Name: Generowanie chimerycznych zarodków danio pręgowanego przez przeszczep (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-17T16:04:00.000+00:00
Duration: 21 min 1 s
Description: Poznaj technikę tworzenia chimerycznych zarodków Danio rerio przez przeszczep komórek na etapie blastuli lub gastruli. Ta metoda pozwala badać funkcje genów podczas rozwoju i analizować interakcje komórkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Moensa za pomocne uwagi podczas pisania tego artykułu. H.K. jest stypendystą post-doctoral wspieranym przez grant NIH/NICHD nr 5R01HD037909-08. C.B.M. jest badaczem w Howard Hughes Medical Institute.

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+and+developmental+potential+of+cells+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo.</a> Trends Genet. 4, 68-74 (1988).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ-cell+development%3A+the+zebrafish+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective.</a> Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124, 3157-3165 (1997).</li>
<li>Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+nanos-related+gene+is+essential+for+the+development+of+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells.</a> Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).</li>
<li>Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tissues+and+patterning+events+required+for+distinct+steps+in+early+migration+of+zebrafish+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells.</a> Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).</li>
<li>Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+by+attraction+towards+an+intermediate+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target.</a> Development. 129 (1), 25-36 (2002).</li>
<li>Ciruna, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).</li>
<li>Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+zebrafish+pbx+proteins+reveals+a+hindbrain+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state.</a> Dev Cell. 3, 723-733 (2002).</li>
<li>Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).</li>
<li>Blaser, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
</ol>

Łatwość, z jaką transplantację można wykorzystać do tworzenia ukierunkowanych chimer, jest jedną z największych zalet danio pręgowanego jako modelu kręgowca. Modyfikacja tego protokołu, nieopisana powyżej, pozwala na analizę funkcji genów matczynych w przypadku genów pełniących kluczowe role w rozwoju zygoticznym. Ponieważ ryby z takimi mutacjami nie są w stanie przeżyć do wieku dorosłego, konieczne jest przeniesienie zmutowanej linii zarodkowej do zarodka gospodarza o genotypie typu dzikiego, co pozwala na stworzenie „k...

<table><tbody><tr><td>Urządzenie do iniekcji</td><td>Zastosowana Instrumentacja Naukowa</td><td>MPPI-3</td><td>Pedał nożny można zamówić oddzielnie</td></tr><tr><td>Pronaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>proteaza typu XIV&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>roztwór stokowy 100x</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-0387</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescejące dekstrany</td><td>Sondy molekularne, Life Technologies</td><td>różne</td><td>np. rodamina dekstran z możliwością wiązania z lizyną (D7162)</td></tr><tr><td>Pipety do iniekcji (1,2 mm x 0,94 mm x 10 cm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-94-10</td><td></td></tr><tr><td>Opcja 1 przenoszenia pipetą</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Opcja 2 przeniesienia pipetą</td><td>VWR international</td><td>#53508-400</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>UMJ-3FC (?)</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczna podstawa mikromanipulatora</td><td>Narishige International</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Aparat transplantacyjny</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MI-10010</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjny mikromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MMO-203</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy dotyczące depresji</td><td>Fisher Scientific</td><td>12560A</td><td></td></tr><tr><td>Formy agarowe do iniekcji i transplantacji</td><td>AL-AN Mfg, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy przetłumaczyć materiał zgodnie z Twoimi wytycznymi, zachowując precyzję terminologiczną i akademicki rejestr języka polskiego.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Odczynniki:&lt;/strong&gt; Przepisy na wiele z odczynników stosowanych w tych procedurach znajdują się w książce The Zebrafish Book, która jest w całości dostępna online pod adresem &lt;a href=&quot;http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html&quot;&gt;http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html&lt;/a&gt;Podano tam receptury na przygotowanie wody rybiej, pożywki dla embrionów z antybiotykami i bez nich, pronazy do usuwania błony chorionowej, dekstranów fluorescencyjnych oraz metylocelulozy.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

