Name: Zubożenie określonych populacji komórek przez zubożenie dopełniacza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Poznaj technikę zubożenia dopełniacza do izolacji limfocytów T z wysoką czystością. Ta metoda wykorzystuje przeciwciała monoklonalne i kaskadę dopełniacza, osiągając 95-100% eliminację docelowych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chciałbym podziękować Sreemanti Basu za dostarczenie danych do Ryciny 1. Praca ta była częściowo finansowana z grantu NIH AI069358 oraz przez BloodCenter Research Foundation.

A. Dopełniacz królika
<ol>
<li>Zapasowy dopełniacz króliczy należy rozmrozić w temperaturze pokojowej, a następnie rozdzielić na aliquoty o objętości 0,5 i/lub 1 ml i zamrozić w temperaturze -20-80 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
<li>Każdą partię dopełniacza należy poddać miareczkowaniu w celu określenia optymalnego stężenia roboczego. Zazwyczaj optymalne jest rozcieńczenie 1:10-1:20.</li>
<li>Dopełniacz króliczy nie zawsze jest wysterylizowany przed sprzedażą; w zależności od końcowego zastosowania komórek, dopełniacz powinien zostać wysterylizowany przez filtrację podczas rozdzielania na aliquoty i zamrażania lub przed dodaniem do komórek.</li>
</ol>
B. Wybór przeciwciał
<ol>
<li>Nie wszystkie przeciwciała są skuteczne w aktywacji dopełniacza, dlatego w pierwszej kolejności należy przetestować ich aktywność.</li>
<li>Zarówno mysie, jak i szczurze przeciwciała mAb są skuteczne w aktywacji dopełniacza.</li>
<li>Przeciwciała IgM są zazwyczaj najwydajniejsze w indukowanej dopełniaczem lizie komórek, a następnie przeciwciała IgG. Izotypy IgG najlepiej aktywujące dopełniacz różnią się w zależności od gatunku.</li>
<li>Każde przeciwciało należy miareczkować w celu optymalnego zastosowania przy gęstości komórek 107 komórek/ml.</li>
</ol>
C. Protokół podstawowy
<ol>
<li>Dostosuj początkową populację komórek do stężenia 5 x 107 komórek/ml w pożywce zawierającej inaktywowaną termicznie FCS. Końcowa objętość komórek będzie dwukrotnością objętości początkowej. Należy pamiętać o odłożeniu części komórek w celu ilościowego określenia stopnia ich usunięcia.</li>
<li>Każde przeciwciało należy dodać do zawiesiny komórkowej w odpowiednim, wcześniej ustalonym stężeniu lub rozcieńczeniu. Dobrze wymieszaj komórki poprzez odwracanie probówki.</li>
<li>Oblicz wymaganą ilość dopełniacza. Rozmroź zapas dopełniacza w temperaturze pokojowej. Jeśli dopełniacz nie jest sterylny, wysterylizuj go za pomocą filtra strzykawkowego o niskim wiązaniu białek. Przed dodaniem dopełniacza do strzykawki dodaj kilka ml pożywki, a następnie przefiltruj zawartość bezpośrednio do probówki zawierającej komórki i przeciwciało.</li>
<li>Dostosuj końcową objętość w probówce tak, aby stężenie komórek wynosiło 1 x 107 komórek/ml.</li>
<li>Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę, mieszając co 15 minut.</li>
<li>Odwiruj komórki i odlej nadsącz.</li>
<li>Przemyj komórki dwukrotnie pożywką. Pozostałości komórkowe będą przylegać do ścianek probówek polistyrenowych. Martwe komórki i debris można usunąć za pomocą sitka komórkowego lub poprzez wirowanie w gradiencie gęstości.</li>
<li>Sprawdź czystość komórek, porównując populację komórek docelowych przed i po usunięciu. Cytometria przepływowa oraz immunohistochemia to dwie skuteczne metody określania czystości komórek.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Przy zastosowaniu przeciwciała mAb o wysokiej wydajności aktywacji dopełniacza, deplecja komórek po jednej rundzie przekracza 95%. Przedstawiono to na Rysunku 1, gdzie rozpoczęto od splenocytów mysich składających się w 32,2% z limfocytów T αβ, co wykryto poprzez ekspresję TCRβ (eBioscience, San Diego, CA) metodą cytometrii przepływowej. Przeprowadzono deplecję limfocytów T przy użyciu przeciwciała mAb specyficznego dla Thy1, białka eksprymowanego przez wszystkie limfocyty T, ale nie przez inne leukocyty. Zastosowano przeciwciało Y-19, będące rat IgG2c2. Zgodnie z opisaną procedurą, populacja TCRβ została zredukowana do 1,56%, co stanowi redukcję o ponad 95%.
<img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="Wykresy cytometrii przepływowej ekspresji TCRβ przed i po deplecją komórek, przedstawiające zmiany w liczbie komórek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Deplecja limfocytów T śledziony thy1+ poprzez aktywację dopełniacza. Całkowitą populację splenocytów mysich uzyskano poprzez homogenizację śledziony i lizę RBC. Przeciwciała anty-thy1 oraz dopełniacz z krwi królika w określonych stężeniach dodano do zawiesiny pojedynczych komórek splenocytów w taki sposób, aby końcowe stężenie komórek wynosiło 1 x 107 cells/ml. Po inkubacji przez 1 hour w 37 °C komórki przemyto dwukrotnie i oceniono żywotność za pomocą testu wykluczania błękitu trypanu. Efektywność deplecji oceniono za pomocą cytometrii przepływowej, porównując odsetek komórek TCRβ+ przed deplecją (panel lewy) i po deplecji (panel prawy). Pozioma belka wskazuje na barwienie pozytywne, a liczba nad belką oznacza procent komórek pozytywnych.

