Name: Wysokoprzepustowa metoda kriokonserwacji nasienia danio pręgowanego i zapłodnienia in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-06T19:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę kriokonserwacji nasienia danio pręgowanego z zapłodnieniem in vitro. Protokół zapewnia 25% płodność i stabilność próbek przez ponad siedem lat.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez NIH R01 HG002995 „TILLING the Zebrafish Genome: a Reverse Genetics Approach” przyznany CBM.

Część A: Roztwory do mrożenia plemników
1. Roztwór Ringera dla ryb wg Ginsberga (przygotowywać na świeżo co 3 dni; Ginsburg, 1963)
UWAGA: KOLEJNOŚĆ DODAWANIA JEST ISTOTNA, ABY ZAPOBIECĆ WYTRĄCANIU OSIADU
W 450 ml sterylnej ddH2O rozpuścić:
<ul>
<li>NaCl 3.25 g</li>
<li>KCl 0.125 g</li>
<li>CaCl2•2 H2O 0.175 g 
 Następnie dodać:</li>
<li>NaHCO3 0.10 g</li>
</ul>
Uzupełnić objętość końcową do 500 ml za pomocą sterylnej ddH2O i przechowywać w temperaturze 4°C.
2. Pożywka do zamrażania (Przygotowywać codziennie)
<ol style="list-style-type:lower-roman">
<li>BEZ metanolu
<ul><li>roztwór Ginsburg Fish Ringers 10 ml (temp. pokojowa)</li>
<li>odtłuszczone mleko w proszku 1,5 gm</li>
</ul></li>
<li>Z metanolem
 UWAGA: KOLEJNOŚĆ DODAWANIA JEST KLUCZOWA, ABY ZAPOBIEC NAC WYTRĄCANIU SIĘ OSADU 
<ul>
<li>roztwór Ginsburg Fish Ringers 9 ml (temp. pokojowa)</li>
<li>metanol 1 ml</li>
<li>odtłuszczone mleko w proszku 1,5 g
</li></ul>
 Po przygotowaniu medium do mrożenia mieszać dokładnie przez 20 min. na wytrząsarce orbitalnej lub kołysce. Przed użyciem rozdzielić do probótek eppendorf 1 ml, unikając powstawania pęcherzyków powietrza na powierzchni. 
</li></ol>
Część B: Materiały niezbędne do mrożenia plemników
Materiały niezbędne do mrożenia plemników
<ol>
 <li>Jednorazowe pipety 10 μl (Fisherbrand kat# 22-358697)</li>
 <li>Zlewki 250ml na wodę dla ryb zawierającą MESAB/Tricaine</li>
 <li>Szkiełka zegarkowe (Pyrex kat# 9985-75)</li>
 <li>Pipeta P20 Pipetman (lub równoważna) oraz końcówki</li>
 <li>Gąbkowy uchwyt dla ryb (do unieruchomienia samca podczas wyciskania)</li>
 <li>Mikroskop stereoskopowy z oświetleniem nadstołowym</li>
 <li>Pinceta płaska (np. typu Millipore)</li>
 <li>Probówki kriogeniczne 2.0ml (Corning kat# 430488)</li>
 <li>Kriopudełka 10X10 (Nalgene kat#03-337-7AA)</li>
 <li>Styropianowy pojemnik wypełniony ~ 15 cm drobno kruszonego suchego lodu1</li>
 <li>Probówki stożkowe 15 ml (Falcon # 352099)</li>
 <li>Naczynie Dewara z ciekłym azotem</li>
 <li>Długie kleszcze (np. CMS Fisher Health Care kat# 10-316B)</li>
 <li>Rękawice kriogeniczne</li>
 <li>Zbiornik regeneracyjny dla samców</li>
 <li>Jedna probówka Eppendorf wypełniona medium do mrożenia bez metanolu</li>
 <li>Jedna probówka Eppendorf wypełniona medium do mrożenia z metanolem</li>
 <li>Zamrażarka kriogeniczna (np. Taylor-Warton seria K)</li>
</ol>
1 Prosta metoda przygotowania drobno zmielonego suchego lodu polega na zawinięciu go w ręcznik i rozkruszeniu młotkiem. Bardziej wydajną metodą jest zastosowanie młynka do suchego lodu, np. Clawson model RE-2.
Część C: Metoda zamrażania plemników
<ol>
<li>OZNACZANIE KAPILAR: Przed rozpoczęciem procedury należy oznaczyć kapilary 10μl pisakiem laboratoryjnym na poziomie 3,33 μl (tj. 16,7 mm od dołu; patrz Rys. 1.1).</li>
<li>ZESPOLENIE SAMCA: Umieścić samca/samców w zlewce zawierającej MESAB/tricainę rozcieńczoną w wodzie dla ryb (przepis w „The Zebrafish Book”).</li>
<li>OSUSZANIE RYBY: Po znieczuleniu wyjąć rybę z roztworu anestetyka za pomocą plastikowej łyżki i delikatnie osuszyć ją ręcznikiem papierowym, zwracając szczególną uwagę na osuszenie strony brzusznej. Woda aktywuje plemniki, dlatego ważne jest dokładne osuszenie okolic ujścia kloaki. Umieścić rybę na uchwycie gąbkowym stroną brzuszną do góry (Rys. 1.2). Jeśli obszar wokół płetwy odbytniczej jest nadal wilgotny, delikatnie osuszyć go chusteczką typu Kimwipe. Należy uważać, aby nie doprowadzić do przedwczesnego wydzielenia nasienia!</li>
<li>Umieścić oznaczoną kapilarę w gumowym adapterze do pipety ustnej, który jest dołączony do kapilar. Adapter stanowi gumowy wąż z ustnikiem na jednym końcu i uchwytem na kapilarę na drugim. Alternatywnie kapilarę można połączyć ze strzykawką Hamiltona 50μl za pomocą krótkiego odcinka rurki Tygon o odpowiedniej średnicy.</li>
<li>Umieścić samca pod mikroskopem i odsłonić otwór urogenitalny, ostrożnie rozsuwając płetwy brzuszne końcem kapilary.</li>
