Name: Przeciwporostowe, samoorganizujące się monowarstwy na mikroelektrodach do modelowania biomolekuł (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-25T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę tworzenia przeciwporostowej monowarstwy PEG-SAM na mikroelektrodach złotych do precyzyjnego nanostrukturalnego wzorcowania mikrotubulek metodą elektroforezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Melissie Grunlan za pomocne dyskusje na temat tworzenia SAM. Badania te były częściowo wspierane przez Robert A. Welch Foundation (A-1585).

Przygotowanie odczynników
Przygotować bufor PIPES (80 mM PIPES, 1mM MgCl2, 1mM EGTA, pH skorygowane do 6,8 za pomocą KOH). Odważyć i przechowywać oksydazę glukozową, katalazę oraz glukozę w temperaturze -70°C, a taksol w temperaturze -20°C zgodnie z obowiązującymi protokołami.1,2 Odważyć i przechowywać tubulinę w temperaturze -70°C zgodnie z instrukcją dostawcy.
Wytrawianie mikroelektronod Au za pomocą litografii
<ol>
<li>Potnij wafle krzemowe na podłoża o wymiarach 1 cm × 1,5 cm, używając rysika lub przecinarki do wafli. Oczyść podłoża, umieszczając je w zlewce z ilością acetonu wystarczającą do ich całkowitego zakrycia, a następnie poddaj sonikacji przez 5 minut. Nie pozwalając podłożom wyschnąć, wypłucz je w świeżym acetonie, następnie natychmiast wypłucz w izopropanolu i wysusz azotem.</li>
<li>Wykonaj złote mikroelektrody (Au) na czystych podłożach, stosując standardową fotolitografię pozytywową lub litografię wiązką elektronów, w zależności od pożądanego rozmiaru struktur.3 Projektując geometrię wzoru, zachowaj średnicę każdego wzoru elektrody poniżej 100 µm, aby zapewnić pokrycie przez PEG SAM (opisane w następnej sekcji). Uwzględnij pady kontaktowe (~ 300 mm2) umieszczone w odległości od 300 do 500 µm od wzoru, z linią o szerokości 1 µm łączącą pad z elektrodą (Ryc. 1). Umieść wzory litograficzne w pobliżu środka podłoża, aby pozostawić wokół nich miejsce na montaż komory przepływowej. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1390/1390fig1thumb.jpg" alt="Schemat podłoża krzemowego ze wzorem litograficznym; układ kontaktu drapanego Au i mikroelektrody." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 1"> Rycina 1. Przykładowa geometria. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.</li>
<li>Po wywołaniu wzoru w warstwie rezystu, wydrap pęsetą linię w rezystcie od pada kontaktowego do krawędzi podłoża (Ryc. 1). Po osadzeniu metalu zadrapanie to umożliwi kontakt elektryczny między elektrodą a krawędzią podłoża. Do osadzania warstwy metalu należy użyć komory osadzania, najlepiej z dwoma źródłami. Elektrody tworzy się poprzez osadzenie 2 nm Cr (dla zapewnienia adhezji), a następnie 6 nm Au, bez przerywania próżni. Do pomiaru grubości warstw podczas osadzania można wykorzystać zamontowaną w komorze mikro-wagę kwarcową.</li>
</ol>
Przygotowanie SAM
<ol>
<li>Rozgrzej piekarnik w dobrze wentylowanym pomieszczeniu do 75°C. Przygotuj roztwór do silanizacji, wlewając 20 mL toluenu do szklanego zlewka o pojemności 250 mL. Następnie za pomocą plastikowej pipety dodaj do toluenu 1 mL PEG-silanu (tj. 5% v/v). Dobrze wymieszaj PEG-silan, pobierając i wypuszczając ciecz pipetą od 5 do 10 razy, a następnie mieszając pipetą przez 30 sekund.</li>
