Wytwarzanie gynogenetycznych diploidalnych danio pręgowanych za pomocą wczesnego wywierania nacisku

Witam, jestem Charlene Walker z laboratorium Charlesa Kimmela na Uniwersytecie Oregonu, w Instytucie Neuronauki. A ja jestem Gregory Walsh. Pracuję w laboratorium Cecilii Moens w Wydziale Nauk Podstawowych w Fred Hutchinson Cancer Research Center.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę otrzymywania diploidowych danio pręgowanych metodą wczesnego wywierania ciśnienia. Metoda ta wykorzystuje ciśnienie hydrostatyczne do depolimeryzacji mikrotubul w komórce jajowej zapłodnionej plemnikami naświetlonymi promieniami UV. Kluczowe jest zastosowanie tej metody w odpowiednim czasie.

Zapobiega to wydaleniu drugiego ciałka polarnego, co prowadzi do powstania zarodka diploidalnego, którego chromosomy homologiczne są dwoma produktami pierwszej mejozy. Technika ta została opracowana na początku lat 70., kiedy pracowałem w laboratorium George'a Reisingera na Uniwersytecie Oregon. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę w czteropokoleniowych przesiewach genetycznych.

Gamety ryb z mutagennej generacji F1 mogą być bezpośrednio badane pod kątem mutacji recesywnych, które wywołują fenotypy rozwojowe u homozygotycznego potomstwa gino o diploidalnym genomie. Ponieważ danio przezewiany wykazuje silną interferencję genetyczną, metodę tę wykorzystujemy również do mapowania mutacji na chromosomach oraz szacowania odległości tych mutacji od centromeru. Przejdźmy zatem do realizacji. Późnym popołudniem, w dniu poprzedzającym eksperyment, należy przygotować się do pobrania plemników poprzez odseparowanie samców i samic przeznaczonych do wyciskania; można wykorzystać starsze samce, ponieważ nie będą one dostarczać materiału genetycznego.

Samice powinny być duże i mieć wydatne brzuchy, natomiast samce powinny być żółte i żwawe. Przechowywać samce i samice przez noc w oddzielnych zbiornikach, aby zapewnić do nich łatwy dostęp rano. W dniu eksperymentu przygotować roztwór Hanksa i dodać wodorowęglan sodu.

Przenieś ryby do rybozakładu w wiaderku z lodem. Roztwór Hank's zawiera trica, a timer i probówki służą do zbierania nasienia. Na koniec, po dotarciu do rybozakładu, rozcieńcz trica w wodzie rybiej.

Roztwór ten zostanie wykorzystany do znieczulenia ryb w następnym kroku. Aby rozpocząć pobieranie nasienia, przygotuj na lodzie czystą fiolkę z roztworem Hanksa. Przygotuj wystarczającą ilość schłodzonego roztworu Hanksa (około 50 µL na samca), a następnie znieczul jednego lub dwóch samców jednocześnie.

Poprzez zanurzenie i przelewanie, można je wyjąć z anestetyka za pomocą plastikowej łyżki. Opłukać samce w wodzie dla ryb i osuszyć papierowym ręcznikiem. Jest to bardzo istotne, ponieważ woda aktywuje plemniki.

Po wyschnięciu umieść ryby w uchwycie z pianki pod mikroskopem stereoskopowym przy niskim powiększeniu z oświetleniem episkopowym. Rozchyl pincetą płetwy brzuszne i ustaw mikrokapilarę przy ujściu kloaki, aby rozpocząć pobieranie nasienia. Delikatnie, lecz zdecydowanie, masuj boki ryby gładkimi pęsetami; gdy mleczne nasienie zacznie wypływać z otworu kopulacyjnego, zbierz je do mikrokapilary za pomocą delikatnego ssania. Pobierz nasienie od kilku samców i przechowuj w lodzie.

