Generowanie chimerycznych zarodków danio pręgowanego przez przeszczep

Cześć, nazywam się Hillary Kemp i pracuję w Laboratorium Cecilii Owens. A ja nazywam się Cecilia Owens. Hillary i ja pracujemy na wydziale nauk podstawowych w Fred Hutchinson Cancer Research Center w Seattle.

Dzisiaj pokażemy Wam technikę tworzenia chimerycznych zarodków danio pręgowanego, znaną również jako mozaiki genetyczne. Procedura ta pozwala nam ocenić komórkowe podstawy funkcji genów podczas rozwoju. Możemy zapytać, czy dany gen funkcjonuje w komórkach ze zmutowanym fenotypem znanym jako autonomiczna funkcja komórki, czy w środowisku tych komórek znanym jako brak autonomii komórki.

Tworzymy te mozaiki poprzez przeszczepianie komórek między dzikimi zarodkami ze zmutowanymi zarodkami w stadium blastuli lub wczesnego stadium żołądkowego. Następnie oceniamy funkcję genów, obserwując fenotyp i genotyp komórek pochodzących od dawcy w ich środowisku gospodarza. Więc zacznijmy.

W tej części protokołu do zarodka dawcy wstrzykuje się barwnik rodowy, aby można było śledzić losy komórek pochodzących od dawcy po przeszczepie. Za pomocą tej techniki można również wstrzykiwać dowolną różnorodność kwasów nukleinowych, jednak pomiń etap dekoracji podczas wstrzykiwania DNA przed pracą z zarodkami, przygotuj naczynie do wstrzykiwania, wkładając szklane szkiełko pod kątem 45 stopni w najszerszej części szalki Petriego. Trzy czwarte pełne 1,2% aros w pożywce zarodkowej paciorkowca piórowego.

Zdejmij zjeżdżalnię po tym, jak agro stężeje, aby zrobić skośne koryto. Napełnij koryto pożywką dla zarodków paciorkowca długopisowego. Teraz przystąp do enzymatycznej dekoracji zarodków w jednym stadium komórkowym.

Inkubuj zarodki na etapie jednej komórki przez jedną do pięciu minut w 0,5 miligrama na mililitr. Roztwór pronazy. Uważnie monitoruj dekorację.

Gdy tylko korion zacznie się widocznie zapadać, zanurz zarodki w wodzie systemowej A to wylewa całe korium, a zarodki pozostają w tyle na dole krzywej dzioba. I bardzo ważne jest, aby zarodki nie uderzyły o powierzchnię wody tylko jeden raz, a większość z nich miała wyłączony corion. Na zewnątrz krąży kilka rzeczy, które tego nie robią.

Jeśli coś nadal znajduje się w swoim rdzeniu, to akt pipetowania ich w ten sposób wydobędzie je na zewnątrz, a następnie uwolni zarodki, tak aby nigdy nie uderzyły o powierzchnię wody. Ważne jest, aby obchodzić się z powlekanymi zarodkami za pomocą pipety, która została wypolerowana ogniowo w celu wygładzenia jej krawędzi. Delikatnie przenieś delikatne zarodki pokryte dekiem do koryta naczynia iniekcyjnego za pomocą pipety z polerowanego szkła o szerokim otworze.

A potem ładujemy pojedynczy plik do tego koryta. Teraz zarodki są gotowe do wstrzyknięcia za pomocą markera linii za pomocą precyzyjnie skalibrowanego ognia, wyciągniętej szklanej pipety iniekcyjnej i ciśnieniowego zestawu do wstrzykiwań. Użyjemy naczynia pełnego pożywki z zarodków, aby złamać igłę i naczynia pełnego oleju, aby skalibrować igłę.

Jest to po prostu zwykły standardowy olej mineralny klasy laboratoryjnej. Bierzemy parę zaostrzonych kleszczyków zegarmistrzowskich, a następnie, patrząc przez okulary, aby określić, jaki byłby właściwy rozmiar, kładziemy kleszcze po obu stronach igły, a następnie delikatnie odłamujemy chip, czego właściwie nie mogę zrobić bez patrzenia Aby określić objętość dostarczanego barwnika lub rybonukleotydu. Przed rozpoczęciem.

Zmierz rozmiar bolusa w naczyniu z olejem mineralnym. Igłę należy odłamać tak, aby bolus o mocy jednego nanolitra został dostarczony z jednym lub dwoma impulsami mikrowtryskiwacza. Objętość bolusa można obliczyć na podstawie jego średnicy mierzonej za pomocą mikrometru okularowego.

Wstrzyknąć jeden nanolitr od jednego do 3% roztworu fluorescencyjnego dekstranu bezpośrednio do ylk powlekanych zarodków między etapem jednej do czterech komórek. To, co zamierzam zrobić, to umieścić zarodek tuż pod igłą. Zamierzam delikatnie wbić igłę w środek żółtka i wcisnąć pedał nożny.