<li>Umieść wzorowane próbki w zlewce stroną wzorowaną do góry, upewniając się, że są całkowicie zanurzone w roztworze PEG-silanu w toluenie i równomiernie rozmieszczone na dnie zlewki. Wstaw zlewkę do piekarnika i wypalaj od 18 do 21 godzin w temperaturze 75°C. Podczas formowania się SAM, przygotuj przeciwelektrodę (patrz poniżej) oraz złóż wszystkie dodatkowe komponenty wymagane do pozostałych etapów.</li>
<li>Po 18–21 godzinach w piekarniku toluen powinien odparować, pozostawiając wzorowane próbki w lepkim osadzie z PEG-silanu. Dolej do zlewki 20 mL toluenu i mocz próbki przez 1–2 minuty. Wyjmij próbki ze zlewki i opłucz je toluenem, następnie izopropanolem, a na koniec osusz azotem. Na tym etapie próbki powinny wyglądać na czyste, a warstwa SAM powinna być niewidoczna gołym okiem. SAMy przygotowane w ten sposób można wykorzystywać do dwóch dni, przechowując je w chłodnych i suchych warunkach (25 °C, umiarkowana wilgotność). Niepowodzenie w formowaniu SAM objawia się mętną lub nierównomiernie zabarwioną powłoką osadu na powierzchni.</li>
</ol>
Wytwarzanie przeciwelektrody
W tym samym układzie komory naparnej, który został wykorzystany do nanoszenia mikroelektrod, przygotuj przeciwelektrodę, nanosząc 1 nm Cr, a następnie 4 nm Au na szklaną lamellę nr 1 lub nr 0 o wymiarach 22 x 50 mm. Przeciwelektroda powinna być niemal przezroczysta, z jasnoszarym lub różowym odcieniem. Przechowuj przeciwelektrodę w szalce Petriego stroną z powłoką do góry, aby utrzymać ją w czystości.
Polimeryzacja tubuliny w mikrotubule (MTs)
<ol>
<li>Rozmrozić tubulinę nieznakowaną oraz tubulinę znakowaną rodaminą i niezwłocznie połączyć je w stosunku 1:2 (znakowana do nieznakowanej), aby uzyskać jasne mikrotubule (MT). Pomieszać, pipetując próbkę w górę i w dół kilka razy. Polimeryzować tubulinę przez 20-40 minut w ciepłej kąpieli wodnej w temperaturze 37°C. Dłuższy czas polimeryzacji spowoduje uzyskanie dłuższych MT. Podczas polimeryzacji tubuliny przygotować bufor PIPES-taxol, dodając taxol do stężenia 20 mM do probówki do mikrocentryfugi zawierającej bufor PIPES. Dokładnie wymieszać taxol, pipetując w górę i w dół kilka razy oraz wierzchołkując (vortexing), a następnie umieścić probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Po polimeryzacji rozcieńczyć MT 1/100 w ciepłym buforze PIPES-taxol i chronić przed światłem. MT przygotowane w ten sposób będą z czasem wydłużać się i tworzyć wiązki, co można ograniczyć poprzez dalsze rozcieńczenie.</li>
<li>Przygotować 10x mieszaninę usuwającą tlen (OS), łącząc 30 mL zimnego buforu PIPES (0-4°C), 5 mL 50% 2-merkaptoetanolu, 5 mL oksydazy glukozowej, 5 mL katalazy oraz 5 mL glukozy.2 Glukozę należy dodać na końcu. Mieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół 3-5 razy po dodaniu każdego składnika. Umieścić mieszaninę OS na lodzie; pozostanie ona aktywna przez około 2 godziny.</li>
<li>Potwierdzić poprawność polimeryzacji MT oraz ich stabilność podczas kilku minut wzbudzania fluorescencyjnego, obrazując przygotowane MT z dodatkiem 1x mieszaniny OS. Do obrazowania MT przygotowanych w ten sposób należy użyć kombinacji filtrów wzbudzania/emisji odpowiedniej dla fluorescencji rodaminy. Ustalić optymalne rozcieńczenie robocze do obrazowania pojedynczych filamentów, rozcieńczając MT dalej w zakresie od 1/10 do 1/100 za pomocą buforu PIPES i obrazując je z dodatkiem 1x mieszaniny OS.</li>