<ol><li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immune+System+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , Current Biology Limited; Garland Pub. Inc. London; San Francisco; New York. (1994).</li>
<li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li>
</ol>

Oczyszczanie populacji komórek jest powszechną procedurą niezbędną do badania ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy szybką i skuteczną metodę usuwania określonych populacji komórek z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla antygenu oraz deplecji dopełniaczem. Usunięcie dowolnej populacji komórek jest możliwe, jeśli dostępny jest przeciwciało aktywujące dopełniacz, specyficzne dla markera danej linii komórkowej. Wykazaliśmy tutaj usunięcie limfocytów T przy użyciu przeciwciała monoklonalnego (mAb) specyficznego dla Thy1, białka ekspresyowanego przez niemal wszystkie populacje limfocytów T. Usunęliśmy ponad 95% limfocytów T αβ, a odsetek pozostałych splenocytów wzrósł z 68% do 98%. Taki poziom czystości komórek jest porównywalny z innymi strategiami oczyszczania, w tym FACS i separacją za pomocą kulek magnetycznych. Deplecja dopełniaczem jest szybką techniką, którą można przeprowadzić w ciągu 1,5 godziny po uzyskaniu początkowej populacji komórek. Inną zaletą deplecji dopełniaczem jest to, że technika ta może być wykonana w każdym laboratorium, ponieważ nie wymaga ona drogiego sprzętu i odczynników. Jedynymi niezbędnymi urządzeniami są łaźnia wodna i wirówka. Dopełniacz króliczy można nabyć od wielu dostawców w przystępnej cenie (patrz tabela odczynników), a wiele przeciwciał mAb można kupić w ATTC i hodować lokalnie w celu ograniczenia kosztów. W przeciwieństwie do tego, FACS wymaga cytometru przepływowego z funkcją sortowania komórek, którego koszt sięga setek tysięcy dolarów, oraz drogich przeciwciał mAb znakowanych fluorescencyjnie. Separacja za pomocą kulek magnetycznych jest umiarkowanie cenna, ale wymaga zakupu magnesu i kulek magnetycznych, co może być kosztowne. Ponadto niektóre strategie separacji magnetycznej wymagają również zakupu kolumn.
Główną przeszkodą w wykorzystaniu układu dopełniacza do deplekcji komórek jest dostępność przeciwciał monoklonalnych (mAb) aktywujących dopełniacz o wymaganej swoistości antygenowej. Chociaż przeciwciała ludzkie, mysie i szczurze posiadają zdolność do wiązania dopełniacza, niektóre izotypy są skuteczniejsze od innych. Mimo że IgM ze wszystkich trzech gatunków wykazuje wysoką skuteczność w wiązaniu dopełniacza, izotypy IgG różnią się między sobą. W związku z tym każde przeciwciało mAb musi zostać najpierw przebadane w badaniu pilotażowym w celu określenia jego efektywności. W przypadku przeciwciał o niskiej wydajności można przeprowadzić dwie rundy deplekcji dopełniaczem bez wpływu na żywotność pozostałych populacji komórek. W celu ograniczenia kosztów należy przeprowadzić miareczkowanie przeciwciał w celu uzyskania optymalnej skuteczności. Ponadto stosowane przeciwciała nie muszą być oczyszczone. Nadnadczynki hybridoma oraz płyn z brzucha są równie skuteczne, co jest szczególnie wygodne w przypadku przeciwciał IgM, które są trudne do oczyszczenia. Podobnie jak w przypadku przeciwciał, niezbędne jest przeprowadzenie miareczkowania dopełniacza w badaniu pilotażowym. Zbyt wysokie stężenie doprowadzi do utraty żywotności populacji komórek niecelowych. Ważne jest również, aby czas inkubacji nie przekraczał 60 minut.
W naszym protokole inkubujemy przeciwciało i dopełniacz wspólnie. Komórki można jednak znakować przeciwciałem przez 15-30 minut i przemyć przed dodaniem dopełniacza. Stosując tę strategię, należy przeprowadzać inkubacje z przeciwciałami w lodzie, aby zapobiec utracie antygenu z powierzchni komórki, co w przypadku niektórych białek zachodzi poprzez procesy patchingu, cappingu lub internalizacji receptorów. Choć metoda ta jest wysoce wydajna, główną wadą deplekcji dopełniaczem w porównaniu z innymi metodami jest to, że nie może być ona stosowana do selekcji pozytywnej. Utrudnia to zatem uzyskanie subpopulacji komórek. Na przykład trudno byłoby oddzielić komórki B strefy marginalnej od komórek B pęchechowych, co najlepiej wykonać za pomocą FACS. W takiej sytuacji aktywację dopełniacza można wykorzystać do deplekcji limfocytów T, aby zmniejszyć liczbę sortowanych komórek. Strategia ta skróciłaby czas sortowania, co pozwoliłoby zaoszczędzić środki i byłoby mniej obciążające dla komórek.
Ponieważ oczyszczanie specyficznych populacji komórek jest powszechnie stosowanym wymogiem, opracowano szereg strategii. Głównymi zaletami strategii usuwania dopełniacza są jej przystępność cenowa, prostota techniczna oraz oszczędność czasu.

<table><tbody><tr><td>dopełniacz z krwi królików w wieku 3-4 tygodni</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31061-3</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Różne</td><td>różne</td><td>Można również użyć inkubatora ustawionego na 37 &amp;#x00B0;C.</td></tr></tbody></table>

