Wysokoprzepustowa metoda kriokonserwacji nasienia danio pręgowanego i zapłodnienia in vitro
6 lipca 2009
To jest protokół kriokonserwacji nasienia o wysokiej przepustowości dla danio pręgowanego. Kriokonserwacja nasienia przy użyciu tego protokołu ma średnio 25% płodności w późniejszym zapłodnieniu in vitro i jest stabilna przez wiele lat.
Cześć, nazywam się Bruce Draper z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis, na Wydziale Biologii Molekularnej i Komórkowej, i nazywam się Cecilia Moans z Wydziału Nauk Podstawowych w Fred Hutchinson Cancer Research Center w Seattle. Dzisiaj Cecilia i ja zamierzamy zademonstrować protokół zachowania plemników danio pręgowanego, który jest modyfikacją oryginalnego protokołu Briana Harveya. Pokażemy Ci, że pracując w dwuosobowych zespołach, możliwe jest dokonanie krioprezerwacji nasienia od 100 pojedynczych samców w czasie krótszym niż dwie godziny.
Chociaż istnieje szeroki zakres płodności po rozmrożeniu, średnio otrzymujemy 25% płodności, a to z biblioteki, która była kriokonserwowana przez ponad siedem lat. Więc zacznijmy. Przed wykonaniem tej procedury najpierw przygotuj roztwory do zamrażania nasienia.
Roztwór dzwonka Ginsburg Fish jest świeży co trzy dni, a pożywka do zamrażania jest codziennie świeża z metanolem i bez. Skład tych roztworów można znaleźć w informacjach uzupełniających online dołączonych do niniejszego protokołu. Materiały użyte w tej procedurze mogą wpływać na szybkość zamrażania i rozmrażania, co z kolei może wpływać na płodność zamrożonych plemników.
Z tego powodu lista zalecanych materiałów jest również dostępna jako dodatkowe informacje online. Najlepiej jest zamrażać plemniki na drobno pokruszonym suchym lodzie, a nie na granulkach suchego lodu. Jednym z prostych sposobów na zmiażdżenie suchego lodu jest zawinięcie go w ręcznik i sproszkowanie młotkiem.
Bardziej wydajną metodą jest użycie młynka do suchego lodu, takiego jak pazury i model RE dwa, do zamrożenia nasienia danio pręgowanego. Najpierw zaznacz 10 mikrolitrowych rurek kapilarnych długopisem laboratoryjnym na poziomie 3,33 mikrolitra lub około 16,7 milimetra od dna, aby znieczulić samce, umieść od dwóch do czterech samców w zlewce zawierającej rozcieńczoną trica i wodę dla ryb. Przepis można znaleźć w książce o danio pręgowanym.
Po znieczuleniu wyjmij rybę ze środka znieczulającego za pomocą plastikowej łyżki i delikatnie osusz ją na ręczniku papierowym. Zwróć szczególną uwagę na narysowanie strony brzusznej. Woda aktywuje plemniki, dlatego bardzo ważne jest, aby dokładnie wysuszyć okolice ika.
Umieść rybę na uchwycie gąbki brzuszną stroną do góry. Jeśli obszar wokół płetw brzusznych jest nadal wilgotny, delikatnie osusz go chusteczką Kim. Umieść oznaczoną rurkę kapilarną w gumowym adapterze do pipet doustnych, który jest dołączony do rurek kapilarnych.
Adapter to gumowy wąż, który ma ustnik na jednym końcu i uchwyt kapilarny na drugim. Alternatywnie rurkę kapilarną można podłączyć do 50-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona. Za pomocą krótkiego kawałka rurki tigon o odpowiedniej średnicy umieść samca pod lunetą i odsłonij otwór moczowo-płciowy, ostrożnie rozsuwając płetwy brzuszne.
Używając końca rurki kapilarnej, odciągnij plemniki, delikatnie głaszcząc boki ryby gładkimi kleszczami lub delikatnie ściskając boki ryby palcem wskazującym i kciukiem, zbierz plemniki do rurki kapilarnej, gdy są wydalane za pomocą delikatnego odsysania. Unikaj kału, który może zostać wydalony wraz z plemnikami. Docelowa objętość plemników wynosi 3,3 mikrolitra.