<li>Przygotować komorę przepływową, łącząc dużą (22 x 50 mm) i małą (22 x 22 mm) szklaną lamelkę za pomocą dwóch kawałków dwustronnej taśmy umieszczonych w odległości 2-3 mm od siebie. Taśmę można łatwo pociąć w paski, kładąc ją na szkiełku przedmiotowym i rozcinając żyletką. Wprowadzić kilka mikrolitrów MT do komory przepływowej za pomocą mikropipety. Do obrazowania przy dużym powiększeniu mogą być wymagane obiektywy o dużej odległości roboczej, aby obrazować górną powierzchnię komory przepływowej. Odległość od lamelki/powierzchni próbki do górnej powierzchni komory przepływowej jest określona przez grubość taśmy i powinna wynosić 60-100 mm.</li>
</ol>
Analiza wzorców MT za pomocą elektroforezy
<ol>
<li>Przygotuj komorę elektroforetyczną, naklejając dwa wąskie paski dwustronnej taśmy na wzorowany materiał próbkowy pokryty SAM w taki sposób, aby elektroda znajdowała się pomiędzy paskami, a ścieżka połączenia biegła prostopadle do taśmy (Rys. 2). Umieść przeciwelektrodę na dwustronnej taśmie stroną metalową do taśmy, tak aby krawędź próbki wystawała poza przeciwelektrodę o około 3 mm (Rys. 2). Odetnij kilka odcinków izolowanego miedzianego drutu magnetowego o długości 15 cm i zdejmij 1 cm izolacji z obu końców. Przymocuj jeden drut do odsłoniętego obszaru Au podłoża za pomocą małej kropli farby srebrnej, uważając, aby nie doprowadzić do kontaktu elektrycznego z przeciwelektrodą (można to sprawdzić za pomocą multimetru). Przymocuj drugi drut do przeciwelektrody za pomocą farby srebrnej. Druty przymocowane farbą srebrną można dodatkowo zabezpieczyć na próbkach za pomocą taśmy. <img src="/files/ftp_upload/1390/1390fig2thumb.jpg" border="0" alt="Schemat urządzenia mikrofluidycznego; kontrola przepływu, pozycjonowanie próbki, metoda zapobiegania parowaniu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 2"> Rycina 2. Montaż celi przepływowej dla odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig2.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.</li>
<li>Wprowadź MT w pożądanym rozcieńczeniu, używając buforu PIPES w połączeniu z OS w końcowym stężeniu 1x. Wykonaj obrazowanie przy powiększeniu 20X i zlokalizuj wzór na waflu krzemowym przed przyłożeniem napięcia. Opcjonalnie komorę przepływową można uszczelnić lakierem do paznokci, aby zapobiec przepływowi cieczy i migracji MT w płaszczyźnie komory przepływowej.</li>
<li>Przyłoż napięcie do 1 V i obserwuj migrację MT. Niższe napięcia (do około 0,5 V) mogą być stosowane w przypadku chęci odwracalnego uwięzienia MT; wymaga to jednak uszczelnienia komory przepływowej w celu zapobiegania dryftowi bocznemu. Lakier do paznokci dobrze sprawdza się przy uszczelnianiu otwartych końców komory przepływowej. Przy napięciach powyżej około 0,7 V może być widoczna pewna adhezja MT do wzoru, choć będzie ona słaba. Przy napięciach powyżej około 0,9 V migracja MT będzie szybsza, a adhezja silniejsza. Powyżej około 1,2 V znacznie wzrasta prawdopodobieństwo wywołania elektrolizy (tworzenia pęcherzyków gazu), a także zniszczenia mikroelektrod. Migrację można śledzić, regulując pionową płaszczyznę ostrości mikroskopu. Jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo, MT zlokalizują się na powierzchniach elektrod.</li>
</ol>