<li>POBIERANIE NASIENIA: Wywołać wydzielenie nasienia, delikatnie przesuwając gładkimi pincetami (np. Millipore) po bokach ryby lub delikatnie ściskając boki ryby między palcem wskazującym a kciukiem. Pobierać nasienie do kapilary w momencie jego wydzielania, stosując delikatne ssanie (Rys. 1.2). Należy unikać pobrania odchodów, które mogą zostać wydzielone wraz z nasieniem.</li>
<li>NORMALIZACJA OBJĘTOŚCI NASIENIA DO 3,3 μl: Jeśli objętość nasienia osiągnie lub przekroczy oznaczenie pisakiem na kapilarze (tj. 16,7 mm lub więcej), przejść do kroku 8. Jeśli objętość nasienia nie osiągnęła wartości docelowej, należy znormalizować objętość do oznaczenia, używając Medium do Zamrażania BEZ Metanolu (Rys. 1.3). Minimalna akceptowalna ilość nasienia zależy od jego jakości. Dobre nasienie jest białe i nieprzezroczyste. Nasienie słabej jakości ma wodnisty wygląd. Generalnie przyjmujemy następujące minima: 1 μl dobrego nasienia (lub 1/3 wartości docelowej) oraz 2 μl nasienia słabej jakości (lub 2/3 wartości docelowej). Objętość jest teraz znormalizowana do 3,3 μl.</li>
<li>DODANIE KRJOPROTEKTA: Naciągnąć Medium do Zamrażania Z Metanolem do pomarańczowego znacznika (całkowita objętość wynosi teraz ok. 20 μl; Rys. 1.4). Wypuścić mieszaninę nasienia i krioprotektanta na czystą powierzchnię szkła zegarowego, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół ok. 4 razy (unikając wprowadzania pęcherzyków).</li>
<li>PRZENIESIENIE 10μl NASIENIA DO KAŻDEJ Z 2 KRJOPROBEK: Nabrać 10 μl roztworu nasienie:krioprotektant i nanieść na dno dwóch osobnych, odpowiednio oznakowanych krioprobek (Rys. 1.5). Szybko zakręcić probówki i wrzucić je na dno probótek Falcon 15 ml o temperaturze pokojowej — jedna krioprobka na każdą probówkę Falcon. Zakręcić probówkę Falcon i umieścić parę probótek Falcon zawierających krioprobki w kruszonym suchym lodzie.</li>
<li>ZAMRAŻANIE NASIENIA PRZEZ 20 MIN. W SUCHYM LODZIE: Suchy lód powinien być w formie drobnego proszku, nie w granulach. Probówki należy zanurzyć w suchym lodzie na tyle głęboko, aby wystawały z niego jedynie ich zakrętki (Rys. 1.6). Aby monitorować probówki w suchym lodzie, należy nadać każdej parze probówek Falcon numer od 1 do 20 (zapisać na zakrętkach) i odnotować czas ich umieszczenia w suchym lodzie.</li>
<li>UMIEZCZENIE KRJOPROBEK W CIEKŁYM AZOCIE: Po zamrożeniu nasienia w suchym lodzie przez 20 min., przenieść je do naczynia Dewar z ciekłym azotem. Nasienie jest tu przechowywane do czasu umieszczenia w zamrażarce do azotu ciekłego. Podczas przenoszenia do pudełek zamrażarki, należy umieścić pudełko w kąpieli z ciekłego azotu, aby próbki się nie nagrzały. Do wyjmowania probówek z naczynia Dewar należy używać długich metalowych kleszczy i pracować w rękawicach kriogenicznych. Alternatywnie krioprobki można przenosić bezpośrednio z suchego lodu do pudełka zamrażarki, jeśli pudełko jest zanurzone w ciekłym azocie w pojemniku styropianowym.</li>
<li>Długoterminowo przechowywać krioprobki w kriogenicznej zamrażarce z ciekłym azotem. Aby zachować żywotność nasienia, ważne jest, aby probówki były przechowywane w pełnym zanurzeniu w ciekłym azocie. Z naszego doświadczenia wynika, że probówki przechowywane w fazie gazowej z czasem tracą żywotność. Szybkość działania jest kluczowa! Czas między dodaniem krioprotektanta a umieszczeniem probówek z nasieniem w suchym lodzie (tj. kroki 6-10) nie powinien przekroczyć 30 s. </li></ol>
Część D: Metoda zapłodnienia in vitro z wykorzystaniem kriokonserwowanych plemników
Stwierdzamy, że metoda ta działa najlepiej przy udziale dwóch osób. Jedna osoba wyciska komórki jajowe od samic, podczas gdy druga rozmraża plemniki.
<ol><li>Ustaw kąpiel wodną na 33°C.</li>
<li>Wyjmij krioprobowkę z zamrażarki z ciekłym azotem i przenieś ją do naczynia Dewar z ciekłym azotem do momentu rozpoczęcia rozmrażania.</li>
<li>Wyciskaj jaja z samic do plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm. Jeśli to możliwe, spróbuj uzyskać 3 nieśmiertelne zbiory jaj i połącz je w jednej szalce. Jeśli nie uda się uzyskać trzech dobrych zbiorów w ciągu 1 min od pierwszego zbioru, przejdź do kroku 4 (jeden dobry zbiór jest wystarczający). Definicja dobrego zbioru: &gt;150 jednolitych, dobrze wyglądających jaj (tj. żółtawych, bez białych zanieczyszczeń świadczących o degradacji). Przykryj szalkę podczas rozmrażania plemników.</li>
