Name: Wytwarzanie gynogenetycznego diploidalnego danio pręgowanego za pomocą wczesnego ciśnienia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Poznaj metodę wczesnego ciśnienia do wytwarzania gynogenetycznych diploidalnych zarodków Danio rerio. Technika wykorzystuje ciśnienie hydrostatyczne do depolimeryzacji mikrotubul w jajach zapłodnionych nasieniem napromieniowanym UV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Metody zapłodnienia in vitro oraz otrzymywania diploidów gynogenetycznych dla danio pręgowanego zostały opracowane przez Charline Walker w laboratorium George'a Streisingera na Uniwersytecie Oregon w latach 70. i 80. XX wieku. Opisana tutaj metoda nie różni się od protokołów Charline, które w pełnej wersji są dostępne w publikacji The Zebrafish Book3.Metody zapłodnienia in vitro oraz otrzymywania diploidów gynogenetycznych u danio pręgowanego zostały opracowane przez Charline Walker w laboratorium George'a Streisingera na Uniwersytecie Oregon w latach 70. i 80. XX wieku. Metoda opisana w niniejszym materiale nie różni się od protokołów Charline, które w pełnej wersji są dostępne w The Zebrafish Book3.

Przegląd wczesnego ciśnienia
Uwaga: receptury na wiele z odczynników stosowanych w tym protokole, takich jak tricaina, woda dla ryb oraz sól Hanksa, są dostępne online w rozdziale 10 książki The Zebrafish Book3 (<a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html</a>)
<ol>
<li>Uzyskać embriony poprzez zapłodnienie in vitro z użyciem plemników inaktywowanych promieniami UV.</li>
<li>Niezwłocznie przenieść zapłodnione jaja do szklanej fiolki (z plastikowym zamknięciem zatrzaskowym) wypełnionej po brzegi wodą dla jaj. Przykryć otwarty koniec fiolki cienką arkuszem gumy lateksowej i zatrzasnąć górną część (w której wycięto otwór) na fiolce, dociskając gumę.</li>
<li>Umieścić fiolkę w prasie hydraulicznej i w 1,4 min po zapłodnieniu zwiększyć ciśnienie do 8,000 p.s.i. (Należy pamiętać, że wiele pras jest skalibrowanych tak, aby odczytywać ciśnienie wywierane na tłok o średnicy 2 cali, zatem odczyty muszą zostać przeliczone na p.s.i.)</li>
<li>Zacząć stopniowo zwalniać ciśnienie w ciągu 1 min, począwszy od 6 min po zapłodnieniu.</li>
</ol>
Szczegółowa procedura wstępnego ciśnienia
<ol>
 <li>Dzień przed eksperymentem
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Późnym popołudniem oddziel samce i samice przeznaczone do wyciskania. Można użyć dowolnego starszego samca, ponieważ nie będzie on dostarczał materiału genetycznego. Samice powinny być duże i mieć wydęte brzuchy. Samce powinny mieć żółty kolor i być żwawe.</li>
 <li>Przechowuj samice i samce oddzielnie przez noc w zbiornikach, do których będzie można łatwo uzyskać dostęp rano.</li>
 </ol></li>
 <li>Dzień eksperymentu (rano)
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Przygotuj roztwór Hanksa; dodaj wodorowęglan sodu.</li>
 <li>Zabierz do rybochowli: wiadro z lodem, roztwór Hanksa, tricain, timer, probówki do zbierania nasienia.</li>
 <li>Rozcieńcz tricain w wodzie dla ryb.</li>
 </ol></li>
 <li>Zbiór nasienia
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Przygotuj przejrzystą fiolkę z roztworem Hanksa na lodzie. Odmierz ~50 μl na każdego samca przeznaczonego do wyciskania.</li>
 <li>Zanurz 3 lub 4 samce jednocześnie w tricainie w celu znieczulenia. Można je wyciągnąć z znieczulenia za pomocą plastikowej łyżki.</li>
 <li>Opłucz w wodzie dla ryb i osusz ręcznikiem papierowym do stanu „wilgotno-suchego” (bardzo ważne: woda aktywuje plemniki).</li>
 <li>Umieść rybę w uchwycie z pianki pod stereomikroskopem przy małym powiększeniu z oświetleniem episkopowym. Rozchyl płetwy brzuszne pęsetą i umieść mikrokapilarę przy ujściu kloaki.</li>
 <li>Gładkimi pęsetami (Millipore) delikatnie, ale stanowczo masuj boki ryby.</li>
 <li>Gdy mleczne nasienie zacznie wypływać z otworu kopulacyjnego, zbierz je do mikrokapilary za pomocą delikatnego zasysania.</li>
 <li>Połącz nasienie od kilku samców w lodowatym roztworze Hanksa. Nasienie od 5-10 samców jest wystarczające do zapłodnienia kilkuset jaj. Plemniki w zimnym roztworze Hanksa będą skutecznie zapładniać jaja przez kilka godzin, a nawet dni. Oceń „na oko” stężenie nasienia, zbierając ilość wystarczającą do uzyskania mętnej zawiesiny.</li>