Plemniki w zimnym roztworze Hanksa od pięciu do 10 samców są wystarczające do zapłodnienia jaj od 20 do 30 samic. Plemniki przechowywane w zimnym roztworze Hanksa będą efektywnie zapładniać jaja przez kilka godzin.

Należy zebrać wystarczającą ilość nasienia, aby przygotować mętna zawiesinę do inaktywacji plemników promieniami UV. Rozpocznij od wypełnienia dna szklanej szalki Petriego lodem. Na lodzie w szalce umieść szkiełko zegarkowe.

Następnie za pomocą pipety przenieś nasienie z probówki na szkiełko zegarkowe. Należy zadbać o to, aby pobrać do pipety jak najwięcej nasienia, unikając jednocześnie zaciągnięcia pęcherzyków powietrza. Kluczowe jest, aby nie dopuścić do spienienia nasienia; nanieś je cienką, równomierną warstwą na szkiełko zegarkowe, a następnie wyrzuć pipetę.

Po przeniesieniu plemników umieść szalkę Petriego w urządzeniu do sieciowania UV. Włącz urządzenie, ustawiając energię na poziomie 900 JUULs. Po przeprowadzeniu sieciowania za pomocą czystej pipety pobierz plemniki ze szkiełka zegarowego, przenieś je do probówki typu fendor oznakowanej jako „plemniki UV” i umieść na lodzie.

Aby rozpocząć zbiór jaj, należy najpierw znieczulić dwie samice jednocześnie. W przypadku stosowania Trica kluczowe jest, aby nie trzymać ryb w roztworze zbyt długo, ponieważ przedłużona anestezja może doprowadzić do ich śmierci. Następnie opłucz ryby w wodzie dla ryb i osusz je za pomocą ręcznika papierowego.

Jest to kluczowe, ponieważ nadmiar wody spowoduje obrzęk jaj i uniemożliwi zapłodnienie. Umieść samicę w plastikowej szalce Petri o średnicy 35 milimetrów, używając wilgotnych, ale nie mokrych palców. Naciśnij delikatnie, lecz stanowczo na brzuch.

Jeśli samica jest gotowa do tarła, ikra zostanie wydalona z łatwością; należy zebrać ją za pomocą szpatułki, a następnie umieścić samicę z powrotem w wodzie. Zdrowe jaja mają żółtawy, półprzezroczysty kolor, natomiast jaja, które zbyt długo pozostawały w organizmie samicy, są białe i wodniste. Aby zapewnić pozyskanie wysokiej jakości ikry, należy zbierać ją w ciągu pierwszych dwóch godzin po zapaleniu świateł w pracowni ichtiologicznej, dbając o to, aby jaja pozostawały przykryte w celu zapobieżenia ich wysychaniu.

Po zebraniu ikry, należy dodać od 30 do 50 µL zawiesiny plemników poddanych działaniu UV do ikry i delikatnie wymieszać końcówką pipety. Natychmiast dodać około 1 mL wody rybnej i uruchomić stoper. Ikra pozostawiona do rozwoju na tym etapie będzie haploidalna.

Następujące kroki muszą zostać wykonane w ciągu 90 sekund od zapłodnienia. Uruchom stoper w momencie aktywacji jaj poprzez dodanie wody.

Dokładny czas trwania metafazy pierwszego podziału mejozy zależy od temperatury. Czas trwania przyłożenia i zdjęcia nacisku jest zoptymalizowany dla 28,5°C. Po uruchomieniu stopera odczekaj chwilę, a następnie dolej wody i przesuń jaja do środka szalki.

Używając odciętej i wypolerowanej pipety Pasteura, przenieś zapłodnione jaja do fiolek ciśnieniowych, jeśli jest to konieczne. Dolej do fiolki więcej wody do jaj, tak aby były niemal całkowicie wypełnione, pozostawiając kroplę wody w górnej części fiolki. Następnie nałóż gumowy korek na kroplę wody i zabezpiecz go plastikową zakrętką.