Jednym z najpotężniejszych narzędzi służących do zgłębienia złożonych procesów rozwojowych jest analiza embrionów chimerycznych. Chimerę definiuje się jako organizm zawierający komórki pochodzące od więcej niż jednego zwierzęcia; mozaiki są rodzajem chimery, w której zmieszane są komórki o więcej niż jednym genotypie, zazwyczaj typu dzikiego i mutanty. U danio przebrwionego chimery można łatwo uzyskać poprzez transplantację komórek z embrionu dawcy do embrionu biorcy na odpowiednim etapie rozwoju. Znakowane komórki dawcy generuje się poprzez wstrzyknięcie markera linii komórkowej, takiego jak barwnik fluorescencyjny, do embrionu w stadium jednego komórki. Znakowane komórki dawcy są pobierane z embrionów dawców i wprowadzane do nieznakowanych embrionów biorców przy użyciu szklanej pipety z kontrolą olejową, zamontowanej na mikroskopie złożonym lub stereomikroskopie. W niektórych przypadkach komórki dawcy mogą być kierowane do konkretnego regionu lub tkanki rozwijającego się embrionu biorcy w stadium blastuli lub gastruli, poprzez wybór miejsca transplantacji w embrionie biorcy w oparciu o dobrze opracowane mapy losów komórek.

Przewodnik krok po kroku po generowaniu ukierunkowanych chimerycznych zarodków danio przewrotnego poprzez transplantację w stadium blastuli lub gastruli.

Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Jednym z najpotężniejszych narzędzi służących do zgłębiania złożonych procesów rozwojowych jest analiza embrionów chimerycznych. Chimerę definiuje się jako...