 </ol></li>
 <li>Inaktywacja nasienia promieniami UV
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Wypełnij dno szklanej płytki Petriego lodem.</li>
 <li>Połóż szkiełko zegarkowe na lodzie w płytce.</li>
 <li>Za pomocą pipety Pasteura przenieś nasienie z probówki na szkiełko zegarkowe. Upewnij się, że do pipety pobrano jak najwięcej nasienia, nie wciągając pęcherzyków powietrza. Ponadto, nie napowietrzaj nasienia na szkiełku podczas jego wyprowadzania z pipety. Rozlej nasienie cienką, równą warstwą na szkiełku. WYRZUĆ TĘ PIPETĘ.</li>
 <li>Umieść płytkę Petriego w urządzeniu do sieciowania UV.</li>
 <li>Włącz urządzenie na 2 minuty.</li>
 <li>Używając CZYSTEJ pipety, zbierz nasienie ze szkiełka zegarkowego i przenieś je do probówki Eppendorf oznaczonej jako „Nasienie UV”, a następnie umieść na lodzie.</li>
 </ol></li>
 <li>Zbiór jaj i zapłodnienie in vitro
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Znieczul trzy lub cztery samice jednocześnie w tricainie.</li>
 <li>Opłucz w wodzie dla ryb i osusz &quot;wilgotno-sucho&quot; ręcznikiem papierowym. Nadmiar wody spowoduje pęcznienie jaj i uniemożliwi zapłodnienie.</li>
 <li>Umieść samicę w plastikowej płytce Petriego o średnicy 35 mm i wilgotnymi (nie mokrymi) palcami delikatnie, ale stanowczo naciśnij na brzuch. Jeśli samica jest gotowa do tarła, jaja wyjdą dość łatwo.</li>
 <li>Zbierz jaja szpatułką i zwróć samicę do wody. Dobre jaja mają żółtawy, półprzezroczysty kolor, natomiast jaja, które zbyt długo pozostały w samicy, są białe i wodniste (patrz poniżej). Aby mieć pewność uzyskania dobrych jaj, zbieraj je w ciągu pierwszych 2 godzin po zapaleniu świateł w rybochowli. Trzymaj jaja pod przykryciem, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
 <li>Dodaj 30-50 μl zawiesiny nasienia UV do jaj, wymieszaj delikatnie końcówką pipety.</li>
 <li>Natychmiast dodaj około 1 ml wody dla ryb i uruchom timer. Jaja pozostawione do rozwoju na tym etapie będą haploidalne.</li>
 </ol></li>
 <li>Wczesne ciśnienie. Uwaga: kroki a-g muszą zostać wykonane w ciągu 90 sekund od zapłodnienia!
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Uruchom timer w momencie aktywacji jaj poprzez dodanie wody.</li>
 <li>Odczekaj chwilę i dodaj więcej wody, zakręć jajami, aby skupiły się w centrum płytki.</li>
 <li>Używając uciętej i wypolerowanej pipety Pasteura, przenieś zapłodnione jaja do fiolek ciśnieniowych.</li>
 <li>Jeśli to konieczne, dodaj więcej wody z jajami do fiolek tak, aby były prawie przepełnione, pozostawiając kroplę wody na krawędzi fiolek.</li>
 <li>Nałóż gumową zatyczkę na kroplę wody i zabezpiecz plastikową pokrywką nad gumą.</li>
 <li>Umieść fiolkę(fiolki) do góry dnem w cylindrze ciśnieniowym, dolewając więcej wody z jajami, aby wypełnić cylinder. Mocno zakręć cylinder.</li>
 <li>Umieść cylinder w prasie z tłokiem skierowanym w górę i zastosuj nacisk 8,000 lbs/sq. in.</li>
 <li>Pozostaw cylinder w prasie do 6 min od czasu aktywacji (łącznie przez 4,5 min ciśnienia).</li>
 <li>W 6 minucie po aktywacji wyjmij cylinder z prasy, a następnie wyjmij fiolki z cylindra. Ostrożnie osusz fiolki, aby zapobiec ochłodzeniu embrionów.</li>
 <li>Zresetuj cylinder i ponownie napełnij go wodą z jajami.</li>
 <li>Przygotuj kolejne fiolki, wypełniając je częściowo wodą z jajami w razie potrzeby.</li>
 <li>Powtórz dla wszystkich partii jaj.</li>
 </ol></li>
</ol>
UWAGA: Cylinder pomieści jednocześnie do 3 fiolek, dlatego można opóźnić zapłodnienie jaj o kilka minut, aby sprawdzić, czy pozostałe samice znajdujące się już w tricainie złożą ikrę. Pozwoli to przyspieszyć pracę poprzez jednoczesne przetwarzanie większej liczby partii. Należy również pamiętać, że w momencie korzystania z prasy nie wolno umieszczać kolejnych ryb w tricainie, dopóki zabieg nie zostanie zakończony. Zbyt długie przebywanie ryb w środku anestetycznym może doprowadzić do ich śmierci. Ponadto, jeśli wyciśnie się ikrę z ryb podczas gdy prasa jest zajęta, jaja mogą stać się zbyt suche, by zachować żywotność do czasu ponownego zwolnienia urządzenia.