<ol><li>Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html">http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html</a> (2009).</li>
<li>Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html">http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html</a> (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Microlithography%2C+Micromachining%2C+and+Microfabrication%3A+Microlithography%22">Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography</a>. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Migrację MT można łatwo zwizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ze względu na ich jasność oraz niską fluorescencję tła. Metoda ta ma ogólne zastosowanie w wzorcowaniu biomolekuł, ponieważ wymaga jedynie, aby biomolekuły uzyskały ładunek wypadkowy poprzez odpowiednią regulację pH buforu. W tej konfiguracji uniknięto elektroosmozy, ponieważ nie występują naładowane powierzchnie, takie jak ścianki krzemionkowe stosowane w elektroforezie kapilarnej.
Możliwe są liczne modyfikacje tej ...

<table><tbody><tr><td>2-[metoksypoli-(etylenoooksy)propyl]-trimetoksysilan (PEG-silan)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td>6-9 jednostek PEG; masa cząsteczkowa 450-600 g mol&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>2-merkapt&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0120-8</td><td>stopień czystości ACS</td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Calbiochem</td><td>219001-5MU</td><td></td></tr><tr><td>Chlorobenzen</td><td>EMD Millipore</td><td>MK441908</td><td>stopień czystości ACS</td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(2-amino&amp;#8211;etyloeter)&lt;em&gt;-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-&lt;/em&gt;kwas tetraoctowy (EGTA)</td><td>Calbiochem</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>EMD Millipore</td><td>DX0145-1</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>MP Biomedicals</td><td>100330</td><td></td></tr><tr><td>Guanozyna-5&amp;rsquo;-[(&amp;alpha;,&amp;#914;)-metyleno]trifosforan, sól sodowa (GMPCPP)</td><td>Jena Biosciences, GmbH</td><td>NU-405s</td><td></td></tr><tr><td>Guanozyna-5&amp;rsquo;-trifosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8752</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1835-5</td><td>stopień czystości ACS</td></tr><tr><td>Metylizobutylo-keton (MIBK)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12739-0010</td><td></td></tr><tr><td>Paklitaksel (taxol)</td><td>Calbiochem</td><td>580555</td><td></td></tr><tr><td>Piperazyna-N,N&amp;rsquo;&amp;rsquo;-bis(2-etanosulfonowy kwas) (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>Polimetylometakrylan (PMMA)</td><td>Brewer Science, Inc.</td><td>950K</td><td>masa cząsteczkowa 950K</td></tr><tr><td>Rodamina-tubulina</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T331M</td><td>z mózgu bydlęcego, czystość 99%, liofilizowana</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>EMD Millipore</td><td>TX0735-5</td><td>stopień czystości ACS</td></tr><tr><td>Tubulina</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T238</td><td>z mózgu bydlęcego, czystość 99%, liofilizowana</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">Szklane pipety nakrywkowe z borokrzemianu nr 1 (22 X 50 mm) zakupiono w VWR. Polerowane wafle krzemowe typu p o orientacji &amp;lt;111&amp;gt; klasy elektronicznej zakupiono w Addison Engineering, Inc. Wysokiej czystości farbę srebrną otrzymano z Structure Probe, Inc. (Katalog # 5001 AB). Izolowany miedziany drut magnetyczny o cienkim przekroju (średnica ~ 0.08 mm (0.003&amp;#8221;)) można nabyć od dostawców komponentów elektronicznych.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

antyfouling samoorganizujące się monowarstwy na mikroelektrodach do wzorcowania biomolekuł

Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

Przedstawiamy procedurę tworzenia samoorganizującej się monowarstwy (SAM) z trimetoksysilanu poli(glikolu etylenowego) (PEG) na podłożu krzemowym z mikroelektrodami złoconymi. PEG-SAM jest tworzona w jednym kroku montażu i zapobiega biofoulingowi na powierzchniach krzemu i złota. Monowarstwa służy do powlekania mikroelektrod uformowanych za pomocą standardowej litografii pozytywowej. Na przykładzie mikrotubul przykładamy napięcie stałe (DC), aby wywołać odwracalną migrację elektroforetyczną do elektrody powleczonej SAM. Do obrazowania migracji elektroforetycznej i wzorowania mikrotubul wykorzystywana jest komora przepływowa.in situz wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w tworzeniu wzorów biomolekularnych, ponieważ wykorzystuje elektroforezę do unieruchomienia cząsteczek docelowych, a tym samym nie wymaga specyficznych oddziaływań molekularnych. Ponadto pozwala ona uniknąć problemów występujących podczas prób bezpośredniego tworzenia wzorów z cząsteczek SAM za pomocą technik litograficznych. Kompatybilność z litografią wiązką elektronów umożliwia zastosowanie tej metody do tworzenia wzorów biomolekularnych w nanoskali.

