Produkcja bibliotek genomicznych z dużymi wkładkami środowiskowymi

Cześć, jestem Marcus i pracuję w laboratorium Stevena Helma na Wydziale Mikrobiologii i Immunologii Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę budowy dużej biblioteki środowiskowej wkładki. W dzisiejszej procedurze pomaga mi San Lee, która będzie przeprowadzać pakowanie fagów i infekcję hosta bibliotecznego E. coli, a także Elise Hawley i Chin Yang, którzy będą przeprowadzać pobieranie kolonii.

Mamy tę procedurę w naszym laboratorium do badania struktury i metabolizmu społeczności mikrobiologicznych w środowiskach morskich i lądowych. Więc zacznijmy. Ten protokół tworzenia biblioteki DNA dla smid rozpoczyna się po procedurach izolacji i ścinania genomowego DNA z próbek biomasy, które szczegółowo opisaliśmy w dołączonych artykułach.

Kolejne kilka kroków przygotowuje DNA SHE do ligacji do wektora SMID PCC. Pierwszym krokiem jest naprawa końców fragmentów DNA SHE i fosforylacji. Pięć głównych końców, wszystkie odczynniki niezbędne do tego etapu są zawarte w zestawie produkcyjnym biblioteki PCC jeden SMID z epicentrum w celu ustawienia reakcji naprawy końcowej, rozmrożenia wszystkich odczynników na lodzie, a następnie połączenia buforu naprawy końcowej DNTP, wymieszania TP do 20 mikrogramów wstawienia DNA przy 0,5 mikrograma na mikrolitr mieszanki enzymów i wody Aby osiągnąć 80 mikrolitrów, krótko odwiruj probówkę, aby dostarczyć całą ciecz do dno.

Inkubować końcową reakcję naprawy w temperaturze pokojowej przez 45 minut do godziny. Następnie podgrzeje, dezaktywuje enzymy w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Podczas końcowej inkubacji naprawczej możesz przygotować żel do następnego kroku.

Elektroforeza żelowa w polu pulsacyjnym lub PFGE, Twoim celem jest wyizolowanie cząsteczek DNA w zakresie od 30 do 60. Kilozasady PFGE to elektroforetyczna metoda rozdzielania tych dużych fragmentów, które biegną razem podczas standardowej elektroforezy. Na początek przygotuj 1% żel przy użyciu niskotopliwego aros w 150 mililitrach jednego buforu do biegania XTAE.

Wybierz grzebienie, które pozwolą Ci załadować całą 80-mikrolitrową próbkę DNA naprawy końcówki wraz z buforem ładującym do jednej lub dwóch studzienek. Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z żelem jako niskotopliwymi żelami agros. Bardzo łatwo się łamie, gdy żel krzepnie.

Przygotuj komorę do elektroforezy. Dodaj 2,2 litra jednego XTAE do komory i włącz maszynę, aby wprowadzić cyrkulację uruchomionego bufora. Ustaw urządzenie chłodzące na 14 stopni Celsjusza i ustaw pompę na 70 obr./min.

Dołącz marker PFG średniego zasięgu, również z NEB. Aby uniknąć zbyt wysokiego przecięcia żelu, wyciśnij aros ze strzykawki z żelem i przetnij skalpelem małą zatyczkę od końca. Umieść korek z przodu studni i uszczelnij stopionym arosem.

Upewnij się, że uruchomiony bufor ostygł do 14 stopni Celsjusza przed załadowaniem żelu. W pierwszej studni załaduj pięć mikrolitrów New England Biolabs Lambda Hindi trzy trawienie. W drugiej studzience załadować jeden mikrolitr znacznika wielkości kontrolnej Smid rozcieńczony w 10 mikrolitrach sterylnej wody plus bufor ładujący.

Następnie załaduj naprawioną i inaktywowaną termicznie mieszankę plus bufor ładujący. Zamknij pokrywę i zaprogramuj maszynę. Żel będzie działał przez noc lub 12 godzin.

