Name: Wizualizacja bijącego serca u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-28T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj techniki wizualizacji bijącego serca u larw i dorosłych osobników Drosophila. Metody obejmują preparację dorosłych owadów oraz immobilizację larw za pomocą kleju histoacrylowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KO jest wspierane przez grant z American Heart Association.

Przed rozpoczęciem
Serca dorosłych
<ol>
 <li>Przygotować świeży roztwór sztucznej hemolimfy (AH) zawierający 108mM Na+, 5mM K+, 2mM Ca2+, 8mM MgCl2, 1mM NaH2PO4, 4mM NaHCO3, 10mM sacharozy, 5mM trehalozy oraz 5mM HEPES (pH 7,1; wszystkie odczynniki firmy Sigma Chemicals). Sacharozę i trehalozę należy dodać do AH z chłodzonych roztworów zapasowych bezpośrednio przed użyciem, aby zapobiec kontaminacji bakteryjnej.</li>
 <li>Doprowadzić AH do temperatury pokojowej i napowietrzyć roztwór poprzez bąblowanie powietrzem przez co najmniej 15 min.</li>
 <li>Wyciągnąć kilka cienkich kapilar (np. Glass Capillaries, 100ul, VWR) niezbędnych do usunięcia tkanki tłuszczowej.</li>
</ol>
Serca larwalne
<ol>
 <li>Kryszalki pokryte Sylgardem: za pomocą wykałaczki przenieś około 50-70μl roztworu Sylgard na kryszalkę o wymiarach 22x22mm. Pozostaw Sylgard do utwardzenia w temperaturze 65°C przez noc. </li>
 <li>Przygotuj bufor Broadie i Bate’a (135mM NaCl, 5mM KCl, 4mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM TES, 36mM sacharozy; pH 7,15. Patrz Broadie i Bate, 1993).</li>
 <li>Przygotuj narzędzia niezbędne do aplikacji kleju histoacryl. Najpierw wyciągnij kilka cienkich kapilar (np. Science Products GB100T8P). Połącz końcówkę pipety 1,5ml z małym plastikowym wężykiem (Tygon, 1/32”), wsuwając mniejszy koniec do rurki. Wsuń kapilarę szerszym otworem w drugi koniec. Napełnij kapilarę klejem Histoacryl, zanurzając ją w kropli kleju i delikatnie zasysając go do plastikowej końcówki. Podczas pracy z klejem należy mieć pod ręką drugą szklaną kapilarę, aby usunąć nadmiar kleju z końcówki kapilary aplikacyjnej. Klej pozostaje w stanie ciekłym do momentu kontaktu z buforowaną solą fizjologiczną, w której utwardza się w ciągu kilku sekund. Zazwyczaj pozostaje jednak plastyczny wystarczająco długo, aby można go było usunąć z końcówki kapilary lub nanieść na preparat.</li>
</ol>
Preparacja częściowo nienaruszonego serca Drosophila z dorosłej muchy
<ol>
 <li>Dorosłe muchy Drosophila są znieczulane preparatem Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) przez 2-5 minut. Należy zadbać o to, aby nie pozostawiać much w Fly Nap przez dłuższy czas. Do znieczulania much można również wykorzystać krótkotrwałą ekspozycję na zimno, jednak nie zaleca się stosowania CO2, ponieważ wywiera on dłużej utrzymujące się działanie na częstość i rytmikę bicia serca.</li>
 <li>Znieczulone muchy umieszcza się stroną grzbietową do dołu w szalce Petriego pokrytej cienką warstwą wazeliny. Hydrofobowa kutykula skrzydeł i ciała odwracalnie „przykleja się” do wazeliny, ale w razie potrzeby można zmienić położenie muchy. Staje się to szczególnie istotne podczas późniejszych manipulacji.</li>
 <li>Pierwsze cięcie wykonuje się za pomocą zakrzywionych nożyczek sprężynowych (Roboz #5611). Ostrza nożyczek umieszcza się pod odnóżami i kieruje je w dół w stronę powierzchni grzbietowej klatki piersiowej w pobliżu szyi. Głowę, brzuszny sznur nerwowy i odnóża usuwa się jednym cięciem. Preparat zanurza się następnie w natlenionym roztworze sztucznej hemolimfy (AH).</li>
 <li>Za pomocą nożyczek sprężynowych jednym cięciem usuwa się tylną końcówkę odwłoka (składającą się z segmentów odwłoka 7 i 8). Umożliwia to wykonanie cięć bocznych wzdłuż obu krawędzi odwłoka i służy do przerwania połączenia między tylną częścią jelita a kutykulą odwłoka. Następnie usuwa się uwolnioną płat kutykuli brzusznej odwłoka.</li>
 <li>W krokach 3 i 4 przecina się przednie i tylne połączenia jelita, tak że narządy odwłoka są teraz utrzymywane na miejscu jedynie przez tracheole. Jelito i inne narządy odwłoka można zazwyczaj usunąć jako jedną masę, używając pęsety jubilerskiej (Roboz, #55) i delikatnie pociągając. Usunięcie narządów wewnętrznych odsłania bijącą rurkę serca, która wciąż jest przymocowana do kutykuli grzbietowej i otoczona ciałami tłuszczowymi.</li>