Przedstawiamy procedurę tworzenia samoorganizującej się monowarstwy z poli(glikolu etylenowego) (PEG-SAM) na podłożu krzemowym z mikroelektrodami złotymi. Warstwa PEG-SAM jest tworzona w jednym kroku i zapobiega biofoulingowi na powierzchniach krzemu oraz złota. Następnie wykorzystuje się elektroforezę do rozmieszczania biomolekuł w skali nanometrycznej.

Antyfouling samoorganizujące się monowarstwy na mikroelektrodach do wzorcowania biomolekuł

Przedstawiamy procedurę tworzenia samoorganizującej się monowarstwy (SAM) trimetoksysilanu poli(glikolu etylenowego) (PEG) na podłożu krzemowym ze złotem...

Procedura ta rozpoczyna się od wykonania mikroelektrody na podłożu silikonowym. Na mikroelektrodzie i podłożu tworzona jest samoporządkująca się monowarstwa z glikolu polietylenowego, aby zapobiec osadzaniu się mikrotubul. Następnie przygotowywane są mikrotubule znakowane rubidyną.Na koniec mikrotubule są rozmieszczane na elektrodach przy użyciu elektroforezy. Cześć, jestem John Noel z Nana Lab w Katedrze Fizyki oraz z Laboratorium Biomechaniki Molekularnej w Katedrze Inżynierii Biomedycznej na Texas A&M University. Jestem Wil free Teza z katedry fizyki i dyrektorem Center Skill Science and Technology na Texas A&M University.Jestem Juan Quang, dyrektor Laboratorium Biomechaniki Molekularnej w Departamencie Inżynierii Biomedycznej na Texas A&M University. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wytwarzania mikroelektrod pokrytych nieprzywiercającą monowarstwą samoorganizującą się. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania ruchu mikroprzewodów za pomocą elektroforezy.Zacznijmy. W pierwszej kolejności należy użyć rysika lub przecinaka do wafli krzemowych, aby pociąć wafle krzemowe na kawałki o wymiarach 1 cm na 1,5 cm, które posłużą jako podłoża. Następnie należy oczyścić podłoża, umieszczając je w zlewce z ilością acetonu wystarczającą do ich całkowitego zanurzenia, i poddać sonikacji przez pięć minut, nie dopuszczając do wyschnięcia podłoży.Opłucz je w świeżym acetonie, a następnie niezwłocznie ponownie opłucz w izopropanolu i osusz strumieniem azotu. Wykorzystując standardową fotolitografię pozytywową lub litografię wiązką elektronów, wykonaj złote mikroelektrody na czystych podłożach. Projektując geometrię wzoru, zachowaj średnicę każdego wzoru elektrody poniżej 100 µm. Aby zapewnić pokrycie przez samoorganizującą się monowarstwę trimetoksysilanu glikolu polietylenowego (peg Sam), uwzględnij pady kontaktowe umieszczone w odległości od 300 do 500 µm od wzoru, z linią o długości 1 mm łączącą pad z elektrodą.Po wywołaniu wzoru w warstwie rezystu należy za pomocą pęsety wydrapać linię w rezyście od pola kontaktowego do krawędzi podłoża. Podczas osadzania metalu zadrapanie to umożliwi kontakt elektryczny między elektrodą a krawędzią podłoża. Do osadzania warstwy metalu wykorzystuje się komorę osadzania, najlepiej wyposażoną w dwa źródła.Elektrody tworzy się poprzez osadzanie dwóch nanometrów chromu, a następnie sześciu nanometrów złota. Bez przerywania próżni do pomiaru grubości warstw podczas osadzania można wykorzystać kwarcową mikrowagę znajdującą się wewnątrz komory. Można teraz przystąpić do przygotowania samoporządkującej się monowarstwy w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, uprzednio rozgrzewając piekarnik do 75 °C. Przygotować roztwór do funkcjonalizacji, dodając 1 mL peg seliny do 20 mL toluenu w szklanym zlewce o pojemności 250 mL.Wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół od pięciu do 10 razy, a następnie mieszając pipetą przez 30 sekund. Umieść próbki z wzorem w zlewce stroną z wzorem do góry, upewniając się, że są całkowicie zanurzone w roztworze i równomiernie rozmieszczone na dnie zlewki. Włóż zlewkę do pieca i wypalaj przez 18 do 21 godzin, podczas gdy formuje się Sam.Przygotuj elektrodę przeciwprostną, nanosząc jedną nanometr chromu, a następnie cztery nanometry złota na szklane szkiełko nakrywki o wymiarach 22 na 50 milimetrów. Elektroda przeciwprostna powinna być niemal przezroczysta z jasnoszarą lub różową barwą. Przechowuj elektrodę przeciwprostną stroną pokrytą do góry w szalce Petriego, aby zachować jej czystość.Po 18 do 21 godzin w