Wykorzystanie kraba podkowiastego, Limulus Polyphemus, w badaniach nad wzrokiem

Witajcie, jestem Chris Paglia, dyrektor Laboratorium Przetwarzania Informacji Wizualnych w Departamencie Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Bostońskim. Cześć, jestem Jacque Liu, doktorantka w laboratorium dr. Paglii. Działania badawcze naszego laboratorium są skierowane na zrozumienie obliczeń neuronalnych, które umożliwiają zwierzętom widzenie.

W badaniach tych wykorzystujemy jednego z najstarszych organizmów na Ziemi – amerykańskiego kraba podkowiasty. Zwierzęta te mogą być uznane za żywe skamieniałości, a mimo to wciąż odgrywają niezastąpioną rolę w badaniach biomedycznych.

Nie tylko ich krew zawiera specjalne komórki, których naukowcy używają do wykrywania toksyn bakteryjnych w naszych lekach, ale ich oczy zawierają również sieć neuronalną, która dostarczyła wielu cennych informacji na temat funkcjonowania naszego systemu wzrokowego. Podstawy komórkowe procesów takich jak adaptacja do światła i inhibicja boczna zostały po raz pierwszy ujawnione w badaniach nad złożonymi oczami bocznymi tego zwierzęcia, a za tę pionierską pracę dr Keffer Hartline otrzymał Nagrodę Nobla w 1967 roku. Krab podkowa pozostaje atrakcyjnym modelem w badaniach nad wzrokiem, ponieważ zwierzę to jest duże i wytrzymałe jak na bezkręgowca, a jego neurony siatkówki są duże i łatwo dostępne.

Ich układ wzrokowy jest kompaktowy i obszernie zbadany, a zachowania wzrokowe są dobrze zdefiniowane. Co więcej, struktura i funkcja oczu są modulowane w cyklu dobowym przez zegar biologiczny w mózgu zwierzęcia. Krótko mówiąc, układ wzrokowy paginate krabów podkowiastych jest na tyle prosty, by można go było zrozumieć, a jednocześnie na tyle złożony, by był interesujący.

W tym filmie przedstawimy trzy paradygmaty eksperymentalne służące do badania podstaw neurologicznych widzenia, które można przeprowadzić in vivo z wykorzystaniem tego klasycznego modelu zwierzęcego. W badaniach nad widzeniem są to: rejestracja elektroretinogramu, rejestracja z nerwu wzrokowego oraz rejestracja wewnątrzsiatkówkowa. Kraby podkowiaste są utrzymywane w napowietrzanym zbiorniku z wodą słoną w pomieszczeniu poddanym regulowanemu cyklowi światła i ciemności.

Przed rozpoczęciem którejkolwiek z tych technik rejestracji, zwierzęta chłodzono w wiaderku z lodem przez około 10 minut, a następnie przymocowano do drewnianej platformy, umieszczając dwie śruby ze stali nierdzewnej w prosomie i dwie w episomie. Platforma jest dociążona od spodu granitem, aby zatunęła w wodzie. Elektroretinogram lub ERG jest wykorzystywany do monitorowania czułości oka w czasie.

Metoda ta mierzy całkowitą odpowiedź elektryczną wszystkich komórek w oku. Do wywołania błysku światła w tej procedurze niezbędne są: śrubokręt, wazelina, roztwór Ringera, pipeta, dioda LED, komora rejestracyjna, śruby ze stali nierdzewnej oraz patyczek higieniczny. Do pomiaru ERG wykorzystujemy własnej roboty komorę rejestracyjną.

Korpus jest zaprojektowany tak, aby utrzymywać rezerwuar soli fizjologicznej w kontakcie z okiem. Powieka zawiera drucik z chlorku srebra służący do połączenia przewodzącego roztworu z wzmacniaczem oraz niewielki otwór o rozmiarze dopasowanym do diody LED przed montażem. Spód komory jest pokryty wazeliną.

Następnie komory przymocowano do oka Horseshoe crab za pomocą dwóch śrub, wypełniono solą fizjologiczną i zamknięto nakrętkami. Zwierzę umieszczono w klatce nieprzepuszczającej światła w zbiorniku wypełnionym wodą morską tak, aby skrzela były zanurzone. Kabel LED włożono do pokrywy komory.

Przewód sygnałowy przypina się do drutu w komorze, a przewód referencyjny do jednej z implantowanych śrub; oba przewody są podłączone do stopnia wejściowego wysokimpedyjnego wzmacniacza różnicowego w celu wzmocnienia sygnału i filtrowania szumów. Następnie zamyka się klatkę, aby zablokować dostęp światła pomieszczenia do zwierzęcia. Stopień wejściowy jest połączony ze wzmacniaczem, a filtry wzmacniacza ustawiono tak, aby przepuszczać częstotliwości poniżej około 10 hertz.