Cześć, jestem Hillary Kemp z laboratorium Cecilii Owens. A ja jestem Cecilia Owens. Wraz z Hillary pracujemy w dziale nauk podstawowych w Fred Hutchinson Cancer Research Center w Seattle.Dzisiaj przedstawimy technikę tworzenia chimerycznych zarodków danio przebrzmiałego, znanych również jako mozaiki genetyczne. Procedura ta pozwala nam ocenić komórkowe podstawy funkcji genów podczas rozwoju. Możemy zbadać, czy dany gen funkcjonuje wewnątrz komórek o fenotypie mutanta, co określa się jako funkcję autonomiczną komórkowo, czy też w ich środowisku, co określa się jako brak autonomii komórkowej.Tworzymy te mozaiki poprzez transplantację komórek między embriony typu dzikiego a mutantami w stadium blastuli lub wczesnej gastruli. Następnie oceniamy funkcję genów, obserwując fenotyp i genotyp komórek pochodzących od dawcy w ich środowisku gospodarza. Zacznijmy zatem.W tej części protokołu do embrionu dawcy wstrzykuje się barwnik linii komórkowej, aby umożliwić śledzenie losów komórek pochodzących od dawcy po transplantacji. Za pomocą tej techniki można wstrzyknąć dowolny rodzaj kwasów nukleinowych; jednak w przypadku wstrzykiwania DNA należy pominąć etap dekoracji przed pracą z embrionami. Następnie przygotowuje się szalkę do iniekcji, umieszczając szkiełko przedmiotowe pod kątem 45 stopni w najszerszej części szalki Petriego, wypełnionej w trzech czwartych pożywką dla embrionów 1.2% aros w pen strep.Usuń szkiełko po zastygnięciu agaru, aby utworzyć skośną rynienkę. Wypełnij rynienkę pożywką dla embrionów z pen strep. Następnie przejdź do enzymatycznej dekortykacji embrionów w jednym stadium rozwojowym.Inkubować zarodki w stadium jednego komórki od jednej do pięciu minut w roztworze pronazy o stężeniu 0,5 mg/mL. Ściśle monitorować proces dekortykacji.Gdy tylko chorion zacznie widocznie zapadać się, zanurz embriony w wodzie systemowej. Następnie odlej cały chorion, podczas gdy embriony pozostaną na dnie zakrzywionego naczynia. Bardzo ważne jest, aby embriony nie uderzyły ponownie o powierzchnię wody; większość z nich nie posiada już chorionu. Kilka sztuk, które wciąż go mają, wiruje na zewnątrz.Jeśli jakiekolwiek zarodki nadal znajdują się w chorionie, pipetowanie ich w ten sposób pozwoli na ich wydobycie i uwolnienie, dzięki czemu nigdy nie dotkną one powierzchni wody. Ważne jest, aby obchodzić się z zarodkami pokrytymi powłoką za pomocą pipety, której krawędzie zostały wygładzone poprzez polerowanie ogniowe. Delikatnie przenieś delikatne zarodki pokryte powłoką dec do korytka naczynia do iniekcji, używając szklanej pipety o szerokim światle, wypolerowanej ogniowo.Następnie umieszczamy pojedynczy plik w tym korytku. Zarodki są teraz gotowe do wstrzyknięcia markera linii komórkowych przy użyciu precyzyjnie skalibrowanej, wyciąganej ogniem pipety szklanej oraz urządzenia do wtrysku ciśnieniowego. Użyjemy naczynia wypełnionego medium do zarodków do ułamania igły oraz naczynia wypełnionego olejem do skalibrowania igły.Jest to zwykły olej mineralny o standardowej czystości laboratoryjnej. Używamy pary zaostrzonych pęset zegarmistrzowskich, a następnie, patrząc przez okulary, aby określić odpowiedni rozmiar, umieszczamy pęsetę po obu stronach igły i delikatnie odłamujemy fragment, czego nie jestem w stanie zrobić bez patrzenia. Aby określić objętość dostarczanego barwnika lub rybonukleotydu przed rozpoczęciem.Zmierzyć wielkość bolusa w naczyniu z olejem mineralnym. Igłę należy odłamać tak, aby jednym lub dwoma impulsami mikroinjektora podać bolus o objętości jednego nanolitra. Objętość bolusa można obliczyć na podstawie jego średnicy zmierzonej za pomocą mikrometru okularowego.Wstrzyknij jeden nanolitr od 1 do 3% roztworu fluorescencyjnego dekstranu bezpośrednio do żółtka pokrytych embrionów w stadium od jednego do czterech komórek. Teraz umieszczę embrion dokładnie pod igłą. Delikatnie wbiję igłę w środek żółtka i nacisnę pedał sterujący.Podczas wstrzykiwania ważne jest, aby celować w prądy żółtkowe, tak aby barwnik został przetransportowany do komórek. Taka iniekcja będzie wystarczająca do śledzenia komórek w embrionach