deplecja specyficznych populacji komórek poprzez deplecję dopełniacza

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Oczyszczanie populacji komórek odpornościowych jest często niezbędne w celu zbadania ich unikalnych funkcji. W szczególności podejścia molekularne, takie jak real-time PCR i analiza mikromacierzy, wymagają izolacji populacji komórek o wysokiej czystości. Powszechnie stosowane strategie oczyszczania obejmują fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS), separację za pomocą kulek magnetycznych oraz usuwanie dopełniacza. Spośród tych trzech strategii usuwanie dopełniacza oferuje zalety w postaci szybkości, niskich kosztów, łagodnego traktowania komórek oraz wysokiej wydajności uzyskiwania komórek. Układ dopełniacza składa się z dużej liczby białek osocza, które po aktywacji inicjują kaskadę proteolityczną, kończącą się powstaniem kompleksu atakującego błonę, który tworzy por na powierzchni komórki, prowadząc do jej śmierci.1Droga klasyczna jest aktywowana przez przeciwciała IgM i IgG i została po raz pierwszy opisana jako mechanizm zabijania bakterii. Dzięki opracowaniu przeciwciał monoklonalnych (mAb), kaskada dopełniacza może być wykorzystana do lizy dowolnej populacji komórek w sposób specyficzny dla antygenu. Deplecja komórek za pomocą kaskady dopełniacza odbywa się poprzez dodanie do wyjściowej populacji komórek przeciwciał specyficznych dla antygenu, wiążących dopełniacz, oraz dopełniacza króliczego. Komórki inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37°C, a zlizowane komórki są następnie usuwane w dwóch cyklach płukania. Przeciwciała monoklonalne o wysokiej wydajności wiązania dopełniacza zazwyczaj usuwają 95-100% docelowej populacji komórek. W zależności od strategii oczyszczania docelowej populacji komórek, deplecja dopełniaczem może być stosowana do oczyszczania komórek lub do wzbogacania populacji komórek, które mogą być następnie oczyszczane za pomocą kolejnej metody.

Aby skutecznie badać funkcje populacji komórek odpornościowych, często konieczna jest ich puryfikacja. Usuwanie dopełniacza jest szybką i niedrogą techniką izolacji populacji komórek odpornościowych o wysokiej czystości.

Deplecja specyficznych populacji komórek poprzez deplecję dopełniacza

Oczyszczanie populacji komórek odpornościowych jest często niezbędne w celu zbadania ich unikalnych funkcji. W szczególności podejścia molekularne, takie jak...