Umieść fiolki dnem do góry w cylindrze ciśnieniowym, dodając więcej wody z jaj.

Pozostaw cylinder w prasie do czasu upływu sześciu minut od momentu aktywacji, aby zapewnić łączny czas nacisku wynoszący 4,5 minuty. Sześć minut po aktywacji wyjmij cylinder z prasy. Wyjmij fiolki z cylindra i ostrożnie je osusz, aby zapobiec schłodzeniu embrionów.

Opróżnij cylinder i ponownie napełnij go wodą z jajami. Przygotuj kolejne fiolki, napełniając je częściowo wodą z jajami w razie potrzeby. Powtórz te kroki dla wszystkich partii jaj.

Cylinder pomieści do dwóch probówek jednocześnie, dlatego można opóźnić zapłodnienie jaj o jedną lub dwie minuty, aby sprawdzić, czy inne samice znajdujące się już w trica złożą jaja. Pomoże to przyspieszyć proces poprzez przetwarzanie większej liczby partii w jednym czasie. Ponadto, jeśli zostanie wykonane wyciskanie ryb podczas używania prasy, jaja mogą stać się zbyt suche, aby zachować żywotność do czasu, aż prasa będzie mogła zostać użyta ponownie; 24 godziny po zapłodnieniu haploidalny embrion zebrafish będzie miał krótki, krępy tułów, krótki ogon i mniej wyraźnie uformowany mózg.

Niemniej jednak wszystkie będą posiadać te same części ciała, takie jak somity, sznur nerwowy, oczy i uszy. Zarówno diploidy, haploidy, jak i diploidy wykazują nieograniczone ruchy zginania około 24 godziny po zapłodnieniu. Po zapłodnieniu diploidalne rodzeństwo EP posiada długie ogony, dobrze uformowane mózgi i powinno wykazywać żywotność na poziomie około 60 do 70%.

Wyglądają one bardzo podobnie do niepoddanych działaniu kontroli rozmieszczonych. Zazwyczaj partia embrionów haplo zawiera mieszankę embrionów o dobrym wyglądzie, embrionów martwych oraz wszystkich stanów pośrednich. Proporcja embrionów o dobrym wyglądzie do wadliwych odzwierciedla obecność szkodliwych genów w genomie żeńskim.

Mutacje są stosunkowo łatwe do zidentyfikowania nawet przy takim tle, ponieważ pojawi się kilka osobników, aż do 50%, o tym samym charakterystycznym fenotypie. Ważne jest upewnienie się, że embriony otrzymane tą metodą są prawdziwymi OID; w celu kontroli należy wygenerować zestaw normalnych diploidalnych jaj, odkładając część plemników bez inaktywacji UV, oraz zestaw embrionów haploidalnych, odkładając zestaw jaj zapłodnionych plemnikami poddanymi działaniu UV bez przeprowadzania procedury EP; haploidy nie są żywotne po dwóch do trzech dniach. Diploidy otrzymane drogą EP powinny wyglądać jak normalne diploidy.

Choć mogą wystąpić niektóre nieregularne potwory EP, lęgi diploidów EP powinny być w dużej mierze żywotne, na poziomie około 70 do 90%. Obecność haplo w lęgu EP sugeruje niepowodzenie w procesie EP, na przykład brak utrzymania ciśnienia przez prasę. Obecność diploidów w lęgu haplo sugeruje niepełną inaktywację plemników, na przykład awarię sieciującego.

Właśnie pokazaliśmy, jak łatwo przeprowadzić zapłodnienie in vitro u rybek danio oraz jak uzyskać ginekogenne diploidalne embriony rybek danio poprzez zahamowanie drugiego podziału mejozy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać, że czas wczesnego wywarcia nacisku jest precyzyjny, a prasa utrzymuje stałe ciśnienie na poziomie 8 000 psi przez cały czas trwania zabiegu. Należy upewnić się, że prasa została skalibrowana.

To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.