<ol><li>Streisinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).</li>
<li>Streisinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half-tetrad+analysis+in+zebrafish%3A+mapping+the+ros+mutation+and+the+centromere+of+linkage+group+I%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I.</a> Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).</li>
<li>Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+pressure+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Early pressure screens.</a> Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).</li>
<li>Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-linkage+analysis+and+consolidation+of+the+zebrafish+genetic+map%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map.</a> Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).</li>
<li>Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutants+with+disrupted+early+T-cell+and+thymus+development+identified+in+early+pressure+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen.</a> Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).</li>
</ol>

Ważne jest upewnienie się, że embriony otrzymane tą metodą są prawdziwymi diploidami gynogenetycznymi. W ramach kontroli należy wyhodować partię normalnych jaj diploidalnych (odkładając część plemników bez inaktywacji UV) oraz partię embrionów haploidalnych (odkładając partię jaj zapłodnionych plemnikami poddanymi działaniu UV, ale bez przeprowadzenia procedury EP). W 1. dniu po zapłodnieniu embriony haploidalne charakteryzują się krótką osią ciała oraz nieregularną morfologią mózgu i somytów. Haploidy nie są żywotne po ...

<table><tbody><tr><td>Trykaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko zegarkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prasa francuska</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butla ciśnieniowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td></td><td></td><td>Odciąć wąski koniec, wypolerować ogniowo</td></tr><tr><td>Kroslinker UV</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikrokapilary</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie gynogenetycznych diploidalnych danio pręgowanych za pomocą wczesnego wywierania nacisku

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygotyczność u diploidalnych eukariontów często utrudnia badania genetyczne. Metody pozwalające na uzyskanie żywotnych potomstwa diploidalnego, homozygotycznego bezpośrednio od samic heterozygotycznych umożliwiają bezpośredni przesiew samic F1 poddanych mutagenezie w celu wykrycia mutacji szkodliwych w przyspieszonym ekranie genetycznym typu forward. Streisinger et al.1,2opisano metody otrzymywania gynogenetycznych (homozygotycznych) diploidalnych danio pręgowanych poprzez aktywację jaj danio za pomocą nasienia inaktywowanego promieniowaniem ultrafioletowym oraz zapobieganie drugiej dywizji mejotycznej lub pierwszej dywizji komórkowej zygoty za pomocą zabiegów fizycznych (ciepła lub ciśnienia), które depolimeryzują mikrotubule. Metoda „wczesnego ciśnienia” (EP) blokuje mejozę II, która zachodzi krótko po zapłodnieniu. Metoda EP daje wysoki odsetek żywotnych embrionów, które mogą rozwinąć się w płodne dorosłe osobniki obu płci. Metoda ta generuje embriony homozygotyczne we wszystkich locus, z wyjątkiem tych, które zostały oddzielone od centromeru w wyniku rekombinacji podczas mejozy I. Homozygotyczne mutacje wykrywa się w kłakach EP w zakresie od 50% dla locus centromerowych do mniej niż 1% dla locus telomerowych. Metoda ta została odtworzona słowo w słowo z Zebrafish Book3.

Jest to metoda generowania gynogenetycznych diploidalnych embrionów danio przeżębnika (embrionów, których jedynym wkładem genetycznym jest materiał macierzysty), poprzez blokowanie drugiego podziału mejozy bezpośrednio po zapłodnieniu plemnikami inaktywowanymi światłem ultrafioletowym. Embriony EP nie są w pełni homozygotyczne ze względu na rekombinację podczas pierwszego podziału mejozy, są jednak homozygotyczne we wszystkich loci, które nie zostały oddzielone od centromeru w wyniku rekombinacji.

Wytwarzanie gynogenetycznych diploidalnych danio pręgowanych za pomocą wczesnego wywierania nacisku

Heterozygotyczność u eukariontów diploidalnych często utrudnia badania genetyczne. Metody pozwalające na bezpośrednie uzyskanie żywotnego, homozygotycznego potomstwa diploidalnego z...

