Name: Produkcja bibliotek genomicznych z dużymi wkładkami środowiskowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 59 s
Description: Naucz się konstrukcji biblioteki fosmidowej z dużymi wkładkami DNA z próbek środowiskowych. Ta metoda umożliwia badanie struktury i metabolizmu społeczności mikrobiologicznych w ekosystemach morskich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Kanadyjskiej Fundacji Innowacji (Canadian Foundation for Innovation), Funduszowi Rozwoju Wiedzy Kolumbii Brytyjskiej (British Columbia Knowledge Development Fund) oraz Narodowej Radzie Badań Naukowych i Inżynieryjnych (NSERC) w Kanadzie za wsparcie prowadzonych badań nad obszarami o niskiej zawartości tlenu w wodach przybrzeżnych i otwartych oceanach. M.T. i S.L. otrzymali wsparcie w ramach stypendiów z Centrum Różnorodności i Ewolucji Mikrobowej (CMDE), finansowanego przez fundację TULA. M.T. otrzymał również wsparcie stypendialne z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

<ol><li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seawater+sampling+and%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li>
<li>Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean%27s+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+methanogenesis%3A+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li>
</ol>

Nie mam nic do ujawnienia.

Opisano procedurę najefektywniejszego tworzenia biblioteki fosmidów z dużymi wkładkami przy użyciu DNA genomowego wyizolowanego z próbki wody przybrzeżnej. Ekstrakcja DNA genomowego poprzedzająca ten etap została opisana w oddzielnym protokole [3].
Ponieważ tworzenie biblioteki fosmidów jest procesem wieloetapowym, należy zaplanować co najmniej dwa do trzech tygodni na cały przebieg procedury, obejmujący wszystkie cztery przedstawione kroki. Ekstrakcja DNA genomowego jest najważniejszym etape...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Krok II&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do tworzenia bibliotek fosmidowych CopyControl&amp;#8482;</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CCFOS110</td><td>ilość wystarczająca do wytworzenia 9-10 bibliotek fosmidowych</td></tr><tr><td>Agaroza SeaPlaque</td><td>Cambrex</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>mieszalnik magnetyczny z podgrzewaniem</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy 1,0X TAE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy w polu impulsowym CHEF Mapper XA z modułem chłodzącym i pompą o zmiennej prędkości</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#955; DNA trawione HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>N3012S</td><td></td></tr><tr><td>Marker PFG MidRange I</td><td>New England Biolabs</td><td>N3551S</td><td></td></tr><tr><td>10 000X SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>folia plastikowa do mikrofalówek</td><td>Saran premium wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transiluminator Safe Imager</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Preparat GELase do trawienia żelu agarozowego</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>G09100</td><td></td></tr><tr><td>skalpel</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Odwirnik Amicon Ultra-4 z membraną Ultracel-10</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Odwirnik Microcon YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td></td></tr><tr><td>woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania dsDNA Quant-iT PicoGreen *2000 testów*#</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>cyfrowy grzejnik blokowy</td><td>VWR international</td><td>12621-088</td><td></td></tr><tr><td>łaźnia wodna</td><td>VWR international</td><td>14231-854</td><td></td></tr><tr><td>wirówka</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>rotor do wirówki</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>JA 5.3</td><td></td></tr><tr><td>wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>probówki do mikrocentryfugi, 1,7 mL, przezroczyste</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>probówki do wirówki 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Krok III&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pożywka LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>bufor do rozcieńczania fagi</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>probówki kriogeniczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Krok IV&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytka 96-dołkowa z pokrywką</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003370(3370)</td><td></td></tr><tr><td>płytka 384-dołkowa z pokrywką</td><td>Fisher Scientific</td><td>07201157(3680)</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 100 O.D. x 15 mm W</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 150 Dia. x 15 mm W</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm</td><td>VWR international</td><td>CABD351040</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>pożywka LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar Difco</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>kuleczki szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-1</td><td></td></tr><tr><td>QFill3</td><td>Genetix</td><td>X3050</td><td></td></tr><tr><td>wybielacz</td><td>Javex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>probówki do wirówki 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>robot do pobierania kolonii QPix</td><td>Genetix</td><td>QPix2</td><td></td></tr><tr><td>głowica pobierająca (E. coli)</td><td>Genetix</td><td>X4006</td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie środowiskowej biblioteki genomicznej z dużymi insertami