Kiedy żel skończy działać, użyj plamy z cyber złota, aby uwidocznić, jak DNA rozcieńcza cyber złoto. W 250 mililitrach jednego XTAE umieść żel w roztworze i barwij przez godzinę w ciemności cyberg gold jest wrażliwy na światło, podczas gdy żel plami. Przygotuj łaźnię wodną o temperaturze 70 stopni Celsjusza i jednej F 45 stopni Celsjusza do następnego etapu ekstrakcji żelu.

Kolejnym krokiem jest akcyza i żelowanie. Oczyść DNA w pożądanym zakresie wielkości od 30 do 60 kilozasad. Weź poplamiony żel razem z pustą, podartą i opisaną tubką do mikro podstępu i sterylnym skalpelem do transluminatora światła niebieskiego.

Wyłóż transluminator folią, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego żelu. Zapal okulary i włącz niebieskie światło. Teraz możesz zobaczyć swój koniec naprawionego genomowego DNA i marker wielkości kontrolnej FO smid Za pomocą skalpela wytnij plasterek żelu o szerokości od pięciu do siedmiu milimetrów, który migrował wraz ze znacznikiem wielkości smid control i nieco powyżej niego.

Użyj znacznika PFG jako górnej granicy swojego plasterka. Przenieś plasterek do oderwanej rurki. Przed kontynuowaniem możesz przechowywać plastry w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do jednego roku.

Teraz nadszedł czas na żelowanie. Oczyść DNA ze swojego kawałka. Zważ tubkę zawierającą plasterek żelu i oblicz wagę plasterka, odejmując wagę rozdarcia.

Następnie rozpuść plasterek w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Po całkowitym stopieniu plastra żelu szybko przenieś probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza. Należy pamiętać, że jeden miligram stałego żelu ma objętość jednego mikrolitra po stopieniu.

Dodać jedną jednostkę lub jeden mikrolitr preparatu enzymatycznego Jase na 100 mikrolitrów stopionego aros. Inkubować w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie dodaj jeszcze dwa do czterech mikrolitrów i inkubuj w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez godzinę więcej ciepła.

Dezaktywuj żel w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 10 minut po podgrzaniu. Dezaktywując enzym, umieść probówkę na lodzie na 10 minut, a następnie odwiruj z maksymalną prędkością. 13 000 obr./min przez 15 minut, aby granulować wszelkie nierozpuszczalne cząstki.

Uważając, aby nie naruszyć pelletu. Usuń górny supernatant zawierający oczyszczone DNA i przenieś go do 15-mililitrowej probówki sokoła. Następnie przelej go trzema mililitrami sterylnej wody obok, aby umyć i skoncentrować DNA.

Przenieś roztwór z 15-mililitrowej rurki Falcon do czteroodśrodkowego zespołu filtrującego Ancon Ultra z membraną ultra cell 10. Umieść jednostkę filtrującą w wahadłowym wirniku kubełkowym, używając 50-mililitrowej rurki falcon jako adaptera i wiruj z prędkością 4 000 GS przez sześć do ośmiu minut. Odwirować do około 100 do 500 mikrolitrów roztworu.

Pozostań na filtrze i wyrzuć przepływ. Następnie dodaj kolejne trzy mililitry sterylnej wody do pustej probówki sokoła. Przenieść roztwór do probówki Amona i powtórzyć etap wirowania.

Umyj rurkę sokoła po raz trzeci i zmniejsz końcową objętość zebraną na filtrze do 50 do 100 mikrolitrów. Nie musisz się martwić, że zgubisz próbkę. Filtr zatrzyma 50 mikrolitrów cieczy nawet po dłuższym wirowaniu.

Przenieś pozostały roztwór DNA z probówki AmCon do wstępnie umytego filtra odśrodkowego MicroCon YM 50 i przepłucz probówkę Amon dodatkowymi 50 mikrolitrami sterylnej wody, aby odzyskać całą wirówkę DNA. Filtr odśrodkowy MicroCon YM 50 w mikrowirówce przy 10 000 GS, aż filtr będzie nadal lekko pokryty cieczą. Sprawdzaj co minutę.