<li>Wyjmij probówkę z ciekłego azotu i zdejmij korek. Szybko zanurz probówkę mniej więcej do 1/2 wysokości w kąpieli wodnej o temperaturze 33°C na 8-10 s.</li>
<li>Szybko dodaj do probówki 70 μl roztworu Hanksa o temperaturze pokojowej i wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół. Natychmiast dodaj do jaj i delikatnie wymieszaj końcówką pipety.</li>
<li>Bezzwłocznie aktywuj plemniki i jaja, dodając 750 μl wody dla ryb. Zamieszaj przez wirowanie. Inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Po 5 min napełnij szalkę wodą dla ryb i inkubuj ją w temperaturze 28°C. Po 2-3 h policz i przenieś zapłodnione embriony do szalek o średnicy 100 mm (po 50 na szalkę). Policz niezapłodnione jaja, aby móc określić częstotliwość zapłodnienia.</li>
<li>Odpowiednio pielęgnuj larwy! Przez pierwsze 5 dni codziennie wymieniaj wodę i usuwaj martwe embriony. Przenieś do przedszkola w 5. dniu tylko te larwy, które posiadają pęcherz pławny.</li>
</ol>
Część E: Reprezentatywne wyniki
Wykorzystaliśmy tę metodologię kriozachowania do stworzenia biblioteki 8600 zamrożonych próbek nasienia do TILLING w latach 2001–2003. Rozmroziliśmy 106 z tych próbek i określiliśmy ich płodność. Płodność jest stosunkiem żywotnych zarodków powstałych w procesie zapłodnienia in vitro do całkowitej liczby jaj zapłodnionych zamrożonym nasieniem. Świeże (niekriokonserwowane) nasienie wykazuje zazwyczaj płodność &gt;95%; nasienie kriokonserwowane ma znacznie niższą płodność: średnio 29% (n=106 fiolek). Zmienność płodności między poszczególnymi fiolkami jest duża i wynosi od mniej niż 1% do nawet 62%. Zmienność ta jest przedstawiona na Rys. 2 za pomocą dużych słupków błędów oznaczających odchylenie standardowe. Jednakże w 106 próbkach nasienia rozmrożonych do tej pory tylko raz odnotowano 0% płodności w obu próbkach nasienia, co uniemożliwiło odzyskanie odpowiadającej im mutacji TILLING.
Odmrażając fiolki z nasieniem z naszej biblioteki na przestrzeni kilku lat (2001-2008), ustaliliśmy, że średnia płodność próbek nasienia zamrożonych tą metodą pozostaje stabilna w czasie (Rys. 2). Średnia płodność zamrożonych próbek nasienia rozmrożonych w 2001 roku wynosiła 23,5% (na podstawie 11 próbek nasienia), a w 2008 roku wynosiła 25% (na podstawie 21 próbek nasienia).
Liczni inni badacze stosują obecnie ten protokół mrożenia plemników w swoich laboratoriach. Niektórzy zgłaszali sukcesy w zakresie wskaźników płodności oraz zmienności między próbkami, zbliżone do naszych obserwacji. Inni natomiast donieśli o niepowodzeniu w implementacji tego protokołu w swoich warunkach. Uważamy, że prawdopodobnymi źródłami problemów są:
<ol>
<li>Niestosowanie dokładnie tych samych krioprowetek lub probówek stożkowych, które zasugerowano w protokole, co prowadzi do innej szybkości chłodzenia w suchym lodzie;</li>
<li>Niestosowanie sypkiego suchego lodu, co prowadzi do nieoptymalnej szybkości chłodzenia;</li>
<li>Użycie samców o niskiej płodności: z jednego samca powinno uzyskać się co najmniej 1 μl nasienia. Można również sprawdzić płodność samców, wykonując zapłodnienie in vitro ze świeżym nasieniem, jednak może to być mylące, ponieważ do uzyskania blisko 100% zapłodnienia potrzeba bardzo niewielkiej ilości świeżego nasienia.</li>
<li>Użycie jaj o niskiej jakości podczas zapłodnienia in vitro. Użycie jakichikolwiek partii jaj innych niż idealne zawsze prowadzi do blisko 0% zapłodnienia, nawet w przypadku próbek nasienia, które w rzeczywistości wykazują dobrą płodność (na podstawie płodności probówki powtórzonej).</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="Proces krio konserwacji plemników zebrafish z diagramami szczegółowo opisującymi pomiar objętości i krio probówki." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Schemat metodologii mrożenia plemników.
<img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="Wykres słupkowy trendów płodności biblioteki, 2001-2008, analiza średniego procentu płodności." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Płodność kriosprzedzamrożonych plemników pozostaje stabilna w czasie. Procent płodności to liczba żywotnych zarodków uzyskanych podczas zapłodnienia in vitro podzielona przez całkowitą liczbę jaj zapłodnionych zamrożonymi plemnikami. „n” oznacza liczbę fiolek z kriosprzedzamrożonymi plemnikami, których płodność była badana w odpowiednim roku. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Ponieważ każda fiolka z plemnikami pochodzi od innego samca, obserwuje się zmienność między fiolkami.