 <li>Ciała tłuszczowe są dość nieprzezroczyste w mikroskopie świetlnym, w związku z czym często konieczne jest usunięcie części tego tłuszczu, aby wyraźnie widzieć rurkę serca. Osiąga się to za pomocą techniki liposukcji przy użyciu cienkich kapilar szklanych. Kapilary wykonuje się za pomocą standardowego wyciągacza do pipet (np. Sutter P-97 Pipette Puller), a następnie wstawia się je do plastikowych rurek (Tygon, 1/16”) podłączonych do źródła próżni. System ten służy do odsysania nadmiaru tłuszczu z okolic rurki serca. Siła ssania jest proporcjonalna do średnicy końcówki, dlatego nie należy używać pipet o końcówkach o średnicy większej niż 40 mikronów. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dotknąć samego serca, a ponieważ tylna część serca jest bardzo krucha, należy całkowicie unikać tego obszaru.</li>
 <li>Rurka serca dorosłej Drosophila jest teraz odsłonięta i powinna bić. W razie potrzeby można zmienić położenie kutykuli wraz z przymocowanym sercem, delikatnie podnosząc kutykulę z wazeliny i ostrożnie przykładając ją z powrotem, unikając ponownie jakiegokolwiek kontaktu z tkanką serca. W tym momencie roztwór kąpieli preparatu należy zastąpić świeżym AHL. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek manipulacji należy pozwolić preparatowi na równowagę przez 20-30 minut przy jednoczesnym natlenianiu. Jeśli preparat ma być utrzymywany przez więcej niż 60 minut, należy go perfundować świeżym AHL.</li>
</ol>
Unieruchamianie larw Drosophila do rejestracji optycznej
<ol>
 <li>Nanieś kroplę kleju Histoacryl w pobliżu każdego narożnika szkiełek przykrywek Sylgard. Dodaj 50μl buforu B&amp;B do kropel kleju, który natychmiast stwardnieje. Wypełnij przestrzeń między punktami klejenia buforem B&amp;B – klej utrzyma bufor na szkiełku.</li>
 <li>Pobierz wędrującą larwę w stadium L3 i umieść ją na kawałku mokrej chusteczki higienicznej na lodzie przez 2 min. Spowolni to jej ruchy. Następnie przenieś larwę do buforu i zorientuj ją grzbietem do góry (jest to strona larwy pozbawiona pasów z kolcami). Szybko nanieś niewielką ilość kleju między obszar głowy a Sylgard. Klej stwardnieje bardzo szybko i zapobiegnie przemieszczaniu się głowy larwy.</li>
 <li>Używając pęsety, ostrożnie chwyć zwierzę za przesuwy tylne i delikatnie je rozciągnij. Utrwal larwę w tej pozycji, nakładając klej wzdłuż obu stron ciała w tylnej połowie. Aby ograniczyć dalsze ruchy kutykuli wywołane przez mięśnie ściany ciała, dodaj więcej kleju na boki zwierzęcia. Larwa jest teraz unieruchomiona w tej pozycji. Szkiełko przykrywkę można umieścić w małej szalce Petriego wypełnionej AHL lub PBS. Można teraz rejestrować skurcze serca bez zakłóceń wywołanych ruchami ściany ciała.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Półzachowane serce dorosłej muszki *Drosophila* po wycięciu będzie bić rytmicznie przez wiele godzin, jeśli zostanie utrzymane w świeżym, natlenionym roztworze AH (patrz Supplemental Data, Ocorr, et al., 2007). Reprezentatywny przykład przedstawiono w Movie 1. Serca od 3Badania i rozwój Larwy w stadium rozwojowym oraz młode muchy (1–3 tygodnie po wykluciu) zazwyczaj wykazują regularny rytm pracy serca z częstotliwością od 1 do 3 Hz. Muchy starsze niż 3 tygodnie są zazwyczaj bardziej arytmiczne; niemniej jednak ich serca wciąż są zdolne do spontanicznego bicia przez wiele godzin w napowietrzonym roztworze AHL. Serca dorosłych much, które uległy uszkodzeniu w wyniku procedury sekcji, typowo wykazują zlokalizowane obszary ekstremalnego skurczu, które nie są w stanie się rozkurczyć. Częstotliwość bicia serca niższa niż 1 Hz jest rzadko obserwowana u much młodszych niż 3 tygodnie; w związku z tym takie preparaty są uznawane za uszkodzone i są odrzucane.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1425/MOVIE1.avi">Kliknij tutaj, aby pobrać Film 1.</a>- Jednotygodniowa dorosła mucha typu dzikiego (szczep laboratoryjny w1118) z odsłoniętą rurką serca brzusznego (przód po lewej stronie). Zauważ regularne, rytmiczne skurcze. Nieprzezroczyste obszary w prawym górnym rogu to pozostałości ciał tłuszczowych brzusznych; okrągłe komórki po obu stronach serca to komórki osierdzia.