Wyczerpanie dopełniacza jest szybką, skuteczną i niedrogą metodą oczyszczania populacji komórek odpornościowych. Proces wyczerpania dopełniacza rozpoczyna się od dodania do populacji komórek przeciwciał monoklonalnych klasy IGM lub IgG, które kierują się przeciwko konkretnemu typowi komórek. W tym przykładzie celem procesu wyczerpania będą limfocyty T.Następnie dodaje się układ dopełniacza, co inicjuje kaskadę proteolityczną prowadzącą do śmierci limfocytów T. Populację komórek poddaje się następnie przemywaniu przez wirowanie oraz filtracji w celu usunięcia martwych komórek i zanieczyszczeń. Ta metoda usuwania za pomocą dopełniacza zazwyczaj pozwala na eliminację od 95 do 100% docelowej populacji komórek.Witajcie, jestem Bonnie Dittle. Jestem badaczem w Instytucie Badań nad Krwią w Blood Center of Wisconsin w Milwaukee. Dzisiaj zaprezentuję Państwu technikę deplecji komplementarnej, szybką i niedrogą metodę usuwania specyficznych populacji komórek.W moim laboratorium stosujemy tę technikę do wysokiego wzbogacania populacji komórek odpornościowych, które następnie wykorzystujemy w szeregu testów biologicznych, w tym w badaniach aktywacji komórek oraz analizie ekspresji białek. Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować aliquoty dopełniacza króliczego o objętości 0,5 lub 1 mL i przechowywać je w zamrażarce w temperaturze -20 lub -80 °C.Należy miareczkować dopełniacz do optymalnego rozcieńczenia w zakresie od 1:10 do 1:20. Doskonałym komercyjnym źródłem dopełniacza, którego rutynowo używamy w tej procedurze, są produkty firmy Pereze Biologicals. Przeciwciała monoklonalne mysie i królicze są zazwyczaj skuteczne w aktywacji dopełniacza, jednak nie wszystkie przeciwciała będą odpowiednie. Przeciwciała IgM są zazwyczaj najskuteczniejsze w indukowaniu lizy komórek przez dopełniacz.Przeciwciała IgG są drugimi pod względem wydajności i są zazwyczaj stosowane, ponieważ większość przeciwciał monoklonalnych to IgG. Należy przeprowadzić miareczkowanie każdego przeciwciała w celu optymalizacji jego użycia przy gęstości komórek wynoszącej 10⁷ komórek/ml, co określa się empirycznie. Większość przeciwciał stosuje się w zakresie od 0,1 do 10 µg/ml. Do usuwania limfocytów T ze śledziony stosujemy przeciwciało monoklonalne specyficzne dla TH1.Aby rozpocząć proces usuwania dopełniacza, należy rozcieńczyć komórki w pożywce do hodowli komórkowych zawierającej 5% inaktywowanej ciepłem płatkowej surowicy bydlęcej, tak aby początkowa populacja komórek wynosiła 2 × 10⁷ komórek/ml. Na przykład 5 × 10⁷ komórek należy rozcieńczyć w 2,5 ml pożywki. Ta objętość komórek stanowi połowę objętości końcowej, a zatem jest dwukrotnością stężenia komórek stosowanego podczas usuwania dopełniacza, które będzie wynosić 1 × 10⁷ komórek/ml.W tym momencie należy zachować do 1 × 10⁶ komórek, aby na koniec eksperymentu móc określić ilość ubytku. Dodatkowo