Tworzenie środowiskowej biblioteki genomicznej z dużymi insertami

Cześć, nazywam się Marcus i pracuję w laboratorium Stevena Helma w Departamencie Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia biblioteki środowiskowej z dużymi wkładkami. Pomagać mi będzie San Lee, która przeprowadzi pakowanie fagów i infekcję gospodarza biblioteki e coli, a także Elise Hawley i Chin Yang, które zajmą się wybieraniem kolonii.

W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania struktury i metabolizmu społeczności mikroorganizmów w środowiskach morskich i lądowych. Zacznijmy zatem. Niniejszy protokół tworzenia biblioteki DNA fosmidów jest kontynuacją procedur izolacji i fragmentacji genomowego DNA z próbek biomasy, które szczegółowo opisaliśmy w towarzyszących artykułach JoVE.

Kolejne kroki przygotowują DNA SHE do ligacji do wektora SMID PCC one. Pierwszym krokiem jest naprawa końców fragmentów DNA SHE oraz ich fosforylacja końców 5'. Wszystkie odczynniki niezbędne do tego etapu znajdują się w zestawie do produkcji biblioteki PCC one SMID od firmy Epicentre. Aby przygotować reakcję naprawy końców, rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie, a następnie połączyć bufor do naprawy końców, dNTP, kNTP, do 20 µg insertu DNA SHE w stężeniu 0,5 µg/µL, mieszankę enzymów oraz wodę, aby uzyskać objętość 80 µL. Krótko odwiruj probówkę, aby cały płyn zebrał się na dnie.

Inkubuj reakcję naprawy końców w temperaturze pokojowej od 45 minut do godziny. Następnie podgrzej próbkę, aby inaktywować enzymy w temperaturze 70 °C przez 10 minut. W czasie inkubacji naprawy końców można przygotować żel do następnego etapu.

W pulsacyjnej elektroforezie żelowej (PFGE) celem jest wyizolowanie cząsteczek DNA o wielkości od 30 do 60 kb. PFGE jest metodą elektroforetyczną pozwalającą na rozdzielenie tych dużych fragmentów, które podczas standardowej elektroforezy migrują razem. W pierwszej kolejności przygotuj 1% żel, używając agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 150 ml buforu do elektroforezy 1XTAE.

Należy wybrać grzebienie, które pozwolą na załadowanie całej 80 µL próbki DNA po naprawie końców wraz z buforem do ładowania do jednego lub dwóch dołków. Należy zachować szczególną ostrożność podczas manipulowania żelem, ponieważ żele agarozowe o niskiej temperaturze topnienia bardzo łatwo pękają w trakcie krzepnięcia.

Przygotuj komorę elektroforetyczną. Wlej do komory 2,2 litra buforu 1X TAE i włącz urządzenie, aby rozpocząć cyrkulację buforu roboczego. Ustaw urządzenie chłodzące na 14 °C, a pompę na 70 RPM.

Dołącz marker PFG o średnim zakresie również firmy NEB. Aby uniknąć zbyt wysokiego wycięcia żelu, wyciśnij agarozę z strzykawki do żelu i odetnij skalpelem mały korek z końca. Umieść korek z przodu studni i uszczelnij go stopioną agarozą.

Przed nałożeniem próbek na żel upewnij się, że bufor do elektroforezy schłodził się do 14 °C. Do pierwszej studzienki nałóż 5 µL trawienia Lambda Hindi III od New England Biolabs. Do drugiej studzienki nałóż 1 µL markera wielkości Smid control rozcieńczonego w 10 µL sterylnej wody z dodatkiem buforu do nakładania próbek.

Następnie nanieś mieszaninę po naprawie końców i inaktywacji termicznej z dodatkiem buforu do nakładania. Zamknij pokrywę i zaprogramuj urządzenie. Elektroforeza powinna trwać przez noc lub przez 12 godzin.

Po zakończeniu elektroforezy żelu, w celu wizualizacji DNA należy zastosować barwnik Cyber Gold; rozcieńcz Cyber Gold w 250 ml 1x TAE. Umieść żel w roztworze i barw przez jedną godzinę w ciemności, ponieważ Cyber Gold jest światłoczuły. W czasie barwienia żelu przygotuj łaźnię wodną o temperaturze 70 °C oraz 45 °C na potrzeby następnego etapu, czyli wycinania żelu.

Kolejnym krokiem jest wycięcie i żelowanie. Oczyść DNA w żądanym zakresie wielkości od 30 do 60 kilobaz. Zabierz zabarwiony żel wraz z pustą, otwartą i opisaną probówką typu microcentrifuge oraz sterylnym skalpelem do transiluminatora z niebieskim światłem.

Wyłóż transluminator folią spożywczą, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej żelu. Załóż okulary ochronne i włącz światło niebieskie. Teraz można zobaczyć naprawione genomic DNA oraz marker wielkości FO smid control. Za pomocą skalpela wytnij fragment żelu o szerokości od pięciu do siedmiu milimetrów, który przemieścił się na poziomie i nieco powyżej markera wielkości smid control.

Użyj markera PFG jako górnej granicy warstwy. Przenieś warstwę do probówki typu tear-off. Warstwy można przechowywać w temperaturze -20 °C do jednego roku przed przystąpieniem do dalszych etapów.

Nadszedł czas na elektroforezę. Oczyść DNA z wyciętego fragmentu żelu. Zważ probówkę zawierającą fragment żelu i oblicz masę wycinka, odejmując masę tary.

Następnie rozpuść fragment żelu w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C przez 10 do 15 minut. Po całkowitym rozpuszczeniu fragmentu żelu szybko przenieś probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 45 °C. Należy pamiętać, że jeden miligram stałego żelu po rozpuszczeniu ma objętość jednego mikrolitra.

Do 100 µL roztopionego aros dodaj jedną jednostkę lub 1 µL preparatu enzymu Jase. Inkubuj w temperaturze 45 °C przez jedną godzinę. Następnie dodaj od 2 do 4 µL więcej les i inkubuj ponownie w temperaturze 45 °C przez kolejną godzinę.

Po podgrzaniu dezaktywować żel w temperaturze 70 °C przez 10 minut. W celu inaktywacji enzymu umieścić probówkę na lodzie na 10 minut, a następnie odwirować z maksymalną prędkością 13 000 RPM przez 15 minut, abyt stworzyć osad z nierozpuszczalnych cząstek.

Należy uważać, aby nie zakłócić osadu. Usunąć górną warstwę nadpływu zawierającą oczyszczone DNA i przenieść ją do probówki Falcon o pojemności 15 mililitrów. Następnie rozcieńczyć ją trzema mililitrami sterylnej wody, aby wyprać i skoncentrować DNA.

Przenieś roztwór z 15 ml probówki Falcon do jednostki filtra odśrodkowego Ancon Ultra four z membraną ultra cell 10. Umieść jednostkę filtra w rotorze z koszyczkami wahadłowymi, używając 50 ml probówki Falcon jako adaptera, i wiruj przy 4 000 GS przez sześć do ośmiu minut. Odśrodkowuj do momentu, aż w probówce pozostanie około 100 do 500 µL roztworu.

Pozostaw osad na filtrze i odrzuć ciecz przefiltrowaną. Następnie dodaj kolejne trzy mililitry sterylnej wody do pustej probówki typu Falcon. Przenieś roztwór do probówki Amona i powtórz etap wirowania.

Przemyj probówkę typu Falcon po raz trzeci i zredukuj końcową objętość zebraną na filtrze do 50–100 µL. Nie należy obawiać się utraty próbki. Filtr zatrzyma 50 µL cieczy nawet po przedłużonym wirowaniu.

Przenieś pozostały roztwór DNA z probówki AmCon do uprzednio przemytej jednostki filtra odśrodkowego MicroCon YM 50 i przepłucz probówkę AmCon dodatkowymi 50 µL sterylnej wody, aby odzyskać cały DNA do wirowania. Wirować jednostkę filtra odśrodkowego MicroCon YM 50 w mikrowirowarce przy 10 000 ×g, aż filtr będzie wciąż lekko pokryty cieczą. Kontrolować co minutę.

Jeśli na filtrze pozostała tylko niewielka ilość cieczy, należy odwrócić filtr do góry dnem i odzyskać roztwór DNA poprzez drugi etap wirowania przy 1000 GS przez trzy minuty w nowej probówce do mikrowirowania. Otrzymana objętość nie powinna przekraczać łącznie 10 do 15 microliters.

W przeciwnym razie DNA może być zbyt rozcieńczone do ligacji. Sprawdź stężenie otrzymanego roztworu DNA za pomocą NanoDrop lub testu Pico Green. Odzyskane i naprawione.

DNA jest teraz gotowy do ligacji z wektorem klonującym PCC one FO SMID; przed przystąpieniem do ligacji należy rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie. Następnie należy połączyć je w podanej kolejności, mieszając po każdym dodaniu. W pierwszej kolejności dodać wodę sterylną, aby uzyskać objętość reakcji 10 µL.

Następnie dodaje się 10x bufor ligacyjny fast link, 10 millimolar A-T-P-P-C-C, jeden wektor SMID oraz insert w stosunku molowym 10:1. Na koniec dodaje się ligazę DNA fast link. Probówkę należy krótko odwirować, aby cały płyn zgromadził się na dnie.

Opukaj probówkę i ponownie odwiruj. Inkubuj reakcję ligacji w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie przeprowadź inaktywację termiczną enzymu przez 10 minut w temperaturze 70 °C. Na tym etapie można albo przechowywać produkt reakcji ligacji w temperaturze -20 °C, albo przejść do etapu pakowania fagów.

Kolejnym krokiem jest wygenerowanie fagów bakteryjnych, które posłużą do wprowadzenia biblioteki FO SMID do e coli. Na dwa lub trzy dni przed planowanym etapem pakowania fagów, wyseHej dostarczony szczep do wysiewu EPI 300 T1 odporny na antybiotyki na zwykłą płytkę z LB i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Płytkę można szczelnie zamknąć i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia. Dzień przed reakcjami pakowania, zaszczep 50 ml bulionu LB z dodatkiem 10 mM siarczanu magnezu pojedynczą kolonią z płytki Epi 300. Inkubuj z wytrząsaniem przy 225 RPM w temperaturze 37 °C przez noc.

W dniu przeprowadzania reakcji pakowania zaszczepiono świeżą pożywkę LB o objętości 50 mililitrów z dodatkiem 10 milimolarnego siarczanu magnezu pięcioma mililitrami hodowli nocnej. Bakterie hodowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza do uzyskania OD 600 w zakresie od 0,8 do 1,0. Nie należy przekraczać wartości OD 600 równej 1,0.

Rozcieńcz próbkę przed pomiarem na spektrofotometrze, aby uzyskać dokładny wynik. Przechowuj w lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza do momentu rozpoczęcia dalszych prac lub maksymalnie przez 72 godziny. Po przygotowaniu bakterii do infekcji należy przystąpić do rozmrażania faga.

Ekstrakty z maksymalnych plak Lambda Packaging rozmrażamy na lodzie. Używając jednej probówki na każdą reakcję ligacji, rozmrażanie zajmie około 10 do 15 minut. W międzyczasie ponownie schładzamy na lodzie pustą probówkę o pojemności 1,5 mililitra, stosując jedną probówkę na reakcję.

Po rozmrożeniu ekstraktów do pakowania Lambda natychmiast przenieś 25 µL każdego ekstraktu do schłodzonej rurki mikroodśrodkowej o pojemności 1,5 ml i umieść na lodzie. Pozostałą część ekstraktu do pakowania przechowuj w temperaturze -80 °C. Zbyt długie pozostawienie rozmrożonych ekstraktów na lodzie obniży wydajność infekcji.

Następnie dodaj 10 µL mieszaniny z reakcji ligacji do każdych 25 µL rozmrożonych w lodzie ekstraktów, mieszając roztwór poprzez kilkukrotne pipetowanie, tak aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Krótko odwiruj próbki, aby zebrać cały płyn na dnie probówek, a następnie inkubuj reakcje pakowania w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C przez 90 minut. Po 80 minutach inkubacji rozmroź w lodzie pozostały ekstrakt do pakowania.

Po zakończeniu 90-minutowej reakcji pakowania, do każdej probówki z reakcją należy dodać pozostałe 25 µL ekstraktu pakującego. Reakcje należy inkubować przez kolejne 90 minut w temperaturze 30 °C. Po drugiej inkubacji do każdej probówki z pakowaniem należy dodać 100 µL przygotowanego buforu do rozcieńczania fagów i delikatnie wymieszać, a następnie dodać 5 µL chloroformu do każdej probówki.

Obecnie w probówce powinna znajdować się całkowita objętość 165 µL. Po dodaniu chloroformu może wytrącić się lepki osad. Należy go unikać, podobnie jak organicznej fazy chloroformowej, podczas pipetowania cząstek fagów.

Na tym etapie, w razie potrzeby, można przechowywać zapakowane cząsteczki fagów w temperaturze czterech stopni przez kilka dni, jednak dla uzyskania najlepszych wyników należy użyć świeżo przygotowanych fagów. Teraz można przystąpić do zakażania zapakowanymi fagami komórek gospodarza, które były hodowane podczas etapów pakowania fagów. Dodaj zapakowane fagi do odpornych komórek gospodarza EPI 300 T one o OD 600 od 0,8 do 1,0 w stosunku 400 µL odpornych komórek EPI 300 T one na każde 10 µL cząsteczek fagów.

Aby uniknąć pobrania chloroformu z dna probówki z zapakowanymi fagami, wykorzystujemy 125 µL cząsteczek zapakowanych fagów oraz pięć mililitrów przygotowanych komórek gospodarza epi 300 T one resistant; po delikatnym wymieszaniu inkubujemy je w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Kolejnym krokiem jest oznaczenie miana zapakowanych fagów. Robimy to poprzez wysianie zainfekowanych bakterii na podłoże w celu wyselekcjonowania zainfekowanych komórek.

Następnie należy policzyć powstałe kolonie i podzielić tę liczbę przez objętość fagów dodanych do bakterii, które zostały wysiane na płytki. Wektor C one SMID zawiera gen oporności na chloramfenikol. Aby wyselekcjonować zainfekowane klony, należy wysiać bakterie na płytki LB z dodatkiem chloramfenikolu.

Rozprowadź dwie porcje po 50 µL oraz dwie porcje po 10 µL komórek EPI 300 T1 opornych na fagi na czterech oddzielnych płytkach, a następnie umieść płytki odwrócone do góry dnem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 16 do 24 godzin (nie dłużej niż 48 godzin), aż do pojawienia się kolonii. W międzyczasie odzyskaj pozostałe komórki EPI 300 T1 oporne na fagi z 5 mL zawiesiny po infekcji poprzez wirowanie przy 3 500 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odlej supernatant.

Do probówki z resuspensją dodać 1 ml pożywki LB z 20% glicerolem. Resuspensować pellet komórkowy i rozdzielić do dwóch probówek kriogenicznych o objętości 2 ml po 100 µL każda, a następnie natychmiast zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C. W celu dalszego wykorzystania w kroku wyboru kolonii następnego dnia, należy policzyć liczbę klonów na czterech płytkach w inkubatorze w temperaturze 37 °C i wyznaczyć miano zapakowanego faga, którego użyje się w kolejnym kroku.

Zamrożony glicerolowy stok komórek EPI 300 T one resistant zawiera komórki transdukowane wszystkimi różnymi plazmidami z biblioteki. Następnie, w zależności od miana wirusa i wielkości płytki, rozsiej odpowiednią ilość z każdego smidu. Klonuj na kwadracie o wymiarach 45 na 45 milimetrów.