Po wstrzyknięciu ważne jest, aby wstrzyknąć do strumieni żółtka, aby barwnik został przetransportowany do komórek. To wstrzyknięcie będzie wystarczające do śledzenia komórek w chimerycznych zarodkach przez kilka dni rozwoju. Idealnie byłoby, gdybyśmy zrobili to, zanim komórki osiągną stadium czterokomórkowe, Podnieś wstrzyknięte zarodki o niskiej gęstości na powlekanej szalce Petriego wypełnionej świeżym zarodkiem paciorkowca piórowego. Średni.

Należy pamiętać, że wstrzykiwane zarodki mają zwykle nieco spowolnione tempo rozwoju, inkubują zarodki w różnych temperaturach, 25, 28 i 31 stopni Celsjusza, aby rozłożyć ich rozwój i zmaksymalizować okno czasowe, w którym można wykonać przeszczepy. Aparatura używana do przeszczepu komórek u blastuli zebry składa się ze sterowanej napędem strzykawki Hamiltona, przymocowanej za pomocą trójdrożnego kurka odcinającego do zbiornika oleju mineralnego i do uchwytu na mikropipety za pomocą elastycznej rurki. Wyeliminuj wszystkie pęcherzyki powietrza z systemu, ponieważ zrujnują one Twoją zdolność do kontrolowania ssania i ciśnienia.

Użyj mikroskopu stereoskopowego z wysokiej jakości optyką o powiększeniu co najmniej DX. Aby kontrolować położenie uchwytu na mikropipety i igły, sugerujemy ręczny mikromanipulator NARA shige. Upewnij się, że jest przymocowany do ławki za pomocą podstawy magnetycznej, aby zapobiec przenoszeniu wibracji na przeszczep.

Igły do przeszczepów igieł są wykonane ze szklanych pipet kapilarnych, które są przyciągane do delikatnego stożka na biegunowej elektrodzie. Zapoznaj się z protokołem JoVE z laboratorium Miriam Goodman, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wyciągania pipet pod mikroskopem preparacyjnym, odłamania końcówki wyciągniętej igły. W przypadku przeszczepów w stadium blastuli zewnętrzna średnica igły powinna wynosić około 50 do 60 mikronów lub 30 do 40 mikronów w przypadku transferu w stadium żołądkowym.

Aby przenieść się na etapie żołądkowym, aby poprawić penetrację, należy najpierw pociągnąć ostry zadzior na końcu igły za pomocą mikro paszy, wygładzić końcówkę igły, zbliżając ją do włókna mikro kuźni. Następnie obróć igłę tak, aby krawędź natarcia skosu mogła zetknąć się z filamentem. Gdy krawędź natarcia igły zetknie się z filamentem, szybko go odciągnij, aby utworzyć zadzior.

Aby uniknąć uszkodzenia komórek, zadzior powinien być prosty, a końcówka igły nie powinna się zakrzywiać Mając przygotowany zestaw i igły do przeszczepów, jesteś gotowy do tworzenia chimerycznych zarodków. Przeszczepy blastuli są używane do przeszczepiania komórek między zarodkami, gdy dokładne informacje o mapie losu nie są wymagane. Z wyjątkiem pierwotnych komórek rozrodczych, większość komórek na tym etapie na ogół nie jest skazana na los.

Mapa losów blastuli jest taka, że możemy rozróżnić komórki, które dadzą początek ektodermie i komórkom, które dadzą początek mezodermie. Mezodermalny i endodermalny leżą w pobliżu brzegu zarodka w stadium blastuli, podczas gdy przodkowie skórni, którzy dadzą początek układowi nerwowemu i powierzchniowej skórze właściwej, leżą dalej od brzegu zarodka. Więc kiedy przeszczepiamy komórki do zarodków w stadium blastuli, możemy skierować te komórki do przypuszczalnej mezodermy lub przypuszczalnej ektodermy.

Ale nie możemy kierować komórek do żadnego konkretnego regionu ektodermy lub mezodermy, ponieważ nie wiemy. W stadium blastuli, gdzie znajduje się grzbietowa strona zarodka, przygotuj wcześniej naczynia do wstrzykiwań, unosząc plastikową formę z parami rzędów wypukłości w kształcie klina na szalce Petriego, do połowy wypełnionej stopionym 1,2% aros w pożywce zarodkowej. Gdy aros zastygnie, usuń szablon, pozostawiając rzędy trójkątnych studzienek, z których każdy jest wystarczająco duży, aby pomieścić jeden zarodek.