Witam, jestem Charlene Walker z laboratorium Charlesa Kimmela na Uniwersytecie Oregonu, w Instytucie Neuronauki. A ja jestem Gregory Walsh. Pracuję w laboratorium Cecilii Moens w Wydziale Nauk Podstawowych w Fred Hutchinson Cancer Research Center.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę otrzymywania diploidowych danio pręgowanych metodą wczesnego wywierania ciśnienia. Metoda ta wykorzystuje ciśnienie hydrostatyczne do depolimeryzacji mikrotubul w komórce jajowej zapłodnionej plemnikami naświetlonymi promieniami UV. Kluczowe jest zastosowanie tej metody w odpowiednim czasie.Zapobiega to wydaleniu drugiego ciałka polarnego, co prowadzi do powstania zarodka diploidalnego, którego chromosomy homologiczne są dwoma produktami pierwszej mejozy. Technika ta została opracowana na początku lat 70., kiedy pracowałem w laboratorium George'a Reisingera na Uniwersytecie Oregon. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę w czteropokoleniowych przesiewach genetycznych.Gamety ryb z mutagennej generacji F1 mogą być bezpośrednio badane pod kątem mutacji recesywnych, które wywołują fenotypy rozwojowe u homozygotycznego potomstwa gino o diploidalnym genomie. Ponieważ danio przezewiany wykazuje silną interferencję genetyczną, metodę tę wykorzystujemy również do mapowania mutacji na chromosomach oraz szacowania odległości tych mutacji od centromeru. Przejdźmy zatem do realizacji. Późnym popołudniem, w dniu poprzedzającym eksperyment, należy przygotować się do pobrania plemników poprzez odseparowanie samców i samic przeznaczonych do wyciskania; można wykorzystać starsze samce, ponieważ nie będą one dostarczać materiału genetycznego.Samice powinny być duże i mieć wydatne brzuchy, natomiast samce powinny być żółte i żwawe. Przechowywać samce i samice przez noc w oddzielnych zbiornikach, aby zapewnić do nich łatwy dostęp rano. W dniu eksperymentu przygotować roztwór Hanksa i dodać wodorowęglan sodu.Przenieś ryby do rybozakładu w wiaderku z lodem. Roztwór Hank's zawiera trica, a timer i probówki służą do zbierania nasienia. Na koniec, po dotarciu do rybozakładu, rozcieńcz trica w wodzie rybiej.Roztwór ten zostanie wykorzystany do znieczulenia ryb w następnym kroku. Aby rozpocząć pobieranie nasienia, przygotuj na lodzie czystą fiolkę z roztworem Hanksa. Przygotuj wystarczającą ilość schłodzonego roztworu Hanksa (około 50 µL na samca), a następnie znieczul jednego lub dwóch samców jednocześnie.Poprzez zanurzenie i przelewanie, można je wyjąć z anestetyka za pomocą plastikowej łyżki. Opłukać samce w wodzie dla ryb i osuszyć papierowym ręcznikiem. Jest to bardzo istotne, ponieważ woda aktywuje plemniki.Po wyschnięciu umieść ryby w uchwycie z pianki pod mikroskopem stereoskopowym przy niskim powiększeniu z oświetleniem episkopowym. Rozchyl pincetą płetwy brzuszne i ustaw mikrokapilarę przy ujściu kloaki, aby rozpocząć pobieranie nasienia. Delikatnie, lecz zdecydowanie, masuj boki ryby gładkimi pęsetami; gdy mleczne nasienie zacznie wypływać z otworu kopulacyjnego, zbierz je do mikrokapilary za pomocą delikatnego ssania. Pobierz nasienie od kilku samców i przechowuj w lodzie.Plemniki w zimnym roztworze Hanksa od pięciu do 10 samców są wystarczające