należy rozmrozić wymaganą ilość dopełniacza w temperaturze pokojowej. Ustaliliśmy, że przy stosowaniu dopełniacza króliczego firmy Pereze Biologicals dla 5 × 10⁷ komórek odpowiednie jest rozcieńczenie 1:15; wystarczające jest 1,5 ml zamrożonego preparatu Eloqua.Teraz należy dodać odpowiednią ilość przeciwciała do zawiesiny komórkowej i wymieszać. W celu wysterylizowania dopełniacza należy użyć filtra końcówki strzykawki o niskim wiązaniu białek. Napełnić strzykawkę od jednego do dwóch mililitrów medium.Przed dodaniem dopełniacza do 5 × 10⁷ komórek, należy przygotować 340 ml dopełniacza w rozcieńczeniu 1:15. Następnie przefiltrować dopełniacz bezpośrednio do probówki zawierającej komórki i przeciwciała. Teraz należy dostosować końcową objętość w probówce tak, aby stężenie komórek wynosiło 1 × 10⁷ komórek/ml.Następnie inkubować komórki w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Należy pamiętać o mieszaniu komórek co 15 minut poprzez delikatne odwracanie probówki. Po inkubacji odwirować komórki z prędkością, która nie wpłynie na ich żywotność.Następnie w komorze z laminarnym przepływem powietrza odrzuć supernatant. W dalszej kolejności przemyj komórki dwukrotnie 10 mililitrami pożywki. Zwróć uwagę, jak zbierają się szczątki komórkowe, z których część przykleja się do ścianek probówek polistyrenowych.Po ostatnim przemyciu przefiltruj komórki przez sterylni rurkę filtrującą z nylonu o oczkach 70 µm. Na koniec sprawdź czystość komórek, porównując populację komórek zainteresowania przed i po przepływowym usuwaniu.Cytometria i immunohistochemia są preferowanymi metodami służącymi do określenia czystości komórek przed rozpoczęciem eksperymentów. Przy zastosowaniu przeciwciała monoklonalnego o wysokiej wydajności aktywacji dopełniacza, pierwsza runda usuwania dopełniacza usunie ponad 95% komórek. Przykładowo, wykorzystując cytometrię przepływową do pomiaru procentowego udziału komórek T $\alpha\beta$ w preparacie komórek z pleurocyta myszy, stwierdzono, że po usunięciu dopełniacza za pomocą anty-CD51, który jest ekspresowany przez wszystkie komórki T, ale nie przez inne leukocyty, zawierały one 32,2% komórek T $\alpha\beta$. Populacja TCR $\beta$ została zredukowana o 95% do końcowego stężenia 1,56%.Przedstawiłem właśnie szybką i skuteczną metodę usuwania specyficznych populacji komórek przy użyciu przeciwciał swoistych dla antygenu w procesie deplecji zależnej od dopełniacza. Przeprowadzając tę procedurę, należy pamiętać o przetestowaniu skuteczności każdego przeciwciała oraz o miareczkowaniu dopełniacza w eksperymencie pilotażowym przed rozpoczęciem właściwych badań. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

depletion-of-specific-cell-populations-by-complement-depletion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Czynne zużywanie określonych populacji komórek poprzez wyczerpanie dopełniacza