Minimalna dopuszczalna ilość plemników różni się w zależności od jakości nasienia. Dobre plemniki są białe i nieprzezroczyste, podczas gdy plemniki porowe wyglądają na wodniste. Ogólnie rzecz biorąc, minimalna dopuszczalna ilość plemników to jeden mikrolitr dobrego plemnika lub jedna trzecia celu i dwa mikrolitry plemników porowych lub dwie trzecie celu.
Jeśli objętość plemników nie osiągnie docelowej objętości 3,3 mikrolitra, konieczne jest znormalizowanie objętości do znaku długopisu za pomocą pożywki zamrażającej bez metanolu. Jeśli objętość plemników osiąga już lub przekracza ślad pióra na rurki kapilarnej, przejdź do następnego kroku. Teraz dodaj krioprotektant do nasienia.
Zassać pożywkę zamrażającą z metanolem do pomarańczowego znaku. Przybliżona całkowita objętość wynosi teraz 20 mikrolitrów. Wyrzuć mieszaninę nasienia i krioprotektantu na czysty obszar szkiełka zegarka, delikatnie mieszając, pipetując w górę iw dół około czterech razy i unikaj wprowadzania pęcherzyków.
Podzielić plemniki na dwie fiolki kriogeniczne, pipetując 10 mikrolitrów roztworu krioprotektantu nasienia na dno każdej oznakowanej fiolki. Poruszając się szybko, zakręć fiolki i wrzuć każdą fiolkę kriogeniczną do osobnej 15-mililitrowej probówki sokoła. W temperaturze pokojowej zakryj rurki falcon i włóż je do drobno sproszkowanego suchego lodu.
Rurki powinny być włożone na tyle głęboko, aby tylko nakrętki pokazywały, aby śledzić rurki sokoła. Ponumeruj je i zapisz czas, w którym każda rurka wchodzi do suchego lodu. Pozwól plemnikom zamarznąć w suchym lodzie przez 20 minut.
Po zamrożeniu plemników przenieść dwie fiolki kriogeniczne do kolby z ciekłym azotem zawierającej nasienie. Do czasowego składowania. Umieść zamrażarkę w kąpieli z ciekłym azotem, aby próbki nie nagrzewały się.
Użyj długich metalowych szczypiec, aby wyjąć fiolki z kolby i obchodź się z nimi w rękawicach kriogenicznych. Alternatywnie, fiolki kriogeniczne można przenieść bezpośrednio z suchego lodu do zamrażarki. Jeśli zamrażarka jest zanurzona w ciekłym azocie w styropianowym pojemniku do długotrwałego przechowywania, umieść fiolki kriogeniczne w zamrażarce z ciekłym azotem.
Aby utrzymać żywotność plemników, ważne jest, aby fiolki były przechowywane zanurzone w ciekłym azocie, fiolki przechowywane w fazie gazowej mogą z czasem stracić żywotność. Szybkość ma również kluczowe znaczenie dla utrzymania żywotności plemników. Czas między dodaniem krioprotektantu a umieszczeniem fiolek z nasieniem na suchym lodzie nie powinien przekraczać 30 sekund zapłodnienia in vitro.
Używanie kriopchatywowanych nasienia działa najlepiej w przypadku dwóch osób. Jedna osoba wyciska jaja z samic, podczas gdy druga osoba rozmraża plemniki. Ustaw łaźnię wodną na 33 stopnie Celsjusza.
Wyjąć fiolkę krio z zamrażarki z ciekłym azotem i przenieść ją do ciekłego azotu zawierającego D lub kolby, aż będzie gotowa do rozmrożenia. Wyciśnij jaja znieczulonych samic do 35-milimetrowej plastikowej szalki Petriego. Jest to szczegółowo opisane w protokole JoVE zatytułowanym Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure, który zawiera szczegółowy opis danio pręgowanego.
Zapłodnienie in vitro dobry lęg zawiera ponad 150 jaj, które są jednolite i żółtawe. Wszelkie białe zanieczyszczenia wskazują na degradację. Jeśli to możliwe, postaraj się zdobyć trzy lęgi jajek i połączyć je w jedno naczynie.