Large Insert Environmental Genomic Library Production

Zdecydowana większość mikroorganizmów występujących w naturze pozostaje obecnie niedostępna dla tradycyjnych metod hodowli. W ciągu ostatniej dekady niezależna od hodowli środowiskowa genomika (t.j.(metagenomiczne) podejścia pozwoliły badaczom na wypełnienie tej luki w hodowli poprzez bezpośrednie pobieranie zawartości genetycznej rodzimych społeczności drobnoustrojów ze środowiska. W tym celu konstruuje się biblioteki genomowego DNA z wykorzystaniem standardowych, choć wymagających precyzji laboratoryjnych technik klonowania. W niniejszej pracy opisujemy konstrukcję biblioteki fosmidowej genomu środowiskowego z dużymi insertami, z DNA pochodzącym z pionowego przekroju głębokości sezonowo hipoksyjnego fiordu. Protokół ten jest bezpośrednio powiązany z serią powiązanych procedur, obejmujących pobieranie próbek przybrzeżnych wód morskich [1], filtrację dużych objętości biomasy drobnoustrojowej [2] oraz protokół ekstrakcji i oczyszczania DNA [3]. Na początku wysokiej jakości DNA genomowe poddawane jest naprawie końców w celu utworzenia 5'-fosforylowanych końców tępych. DNA po naprawie końców poddawane jest elektroforezie w polu pulsującym (PFGE) w celu selekcji wielkości, a następnie przeprowadza się ekstrakcję z żelu, aby odzyskać fragmenty DNA o długości od 30 do 60 tysięcy par zasad (Kb). DNA po selekcji wielkości jest oczyszczane z matrycy żelu PFGE i ligowane do potraktowanego fosfatazą wektora fosmidowego o tępych końcach CopyControl pCC1 (EPICENTRE<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Liniowe konkatemery pCC1 i wstawionego DNA są następnie pakowane do cząsteczek fagowych metodą headfull przez terminazę lambda, z następującym zakażeniem opornych na fagiE. colikomórki. Pomyślnie przetransdukowane klony są odzyskiwane na płytkach z agarem LB pod selekcją antybiotykową i archiwizowane w formacie płytek 384-dołkowych przy użyciu zautomatyzowanego robota do pobierania kolonii (Qpix2, GENETIX). Niniejszy protokół opiera się na różnych źródłach, w tym na zestawie CopyControl Fosmid Library Production Kit firmy EPICENTRE oraz na publikacjach wielu grup badawczych [4-7]. Każdy krok został przedstawiony z uwzględnieniem najlepszych praktyk. Tam, gdzie to możliwe, podkreślamy subtelności w wykonaniu, aby poprawić ogólną jakość i wydajność produkcji biblioteki. Cały proces tworzenia biblioteki fosmidów i zautomatyzowanego pobierania kolonii trwa co najmniej 7-10 dni ze względu na liczne etapy inkubacji. Istnieje jednak kilka możliwych punktów przerwania pracy, które zostały wspomniane w protokole.

Opisano konstrukcję biblioteki fosmidów z genomowego DNA środowiskowego, wyizolowanego z pionowego kontinuum głębokości sezonowo hipoksycznego fiordu. Powstała biblioteka klonów zostaje przeniesiona do płytek 384-dołkowych i zarchiwizowana w celu późniejszego sekwencjonowania oraz przesiewania funkcjonalnego przy użyciu zautomatyzowanego systemu wybierania kolonii.

Tworzenie środowiskowej biblioteki genomicznej z dużymi insertami

Ogromna większość mikroorganizmów występujących w naturze pozostaje obecnie niedostępna dla tradycyjnych metod hodowli. W ciągu ostatniej dekady metody niezależne od hodowli...

Cześć, nazywam się Marcus i pracuję w laboratorium Stevena Helma w Departamencie Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia biblioteki środowiskowej z dużymi wkładkami. Pomagać mi będzie San Lee, która przeprowadzi pakowanie fagów i infekcję gospodarza biblioteki e coli, a także Elise Hawley i Chin Yang, które zajmą się wybieraniem kolonii.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania struktury i metabolizmu społeczności mikroorganizmów w środowiskach morskich i lądowych. Zacznijmy zatem. Niniejszy protokół tworzenia biblioteki DNA fosmidów jest kontynuacją procedur izolacji i fragmentacji genomowego DNA z próbek biomasy, które szczegółowo opisaliśmy w towarzyszących artykułach JoVE.Kolejne kroki przygotowują DNA SHE do ligacji do wektora SMID PCC one. Pierwszym krokiem jest naprawa końców fragmentów DNA SHE oraz ich fosforylacja końców 5'. Wszystkie odczynniki niezbędne do tego etapu znajdują się w zestawie do produkcji biblioteki PCC one SMID od firmy Epicentre. Aby przygotować reakcję naprawy końców, rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie, a następnie połączyć bufor do naprawy końców, dNTP, kNTP, do 2

large-insert-environmental-genomic-library-production

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Duża kolekcja bibliotek genomicznych do produkcji środowiskowej

Biblioteki metagenomiczne archiwizują duże fragmenty ciągłych sekwencji genomowych mikroorganizmów bez konieczności ich wcześniejszej hodowli. Tworzenie...

Wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę przygotowania bibliotek do sekwencjonowania mRNA-Seq systemu Illumina, zarówno do odczytów pojedynczych, jak i parowanych, przeznaczonych do analizy ekspresji genów w oparciu o liniową amplifikację RNA za pomocą T7. Protokół ten wymaga jedynie 10 nanogramów całkowitego RNA wyjściowego i pozwala na uzyskanie wysoce spójnych bibliotek reprezentujących pełne transkrypty.

Biblioteki mRNA-Seq Illumina do sekwencjonowania pojedynczego odczytu oraz sekwencjonowania par końców z 10 nanogramów całkowitego RNA

Genetyczny test reporterowy jest dobrze znanym i potężnym narzędziem do analizowania relacji między sekwencjami DNA a ich aktywnością regulacyjną genów. Sprzężenie potencjalnych elementów regulatorowych z genami reporterowymi, które przenoszą identyfikujące znaczniki sekwencji, umożliwia masową równoległość tych testów.

Masowo równoległe testy reporterowe w hodowanych komórkach ssaków

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Metody generowania dużych bibliotek gRNA powinny być proste, wydajne i opłacalne. Opisujemy protokół produkcji bibliotek gRNA oparty na enzymatycznym trawieniu docelowego DNA. Metoda CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) stanowi alternatywę dla kosztownej, niestandardowej syntezy oligonukleotydów.

Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

Korzystanie z wektora binarnego pBIBAC-GW sprawia, że generowanie roślin transgenicznych z nienaruszonymi pojedynczymi kopiami jest łatwym procesem. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów, które prowadzą czytelnika przez proces generowania transgenicznych roślin Arabidopsis oraz testowania roślin pod kątem nienaruszalności i liczby kopii wkładek.

Generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego BIBAC-GW

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Ten protokół szczegółowo opisuje kompleksowe podejście do hodowli, sekwencjonowania i hybrydowego składania genomu de novo bakterii moczowych. Zapewnia powtarzalną procedurę generowania kompletnych, kolistych sekwencji genomu przydatnych w badaniu zarówno chromosomalnych, jak i pozachromosomalnych elementów genetycznych przyczyniających się do kolonizacji dróg moczowych, patogenezy i rozprzestrzeniania się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu

Mutageneza insercyjna jest niezbędnym narzędziem w genetyce postępowej do identyfikacji funkcjonalnych elementów genomu. W tym miejscu opisujemy InSET (InSET) badanie przesiewowe oparte na insercji dla funkcjonalnych elementów i transkryptów, metodę wykrywania miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej opartej na lentiwirusie.

Identyfikacja funkcjonalnie istotnych miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej

Protokół ten zapewnia metodę systematycznej globalnej optymalizacji genetycznie kodowanych bioczujników poprzez wspomagane automatyzacją generowanie i ocenę bibliotek genetycznych. Jest to połączone z metodologiami projektowania eksperymentów w celu usprawnienia eksperymentów i umożliwienia selekcji komponentów genetycznych w celu dostrojenia bioczujników do określonych wyników projektu.

Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Naucz się konstrukcji biblioteki fosmidowej z dużymi wkładkami DNA z próbek środowiskowych. Ta metoda umożliwia badanie struktury i metabolizmu społeczności mikrobiologicznych w ekosystemach morskich.

Tworzenie środowiskowej biblioteki genomicznej z dużymi insertami

Przeglądaj więcej filmów