piekarniku wyjmij zlew z piekarnika. Toluen powinien odparować, pozostawiając próbki wzoru w lepkim osadzie PEG. Do zlewka dodaj 20 ml toluenu i namaczaj próbki przez jedną do dwóch minut.Wyjmij próbki z zlewki i opłucz je toluenem, następnie izopropanolem, a na koniec osusz azotem. Na tym etapie próbki powinny wyglądać na czyste, a warstwa Sam powinna być niewidoczna gołym okiem. Tak przygotowane Sam można wykorzystać w ciągu dwóch dni, przechowując je w chłodnych i suchych warunkach.Nieudana formacja SAM prowadzi do powstania mętnej lub nierównomiernie zabarwionej warstwy osadu na powierzchni. Po przygotowaniu SAM możemy rozpocząć polimeryzację tubuliny w mikrotubule. Należy zacząć od rozmrożenia nieznakowanej tubuliny oraz tubuliny znakowanej rodaminą, a następnie niezwłocznie połączyć je w stosunku dwa do jednego (nieznakowana do znakowanej), aby uzyskać jasne mikrotubule.Wymieszaj je dokładnie, kilkukrotnie pipetując w górę i w dół. Następnie polimeryzuj tubulinę przez 20 do 40 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Przygotuj bufor Taxol, mieszając 20 µM Taxolu z buforem pipee.Wymieszać dokładnie, pipetując ciecz kilkakrotnie w górę i w dół oraz stosując wortex, a następnie umieścić probówkę w łaźni wodnej nagrzanej do 37 °C. Po polimeryzacji rozcieńczyć mikrotubule w ciepłym buforze Taxol i chronić je przed światłem. Zweryfikować, czy polimeryzacja mikrotubul przebiegła pomyślnie i czy mikrotubule pozostają stabilne podczas kilkuminutowego wzbudzania fluorescencyjnego.Obrazuj przygotowane mikrotubule z zastosowaniem mieszaniny usuwającej tlen, gdy polimeryzacja tubuliny w mikrotubule zostanie zakończona. Przejdźmy do wzorowania MTS za pomocą elektroforezy. Aby zacząć, potnij dwustronną taśmę na cienkie paski, kładąc ją na szkiełku przedmiotowym i używając żyletki. Przyklej dwa paski taśmy dwustronnej w poprzek próbki pokrytej Sam, tak aby elektroda znajdowała się pomiędzy paskami, a ścieżka połączenia przebiegała prostopadle do taśmy.Umieść elektrodę pomocniczą na dwustronnej taśmie klejącej, tak aby metalowa strona dotykała taśmy, a krawędź próbki wystawała poza elektrodę pomocniczą o około trzy milimetry. Odetnij kilka odcinków izolowanego miedzianego drutu magnetycznego o długości 15 centymetrów i usuń jeden centymetr izolacji z obu końców. Używając małej kropli farby srebrowej, przymocuj drut do odsłoniętego złotego obszaru podłoża, dbając o to, aby nie stworzyć kontaktu elektrycznego z elektrodą pomocniczą.Teraz należy użyć farby srebrowej, aby przymocować drugi przewód do przeciwelektrody. Przewody elektrod przymocowane farbą srebrową można dodatkowo zabezpieczyć na próbkach za pomocą taśmy. Następnie, używając pipety, należy wprowadzić mikrotubule w wybranym rozcieńczeniu, obrazować je przy 20-krotnym powiększeniu i zlokalizować wzór na waflu krzemowym przed przyłożeniem napięcia.Ze względu na głębokość komory przepływowej, do obrazowania jej górnej powierzchni mogą być potrzebne obiektywy z dużą odległością roboczą. Odległość od powierzchni próbki do górnej powierzchni komory przepływowej jest określona przez grubość taśmy i powinna wynosić około 60 do 100 micrometers. Przyłóż napięcie do 1 V i obserwuj migrację mikrotubul.Jeśli pożądane jest odwracalne unieruchomienie mikrotubul, należy użyć lakieru do paznokci do uszczelnienia komory przepływowej, aby zapobiec dryfowi bocznemu, oraz stosować niższe napięcia, w zakresie do około 0,5 V. Migrację można śledzić, dostosowując pionową płaszczyznę ogniskowania mikroskopu; przy przyłożonym napięciu od około 0,9 do 1,2 V mikrotubule lokalizują się na powierzchniach elektrod.Wyższe napięcie przyspieszy migrację i wzmocni adhezję, jednak zbyt wysokie napięcie wywoła elektrolizę i doprowadzi do depolimeryzacji. Mikrotubule: zaprezentowaliśmy właśnie sposób przygotowania mikroelektrod powlekanych SAM do wzorowania mikrotubul, ponieważ powłoka SAM zapobiega absorpcji mikrotubul na mikroelektrodach. Procedura ta może być również wykorzystana do odwracalnego wzorowania mikrotubul.Ponadto proces ten nie ogranicza się wyłącznie do mikrotubul, lecz może być stosowany do wzorowania biomolekuł w ogóle. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.