Napełnij formę transplantacyjną pożywką dla zarodków z paciorkowca i załaduj zarodki w stadium blastuli pojedynczo do każdej studzienki za pomocą pipety z polerowanego ogniowo szkła. Teraz przenieś zarodki do dołków do przeszczepu, początkowo pozwól im leżeć na boku. Ułóż zarodki tak, aby zarodki dawcy były umieszczone w jednej kolumnie, a zarodki gospodarza w sąsiedniej kolumnie.

Umieść szalkę na stoliku tak, aby gdy igła do przeszczepu wejdzie do zarodka, igła docisnęła zarodek do tylnej ściany jego studni. Za pomocą mikromanipulatora opuść igłę do przeszczepu do naczynia pod dość ostrym kątem. Idealnie byłoby, gdyby igła do przeszczepu weszła do zarodka pod kątem około 45 stopni.

Gdy końcówka igły znajdzie się pod powierzchnią pożywki zarodkowej, należy wciągnąć niewielką ilość pożywki zarodkowej do igły, przekręcając napęd mikrometryczny sterujący strzykawką Hamiltona. W celu uzyskania najbardziej precyzyjnej kontroli, granica faz między olejem mineralnym a pożywką zarodkową powinna pozostać w cienkiej, stożkowej części igły, nie za blisko końca. Delikatnie ustawić zarodek dawcy za pomocą igły, a następnie cofnąć igłę i wprowadzić do osłonki blastuli zarodka w żądanej pozycji.

Szybkie, mocne uderzenie przeniknie do zarodka, nie powodując jego toczenia. Powoli i ostrożnie pobieraj komórki dawcy do igły, aby uniknąć ścinania komórek. Należy unikać wprowadzania żółtka do igły po pobraniu pożądanej liczby komórek.

Nieznacznie odwróć ciśnienie, aby zatrzymać ssanie i wyjmij igłę z zarodka gospodarza na miejsce. Przesuwając naczynie do przeszczepu, można dokonać niewielkich korekt pozycji zarodka gospodarza, delikatnie obracając go za pomocą igły do przeszczepu, o ile zachowa się ostrożność, aby nie dotknąć żółtka. Podczas wydalania komórek dawcy do zarodka gospodarza należy unikać przyjmowania ylk do zarodka, ponieważ spowoduje to uszkodzenie i zabicie komórek dawcy z jednego dawcy zarodek, który może zostać przeszczepiony do wielu gospodarzy po zakończeniu transferu komórek.

Przenieś pary gospodarzy dawcy do powlekanych studzienek 24-dołkowej płytki, aby kontynuować rozwój. Jedynym wyjątkiem od reguły, że komórki nie są zobowiązane do określonego losu w stadium blastuli, są pierwotne komórki rozrodcze. Pierwotne komórki rozrodcze są określane na bardzo wczesnym etapie rozwoju i są zobowiązane do losu swojego pierwotnego stanu komórki rozrodczej.

Od bardzo wczesnego stadium pierwotne komórki rozrodcze leżą w pobliżu brzegu blastuli i zarodka w stadium gast. Jeśli więc celem eksperymentu transplantacyjnego jest przeszczepienie pierwotnych komórek rozrodczych, to bardzo ważne jest, skąd pochodzą one w zarodku dawcy, a nie gdzie trafiają do zarodka gospodarza. Zasada jest więc taka, że w przypadku komórek somatycznych ważne jest, gdzie trafią w zarodku gospodarza, co zadecyduje o ich losie.

Gdzie w przypadku pierwotnych komórek rozrodczych ważne jest, skąd pochodzą w zarodku dawcy, ponieważ ich los jest już przesądzony. Jeśli celem jest przeszczepienie pierwotnych komórek rozrodczych, to komórki te muszą zostać pobrane z marginesu nadziei zarodka dawcy i znajdują się tuż przy brzegu zarodka w czterech małych skupiskach po trzy lub cztery komórki na tym arkuszu, w tym stadium włóczni lub wysokim etapie rozwoju. I trzeba je podnosić bardzo ostrożnie, aby przypadkowo nie zacząć zasysać żółtka.

Okej, i to jest to, co tam zrobiłem, a teraz przechodzę do zarodka gospodarza. Teraz pierwotne komórki rozrodcze skupią się na obszarze grzbietu narządów płciowych dowolnego zarodka, w którym się znajdują. Nie ma więc potrzeby przeszczepiania tych pierwotnych komórek rozrodczych na margines, do którego same tam dotrą.

Więc po prostu przesadzam je z powrotem w dowolne stare miejsce do postembrionu. Kluczem do przeszczepu komórek rozrodczych, który jest zupełnym przeciwieństwem każdego innego rodzaju przeszczepu, jest to, że ma znaczenie, skąd pochodzą komórki dawcy. Przeszczepienie komórek do gospodarza w stadium gastrologicznym pozwala eksperymentatorowi skorzystać z mapy losu zebry danio pręgowanego, która pojawia się, gdy tarcza embrionalna staje się widoczna.