<ol><li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li>
<li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zoology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li>
</ol>

Liczni inni badacze stosują obecnie ten protokół mrożenia plemników w swoich laboratoriach. Niektórzy zgłosili podobną płodność oraz taką samą zmienność między próbkami, jaką zaobserwowaliśmy. Inni rzekomo nie zdołali wprowadzić tego protokołu w życie we własnych pracowniach. Uważamy, że prawdopodobnymi źródłami problemów są: 
<ol>
<li>Niestosowanie dokładnie tych samych krioproletek lub probówek stożkowych, które sugerujemy w protokole, co prowadzi do innej szybkości chłodzenia w suchym lodzie;</li>
<li>Niestosowanie sproszkowanego suchego lodu, co prowadzi do nieoptymalnej szybkości chłodzenia;</li>
<li>Użycie samców o niskiej płodności: z jednego samca należy uzyskać co najmniej 1 μl nasienia. Płodność samców można również testować, przeprowadzając zapłodnienie in vitro ze świeżym nasieniem, jednak może to być mylące, ponieważ do uzyskania blisko 100% płodności wystarczy niewielka ilość świeżego nasienia. Większe samce o bardziej intensywnym ubarwieniu zazwyczaj dostarczają więcej nasienia wyższej jakości.</li>
<li>Użycie jaj o niskiej jakości podczas zapłodnienia in vitro. Wykorzystanie jakichkolwiek partii jaj innych niż idealne zawsze prowadzi do blisko 0% płodności, nawet w przypadku próbek nasienia, które w rzeczywistości wykazują dobrą płodność (na podstawie płodności probówki powtórzonej).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10 &amp;mu;jednorazowe pipety</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-358697</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka zegarkowe</td><td>Pyrex</td><td>9985-75</td><td></td></tr><tr><td>probówki kriogeniczne 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>kriopudełka 10 x 10</td><td>Nalge Nunc international</td><td>03-337-7AA</td><td></td></tr><tr><td>probówki stożkowe 15 ml</td><td>Falcon BD</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316B</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka niskotemperaturowa</td><td>Taylor-Wharton</td><td>seria K</td><td>Na przykład</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa metoda krio konserwacji plemników i zapłodnienia in vitro ryby danio-ostreokonicznej (zebrafish)

