotoreceptorowych u motyla

Kijanki Xenopus laevis preferują pływanie po białej stronie czarno-białego zbiornika. W tym zachowaniu kieruje się ich wizją. Opierając się na tym zachowaniu, przedstawiamy prosty test do testowania funkcji wzrokowej kijanek.

Prosty test behawioralny do badania funkcji wzrokowych u Xenopus laevis

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Elektrofizjologiczna technika zapisu wewnątrzkomórkowego jest demonstrowana i używana do określania wrażliwości spektralnej pojedynczych komórek fotoreceptorowych w złożonym oku motyla.

Wyznaczanie czułości spektralnej komórek fotoreceptorowych w modelu owadów na podstawie nagrań wewnątrzkomórkowych in vivo

Przedstawiono protokół badania desensytyzacji i odzyskiwania wrażliwości fotoreceptorów raków w funkcji czasu okołodobowego.

Odczulanie i odzyskiwanie fotoreceptorów raków po dostarczeniu bodźca świetlnego

Aby zbadać wzrok myszy, przeprowadziliśmy nadciągający test. Myszy umieszczono na dużej kwadratowej arenie z monitorem na suficie. Zbliżający się bodziec wizualny konsekwentnie wywoływał u myszy reakcje zamrożenia lub ucieczki.

Wykorzystanie zbliżających się bodźców wzrokowych do oceny wzroku myszy

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Na znieczulonych samicach krabów przeprowadzono dwa protokoły ablacji gałki ocznej (tj. kauteryzacja i styl podejścia chirurgiczne). Ablacja gałek ocznych krabów błotnych przyspieszyła dojrzewanie jajników, nie zmniejszając przy tym przeżywalności.

Ablacja gałek ocznych w celu zwiększenia dojrzewania jajników u krabów błotnych

Poznaj techniki elektrofizjologiczne w badaniach nad wzrokiem u kraba podkowiastego Limulus polyphemus. Metody obejmują rejestrację elektroretinograficzną, nerwu wzrokowego i wewnątrzsiatkówkową.

Wykorzystanie kraba podkowiastego, Limulus Polyphemus, w badaniach nad wzrokiem

Przeglądaj więcej filmów