do zapłodnienia jaj od 20 do 30 samic. Plemniki przechowywane w zimnym roztworze Hanksa będą efektywnie zapładniać jaja przez kilka godzin.Należy zebrać wystarczającą ilość nasienia, aby przygotować mętna zawiesinę do inaktywacji plemników promieniami UV. Rozpocznij od wypełnienia dna szklanej szalki Petriego lodem. Na lodzie w szalce umieść szkiełko zegarkowe.Następnie za pomocą pipety przenieś nasienie z probówki na szkiełko zegarkowe. Należy zadbać o to, aby pobrać do pipety jak najwięcej nasienia, unikając jednocześnie zaciągnięcia pęcherzyków powietrza. Kluczowe jest, aby nie dopuścić do spienienia nasienia; nanieś je cienką, równomierną warstwą na szkiełko zegarkowe, a następnie wyrzuć pipetę.Po przeniesieniu plemników umieść szalkę Petriego w urządzeniu do sieciowania UV. Włącz urządzenie, ustawiając energię na poziomie 900 JUULs. Po przeprowadzeniu sieciowania za pomocą czystej pipety pobierz plemniki ze szkiełka zegarowego, przenieś je do probówki typu fendor oznakowanej jako „plemniki UV” i umieść na lodzie.Aby rozpocząć zbiór jaj, należy najpierw znieczulić dwie samice jednocześnie. W przypadku stosowania Trica kluczowe jest, aby nie trzymać ryb w roztworze zbyt długo, ponieważ przedłużona anestezja może doprowadzić do ich śmierci. Następnie opłucz ryby w wodzie dla ryb i osusz je za pomocą ręcznika papierowego.Jest to kluczowe, ponieważ nadmiar wody spowoduje obrzęk jaj i uniemożliwi zapłodnienie. Umieść samicę w plastikowej szalce Petri o średnicy 35 milimetrów, używając wilgotnych, ale nie mokrych palców. Naciśnij delikatnie, lecz stanowczo na brzuch.Jeśli samica jest gotowa do tarła, ikra zostanie wydalona z łatwością; należy zebrać ją za pomocą szpatułki, a następnie umieścić samicę z powrotem w wodzie. Zdrowe jaja mają żółtawy, półprzezroczysty kolor, natomiast jaja, które zbyt długo pozostawały w organizmie samicy, są białe i wodniste. Aby zapewnić pozyskanie wysokiej jakości ikry, należy zbierać ją w ciągu pierwszych dwóch godzin po zapaleniu świateł w pracowni ichtiologicznej, dbając o to, aby jaja pozostawały przykryte w celu zapobieżenia ich wysychaniu.Po zebraniu ikry, należy dodać od 30 do 50 µL zawiesiny plemników poddanych działaniu UV do ikry i delikatnie wymieszać końcówką pipety. Natychmiast dodać około 1 mL wody rybnej i uruchomić stoper. Ikra pozostawiona do rozwoju na tym etapie będzie haploidalna.Następujące kroki muszą zostać wykonane w ciągu 90 sekund od zapłodnienia. Uruchom stoper w momencie aktywacji jaj poprzez dodanie wody.Dokładny czas trwania metafazy pierwszego podziału mejozy zależy od temperatury. Czas trwania przyłożenia i zdjęcia nacisku jest zoptymalizowany dla 28,5°C. Po uruchomieniu stopera odczekaj chwilę, a następnie dolej wody i przesuń jaja do środka szalki.Używając odciętej i wypolerowanej pipety Pasteura, przenieś zapłodnione jaja do fiolek ciśnieniowych, jeśli jest to konieczne. Dolej do fiolki więcej wody do jaj, tak aby były niemal całkowicie wypełnione, pozostawiając kroplę wody w górnej części fiolki. Następnie nałóż gumowy korek na kroplę wody i zabezpiecz go plastikową zakrętką.Umieść fiolki dnem do góry w cylindrze ciśnieniowym, dodając więcej wody z jaj.Pozostaw