Wizualizacja bijącego serca u Drosophila

Przedstawione zostaną tutaj dwie techniki wizualizacji bijącego serca u Drosophila w celu przeprowadzenia sekcji serca dorosłego człowieka. Najpierw głowę i klatkę piersiową usuwa się pojedynczym cięciem wzdłuż wskazanej linii. Następnie usuwa się narządy płciowe i otwiera się jamę brzuszną za pomocą kleszczy jelita, a w przypadku samicy muchy usuwa się jajniki.

Ciało tłuszczowe w jamie brzusznej w trzecim i czwartym segmencie brzusznym jest ostrożnie odsysane, aby odsłonić dorosłe serce w celu unieruchomienia serca larwy. Pojedyncza larwa umieszczona w roztworze buforowym jest utrwalana przez nałożenie najpierw kleju histo akralnego wokół obszaru głowy larwy. Larwy są delikatnie rozciągane, a więcej kleju nakłada się na tylny koniec, a następnie na boki ściany ciała larwy.

Cześć, jestem GI Fler. Cześć, jestem Karen. Oboje jesteśmy uczestnikami programu Rozwoju i Starzenia się w Instytucie Badań Medycznych Burnham.

Dziś pokażemy Wam procedury, które opracowaliśmy, aby uwidocznić bijące serce Lavala i dorosłego dorosłego Drosophila. Używamy obu tych preparatów jako sposobu na wizualizację, badanie i ilościowe określanie parametrów bicia serca u muszki owocowej. Drosophila. Zanim zaczniemy, najpierw przygotowujemy sztuczny roztwór hemolimfy.

Roztwór ten zawiera sacharozę, helo, którą należy dodać do sztucznej hemolimfy ze schłodzonych roztworów podstawowych tuż przed użyciem. Aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu, doprowadź sztuczną hemolimfę do temperatury pokojowej i natlenij roztwór za pomocą bulgoczącego powietrza przez co najmniej 15 minut. Następnie wyciągnij kilka drobnych naczyń włosowatych za pomocą standardowego ściągacza do pipet, który będzie potrzebny do usunięcia ciałek tłuszczowych w rozporku.

Gdy wszystko zostanie przygotowane, dorosłe muchy muszą zostać znieczulone. Można to zrobić, używając krótkiej ekspozycji na drzemkę muchy przez dwie do pięciu minut, ale należy uważać, aby nie pozostawiać much w drzemce muchy dłużej niż pięć minut. Krótkotrwała ekspozycja na zimno może być również wykorzystana do znieczulenia much, ale dwutlenek węgla nie jest zalecany, ponieważ ma długotrwały wpływ na tętno i tętno.

Następnie znieczulone muchy umieszcza się grzbietem do dołu na szalce Petriego pokrytej cienką warstwą wazeliny. Hydrofobowy naskórek na skrzydłach i tułowiu powinien odwracalnie przylegać do galaretki, ale w razie potrzeby muchę można przestawić. Wstępne cięcie wykonuje się za pomocą zakrzywionych nożyczek sprężynowych.

Odbywa się to poprzez umieszczenie ostrzy nożyczek pod nogami muchy i skierowanie ich pod kątem w dół w kierunku grzbietowej powierzchni w pobliżu szyi. Głowa, rdzeń nerwowy brzuszny i nogi są usuwane jednym cięciem po przecięciu. Preparat jest następnie zanurzany w natlenionym roztworze sztucznej limfy hemo za pomocą nożyczek sprężynowych.

Tylny koniec brzucha, który składa się z siódmego i ósmego segmentu brzusznego, jest usuwany za pomocą jednego cięcia. Zapewnia to dostęp do wykonywania bocznych nacięć wzdłuż obu krawędzi brzucha i służy do przerwania połączenia między tylnym jelitem a naskórkiem brzucha. Włóż ostrza nożyczek do małego otworu w końcówce brzucha i odetnij naskórek na boki.

To uwalnia jedną krawędź naskórka brzusznego. Chwyć klapę kleszczami i wykonaj podobne cięcie wzdłuż przeciwległej bocznej krawędzi brzucha. Uwolniony płat brzusznego naskórka brzusznego brzusznego można teraz usunąć.

Jelita i inne narządy jamy brzusznej można zwykle usunąć jako pojedynczą masę za pomocą kleszczy jubilerskich i delikatnego szarpania. Usunięcie narządów wewnętrznych odsłania bijącą rurkę serca, która nadal jest przymocowana do naskórka grzbietowego przez małe mięśnie powietrzne i jest otoczona ciałami tłuszczowymi. Wyciągnięte kapilary są umieszczane w plastiku, jedna 16-calowa rurka jest podłączona do źródła podciśnienia.

Siła ssania jest proporcjonalna do średnicy końcówki, dlatego po ustawieniu nie należy używać pipet z końcówkami o średnicy większej niż 40 mikronów. Ten system ssący służy do odsysania nadmiaru tłuszczu z okolic rurki serca. Może być również stosowany do usuwania pęcherzyków powietrza, które gromadzą się wokół naskórka i wszelkich zanieczyszczeń.

Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć dotykania samego serca, a ponieważ tylna część serca jest bardzo delikatna, należy unikać tego obszaru razem. Dorosła rurka serca drosophila jest teraz odsłonięta i powinna bić, jeśli to konieczne. Naskórek i dołączone serce można zmienić, delikatnie podnosząc naskórek z wazeliny i ostrożnie ubijając go z powrotem w dół.

Unikanie kontaktu z tkanką serca. W tym momencie roztwór kąpiący preparat należy zastąpić świeżą sztuczną hemolimfą. Preparat ten należy pozostawić do zrównoważenia przez 20 do 30 minut z natlenieniem przed jakimikolwiek manipulacjami.

Jeśli preparat ma być przechowywany dłużej niż 60 minut, należy go ponownie przetworzyć świeżą sztuczną hemolimfą. Preparat ten jest teraz gotowy do użycia do zapisu optycznego i może być również używany do zapisu elektrofizjologicznego lub do manipulacji histologicznych. Inna technika jest wymagana do wizualizacji bijącego serca wewnątrz larw.

W pierwszej kolejności należy przygotować szkiełka nakrywkowe na dzień przed zabiegiem. Odbywa się to za pomocą wykałaczki do przeniesienia około 50 do 70 mikrolitrów roztworu Sard na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry. Pozwól osłonie syl stwardnieć w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc.

Następnie przygotuj bufor Brody i Bates, po przygotowaniu porcje można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i rozmrozić w razie potrzeby. Na koniec przygotuj narzędzia potrzebne do nałożenia kleju histo acral. Najpierw pociągnij kilka drobnych naczyń włosowatych.

Następnie połącz końcówkę pipety o pojemności 1,5 mililitra z małą plastikową rurką o średnicy około 32 cali. Wkładając mniejszy koniec do rurki, włóż kapilarnę z szerokim otworem na drugi koniec. Po ustawieniu załaduj kapilę klejem histo, zanurzając kapilarnę w kropli kleju i delikatnie zasysając do plastikowej końcówki.

Podczas pracy z klejem należy mieć pod ręką drugą szklaną kapilarę, aby usunąć nadmiar kleju z końcówki kapilary klejowej. Klej jest płynny, dopóki nie wejdzie w kontakt z buforowaną solą fizjologiczną, gdzie stwardnieje w ciągu kilku sekund. Jednak zwykle pozostaje plastikowy wystarczająco długo, aby można go było usunąć z końcówki kapilarnej kleju lub podczas nakładania go na próbkę.

Teraz, aby rozpocząć unieruchamianie larw, umieść kroplę kleju histo acral blisko każdego rogu osłony sylowej. Szkiełka nakrywkowe dodają 50 mikrolitrów buforu B i B do kropli kleju, który stwardnieje natychmiast wypełni przestrzeń między sklejonymi miejscami b i b. Klej utrzyma bufor na szkiełku.

Weź wędrujące larwy L trzy i umieść je na kawałku mokrej bibuły na lodzie na dwie minuty. Spowolni to jego ruch. Następnie przenieś larwy do bufora i ustaw je grzbietem do góry.

Jest to strona larw, która nie ma identycznych pasów. Szybko nałóż trochę kleju między głową a osłoną parapetu. Klej bardzo szybko stwardnieje i zapobiegnie przesuwaniu się głowy larw.

Za pomocą kleszczy ostrożnie chwyć zwierzę za tylne iskierki i delikatnie je rozciągnij. Zamocuj larwy w tej pozycji, nakładając klej po obu stronach larw w tylnej połowie. Aby zmniejszyć dalszy ruch naskórka przez mięśnie ściany ciała, dodaj więcej kleju do boków zwierzęcia.

Larwa jest teraz unieruchomiona w tej pozycji. Szkiełko nakrywkowe można umieścić na małej szalce Petriego wypełnionej sztuczną hemolimfą lub PBS, bicie serca można teraz rejestrować bez zakłóceń spowodowanych ruchami ścian ciała. Częściowo nienaruszone serce dorosłej drosophili będzie bić rytmicznie przez wiele godzin po sekcji, gdy będzie utrzymywane w świeżej, natlenionej sztucznej hemolimfie.

Reprezentatywny przykład jest pokazany tutaj i w filmie uzupełniającym jedno serce od trzeciego w larwach gwiazd pokazanych tutaj, a młode muchy te od jednego do trzech tygodni po elo na ogół wykazują regularne bicie serca w tempie od jednego do trzech herców, muchy starsze niż trzy tygodnie są na ogół bardziej arytmiczne. Niemniej jednak serca te są nadal w stanie spontanicznie bić przez wiele godzin w natlenionych sztucznych sercach hemolimfy, a dorosłe muchy, które są uszkodzone w wyniku procedury preparacji, zwykle wykazują zlokalizowane obszary ekstremalnego zwężenia, które nie są w stanie się zrelaksować i często są niekontrolowane. Tętno wolniejsze niż jeden Hz jest rzadko obserwowane u much w wieku poniżej trzech tygodni

W związku z tym takie preparaty uważa się za uszkodzone i są wyrzucane. Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować poziome i dorosłe serca muszek owocowych do obrazowania optycznego. Pamiętaj, że przygotowując półnienaruszony preparat, nigdy nie dotykaj samego serca.

Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.