Następnie sygnał trafia do oscyloskopu w celu wizualizacji oraz do karty akwizycji danych w celu analizy komputerowej i zapisu. Używamy autorskiego programu napisanego w środowisku LabVIEW do sterowania stymulacją świetlną z diody LED oraz rejestracji sygnału ERG. Dioda LED jest wyzwalana impulsem o napięciu 5 V i czasie trwania 100 ms co 10 minut. Po lewej stronie wyświetlony jest przebieg ERG dla każdego błysku światła, a po prawej naniesiono amplitudę szczyt-szczyt kolejnych przebiegów błyskowych w celu śledzenia zmian w wrażliwości oka w czasie.

Za pomocą rejestracji ERG można badać efekty adaptacji do światła oraz okołodobową modulację neuronalną. Oko przekazuje przekazy wizualne do mózgu oraz odpowiedzi impulsowe włókien nerwu wzrokowego. Zakodowane przekazy można badać poprzez pozakomórkową rejestrację z pojedynczych włókien nerwowych.

W ramach tej metody można również badać sygnały zegara cyrkadiańskiego przekazywane z powrotem do oka. Narzędzia niezbędne do tej procedury obejmują śrubokręt, roztwór czyszczący, pęsety, nożyczki, komorę rejestracyjną, pęsetę zakrzywioną, cienką igłę sondy, tępy skalpel, nożyczki chirurgiczne oraz elektrodę sekcyjną. Komory rejestracyjne zaprojektowano z wypustką umożliwiającą zakotwiczenie nerwu; 20 mililitrów krwi można odprowadzić z konia, wbijając igłę o rozmiarze 16 gauge pomiędzy mięśnie zawiasowe a serce.

Upuszczenie krwi nie jest konieczne, ale ułatwia wypreparowanie nerwu wzrokowego przy zwierzęciu unieruchomionym na platformie. Położenie nerwu wzrokowego określa się poprzez narysowanie lekko zakrzywionej linii na pancerzu między oczami bocznymi a środkowymi. Następnie w pancerzu wykonuje się okrągły otwór za pomocą igły.

Otwór ma tę samą średnicę co dno komory. Środek otworu znajduje się około dwóch centymetrów przed boczny otwór oka i nieco grzbietowo względem linii, tak aby nerw biegł wzdłuż brzusznej części komory; usuwa się tkankę łączną pokrywającą, aż do momentu, gdy widoczna będzie pełna długość nerwu, a odsłonięty nerw zostanie uwolniony z otaczających go i podścielających go tkanek. Nitka zostaje owinięta wokół nerwu i wciągnięta do komory przez półkolisty otwór w dnie.

Przez ten sam otwór nerw jest delikatnie wprowadzany do komory poprzez pociągnięcie za nić. W momencie wchodzenia nerwu do komory, jej dno jest wpychane w otwór, aby zminimalizować rozciąganie nerwu. Następnie komora zostaje przymocowana za pomocą dwóch śrub i wypełniona roztworem Ringera.

Po przymocowaniu komory zwierzę umieszcza się w klatce o niskim przypływie w zbiorniku wypełnionym wodą morską tak, aby poziom wody zakrywał skrzela. Wnętrze komory ogląda się pod stereomikroskopem, a wokół otworu w dnie układa się watę, aby zapobiec wyciekowi krwi do wnętrza oraz wypływowi roztworu Ringera z komory. Komorę ponownie napełnia się świeżym roztworem Ringera.

Pozostałości tkanki usuwa się za pomocą precyzyjnych nożyczek chirurgicznych i pęsety. W osłonce otaczającej nerw wykonuje się niewielkie nacięcie, a następnie za pomocą cienkiej sondy igłowej oddziela się nerw od osłonki. Osłonkę stopniowo rozwija się i usuwa, przecinając ją wzdłuż nerwu.

Następnie za pomocą sondy oddziela się niewielki pęczek włókien od nerwu i przecina go na końcu najdalej oddalonym od oka w przypadku rejestracji włókien doprowadzających oraz na końcu najbliższym oka w przypadku rejestracji włókien odprowadzających. Do rejestracji wykorzystujemy elektrodę sekcyjną systemu AM wypełnioną roztworem Springera, która jest połączona drenikiem ze strzykawką Gilmana w celu wytworzenia ssania. Końcówka elektrody jest tworzona poprzez wypalanie końcówki kapilary z borokrzemianowego szkła o średnicy 1 mm. Połączenie A i B zapewnia przewód sygnałowy, a przewodem referencyjnym jest drut z chlorkiem srebra owinięty wokół elektrody w celu redukcji szumów.