Makrofagi odgrywają centralną rolę w homeostazie i patologii wielu tkanek. Przedstawiony tutaj protokół opisuje metody usuwania makrofagów in vivo, otrzymywania spolaryzowanych makrofagów z aspiratów szpiku kostnego oraz adoptywnego transferu makrofagów do myszy. Techniki te pozwalają na określenie roli, jaką spolaryzowane makrofagi odgrywają w zdrowiu i chorobie.

Wyczerpanie i rekonstytucja makrofagów u myszy

Tutaj opisujemy dwa testy do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Główną przewagą nad obecnymi testami jest ich ilościowy i łatwy w interpretacji charakter.

Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Przedstawiono wytyczne dotyczące generowania zabójczych komórek prezentujących sztuczny antygen, KaAPC, skutecznego narzędzia do in vitro wyczerpywania ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu oraz alternatywnego rozwiązania dla immunoterapii komórkowej w leczeniu chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu bez narażania pozostałego układu odpornościowego.

Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (KaAPC) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu

Mikroglej może wpływać na neurony i inne komórki glejowe w hodowli za pomocą różnych autonomicznych mechanizmów niekomórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół selektywnego usuwania mikrogleju z pierwotnych kultur neuronalnych. Metoda ta może potencjalnie wyjaśnić rolę interakcji mikrogleju i neuronów, co ma implikacje dla schorzeń neurodegeneracyjnych, w których zapalenie nerwów jest cechą charakterystyczną.

Selektywne zubożanie mikrogleju z kultur komórek ziarnistych móżdżku przy użyciu estru metylowego L-leucyny

Ksenoprzeszczepy ludzkich nowotworów są unaczyniane i infiltrowane przez komórki pochodzenia mysiego podczas fazy wzrostu in vivo. Aby obejść odchylenia spowodowane przez te zanieczyszczające komórki podczas dalszej analizy, opracowaliśmy metodę pozwalającą na kompleksowe zubożenie wszystkich komórek myszy poprzez magnetyczne sortowanie komórek.

Zubożenie komórek myszy z ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych znacznie poprawia dalszą analizę komórek docelowych

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Ten protokół szczegółowo opisuje wszystkie etapy związane z uzyskaniem hematopoetycznych progenitorów CD34+ pochodzących z leukofiltrów oraz ich różnicowaniem in vitro i dojrzewaniem do megakariocytów zawierających propłytki, które są w stanie uwalniać płytki krwi w pożywce hodowlanej. Ta procedura jest przydatna do dogłębnej analizy mechanizmów komórkowych i molekularnych kontrolujących megakariopoezę.

Komórki CD34 + pochodzące z filtrów Leukodepletion jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Podano tutaj protokół selektywnej ablacji makrofagów nerkowych w celu zbadania ich regeneracji przy użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 / intermedialyzyny. Metoda ta ma również zastosowanie do badania funkcji i regeneracji innych populacji komórek w nerkach, wątrobie i tkance tłuszczowej.

Szybkie zubożenie makrofagów nerkowych przy użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 / Intermedialysin

Poznaj technikę zubożenia dopełniacza do izolacji limfocytów T z wysoką czystością. Ta metoda wykorzystuje przeciwciała monoklonalne i kaskadę dopełniacza, osiągając 95-100% eliminację docelowych komórek.

Deplecja specyficznych populacji komórek poprzez deplecję dopełniacza

Przeglądaj więcej filmów