Możliwe staje się rozróżnienie różnych typów tkanek, a także domen w obrębie przypuszczalnego ośrodkowego układu nerwowego. Podczas przenoszenia komórek między zarodkami na etapie listy żołądkowej istnieją pewne różnice w protokole, ale ogólna procedura jest podobna do pracy z blastosami w celu zamontowania gastro. Najpierw rozsmaruj pionowy pasek metylocelulozy w wgłębieniu szklanego szkiełka wgłębnego, a następnie zalej dużą ilością pożywki z zarodków paciorkowca za pomocą polerowanego ogniowo transferu pipetą.

Jeden dawca i trzech gospodarzy etapu tarczy do zjeżdżalni depresyjnej. Wybierz zarodki dawców, które są nieco młodsze od gospodarzy. Potrzebne jest nowe narzędzie do manipulowania klejem gastros, końcami krótkiej dwufuntowej żyłki testowej do końca rurki kapilarnej.

W ten sposób tworząc małą pętlę. Użyj pętli, aby delikatnie zwinąć zarodki dawcy i gospodarza na wierzch paska metylocelulozy i wepchnąć je do metylocelulozy, aż będą bezpieczne. Przetocz je na pozycję tak, aby docelowy region znajdował się najwyżej.

Ponieważ podczas przeszczepu igła wejdzie do zarodka stycznie, aby dostarczyć komórki dawcy bez uszkadzania ylk. Przeszczepy w fazie żołądkowej najlepiej wykonywać pod mikroskopem złożonym ze stałym stopniem. Użyj elementów sterujących mikromanipulatora, aby ustawić ostrość końcówki igły do przeszczepu.

Umieść uchwyt na mikropipety i igłę pod dość płytkim kątem, tak aby igła znajdowała się tak blisko poziomu, jak pozwala na to krawędź wgłębienia na szkiełku. Następnie przekłuć zarodek dawcy. Jeśli zarodek jest prawidłowo zamontowany, nie będzie się toczył, gdy igła do przeszczepu zostanie wprowadzona, chyba że zarodek jest zbyt stary, aby igła mogła łatwo wniknąć.

Aby uniknąć przebicia ylk, igła powinna wejść do zarodka w płaszczyźnie ogniskowej, która jest nieco głębsza niż w EDL. Po przekłuciu można pobrać od dawcy dużą liczbę komórek w celu wykonania maksymalnie trzech wstrzyknięć do komórek gospodarza. Podczas pobierania komórek należy unikać zasysania żółtka poprzez przesuwanie igły, gdy komórki są pobierane, jeśli jest to pożądane.

Dodatkowe zarodki można pobrać dla większej liczby komórek za pomocą tej samej igły przed wyrzuceniem komórek do gospodarza, podczas wyrzucania komórek do gospodarza zarodek wydala komórki, podczas gdy igła jest przeciągana przez obszar docelowy, w przeciwieństwie do osadzania komórek w jednej kępce. Zwiększy to prawdopodobieństwo, że komórki dawcy przyczynią się do powstania pożądanej tkanki. Po zakończeniu transferów komórkowych umieść całe szkiełko na szalce Petriego i ostrożnie zalej je zarodkiem paciorkowca. Średni.

W ciągu najbliższych kilku godzin metyloceluloza rozpuści się, uwalniając zarodki. Liczba przenoszonych komórek zależy od konkretnego celu eksperymentu. Komórki od jednego dawcy mogą być przeszczepione do trzech lub czterech gospodarzy następnego dnia po przeszczepie.

Gospodarzy można zbadać w celu określenia, czy celowanie w komórki dawcy zakończyło się sukcesem. Udane przeszczepienie pierwotnych komórek rozrodczych z wieku blastuli skutkuje powstaniem komórek znakowanych fluorescencyjnie, umieszczonych brzusznie w pobliżu połączenia między ylk a przedłużeniem ylk. Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać przeszczep gastruli i blastuli.

Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby wybrać odpowiedni rodzaj metody przeszczepu dla tkanki docelowej, którą masz nadzieję dotrzeć do swoich komórek. Tak więc przeszczep w stadium blastuli jest wystarczający do określenia, które komórki trafiają do skóry właściwej, a nie do ektodermy. Możesz również użyć tej techniki, aby celować w pierwotne komórki rozrodcze.

Jeśli chcesz wykonać dokładniejsze mapowanie, lepiej jest użyć przeszczepu w wieku żołądkowym, w którym strona grzbietowa została już określona. Dzięki tej technice możesz celować w komórki w różnych częściach układu nerwowego, w szczególności w przodomózgowiu, śródmózgowiu, tylnym mózgu i rdzeniu kręgowym. Więc to wszystko.

Bardzo dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia we wszystkich eksperymentach.