Końcówkę elektrody umieszcza się w komorze rejestracyjnej, a przecięty koniec pęczka nerwowego wciąga się do szklanej końcówki za pomocą ssania. Przewody sygnałowe i referencyjne podłącza się do stopnia wejściowego wzmacniacza różnicowego w celu wzmocnienia sygnału i filtrowania szumów. Wyjście wzmacniacza kieruje się do oscyloskopu w celu wizualizacji oraz do karty akwizycji danych w celu analizy komputerowej i zapisu.

Do sterowania bodźcami świetlnymi wykorzystujemy autorski program napisany w środowisku LabVIEW, a do rejestracji serii potencjałów czynnościowych — cyfrowy dyskryminator impulsów. Do oświetlania pojedynczych komórek stosuje się światłowód, natomiast do stymulacji wzorcami w przypadku rejestracji z nerwu wzrokowego wykorzystywany jest sterowany komputerowo wyświetlacz wideo; umożliwia to badanie przesyłania sygnałów między oczami a mózgiem wewnątrzsiatkówkowo. Rejestracja polega na wprowadzeniu mikroelektrody bezpośrednio do komórek w oku i pomiarze wewnątrzkomórkowych fluktuacji napięcia wywołanych światłem.

Narzędzia niezbędne do tej procedury obejmują śrubokręt oraz L-kształtną przezroczystą platformę. Gwintowane otwory na śruby, mikroelektrodę do umieszczenia nad elektrodą szklaną, śruby ze stali nierdzewnej, pęsetę i precyzyjny skalpel. Po unieruchomieniu kraba, zabezpieczeniu drzewa oraz drewnianej platformy, przezroczystą płytkę z fabrycznie przygotowanymi otworami na śruby przymocowuje się do nadgarstka za pomocą dwóch śrub z boku i jednej od góry.

Zwierzę umieszcza się w klatce chroniącej przed światłem, w zbiorniku wypełnionym wodą morską powyżej poziomu skrzeli. Zmotoryzowany mikro pozycjoner zostaje przykręcony do podstawy za pomocą śrub, a ramię pozycjonera zostaje wyrównane nad okiem. Partia szklanych mikro pipet zostaje wykonana poprzez wyciąganie szkła krzemianowego o średnicy zewnętrznej 1 mm, a końcówki zostają wypełnione poprzez działanie kapilarne.

Po umieszczeniu pipet w fiolce z 3 M roztworem chlorku potasu na kilka minut, pozostała część pipety jest napełniana ręcznie roztworem soli i wkładana do uchwytu mikroelektrody uprzednio napełnionego roztworem, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Następnie uchwyt elektrody jest wkładany do głowicy wzmacniacza wewnątrzkomórkowego przymocowanego do mikropozycjonera. Odcinek siatkówki zostaje odsłonięty poprzez ostrożne wycięcie niewielkiego, kwadratowego fragmentu grzbietowej części rogówki.

Za pomocą skalpela nanosi się kroplę roztworu Ringera na odsłoniętą tkankę, aby zapobiec jej wysychaniu, a następnie przesuwa mikropipetę w kierunku siatkówki. W momencie, gdy końcówka pipety dotknie roztworu, aktywowany jest aktualny tryb wstrzykiwania wzmacniacza wewnątrzkomórkowego i mierzy się impedancję elektrody; mikropipety o impedancji spoza zakresu od 20 do 70 mega ohmów są odrzucane. Te mieszczące się w tym zakresie są przesuwane w stronę siatkówki w krokach o rozmiarze mikronów i wprowadzane do komórek poprzez elektroniczne wibrowanie końcówki; w celu wprowadzenia pipety do komórek stosuje się stymulację świetlną za pomocą światłowodu lub wyświetlacza wideo.

W oku paginate kraba podkowiastego można napotkać trzy rodzaje komórek: komórki ularne, komórki ekscentryczne oraz komórki pigmentowe. Komórki ularne wykazują silną odpowiedź depolaryzacyjną na światło, komórki ekscentryczne wykazują serię potencjałów czynnościowych nałożonych na odpowiedź depolaryzacyjną, natomiast komórki pigmentowe nie wykazują żadnych odpowiedzi na światło. Odpowiedź jest obserwowana na oscyloskopie i rejestrowana za pomocą komputera podczas pomiarów wewnątrzretinalnych. Pozwala to na badanie komórkowych podstaw widzenia.

Podsumowując, zaprezentowaliśmy sposób wykonywania zapisów elektroretinogramu, rejestracji z nerwu wzrokowego oraz zapisów wewnątrzsiatkówkowych u krabów podkowiastych in vivo. Metody te są powszechnie stosowane i dostarczają unikalnych informacji na temat mechanizmów neuronalnych przetwarzania informacji wzrokowej u krabów podkowiastych. Są one nie tylko proste do zastosowania w laboratorium badawczym, ale mogą zostać łatwo włączone do programu zajęć laboratoryjnych z neurofizjologii wzroku.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.