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Jest to metoda kriokonserwacji plemników ryb danio-ostropłetwych, stanowiąca adaptację metody Harveya (Harvey et al., 1982). Wprowadziliśmy dwie zmiany w oryginalnym protokole, które usprawniają procedurę i zwiększają jednorodność próbek. Po pierwsze, normalizujemy wszystkie objętości nasienia przy użyciu medium do mrożenia niezawierającego krioprotektanta. Po drugie, kriokonserwowane plemniki są przechowywane w krioprowetkach zamiast w kapilarach. Szybkość zamrażania i rozmrażania plemników (&delta;&deg;C/czas) to prawdopodobnie dwie najważniejsze zmienne, które należy kontrolować w tej procedurze. Z tego powodu nie należy zastępować określonych probówek innymi. Pracując w dwuosobowych zespołach, możliwe jest zamrożenie nasienia 100 samców na zespół w czasie ok. 2 godzin. Plemniki kriokonserwowane zgodnie z tym protokołem wykazują średnią płodność na poziomie 25% (mierzoną jako liczba żywotnych embrionów uzyskanych w wyniku zapłodnienia in vitro podzielona przez całkowitą liczbę zapłodnionych jaj), a odsetek ten pozostaje stabilny przez wiele lat.

Jest to protokół wysokoprzepustowej krio konserwacji plemników rybek zebrafish. Plemniki krio konserwowane zgodnie z tym protokołem wykazują średnią płodność na poziomie 25% podczas późniejszego zapłodnienia in vitro i pozostają stabilne przez wiele lat.

Wysokoprzepustowa metoda krio konserwacji plemników i zapłodnienia in vitro ryby danio-ostreokonicznej (zebrafish)

Jest to metoda kriokonserwacji plemników danio-pręgowanego, która stanowi adaptację metody Harveya (Harvey et al., 1982). Wprowadziliśmy dwie zmiany w...