chimerycznych przez kilka dni rozwoju. Idealnie należy to wykonać, zanim komórki osiągną stadium czterokomórkowe. Hoduj wstrzyknięte embriony przy niskiej gęstości w powlekonej płytce Petriego wypełnionej świeżą pożywką do embrionów z dodatkiem penstrepu.Należy zauważyć, że wstrzyknięte zarodki mają tendencję do nieco wolniejszego tempa rozwoju; należy inkubować zarodki w różnych temperaturach, 25, 28 i 31 stopni Celsjusza, aby rozłożyć ich rozwój w czasie i zmaksymalizować okno czasowe, w którym można przeprowadzić przeszczepy. Aparatura używana do transplantacji komórek w blastuli danio prążkowanego składa się ze strzykawki Hamiltona z kontrolą napędu, połączonej za pomocą trójdrożnego kurka z rezerwuarem oleju mineralnego oraz z uchwytem mikropipety za pomocą odcinka elastycznego przewodu. Należy usunąć z układu wszystkie pęcherzyki powietrza, ponieważ uniemożliwią one kontrolę nad ssaniem i ciśnieniem.Należy użyć stereomikroskopu wyposażonego w wysokiej jakości optykę o powiększeniu co najmniej DX. Do sterowania pozycjonowaniem uchwytu mikropipety i igły zaleca się użycie manualnego mikromanipulatora NARA shige. Należy upewnić się, że jest on przymocowany do stołu laboratoryjnego za pomocą podstawy magnetycznej, aby zapobiec przenoszeniu drgań na przeszczep.Igły do transplantacji wykonuje się z szklanych pipet kapilarnych, które są wyciągane do łagodnego zwężenia na biegunie elektrody. Szczegóły dotyczące wyciągania pipet pod mikroskopem dissectingowym oraz odłamywania końcówki wyciągniętej igły znajdują się w protokole JoVE z laboratorium Miriam Goodman. W przypadku transplantacji na etapie blastuli średnica zewnętrzna igły powinna wynosić od około 50 do 60 micronów, a dla transferu na etapie gastruli od 30 do 40 micronów.Aby przeprowadzić transfer w fazie gastruli i poprawić penetrację, najpierw należy wyciągnąć ostry zadzior na końcu igły za pomocą mikrokuźni, wygładzając końcówkę igły poprzez zbliżenie jej do włókna mikrokuźni. Następnie należy obrócić igłę tak, aby krawędź prowadząca ścięcia mogła zetknąć się z włóknem. Gdy krawędź prowadząca igły dotknie włókna, należy ją szybko odsunąć, aby utworzyć zadzior.Aby uniknąć uszkodzenia komórek, zadziorek powinien być prosty, a końcówka igły nie powinna być zakrzywiona. Po przygotowaniu zestawu oraz igieł do transplantacji można przystąpić do tworzenia embrionów chimerycznych. Transplantacje w stadium blastuli stosuje się do przenoszenia komórek między embrionami w sytuacjach, gdy nie jest wymagana precyzyjna informacja o mapie losów komórkowych. Z wyjątkiem pierwotnych komórek linii zarodkowej, większość komórek na tym etapie zazwyczaj nie jest jeszcze zdeterminowana pod kątem konkretnego losu.Mapa losów blastuli jest taka, że możemy rozróżnić komórki, z których powstanie ektoderma, od komórek, z których powstanie mezoderma. Progenitory mezodermalne i endodermalne znajdują się w pobliżu brzegu zarodka na etapie blastuli, podczas gdy progenitory dermalne, z których powstanie układ nerwowy i skóra powierzchniowa, znajdują się dalej od brzegu zarodka. Dzięki temu, podczas transplantacji komórek do zarodków na etapie blastuli, możemy skierować te komórki do domniemanej mezodermy lub domniemanej ektodermy.Nie możemy jednak skierować komórek do żadnego konkretnego regionu ektodermy lub mezodermy, ponieważ nie wiemy, gdzie on się znajduje. Na etapie blastuli, w miejscu, gdzie znajduje się strona grzbietowa embrionu, przygotuj wcześniej naczynia do iniekcji, umieszczając plastikową formę z parami rzędów klinowatych wypustek w szalce Petriego wypełnionej do połowy stopionym 1,2% agarosem w medium dla embrionów. Po zestaleniu się agarosu usuń szablon, pozostawiając rzędy trójkątnych wgłębień, z których każde jest wystarczająco duże, aby pomieścić jeden embrion.Wypełnij formę do transplantacji pożywką do embrionów z dodatkiem penstrepcyny, a następnie za pomocą wypalanej szklanej pipety umieść pojedynczo embriony w stadium blastuli w każdej z dolek. Przenieś teraz embriony do dolek transplantacyjnych, pozwalając im początkowo leżeć na boku. Ułóż embriony tak, aby embriony donora znajdowały się w jednej kolumnie, a embriony biorcy w kolumnie sąsiedniej.Ustaw szalkę na stole w taki sposób, aby w momencie wniknięcia igły transplantacyjnej do embrionu, igła dociskała go do tylnej ścianki dołka. Za pomocą mikromanipulatora opuść igłę transplantacyjną do szalki pod dość stromym kątem. Idealnie igła transplantacyjna powinna wnikać do embrionu pod kątem około 45 stopni.Gdy końcówka igły znajdzie się poniżej powierzchni medium do zarodków, pobierz niewielką ilość medium do wnętrza igły, obracając mikrometryczny napęd sterujący strzykawką Hamiltona. Aby uzyskać najdokładniejszą kontrolę, granica między olejem mineralnym a medium do zarodków powinna pozostać w cienkiej, zwężającej się części igły, nie za blisko jej końca. Delikatnie ustaw zarodek dawcy za pomocą igły, a następnie wycofaj igłę i wprowadź ją do czapki blastuli zarodka w wybranym miejscu.Szybkie, zdecydowane uderzenie pozwoli na przebicie się przez zarodek, zapobiegając jego przesunięciu. Należy powoli i ostrożnie pobrać komórki donora do igły, aby uniknąć ich uszkodzenia mechanicznego. Po pobraniu pożądanej liczby komórek należy unikać zasysania żółtka do wnętrza igły.Należy lekko odwrócić ciśnienie, aby zatrzymać ssanie, a następnie wyjąć igłę, aby ustawić zarodek biorcy w odpowiedniej pozycji. Poprzez przesuwanie naczynia do transplantacji można wprowadzać niewielkie korekty położenia zarodka biorcy, delikatnie obracając go za pomocą igły transplantacyjnej, dbając jednocześnie o to, aby nie dotknąć żółtka. Podczas wprowadzania komórek dawcy do zarodka biorcy należy unikać zasysania żółtka do wnętrza zarodka, ponieważ spowoduje to uszkodzenie i śmierć komórek dawcy; komórki z jednego zarodka dawcy mogą zostać przeszczepione do wielu biorców po zakończeniu transferów komórkowych.Przenieś pary dawca-gospodarz do powlekanych studzienek płytki 24-dołkowej, aby kontynuować rozwój. Jedynym wyjątkiem od reguły, zgodnie z którą komórki w stadium blastuli nie są jeszcze przypisane do konkretnych losów, są pierwotne komórki płciowe. Komórki pierwotne płciowe są specyfikowane bardzo wcześnie w rozwoju i są przypisane do stanu pierwotnych komórek płciowych.Od bardzo wczesnego etapu pierwotne komórki zarodkowe znajdują się w pobliżu brzegu blastuli oraz embrionu w stadium gastruli. Jeśli zatem celem eksperymentu transplantacyjnego jest przeszczepienie pierwotnych komórek zarodkowych, kluczowe jest miejsce, z którego pochodzą komórki w embrionie dawcy, natomiast nieistotne jest miejsce ich umieszczenia w embrionie biorcy. Zasadą jest zatem taka, że w przypadku komórek somatycznych to miejsce ich przeznaczenia w embrionie biorcy determinuje ich dalszy los.W przypadku pierwotnych komórek płciowych kluczowe jest miejsce ich pobrania z embrionu dawcy, ponieważ ich los jest już zdeterminowany. Jeśli celem jest transplantacja pierwotnych komórek płciowych, należy je pobrać z brzegu jaja embrionu dawcy; na tym etapie rozwoju (stadium sferuli lub wczesnym stadium) znajdują się one tuż przy brzegu embrionu w czterech małych skupiskach, z których każde składa się z trzech lub czterech komórek. Należy je pobierać bardzo ostrożnie, aby przypadkowo nie zasysać żółtka.W porządku, to wszystko, co zrobiłem, a teraz przechodzę do zarodka gospodarza. Prymordialne komórki płciowe będą teraz migrować do obszaru grzbietu płciowego w każdym zarodku, w którym się znajdą. W związku z tym nie ma potrzeby przeszczepiać tych prymordialnych komórek płciowych do krawędzi; dotrą tam samodzielnie.Zatem po prostu przesadzam je, umieszczając w dowolnym miejscu w organizmie po stadium embrionalnym. Kluczową kwestią w przypadku transplantacji komórek linii zarodkowej, co jest całkowitym przeciwieństwem każdego innego rodzaju przeszczepu, jest to, że istotne jest pochodzenie komórek dawcy. Transplantacja komórek do gospodarza w stadium gastrulacji pozwala eksperymentatorowi wykorzystać mapę losów komórek danio pręgowanego, która wyłania się, gdy staje się widoczna tarcza embrionalna.Można już rozróżnić różne typy tkanek, jak również domeny w obrębie presumptive