<ol><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 13, 144-166 (1993).</li>
</ol>

Model Drosophila okazał się potężnym narzędziem genetycznym, które wykorzystywano do badania różnorodnych zagadnień naukowych, od rozwoju embrionalnego po uczenie się i pamięć. Ostatnio ten wszechstronny organizm modelowy został użyty do badania genetyki funkcji serca u muchy. Wiele prób ilościowego określenia fizjologii serca u dorosłych Drosophila opierało się na obserwacjach przeprowadzanych u nienaruszonych much przez kutykulę brzuszną. Większość tych podejść bazowała na obserwacji wizualnej lub rejestracji zmian nat...

<table><tbody><tr><td>Mikro-nożyczki sprężynowe do mikrodissekcji (zakrzywione)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5611</td><td>Dobre do cięć wstępnych (Krok 3)</td></tr><tr><td>Mikro-nożyczki sprężynowe do mikrodissekcji (proste)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane, 100ul</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane, cienkie</td><td>Science Products</td><td>GB100T8P</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica pipet</td><td>Sutter Equipment</td><td>P-97</td><td>Zastosowanie możliwe zarówno dla wytwornic poziomych, jak i pionowych</td></tr><tr><td>Przewód plastikowy</td><td>Tygon</td><td>1/16&amp;#8221; średnicy wewnętrznej</td><td>do kapilar 100&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>Przewód plastikowy</td><td>Tygon</td><td>1/32&amp;#8221; średnicy wewnętrznej</td><td>do małych kapilar</td></tr><tr><td>Klej tkankowy Histoacryl&amp;#174;</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja bijącego serca u drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

TheDrosophilaserce stało się ostatnio dobrym systemem modelowym do badania genetycznych, komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw funkcji serc miogennych. Kluczowym krokiem w badaniu funkcji serca u muchy jest znalezienie sposobu na uzyskanie dostępu do serca w sposób, który zachowuje jego funkcję miogenną, a jednocześnie pozwala na obserwację i rejestrację bijącego organu. Przedstawiono dwie różne metody obserwacji i rejestracji bijącego serca zarówno u larw, jak i u osobników dorosłychDrosophilaopisane są tutaj. Nasza metoda przygotowania preparatu półintegralnego z użyciem dorosłych much pozwala na wyraźną wizualizację serca brzusznego bez zakłóceń ze strony pigmentowanej kutykuli oraz nadległych ciał tłuszczowych. Aby zarejestrować bicie serca larwy, konieczne jest unieruchomienie larwy, co minimalizuje ruchy ścian ciała, redukując tym samym ruchy serca niezwiązane ze skurczami mięśnia sercowego. Nasze metodologie pozwalają na uzyskanie stabilnych preparatów serca dorosłych osobników i larw, które mogą bić przez wiele godzin z częstotliwością 1-3 Hz.

Przedstawiono technikę niezbędną do wizualizacji bijącego serca w larwalnym i dorosłym stadium rozwoju Drosophila. Każdy etap cyklu życiowego wymaga zastosowania odmiennej metodologii.

Wizualizacja bijącego serca u Drosophila

Serce muszki owocówki (*Drosophila*) stało się w ostatnim czasie dobrym modelem badawczym do analizy genetycznych, komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw funkcji w...