Witam, jestem Bruce Draper z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis, z katedry biologii molekularnej i komórkowej, a ja jestem Cecilia Moans z Wydziału Nauk Podstawowych w Fred Hutchinson Cancer Research Center w Seattle. Dzisiaj wraz z Cecilią zaprezentujemy protokół kriokonserwacji nasienia danio pręgowanego, który stanowi modyfikację oryginalnego protokołu Briana Harveya. Pokażemy Państwu, że pracując w dwuosobowych zespołach, możliwe jest kriokonserwowanie nasienia od 100 osobnych samców w czasie krótszym niż dwie godziny.Choć po rozmrożeniu obserwuje się szeroki zakres przeżywalności, średnio otrzymujemy 25% przeżywalności, a dotyczy to biblioteki kriosprzechowywanej przez ponad siedem lat. Przejdźmy zatem do pracy. Przed wykonaniem tej procedury należy najpierw przygotować roztwory do mrożenia plemników.Roztwór Ringera dla ryb według Ginsburga jest przygotowywany na świeżo co trzy dni, natomiast medium do mrożenia jest przygotowywane codziennie, z dodatkiem i bez dodatku metanolu. Skład tych roztworów znajduje się w internetowych informacjach uzupełniających towarzyszących temu protokołowi. Materiały użyte w tej procedurze mogą wpływać na szybkość mrożenia i rozmrażania, co z kolei może oddziaływać na żywotność zamrożonych plemników.Z tego powodu w dodatkowych informacjach online zamieszczono również listę zalecanych materiałów. Najlepiej jest zamrażać plemniki na drobno kruszonym suchym lodzie, a nie na pelletach suchego lodu. Prostym sposobem kruszenia suchego lodu jest zawinięcie go w ręcznik i rozbicie młotkiem.Bardziej efektywną metodą jest zastosowanie młynka z suchym lodem, takiego jak model claws RE two, w celu zamrożenia nasienia danio pręgowanych. Najpierw należy oznaczyć kapilary o pojemności 10 µL za pomocą pisaka laboratoryjnego na poziomie 3,33 µL lub około 16,7 mm od dna. Aby znieczulić samce, umieść dwa do czterech osobników w zlewce zawierającej roztwór trica rozcieńczony w wodzie dla ryb. Przepis można znaleźć w książce o danio pręgowanych.Po znieczuleniu wyjmij ryby z roztworu znieczulającego za pomocą plastikowej łyżki i delikatnie osusz je ręcznikiem papierowym. Zwróć szczególną uwagę na osuszanie strony brzusznej. Woda aktywuje plemniki, dlatego kluczowe jest dokładne osuszenie obszaru wokół otworu płciowego.Umieść rybę na uchwycie gąbkowym stroną brzuszną do góry. Jeśli obszar wokół płetw brzusznych jest nadal wilgotny, delikatnie osusz go za pomocą chusteczki Kim wipe. Umieść oznakowaną kapilarę w gumowym adapterze do pipety ustnej, który jest dołączony do kapilar.Adapterem jest gumowy wąż, który posiada ustnik na jednym końcu i uchwyt kapilarny na drugim. Alternatywnie rurka kapilarna może zostać podłączona do strzykawki Hamiltona o pojemności 50 µL. Używając krótkiego odcinka rurki tigon o odpowiedniej średnicy, umieść samca pod mikroskopem i odsłoń otwór urogenitalny, ostrożnie rozsuwając płetwy brzuszne.Używając końcówki rurki kapilarnej, należy pobrać nasienie, delikatnie pocierając boki ryby gładkimi pincetą lub lekko ściskając boki ryby palcem wskazującym i kciukiem; nasienie powinno być zbierane do rurki kapilarnej podczas jego wydzielania za pomocą delikatnego zasysania. Należy unikać zanieczyszczenia próbki odchodami, które mogą zostać wydalone wraz z nasieniem. Docelowa objętość nasienia wynosi 3.3 µL.Minimalna akceptowalna ilość plemników różni się w zależności od ich jakości. Plemniki wysokiej jakości są białe i nieprzejrzyste, podczas gdy plemniki słabej jakości mają wodnisty wygląd. Generalnie minimalna akceptowalna ilość to 1 µL plemników wysokiej jakości lub jedna trzecia objętości docelowej, oraz 2 µL plemników słabej jakości lub dwie trzecie objętości docelowej.Jeśli objętość nasienia nie osiągnie docelowej wartości 3,3 microliters, należy uzupełnić objętość do oznaczenia piórem, używając medium do mrożenia bez metanolu. Jeśli objętość nasienia już osiąga lub przekracza oznaczenie piórem na rurce kapilarnej, należy przejść do następnego kroku. Teraz dodaj krioprotektant do nasienia.Pobrać medium do mrożenia z metanolem do pomarańczowej kreski. Przybliżona objętość całkowita wynosi obecnie 20 µL. Przenieść mieszaninę plemników i krioprotektanta na czystą powierzchnię szkiełka zegarowego, delikatnie mieszając poprzez czterokrotne pipetowanie w górę i w dół, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza.Podziel spermę na dwie probówki kriogeniczne, pipetując 10 µL roztworu krioprotekcyjnego dla plemników na dno każdej z oznakowanych probówek. Szybko zakręć probówki i umieść każdą z nich w osobnej probówce typu Falcon o pojemności 15 mL. W temperaturze pokojowej zakręć probówki Falcon i umieść je w drobno rozkruszonym suchym lodzie.Probówki należy wetknąć