Jeśli na filtrze pozostała tylko niewielka ilość płynu. Odwróć filtr do góry nogami i odzyskaj roztwór DNA przez drugi etap wirowania w temperaturze 1000 GS przez trzy minuty w świeżej probówce do mikrowirówki. Uzyskana objętość nie powinna przekraczać łącznie od 10 do 15 mikrolitrów.

W przeciwnym razie twoje DNA może być zbyt rozcieńczone do podwiązania. Sprawdź stężenie otrzymanego roztworu DNA za pomocą testu NanoDrop lub Pico Green. Odzyskany i naprawiony.

DNA jest teraz gotowe do ligacji do jednego wektora klonowania FO SMID PCC w celu rozmrożenia wszystkich odczynników na lodzie. Następnie łączymy w podanej tutaj kolejności, mieszając po każdym dodaniu. Najpierw dodaj sterylną wodę, aby osiągnąć objętość reakcji 10 mikrolitrów.

Następnie 10 x bufor ligacji szybkiego łącza, 10 milimolowy A-T-P-P-C-C jeden wektor SMID i wstaw w stosunku 10 do jednego mola. I wreszcie szybkie łącze DNA Ligaze. Krótko odwiruj probówkę, aby cały płyn opadł na dno.

Dotknij rurki i ponownie zakręć. Inkubować reakcję ligacji w temperaturze pokojowej przez dwie godziny i podgrzewać, dezaktywować enzym przez 10 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza. W tym momencie możesz albo przechowywać reakcję ligacji w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, albo przejść do etapu pakowania faga.

Następnym krokiem jest wygenerowanie fagów bakteryjnych, które będą działać w celu wprowadzenia biblioteki FO SMID do E. coli na dwa lub trzy dni przed planowanym wykonaniem etapu pakowania fagów, rozwarstwienie dostarczonego EPI 300 T jeden oporny szczep posiewu na zwykłej płytce LB i inkubacja przez noc w temperaturze 37 do stopni Celsjusza w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Możesz uszczelnić tę płytkę i przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Dzień przed reakcjami pakowania zaszczepij 50 mililitrów bulionu Albee plus 10 milimolowy siarczan magnezu pojedynczą kolonią z płytki Epi 300 Wstrząsaj przez noc przy 225 obr./min i 37 stopniach Celsjusza.

W dniu reakcji pakowania zaszczepić świeży 50-mililitrowy bulion LB plus 10-milimolowy siarczan magnezu pięcioma mililitrami nocnej kultury. Hodowla, bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza do OD 600 od 0,8 do 1,0. Nie przekraczaj OD 600 1.0.

Rozcieńczyć próbkę przed pomiarem na spektrofotometrze, aby uzyskać dokładny wynik. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będziesz gotowy do kontynuowania lub do 72 godzin. Teraz, gdy bakterie są gotowe do infekcji, nadszedł czas, aby przygotować rozmrażanie fagów.

Maksymalne blaszki Lambda Packaging ekstrahuje na lodzie. Używając jednej probówki na reakcję podwiązania, rozmrażanie zajmie około 10 do 15 minut. W międzyczasie ponownie schłodź pustą probówkę o pojemności 1,5 mililitra na lodzie, używając jednej probówki na reakcję.

Po rozmrożeniu ekstraktów z opakowań Lambda natychmiast przenieś do 25 mikrolitrów każdego ekstraktu opakowaniowego do wstępnie schłodzonej 1,5-mililitrowej rurki mikrofuge i umieść na lodzie. Ekstrakt z pozostałego opakowania należy przywrócić do temperatury minus 80 stopni Celsjusza. Zbyt długie pozostawianie rozmrożonych ekstraktów opakowaniowych na lodzie zmniejszy skuteczność infekcji.

Następnie dodać 10 mikrolitrów reakcji ligacji do każdych 25 mikrolitrów rozmrożonych ekstraktów na lodzie zmieszanych przez kilkakrotne pipetowanie roztworu bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Krótko odwirować w celu konsolidacji całej cieczy na dnie probówek i inkubować reakcje pakowania w łaźni wodnej o temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 90 minut. Po 80 minutach inkubacji rozmrozić pozostały ekstrakt opakowaniowy na lodzie.

Po zakończeniu 90-minutowej reakcji pakowania dodać pozostałe 25 mikrolitrów ekstraktu opakowaniowego do każdej probówki reakcyjnej. Inkubuj reakcje przez dodatkowe 90 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po drugiej inkubacji dodać 100 mikrolitrów przygotowanego buforu rozcieńczającego fagi do każdej probówki zbiorczej i delikatnie wymieszać, dodać pięć mikrolitrów chloroformu do każdej probówki.

Teraz powinieneś mieć całkowitą objętość 165 mikrolitrów w tubie. Po edycji chloroformu może powstać lepki osad. Należy unikać tego osadu, jak również organicznej fazy chloroformowej podczas pipetowania cząstek fagowych.

W tym momencie można przechowywać zapakowane cząstki faga w temperaturze czterech stopni przez kilka dni, jeśli to konieczne, ale aby uzyskać najlepsze wyniki, należy użyć świeżo przygotowanego faga. Teraz jesteś gotowy do zainfekowania komórek gospodarza, które dorastałeś przez wszystkie etapy pakowania faga za pomocą zapakowanego faga. Dodać pakowany do EPI 300 T jednej opornej komórki gospodarza OD 600,8 do 1,0 w stosunku 400 mikrolitrów epi 300 T jedna oporna komórka na każde 10 mikrolitrów cząstek fagowych.

Aby uniknąć pipetowania chloroformu z dna probówki z zapakowanym fagiem, używamy 125 mikrolitrów zapakowanych cząstek faga i pięciu mililitrów przygotowanych epi 300 T one odpornych komórek gospodarza delikatnie zmieszanych, a następnie inkubujemy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnym krokiem jest określenie miana zapakowanego faga. Odbywa się to poprzez posiew zainfekowanych bakterii na pożywce, aby wybrać zainfekowane komórki.

Następnie liczenie powstałych kolonii i dzielenie przez objętość faga dodanego do bakterii, które platerowałeś. SMID C one zawiera gen oporności na chloramfenikol. Tak więc, aby wybrać zainfekowane klony, umieść bakterie na płytkach LB zawierających chloramfenikol.

Rozprowadzić dwa razy 50 mikrolitrów i dwa razy 10 mikrolitrów zakażonych fagami EPI 300 T jeden oporne komórki na czterech oddzielnych płytkach i umieścić płytki do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 16 do 24 godzin, nie dłużej niż 48 godzin, aż utworzą się kolonie. W międzyczasie zbierz resztki EPI 300 T one odporne komórki z pięciomililitrowej infekcji przez wirowanie w temperaturze 3 500 GS przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant.

Dodaj jeden mililitr LB z 20% glicerolem do resusu probówki. Zawiesić osad komórkowy i przykuść do 100 mikrolitrów każdy w dwóch mililitrowych probówkach z fiolkami kriogenicznymi, natychmiast zamrozić i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W celu dalszego wykorzystania na etapie pobierania kolonii następnego dnia policz liczbę klonów na czterech płytkach w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i określ miano zapakowanego faga, którego użyjesz w następnym kroku.

Zamrożony EPI 300 T jeden odporny zapas glicerolu zawiera komórki transdukowane wszystkimi różnymi plazmidami z Twojej biblioteki. Następnie rozprowadź odpowiednią ilość w oparciu o miano wirusa i rozmiar płytki każdego smida. Klonuj na kwadracie o wymiarach 2 45 na 2 45 milimetrów.