cylinder w prasie do czasu upływu sześciu minut od momentu aktywacji, aby zapewnić łączny czas nacisku wynoszący 4,5 minuty. Sześć minut po aktywacji wyjmij cylinder z prasy. Wyjmij fiolki z cylindra i ostrożnie je osusz, aby zapobiec schłodzeniu embrionów.Opróżnij cylinder i ponownie napełnij go wodą z jajami. Przygotuj kolejne fiolki, napełniając je częściowo wodą z jajami w razie potrzeby. Powtórz te kroki dla wszystkich partii jaj.Cylinder pomieści do dwóch probówek jednocześnie, dlatego można opóźnić zapłodnienie jaj o jedną lub dwie minuty, aby sprawdzić, czy inne samice znajdujące się już w trica złożą jaja. Pomoże to przyspieszyć proces poprzez przetwarzanie większej liczby partii w jednym czasie. Ponadto, jeśli zostanie wykonane wyciskanie ryb podczas używania prasy, jaja mogą stać się zbyt suche, aby zachować żywotność do czasu, aż prasa będzie mogła zostać użyta ponownie; 24 godziny po zapłodnieniu haploidalny embrion zebrafish będzie miał krótki, krępy tułów, krótki ogon i mniej wyraźnie uformowany mózg.Niemniej jednak wszystkie będą posiadać te same części ciała, takie jak somity, sznur nerwowy, oczy i uszy. Zarówno diploidy, haploidy, jak i diploidy wykazują nieograniczone ruchy zginania około 24 godziny po zapłodnieniu. Po zapłodnieniu diploidalne rodzeństwo EP posiada długie ogony, dobrze uformowane mózgi i powinno wykazywać żywotność na poziomie około 60 do 70%.Wyglądają one bardzo podobnie do niepoddanych działaniu kontroli rozmieszczonych. Zazwyczaj partia embrionów haplo zawiera mieszankę embrionów o dobrym wyglądzie, embrionów martwych oraz wszystkich stanów pośrednich. Proporcja embrionów o dobrym wyglądzie do wadliwych odzwierciedla obecność szkodliwych genów w genomie żeńskim.Mutacje są stosunkowo łatwe do zidentyfikowania nawet przy takim tle, ponieważ pojawi się kilka osobników, aż do 50%, o tym samym charakterystycznym fenotypie. Ważne jest upewnienie się, że embriony otrzymane tą metodą są prawdziwymi OID; w celu kontroli należy wygenerować zestaw normalnych diploidalnych jaj, odkładając część plemników bez inaktywacji UV, oraz zestaw embrionów haploidalnych, odkładając zestaw jaj zapłodnionych plemnikami poddanymi działaniu UV bez przeprowadzania procedury EP; haploidy nie są żywotne po dwóch do trzech dniach. Diploidy otrzymane drogą EP powinny wyglądać jak normalne diploidy.Choć mogą wystąpić niektóre nieregularne potwory EP, lęgi diploidów EP powinny być w dużej mierze żywotne, na poziomie około 70 do 90%. Obecność haplo w lęgu EP sugeruje niepowodzenie w procesie EP, na przykład brak utrzymania ciśnienia przez prasę. Obecność diploidów w lęgu haplo sugeruje niepełną inaktywację plemników, na przykład awarię sieciującego.Właśnie pokazaliśmy, jak łatwo przeprowadzić zapłodnienie in vitro u rybek danio oraz jak uzyskać ginekogenne diploidalne embriony rybek danio poprzez zahamowanie drugiego podziału mejozy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać, że czas wczesnego wywarcia nacisku jest precyzyjny, a prasa utrzymuje stałe ciśnienie na poziomie 8 000 psi przez cały czas trwania zabiegu. Należy upewnić się, że prasa została skalibrowana.To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