wystarczająco głęboko, tak aby widoczne były jedynie zakrętki, co pozwoli na monitorowanie probówek typu Falcon. Należy je ponumerować i zapisać czas umieszczenia każdej z nich w suchym lodzie. Plemniki powinny zamrażać się w suchym lodzie przez 20 minut.Po zamrożeniu nasienia przenieś obie probówki kriogeniczne do naczynia typu doer zawierającego ciekły azot. W celu tymczasowego przechowywania umieść pudełko zamrażarki w kąpieli z ciekłego azotu, aby próbki nie uległy ogrzaniu.Użyj długich metalowych szczypiec, aby wyciągnąć probówki z kolby, i manipuluj nimi w rękawicach kriogenicznych. Alternatywnie probówki kriogeniczne można przenieść bezpośrednio z suchego lodu do zamrażarki. Jeśli pudełko do zamrażarki jest przechowywane w ciekłym azocie w pojemniku styropianowym do długoterminowego składowania, umieść probówki kriogeniczne w kriogenicznej zamrażarce z ciekłym azotem.Aby zachować żywotność plemników, kluczowe jest przechowywanie fiolek w zanurzeniu w ciekłym azocie; fiolki przechowywane w fazie gazowej mogą z czasem utracić żywotność. Równie istotna dla utrzymania żywotności plemników jest szybkość działania. Czas pomiędzy dodaniem krioprotektanta a umieszczeniem fiolek z plemnikami na lodzie suchym nie powinien przekraczać 30 sekund. Zapłodnienie in vitro.Wykorzystanie plemników kriokonserwowanych najlepiej przeprowadzić w dwie osoby. Jedna osoba wyciska jaja z samic, podczas gdy druga rozmraża plemniki. Ustaw kąpiel wodną na 33 °C.Wyjmij krio-probówkę z zamrażarki z ciekłym azotem i przenieś ją do pojemnika lub kolby zawierającej ciekły azot, aż będzie gotowa do rozmrożenia. Wyciśnij ikrę z znieczulonych samic do 35 milimetrowej plastikowej szalki Petriego. Jest to szczegółowo opisane w protokole JoVE zatytułowanym Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure, który zawiera szczegółowy opis ryb zebrafish.W przypadku zapłodnienia in vitro, dobra partia zawiera ponad 150 jednolitych, żółtawych jaj. Wszelkie białe zanieczyszczenia świadczą o degradacji. Jeśli to możliwe, należy starać się pozyskać trzy partie jaj i połączyć je w jednej płytce.Jeśli w ciągu jednej minuty od pobrania pierwszej porcji nie uzyskano trzech dobrych porcji, należy przejść do następnego kroku. Przez cały czas rozmrażania nasienia naczynie powinno pozostać przykryte. W tym czasie należy wyjąć fiolkę z ciekłego azotu i zdjąć nakrętkę.Szybko zanurz fiolkę do połowy w 33 °C kąpieli wodnej na 8 do 10 sekund. Szybko dodaj do fiolki 70 µL w temperaturze pokojowej roztworu soli buforowanej Hanksa i wymieszaj, pipetując w górę i w dół, następnie natychmiast dodaj zawartość do ikry w szalce Petriego i delikatnie wymieszaj końcówką pipety. Następnie natychmiast aktywuj plemniki i ikrę, dodając 750 µL wody dla ryb, zamieszaj przez wirowanie i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po pięciu minutach napełnić naczynie rybami i wodą, a następnie inkubować w temperaturze 28 °C. Po dwóch do trzech godzinach policzyć i przenieść żywe embriony do naczyń o średnicy 100 mm, rozmieszczając po 50 embrionów na naczynie. Należy również policzyć zapłodzone jaja, aby można było określić płodność próbki nasienia.Płodność plemników to stosunek liczby żywotnych embrionów do całkowitej liczby jaj wykorzystanych podczas zapłodnienia in vitro. Jaja można sortować w dowolnym czasie od dwóch do sześciu godzin po zapłodnieniu in vitro. W przypadku łatwego odróżnienia jaj niepłodnych od żywotnych embrionów, jaja niepłodne są przeźroczyste i niepodzielone.Przy oglądaniu z oświetleniem prześwietującym pod mikroskopem stereoskopowym, średnia żywotność kriokonserwowanych plemników wykazuje duże zróżnicowanie. Niemniej jednak możliwe powinno być uzyskanie stabilnej średniej żywotności na poziomie 25% przez wiele lat. Wykres ten przedstawia średni procent żywotności plemników zamrożonych między 2001 a 2003 rokiem i rozmrażanych aż do 2008 roku.Właśnie zaprezentowaliśmy wysokoprzepustową metodę kriokonserwacji nasienia ryb zebranych. Podczas wykonywania tego protokołu ważne jest stosowanie wszystkich zalecanych elementów z tworzyw sztucznych i sprzętu, a także użycie sproszkowanego suchego lodu zamiast jego granulek. Kluczowe jest wykorzystanie nasienia i jaj najwyższej jakości, a w przypadku jaj podczas zapłodnienia in vitro, po rozmrożeniu nasienia, należy użyć jak największej liczby jaj, aby zwiększyć liczbę uzyskanych w końcowym etapie żywotnych embrionów, co może wymagać wykorzystania trzech do czterech samic.Kolejnym kluczowym elementem protokołu jest szybkość. Proces od momentu pozyskania nasienia od samca do umieszczenia go w suchym lodzie nie powinien trwać dłużej niż około minuty. Myślę, że to wszystko.Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

a-high-throughput-method-for-zebrafish-sperm-cryopreservation-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda o wysokiej wydajności do krioprezerwacji plemników ryby zebry i in vitro zapłodnienia

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Zmodyfikowany protokół manipulacji ploidalnością wykorzystuje szok cieplny do wywołania jednocyklowego zatrzymania cytokinezy we wczesnym zarodku. Protokół ten został zademonstrowany w przypadku danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych gatunków.

Manipulacja ploidalna zarodków danio pręgowanego z leczeniem szoku cieplnego 2

Głównym celem tego badania było dostosowanie procedury witryfikacji zanurzonej w igłach (NIV) do kriokonserwacji całych jąder danio pręgowanego. Dodatkowo przetestowano powtarzalność metody w pięciu różnych szczepach danio pręgowanego.

Kriokonserwacja spermatogonii danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle jądra

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Prezentowany tutaj jest protokół do analizy hybrydyzacji RNA in situ u ryb danio pręgowanych oraz testu tworzenia probówek w indukowanych pluripotencjalnych komórkach śródbłonka pochodzących od pacjenta w celu zbadania roli endoglinu w tworzeniu naczyń krwionośnych.

Hybrydyzacja in situ w całości w zarodkach danio pręgowanego i test tworzenia rurek w iPSC-EC w celu zbadania roli endoglinu w rozwoju naczyniowym

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

Poznaj wysokoprzepustową metodę kriokonserwacji nasienia danio pręgowanego z zapłodnieniem in vitro. Protokół zapewnia 25% płodność i stabilność próbek przez ponad siedem lat.

Wysokoprzepustowa metoda krio konserwacji plemników i zapłodnienia in vitro ryby danio-ostreokonicznej (zebrafish)

Przeglądaj więcej filmów