central nervous system. Podczas przenoszenia komórek między embrionami na etapie gastruli występują pewne różnice w protokole, jednak ogólna procedura jest podobna do pracy z blastulami w celu zamontowania gastruli. Najpierw nałóż pionowy pasek metylocelulozy w zagłębieniu szkiełka wgłębnego, a następnie wypełnij je obfitą ilością pożywki dla embrionów z pen-strep, używając wypalanej pipety transferowej.Przenieś jednego dawcę i trzech gospodarzy w stadium tarczy do wgłębienia na preparacie. Wybierz embriony dawców, które są nieco młodsze od gospodarzy. Do manipulowania klejem gastralnym wymagane jest nowe narzędzie: końce krótkiego odcinka żyłki wędkarskiej o wytrzymałości dwóch funtów wprowadzone do końcówki rurki kapilarnej.W ten sposób tworzy się małą pętlę. Używając pętli, należy delikatnie przetoczyć embriony dawcy i biorcy na górną część paska z metylocelulozą i wcisnąć je w metylocelulozę, aż będą stabilnie osadzone. Należy je ustawić tak, aby docelowy region znajdował się na górze.Ponieważ podczas transplantacji igła wnika do zarodka stycznie, aby dostarczyć komórki dawcy bez uszkadzania żółtka, transplantacje w stadium gastruli najlepiej przeprowadzać przy użyciu mikroskopu złożonego ze stałym powiększeniem. Należy użyć sterowników mikromanipulatora, aby ustawić końcówkę igły do transplantacji w płaszczyźnie ostrości.Ustaw uchwyt mikropipety oraz igłę pod niewielkim kątem, tak aby igła znajdowała się jak najbliżej poziomu, na ile pozwala krawędź wgłębienia na szkiełku. Następnie przebij embrion dawcy. Jeśli jest on odpowiednio zamocowany, nie będzie się toczyć podczas wprowadzania igły do transplantacji, chyba że embrion jest zbyt stary, co utrudnia łatwe przeniknięcie igły.Aby uniknąć przebicia żółtka, igła powinna zostać wprowadzona do zarodka na płaszczyźnie ogniskowej znajdującej się nieco głębiej niż EDL. Po przebiciu z dawcy można pobrać dużą liczbę komórek, wystarczającą do wykonania do trzech iniekcji do komórek biorcy. Podczas pobierania komórek należy unikać zasysania żółtka, przesuwając igłę w miarę pobierania komórek, jeśli jest to pożądane.W celu pozyskania większej liczby komórek można pobrać dodatkowe embriony, używając tej samej igły przed wstrzyknięciem komórek do gospodarza; podczas wstrzykiwania komórek do embrionu gospodarza należy je uwalniać, przesuwając igłę przez docelowy obszar, zamiast osadzać komórki w jednej skupionej masie. Zwiększy to prawdopodobieństwo, że komórki donora przyczynią się do powstania pożądanego tkanki. Po zakończeniu transferu komórek należy umieścić cały preparat na szkiełku w czarce Petriego i ostrożnie zalać go pożywką do embrionów z dodatkiem pen strep.W ciągu następnych kilku godzin metyloceluloza rozpuści się, uwalniając embriony. Liczba przeniesionych komórek zależy od konkretnego celu eksperymentu. Komórki od jednego donora mogą zostać przeszczepione do trzech lub czterech biorców rano następnego dnia po transplantacji.Można zbadać organizmy biorcy, aby ustalić, czy celowanie w komórki dawcy zakończyło się sukcesem. Pomyślna transplantacja pierwotnych komórek płciowych z etapu blastuli skutkuje pojawieniem się fluorescencyjnie znakowanych komórek, rozmieszczonych brzusznie w pobliżu połączenia między ylk a przedłużeniem ylk. W ten sposób zaprezentowaliśmy, jak przeprowadzać transplantacje na etapie gastruli i blastuli.Podczas stosowania tej techniki ważne jest wybranie odpowiedniej metody transplantacji dla tkanki docelowej, w którą chcą trafić komórki. Transplantacja na etapie blastuli jest wystarczająca do ustalenia, czy komórki migrują do mezodermy, czy do ektodermy. Technikę tę można również wykorzystać do celowania w pierwotne komórki płciowe.Jeśli chcą Państwo przeprowadzić dokładniejsze mapowanie, lepiej jest zastosować transplantat w wieku gastruli, w którym określono już stronę grzbietową. Dzięki tej technice można kierować komórki do różnych części układu nerwowego, w szczególności do przedmózgowia, śródmózgowia, tyłomózgowia i rdzenia kręgowego. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we wszystkich Państwa eksperymentach.