Płytki do oznaczania biologicznego LB z chloramfenikolem przy użyciu kulek szklanych. Dodaj również niewielką ilość bulionu LB na talerz, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Należy pamiętać, że przygotowanie bulionu glicerolowego dodatkowo koncentruje komórki około pięciokrotnie.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny w dniach zbioru kolonii, przygotować 96 lub 3 84-dołkowe płytki wypełnione 200 mikrolitrami lub 70 mikrolitrami na studzienkę bulionu LB. Uzupełniony 12,5 mikrograma chloramfenikolu na mililitr bulionu do wyboru antybiotyków i 10% glicerolu do zamrażania. Na tym etapie używamy zautomatyzowanego systemu napełniania trzech płytek qfi.

Następnym krokiem jest pobranie kolonii z przygotowanych płytek LB CHLORAMPHENICOL do przygotowanych 96 lub 3 84-dołkowych płytek w celu zamrożenia. Na tym etapie używamy robota do zbierania klonów qix two, zgodnie z instrukcją obsługi, aby stworzyć sterylne środowisko wokół obszaru pobierania klonów. Włącz światło UV na 30 minut, gdy światło UV jest włączone.

Przygotuj 500 mililitrów 1% wybielacza, 500 mililitrów sterylnej wody dejonizowanej i 500 mililitrów 80% etanolu. Gdy światło UV zgaśnie, napełnij tace zgodnie z etykietą od tyłu do przodu. Wlej 1% wybielacz, a następnie autoklaw wodę dejonizowaną i 80% etanolu na przedniej tacy.

Upewnij się, że są pełne, ponieważ igieł do pobierania nie można prawidłowo umyć bez wystarczającej ilości roztworu do mycia. Po ustawieniu parametrów optymalnego pobierania, zdejmij pokrywki z płytek bakteryjnych i płytek wypełnionych LB 96 lub 3 84 dołków i umieść je między słupkami w pobrakach Q. Płyty obszaru roboczego powinny przylegać do prawego przedniego rogu, aby nie mogły się przesuwać podczas pobierania.

Następnie zamknij panel przedni. Po ustawieniu wszystkich parametrów można rozpocząć procedurę kompletacji. Po zakończeniu zbierania opłucz szczotki i tace wodą dejonizowaną i połóż na stole do wyschnięcia.

Usuń wszelkie wycieki, które mogły się zdarzyć i wytrzyj wnętrze CICS 80% etanolem. Upewnij się, że wszystkie płytki podstawowe z glicerolem są oznaczone i umieść je w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny, aby wyhodować kulturę z każdej pobranej kolonii. Zostaw notatkę na inkubatorze, która zawiera datę, liczbę inkubowanych płytek, czas inkubacji, czas usunięcia i swoje inicjały.

Po inkubacji masz swoją bibliotekę. Każda studzienka zawiera kulturę jednego klonu bakteryjnego zawierającego PCC, jeden z nasienką podwiązaną do jednego fragmentu czystego DNA z próbki wyjściowej. Zamroź talerze w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania i pogratuluj sobie dobrze wykonanej pracy.

Prezentowany protokół opisuje procedurę generowania biblioteki środowiskowej smid w celu uchwycenia zawartości genetycznej zbiorowiska drobnoustrojów w danym siedlisku. Protokół ten powinien utworzyć bibliotekę SMID, która jest reprezentatywna dla zawartości genetycznej próbkowanego środowiska i powinna umożliwić czytnikowi optymalizację krytycznych kroków. Jeśli ilość klonów FO smid uzyskanych pod koniec całej procedury jest zbyt niska.

Właśnie pokazaliśmy, jak skonstruować bibliotekę FO SMID z genomowego DNA pochodzącego z próbki wody morskiej. Wykonując tę procedurę, ważne jest, aby zacząć od genomowego DNA wysokiej jakości. Przed rozpoczęciem przygotuj wszystkie płytki i odczynniki i zaplanuj wystarczająco dużo czasu na ten wieloetapowy proces.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.