Płytki do testów biologicznych z medium LB z chloramfenikolem z wykorzystaniem kulek szklanych. Do płytki należy dodać niewielką ilość pożywki LB, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Należy pamiętać, że przygotowanie zapasu glicerolowego dodatkowo koncentruje komórki około pięciokrotnie.

Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. W dniach wyboru kolonii przygotować płytki 96- lub 384-dołkowe wypełnione po 200 µL lub 70 µL na dołek pożywki LB, uzupełnionej o 12,5 µg chloramfenikolu na ml pożywki w celu selekcji antybiotykowej oraz 10% glicerolu do zamrażania. W tym kroku stosujemy zautomatyzowany system napełniania płytek qfi three.

Kolejnym krokiem jest przeniesienie kolonii z przygotowanych szalek LB z CHLORAMPHENICOLEM do przygotowanych płytek 96- lub 384-dołkowych w celu zamrożenia. W tym kroku, zgodnie z instrukcją obsługi, używamy robota do wybierania klonów qix two, aby stworzyć sterylne środowisko wokół obszaru pobierania klonów. Włącz lampę UV na 30 minut; proces należy przeprowadzić przy włączonym świetle UV.

Przygotuj 500 ml 1% bleach, 500 ml sterylnej wody dejonizowanej oraz 500 ml 80% ethanol. Po wyłączeniu lampy UV napełnij kuwety zgodnie z oznaczeniami, postępując od tyłu do przodu. Do tylnej kuwety wlej 1% bleach, następnie wodę dejonizowaną autoklawowaną, a do przedniej kuwety 80% ethanol.

Upewnij się, że są pełne, ponieważ igły do pobierania nie mogą zostać odpowiednio przemyte bez wystarczającej ilości roztworu myjącego. Po ustawieniu parametrów optymalnego pobierania, zdejmij pokrywki z płytek z bakteriami oraz z wypełnionych LB płytek 96- lub 384-dołkowych i umieść je pomiędzy wspornikami w urządzeniu Q picks. Płytki w obszarze roboczym powinny przylegać ściśle do prawego przedniego narożnika, aby nie przemieszczały się podczas pobierania.

Następnie zamknij przedni panel. Po ustawieniu wszystkich parametrów można rozpocząć procedurę pobierania. Po zakończeniu całego procesu pobierania opłucz szczoteczki i tacki wodą dejonizowaną i odstaw na blat do wyschnięcia.

Usunąć wszelkie ewentualne rozlania i przetrzeć wnętrze CICS 80% etanolem. Upewnić się, że wszystkie płytki z zapasami glicerolowymi są odpowiednio oznakowane, a następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny, aby wyhodować kulturę z każdej wybranej kolonii. Pozostawić na inkubatorze notatkę zawierającą datę, liczbę inkubowanych płytek, czas inkubacji, godzinę wyjęcia oraz własne inicjały.

Po inkubacji otrzymują się bibliotekę. Każda studzienka zawiera kulturę jednego klonu bakteryjnego z ligowanym fragmentem PCC one fo smid oraz jednym fragmentem pociętego DNA z próbki wyjściowej. Płytki należy zamrozić w temperaturze -80 °C w celu długoterminowego przechowywania.

Przedstawiony protokół opisuje procedurę generowania środowiskowej biblioteki smid w celu uchwycenia zawartości genetycznej społeczności mikrobiologicznej w danym siedlisku. Niniejszy protokół powinien pozwolić na stworzenie biblioteki SMID reprezentatywnej dla zawartości genetycznej pobranego środowiska i umożliwić czytelnikowi optymalizację krytycznych etapów, jeśli liczba uzyskanych na końcu całej procedury klonów FO smid okaże się zbyt niska.

Właśnie pokazaliśmy, jak skonstruować bibliotekę FO SMID z genomicznego DNA pochodzącego z próbki wody morskiej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zastosowanie genomicznego DNA wysokiej jakości. Przed rozpoczęciem przygotuj wszystkie płytki i odczynniki oraz zaplanuj wystarczającą ilość czasu na ten wieloetapowy proces.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.