making-gynogenetic-diploid-zebrafish-by-early-pressure

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tworzenie gynogenetycznych diploidalnych danio pręgowanego poprzez wczesne ciśnienie

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Ten protokół zawiera instrukcję krok po kroku, jak generować parabiotyczne zarodki danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym. W połączeniu z niezrównanymi możliwościami obrazowania zarodka danio pręgowanego, metoda ta zapewnia wyjątkowo potężny środek do badania funkcji autonomicznych i nieautonomicznych komórek dla genów kandydujących na badanie.

Generowanie parabiotycznych zarodków danio pręgowanego poprzez chirurgiczne zespolenie rozwijających się blastuli

Zmodyfikowany protokół manipulacji ploidalnością wykorzystuje szok cieplny do wywołania jednocyklowego zatrzymania cytokinezy we wczesnym zarodku. Protokół ten został zademonstrowany w przypadku danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych gatunków.

Manipulacja ploidalna zarodków danio pręgowanego z leczeniem szoku cieplnego 2

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Przedstawiamy skuteczny i łatwy w użyciu protokół do przygotowania pierwotnych hodowli komórkowych zarodków danio pręgowanego do transfekcji i obrazowania żywych komórek, a także protokół do przygotowania pierwotnych komórek z mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Hodowla i transfekcja komórek pierwotnych danio pręgowanego

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Poznaj metodę wczesnego ciśnienia do wytwarzania gynogenetycznych diploidalnych zarodków Danio rerio. Technika wykorzystuje ciśnienie hydrostatyczne do depolimeryzacji mikrotubul w jajach zapłodnionych nasieniem napromieniowanym UV.

Wytwarzanie gynogenetycznych diploidalnych danio pręgowanych za pomocą wczesnego wywierania nacisku

Przeglądaj więcej filmów