antifouling-self-assembled-monolayers-on-microelectrodes-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Warstwy monomolekularne samouzbrajace się ochrony antyfoulingowej na mikroelektrodach do układania biocząsteczki

Niebędąca podatna na fouling monowarstwa silanu PEG została desorbowana z indywidualnie adresowalnych elektrod ITO na szkle poprzez przyłożenie potencjału redukcyjnego. Elektrochemiczne usuwanie warstwy silanu PEG z mikroelektrod ITO umożliwiło adhezję komórek w sposób przestrzennie zdefiniowany, przy czym wzory komórkowe ściśle odpowiadały rozmieszczeniu elektrod.

Wzorcowanie komórek na optycznie przezroczystych elektrodach z tlenku indu i cyny

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Koloidy złota stabilizowane alkanotiolanami, znane jako klastry chronione monowarstwą (MPCs), są syntetyzowane, charakteryzowane i montowane w cienkie filmy służące jako interfejs adsorpcyjny dla elektrochemii monowarstw białkowych w przypadku prostych białek redoks, takich jak azuryna (AZ) z Pseudomonas aeruginosa oraz cytochrom c (cyt c).

Synteza, montaż i charakterystyka filmów z nanocząsteczek złota chronionych monowarstwą do elektrochemii monowarstw białek

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorów komórkowych na SiO2 kompatybilną z mikrofabrykacją. Predefiniowany wzór parylenu-C jest drukowany fotolitograficznie na płytkach SiO2. Po inkubacji z surowicą (lub innym roztworem aktywacyjnym) komórki przylegają specyficznie (i rosną zgodnie z zgodnością) leżącego poniżej parylenu-C, będąc jednocześnie odpychane przez regiony SiO2.

Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie 
Parylene-C: Substraty SiO2

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Rusztowanie inspirowane biologią jest wytwarzane techniką miękkiej fotolitografii przy użyciu mechanicznie wytrzymałych i elektrycznie przewodzących hydrożeli. Hydrożele z mikrowzorem zapewniają kierunkowe wyrównanie komórek kardiomiocytów, co skutkuje dostosowanym kierunkiem uruchamiania. Elastyczne mikroelektrody są również zintegrowane z rusztowaniem, aby zapewnić kontrolę elektryczną dla samoczynnie działającej tkanki serca.

Miękki robot inspirowany biologicznie z wbudowanymi mikroelektrodami

Prezentujemy technologię, która wykorzystuje wspomagany kapilarność montaż w platformie mikroprzepływowej do modelowania mikroobiektów zawieszonych w cieczy, takich jak bakterie i koloidy, w określone tablice na podłożu z polidimetylosiloksanu.

Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

Poznaj metodę tworzenia przeciwporostowej monowarstwy PEG-SAM na mikroelektrodach złotych do precyzyjnego nanostrukturalnego wzorcowania mikrotubulek metodą elektroforezy.

Antyfouling samoorganizujące się monowarstwy na mikroelektrodach do wzorcowania biomolekuł

Przeglądaj więcej filmów