Przedstawione zostaną tutaj dwie techniki wizualizacji bijącego serca u Drosophila w celu wypreparowania serca dorosłego osobnika. Najpierw głowę i klatkę piersiową usuwa się za pomocą jednego cięcia wzdłuż zaznaczonej linii. Następnie usuwa się narządy kopulacyjne i otwiera jamę ciała odwłoka za pomocą pęsety; usuwa się jelita, a w przypadku samicy muchy również jajniki.Ciało tłuszczowe w trzecim i czwartym segmencie odwłosa jest ostrożnie odsysane w celu odsłonięcia serca dorosłego osobnika dla unieruchomienia serca larwalnego. Pojedynczą larwę umieszczoną w roztworze buforowym unieruchamia się, nakładając najpierw klej histo acral wokół obszaru głowy larwy. Larwę delikatnie rozciąga się, a następnie nakłada więcej kleju na koniec tylny oraz na boki ściany ciała larwy.Cześć, jestem GI Fler. Cześć, jestem Karen er. Oboje jesteśmy członkami programu Rozwoju i Starzenia w Instytucie Badań Medycznych Burnham.Dzisiaj zaprezentujemy procedury, które opracowaliśmy w celu wizualizacji bijącego serca larw oraz dorosłych osobników Drosophila. Obie te preparacje wykorzystujemy jako metodę wizualizacji, badania i ilościowego określania parametrów tętna u muszki owocówki Drosophila. Przed roz

visualizing-the-beating-heart-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja bijącego serca w Drosophila

W niniejszym opracowaniu opisujemy podstawowy protokół fluorescencyjnego znakowania różnych elementów cewek serca larw i osobników dorosłych Drosophila melanogaster. Próbki te są dobrze dostosowane do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Technika ta umożliwia szczegółową analizę strukturalną cech serc tego potężnego organizmu modelowego.

Fluorescencyjne znakowanie struktur serca Drosophila

Opracowaliśmy półautomatyczną metodę optycznej analizy bicia serca (SOHA) do analizy szybkich nagrań optycznych z serc Drosophila, rybek danio oraz embrionów myszy. Prezentujemy zastosowanie naszej metodologii w analizie funkcji serca muszki owocowej oraz embrionów myszy.

Półautomatyczna optyczna analiza rytmu serca w przypadku małych serc

Przedstawiamy różne metody monitorowania funkcji serca u larw Drosophila w celu analizy kwestii dotyczących funkcji złączy szczelinowych, mutacji kanałów jonowych, modulacji aktywności rozrusznika oraz w badaniach farmakologicznych.

Monitorowanie funkcji serca u larw Drosophila melanogaster w badaniach fizjologicznych

Opisujemy proces utrwalania, zatapiania, krojenia i obrazowania późnych stadiów embrionów Drosophila do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu badania embrionalnej rurki serca. Technika ta umożliwia wizualizację światła rurki serca, a także błony podstawnej wyścielającej światło serca.

Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Ten film opisuje dorosłe serce muchy, inaczej zwane naczyniem grzbietowym Drosophila. Przedstawiony protokół przedstawia procedurę preparacji preparatów z żywym sercem.

Przygotowanie serca Drosophila: technika badania fizjologii serca u dorosłej muchy

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Tutaj opisane są eksperymentalne protokoły przygotowania Drosophila na różnych etapach rozwoju i wykonywania podłużnego optycznego obrazowania uderzeń serca Drosophila za pomocą niestandardowego systemu optycznej mikroskopii koherentnej (OCM). Zmiany morfologiczne i dynamiczne serca można scharakteryzować ilościowo, analizując parametry strukturalne i funkcjonalne serca na podstawie obrazów OCM.

Drosophila Przygotowanie i obrazowanie podłużne funkcji serca in vivo przy użyciu optycznej mikroskopii koherentnej (OCM)

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Obecny protokół opisuje wytwarzanie opsyn Drosophila melanogaster wykazujących ekspresję opsyn eNpHR2.0 lub ReaChR w sercu do obrazowania OCT i optogenetycznej stymulacji serca. Podano szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania OCT Drosophila i modulacji bicia serca, w tym symulacji możliwego do przywrócenia zatrzymania akcji serca, bradykardii i tachykardii u żywych zwierząt na różnych etapach rozwoju.

Opracowanie modeli Drosophila melanogaster do obrazowania i optogenetycznej kontroli funkcji serca

Protokół sekcji serca i obrazowania fluorescencyjnego Drosophila upraszcza badanie struktury i patologii serca. Podejście to obejmuje proste cięcie, barwienie i obrazowanie, z pominięciem wiedzy technicznej potrzebnej do tradycyjnej sekcji. Zwiększa to dostępność, dzięki czemu Drosophila jest modelem szerzej wykorzystywanym do badań związanych z sercem w szerszej społeczności naukowej.

Nowatorska i skuteczna metoda barwienia fluorescencyjnego serca Drosophila z kriosekcją

Poznaj techniki wizualizacji bijącego serca u larw i dorosłych osobników Drosophila. Metody obejmują preparację dorosłych owadów oraz immobilizację larw za pomocą kleju histoacrylowego.

Wizualizacja bijącego serca u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów