Przeciwporostowe, samoorganizujące się monowarstwy na mikroelektrodach do modelowania biomolekuł

Ta procedura rozpoczyna się od wytworzenia mikroelektrody na podłożu silikonowym. Na mikroelektrodzie i podłożu tworzy się samoorganizująca się monowarstwa glikolu polietylenowego, aby zapobiec zanieczyszczeniu mikrotubul. Następnie przygotowuje się mikrotubule znakowane ruminą.

Na koniec mikrotubule są wzorowane na elektrodach za pomocą elektroforezy. Cześć, nazywam się John Noel i pracuję w Nana Lab na Wydziale Fizyki oraz w Laboratorium Biomechaniki Molekularnej na Wydziale Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Teksasie. Nazywam się Wil Free Teza z wydziału fizyki i jestem dyrektorem Centrum Umiejętności, Nauki i Technologii na Uniwersytecie w Teksasie.

Nazywam się Juan Quang i jestem dyrektorem Laboratorium Biomechaniki Molekularnej na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu w Teksasie. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę wytwarzania mikroelektrod pokrytych samoorganizującą się monowarstwą, która nie zanieczyszcza środowiska. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania blaszenia mikrorurek za pomocą elektroforezy.

Więc zacznijmy. Na początek użyj rysika lub noża do wafli, aby pociąć płytki krzemowe na kawałki o wymiarach jeden centymetr na 1,5 centymetra, które można wykorzystać jako podłoża. Teraz oczyść podłoża, umieszczając je w zlewce z wystarczającą ilością acetonu, aby je przykryć i sonikować przez pięć minut, nie dopuszczając do wyschnięcia podłoży.

Opłucz je w świeżym acetonie, a następnie natychmiast ponownie opłucz w izopropanolu i użyj azotu do wysuszenia. Używając standardowej fotolitografii o dodatnim tonie lub litografii wiązką elektronów, wyprodukuj złote mikroelektrody na czystych podłożach. Projektując geometrię wzoru, utrzymuj średnicę każdego wzoru elektrody poniżej 100 mikronów Aby zapewnić pokrycie przez glikol polietylenowy trimeth oxy seline samoorganizującą się monowarstwę lub kołek Sam, dołącz podkładki kontaktowe umieszczone w odległości od 300 do 500 mikrometrów od wzoru z jednomilimetrową linią łączącą podkładkę z elektrodą.

Po opracowaniu wzoru w warstwie rezystancyjnej za pomocą pęsety zarysuj linię w rezyście od podkładki kontaktowej do krawędzi podłoża. Po osadzeniu metalu rysa umożliwi kontakt elektryczny między elektrodą a krawędzią podłoża. Do osadzania warstwy metalu służy komora osadzania, najlepiej z dwoma źródłami.

Elektrody są formowane przez osadzanie dwóch nanometrów chromu, a następnie sześciu nanometrów złota Bez przerywania próżni, mikrowaga kryształu kwarcu wyposażona wewnątrz komory może być używana do pomiaru grubości warstw podczas osadzania. Możemy teraz przystąpić do przygotowania samodzielnie zmontowanej monowarstwy w dobrze wentylowanym miejscu, rozgrzać i wypiec w piekarniku do 75 stopni Celsjusza. Przygotuj roztwór izacyjny, dodając jeden mililitr peg seline do 20 mililitrów toluenu w szklanej zlewce o pojemności 250 mililitrów.

Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół od pięciu do 10 razy, a następnie mieszając pipetą przez 30 sekund. Umieść próbki wzoru w zlewce stroną do góry, upewniając się, że są całkowicie zanurzone w roztworze i są równomiernie rozmieszczone na dnie zlewki. Umieść zlewkę w piekarniku i piecz ją przez 18 do 21 godzin, aż Sam się formuje.

Przygotuj przeciwelektrodę, osadzając jeden nanometr chromu, a następnie cztery nanometry złota na szklanym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 na 50 milimetrów. Przeciwelektroda powinna być prawie przezroczysta z jasnoszarym lub różowym odcieniem. Przechowuj przeciwelektrodę pokrytą stroną do góry na szalce Petriego, aby utrzymać ją w czystości.

Po 18 do 21 godzinach w piekarniku wyjmij zlewkę z piekarnika. Toluen powinien był odparować, pozostawiając próbki wzoru w lepkiej pozostałości po klinach kołków. Dodaj 20 mililitrów toluenu do zlewki i moczyć próbki przez jedną do dwóch minut.

Wyjąć próbki ze zlewki i przepłukać je toluenem, następnie izopropanolem, a na koniec osuszyć azotem. W tym momencie próbki powinny wyglądać na czyste, a warstwa Sam powinna być niewidoczna gołym okiem. Tak przygotowane Sam's nadają się do użytku przez maksymalnie dwa dni, jeśli są przechowywane w chłodnych, suchych warunkach.

Nieudane formowanie Sam powoduje powstawanie mętnej lub nierównomiernie zabarwionej powłoki osadowej na powierzchni. Po przygotowaniu Samsów możemy teraz rozpocząć polimeryzację tubuliny do mikrotubul. Zacznij od rozmrożenia nieznakowanej tubuliny i tubuliny r dominowej i natychmiast połącz je w stosunku dwa do jednego nieznakowanego do znakowanego, aby uzyskać jasne mikrotubule.

Dobrze je wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Następnie polimeryzuj tubulinę przez 20 do 40 minut w podgrzewanej łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, podczas gdy tubulina polimeryzuje. Przygotować bufor Taxol do fajek, mieszając 20 mikromolowy Taxol z buforem rurowym.

Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół i wirując, a następnie umieść probówkę w podgrzewanej łaźni o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po polimeryzacji rozcieńczyć mikrotubule w ciepłym buforze rurowym Taxol i osłonić je przed światłem. Sprawdź, czy polimeryzacja mikrokanalików powiodła się i czy mikrotubule są stabilne pod wpływem kilku minut wzbudzenia fluorescencji.

Obrazowanie przygotowanych mikrotubul mieszaniną wychwytującą tlen z polimeryzacją tubuliny do mikrotubul jest kompletne. Zacznijmy modelować MTS od elektroforezy. Na początek pokrój kawałek taśmy dwustronnej na cienkie paski, umieszczając go na szklanym szkiełku i używając żyletki do cięcia, umieść dwa paski taśmy dwustronnej w poprzek wzorzystej próbki pokrytej Samem, tak aby elektroda znajdowała się między paskami, a ścieżka łącząca biegła prostopadle do taśmy.

Umieść przeciwelektrodę na taśmie dwustronnej tak, aby metalowa strona dotykała taśmy tak, aby krawędź próbki wystawała poza przeciwelektrodę na około trzy milimetry. Wytnij kilka 15-centymetrowych odcinków izolowanego miedzianego drutu magnetycznego i zdejmij jeden centymetr izolacji z obu końców. Użyj małej kropli srebrnej farby, aby przymocować drut do odsłoniętego złotego obszaru podłoża, uważając, aby nie doszło do kontaktu elektrycznego z przeciwelektrodą.

Teraz użyj srebrnej farby, aby przymocować drugi drut do blatu. Przewody elektrod przymocowane srebrną farbą można dodatkowo przymocować do próbek za pomocą taśmy. Następnie, za pomocą pipety, wprowadź mikrotubule do pożądanego obrazu rozcieńczenia w 20-krotnym powiększeniu i zlokalizuj wzór na płytce krzemowej przed przyłożeniem napięcia.

Ze względu na głębokość komory przepływowej, do zobrazowania górnej powierzchni komory przepływowej mogą być potrzebne obiektywy o dużej odległości roboczej. Odległość od powierzchni próbki do górnej powierzchni komory przepływowej zależy od grubości taśmy i powinna wynosić około 60 do 100 mikrometrów. Zastosuj napięcie do jednego wolta i obserwuj migrację mikrotubul.

Jeśli pożądane jest odwracalne wychwytywanie mikrotubul. Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić komorę przepływu, aby zapobiec bocznemu dryfowaniu i użyj niższych napięć, do około 0,5 wolta. Migrację można śledzić, dostosowując pionową płaszczyznę ostrości mikroskopu z przyłożonymi napięciami około 0,9 do 1,2 wolta, mikrotubule zlokalizowane na powierzchniach elektrod.

Wyższe napięcie przyspieszy migrację i wzmocni przyczepność, ale nadmierne napięcie wywoła elektrolizę i depolimeryzację. Mikrotubule, Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować mikroelektrody z powłoką Sam do wzoru MT, ponieważ powłoka SAM zapobiega wchłanianiu mikrorurki na mikroelektrodach. Procedura ta może być również stosowana do odwracalnego wzoru mikrotubul.

Co więcej, proces ten nie ogranicza się tylko do mikrotubul, ale może być również stosowany do modelowania biomolekuł w ogóle. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.