Jeśli trzy dobre sprzęgła nie zostaną uzyskane w ciągu jednej minuty od pierwszego sprzęgła, przejdź do następnego kroku. Trzymaj naczynie pod przykryciem, gdy plemniki się rozmrażają. W międzyczasie wyjąć fiolkę z ciekłym azotem i zdjąć nakrętkę.
Szybko zanurz fiolkę do połowy w łaźni wodnej o temperaturze 33 stopni na osiem do 10 sekund. Szybko dodaj 70 mikrolitrów temperatury pokojowej, buforowanego roztworu soli Hanka do fiolki i wymieszaj, pipetując w górę iw dół, natychmiast dodaj do jaj na szalce Petriego i delikatnie wymieszaj końcówką pipety. Następnie natychmiast aktywuj plemniki i jaja, dodając 750 mikrolitrów wody dla ryb, mieszaj i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Po pięciu minutach napełnij naczynie rybą, wodą i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Po dwóch do trzech godzinach policz i przenieś żywotne zarodki na 100-milimetrowe szalki po 50 zarodków na szalkę. Licz również na zapłodnione jaja, aby można było określić płodność próbki plemników.
Płodność plemników to stosunek zdolnych do życia zarodków do całkowitej liczby komórek jajowych, które zostały użyte do zapłodnienia in vitro. Komórki jajowe można sortować w dowolnym momencie, od dwóch do sześciu godzin po zapłodnieniu in vitro. Kiedy niepłodne jaja można łatwo odróżnić od zdolnych do życia zarodków, jaja niepłodne są czyste i niepodzielone.
Oglądana z oświetleniem trans w mikroskopie stereoskopowym średnia płodność kriokonserwowanych plemników jest bardzo zróżnicowana. Jednak powinno być możliwe uzyskanie średnio 25% płodności, która jest stabilna przez wiele lat. Ten wykres pokazuje średni procent płodności plemników zamrożonych w latach 2001-2003 i jeszcze w 2008 roku.
Właśnie zademonstrowaliśmy wysokoprzepustową metodę zachowującą płacz bez plemników ryb. Stosując ten protokół, ważne jest, aby używać całej zalecanej odzieży i sprzętu z tworzywa sztucznego, a także używać sproszkowanego kruszonego suchego lodu, a nie granulek suchego lodu. Bardzo ważne jest, aby używać naprawdę wysokiej jakości plemników i komórek jajowych, a w przypadku jaj podczas zapłodnienia in vitro, po zapłodnieniu plemników, ważne jest, aby użyć jak największej liczby komórek jajowych, aby zwiększyć liczbę płodnych zarodków, które otrzymujesz na drugim końcu, co może zająć trzy do czterech samic, Prawy?
Kolejnym kluczowym elementem protokołu jest szybkość. Przejście od odciągania nasienia samca do umieszczenia go w suchym lodzie nigdy nie powinno zająć więcej niż około minuty. Cóż, myślę, że to wszystko.
Powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół krioprezerwacji plemników o wysokiej wydajności dla rybki labiryntowej, osiągający średnią wartość płodności 25% w kolejnych zapłodnieniach in vitro. Protokół jest stabilny przez wiele lat, umożliwiając efektywne długoterminowe przechowywanie plemników rybki labiryntowej.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia rozrodu
- Techniki krioprezerwacji
Tło
- Rybki labiryntowe są organizmem modelowym w badaniach biologicznych.
- Krioprezerwacja jest niezbędna do długoterminowego przechowywania materiału genetycznego.
- Utrzymanie żywotności plemników jest kluczowe dla udanej zapłodnienia.
- Protokoły krioprezerwacji plemników mogą różnić się efektywnością.
Cel badania
- Opracowanie metody o wysokiej wydajności do krioprezerwacji plemników rybki labiryntowej.
- Ocenienie płodności krioprezerwowanych plemników w czasie.
- Dostarczenie wiarygodnego protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Stosowane metody
- Przygotowanie roztworów do zamrażania plemników i kryoprotektorów.