generating-chimeric-zebrafish-embryos-by-transplantation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie chimerycznych zarodków rybki zebry przez przeszczepienie

Transplantacja komórek u rybek zebrafish umożliwia połączenie genetyki i embriologii w celu generowania chimer specyficznych dla danej tkanki. Niniejsze wideo demonstruje transplantacje komórek na etapie gastruli, które pozwoliły naszemu laboratorium zbadać role populacji astroglialnych oraz specyficznych sygnałów prowadzących podczas formowania się spoiw w przedmózgowiu.

Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

Prezentujemy protokół generowania chimerycznych embrionów rybek danio w celu obrazowania na żywo zachowania komórek podczas embriogenezy.

Transplantacja blastomerów wykazujących ekspresję GFP w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w chimerycznych embrionach danio pręgowanego

Ze względu na twardy chorion i delikatne embriony, manipulacja zarodkami medaki jest bardziej skomplikowana niż w przypadku danio prążkowanego. W tym filmie zaprezentowano krok po kroku procedury manipulacji embrionami medaki, w tym usuwanie chorionu (dechorionację), unieruchamianie w agarozie do obrazowania oraz transplantację komórek w celu wytworzenia chimer. Procedury te są niezbędne do wykorzystania medaki i danio prążkowanego w laboratorium, aby w pełni skorzystać z ich komplementarnych...

Dechorionizacja zarodków ryby medaka i transplantacja komórek w celu generowania chimer

Ten protokół zawiera instrukcję krok po kroku, jak generować parabiotyczne zarodki danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym. W połączeniu z niezrównanymi możliwościami obrazowania zarodka danio pręgowanego, metoda ta zapewnia wyjątkowo potężny środek do badania funkcji autonomicznych i nieautonomicznych komórek dla genów kandydujących na badanie.

Generowanie parabiotycznych zarodków danio pręgowanego poprzez chirurgiczne zespolenie rozwijających się blastuli

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepiania komórek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w zarodkach i larwach danio pręgowanego na każdym etapie, między co najmniej 1 a 7 dniem po zapłodnieniu.

Przeszczep komórek w wysokiej rozdzielczości u embrionów i larw danio pręgowanego

W niniejszym artykule prezentujemy metodę przeprowadzania HCT u dorosłych danio pręgowanych.

Przeszczepianie całego szpiku nerkowego u dorosłych danio pręgowanych

Poznaj technikę tworzenia chimerycznych zarodków Danio rerio przez przeszczep komórek na etapie blastuli lub gastruli. Ta metoda pozwala badać funkcje genów podczas rozwoju i analizować interakcje komórkowe.

Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Przeglądaj więcej filmów