- Zbieranie plemników od znieczulonych samców rybki labiryntowej.
- Zamrażanie plemników za pomocą suchego lodu i ciekłego azotu.
- Rozmrażanie plemników na potrzeby zapłodnienia in vitro.
Główne wyniki
- Średnia wartość płodności 25% z krioprezerwowanych plemników.
- Protokół umożliwia krioprezerwację plemników od 100 samców w czasie krótszym niż dwie godziny.
- Żywotność plemników utrzymana przez okres dłuższy niż siedem lat.
- Spełnione techniki zwiększają wskaźnik sukcesu krioprezerwacji.
Wnioski
- Opracowany protokół jest efektywny i skuteczny w krioprezerwacji plemników rybki labiryntowej.
- Wysokie wartości płodności można osiągnąć stosując właściwe techniki.
- Ta metoda może wspierać długoterminowe badania genetyczne na rybkach labiryntowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Zebrafish sperm cryopreservation enables long-term genetic resource management in preclinical discovery, supporting consistent model availability for target validation and phenotypic screening. The high-throughput protocol allows cryopreservation of 100 male samples in under two hours, improving operational efficiency in large-scale genetic repositories. Stable 25% fertility rates over multiple years provide predictable outcomes for downstream in vitro fertilization assays, reducing variability in genetic cross experiments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic hypotheses by preserving sperm lines for future crosses to validate gene function in disease-relevant systems.
- Operational Value: Standardized sperm collection and freezing procedures reduce technical variability, supporting reproducible target de-risking across laboratories.
- Predictive Value: Long-term storage capability allows retrospective testing of genetic models as new targets emerge, improving confidence in translational continuity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Cryopreserved sperm provides a uniform biological input for in vitro fertilization assays, enabling consistent egg-to-embryo conversion metrics for compound screening.
- Operational Value: Use of cryovials instead of capillary tubes improves sample handling and storage scalability in high-throughput workflows.
- Assay Readiness: Normalized sperm volumes using methanol-free freezing medium increase procedural uniformity, supporting reliable quantitative outputs in fertilization assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Stable fertility rates over seven years support multi-year preclinical studies requiring consistent genetic backgrounds for mechanism of action and safety profiling.
- Predictive De-risking: Reliable sperm viability reduces attrition in genetic model generation, improving success rates in phenotype-driven target validation pipelines.
- Disease-Relevant System: Zebrafish embryos derived from cryopreserved sperm enable rapid phenotypic assessment in vertebrate models aligned with human disease pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a scalable upstream process for generating zebrafish embryos used in target validation, assay development, and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling on-demand generation of genetically defined embryos from archived sperm lines.
- Screening: Cryopreserved sperm improves assay reproducibility and throughput in in vitro fertilization-based compound or genetic suppressor screens.
- Analytics: Fertility rate measurements (viable embryos per total eggs) provide a quantitative endpoint for assessing sperm quality and genetic cross efficiency.
- Translational Research: Long-term sperm storage supports continuity from gene discovery through preclinical validation using consistent genetic backgrounds.
- Enterprise Reuse: Protocol establishes a reusable genetic resource management capability for large-scale zebrafish facilities supporting multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in genetic model availability, reduction of mechanistic ambiguity in cross-generational studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of sperm processing enable high-throughput biobanking.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions on genetic model investment, capital efficiency in maintaining live colonies, reduced biological risk in longitudinal studies.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of genetic lines based on cryopreservation success rates and long-term fertility stability.
Implementation Considerations
- Required expertise in zebrafish handling, sperm extraction, and cryopreservation techniques.
- Instrumentation needs include dry ice grinder, liquid nitrogen storage, capillary tubes, cryovials, and temperature-controlled water baths for thawing.
- Cross-team standardization requires adherence to specified materials (e.g., finely crushed dry ice, recommended tubes) to control freezing/thawing rates affecting fertility.
- Adaptation considerations include sperm volume normalization using methanol-free freezing medium to ensure uniform sample preparation across variable male outputs.
- Practical limitations: Fertility varies per sample; protocol success depends on sperm and egg quality, with minimum acceptable sperm volume thresholds defined.
