Deplecja specyficznych populacji komórek poprzez deplecję dopełniacza

Wyczerpanie dopełniacza jest szybką, skuteczną i niedrogą metodą oczyszczania populacji komórek odpornościowych. Proces wyczerpania dopełniacza rozpoczyna się od dodania do populacji komórek przeciwciał monoklonalnych klasy IGM lub IgG, które kierują się przeciwko konkretnemu typowi komórek. W tym przykładzie celem procesu wyczerpania będą limfocyty T.

Następnie dodaje się układ dopełniacza, co inicjuje kaskadę proteolityczną prowadzącą do śmierci limfocytów T. Populację komórek poddaje się następnie przemywaniu przez wirowanie oraz filtracji w celu usunięcia martwych komórek i zanieczyszczeń. Ta metoda usuwania za pomocą dopełniacza zazwyczaj pozwala na eliminację od 95 do 100% docelowej populacji komórek.

Witajcie, jestem Bonnie Dittle. Jestem badaczem w Instytucie Badań nad Krwią w Blood Center of Wisconsin w Milwaukee. Dzisiaj zaprezentuję Państwu technikę deplecji komplementarnej, szybką i niedrogą metodę usuwania specyficznych populacji komórek.

W moim laboratorium stosujemy tę technikę do wysokiego wzbogacania populacji komórek odpornościowych, które następnie wykorzystujemy w szeregu testów biologicznych, w tym w badaniach aktywacji komórek oraz analizie ekspresji białek. Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować aliquoty dopełniacza króliczego o objętości 0,5 lub 1 mL i przechowywać je w zamrażarce w temperaturze -20 lub -80 °C.

Należy miareczkować dopełniacz do optymalnego rozcieńczenia w zakresie od 1:10 do 1:20. Doskonałym komercyjnym źródłem dopełniacza, którego rutynowo używamy w tej procedurze, są produkty firmy Pereze Biologicals. Przeciwciała monoklonalne mysie i królicze są zazwyczaj skuteczne w aktywacji dopełniacza, jednak nie wszystkie przeciwciała będą odpowiednie. Przeciwciała IgM są zazwyczaj najskuteczniejsze w indukowaniu lizy komórek przez dopełniacz.

Przeciwciała IgG są drugimi pod względem wydajności i są zazwyczaj stosowane, ponieważ większość przeciwciał monoklonalnych to IgG. Należy przeprowadzić miareczkowanie każdego przeciwciała w celu optymalizacji jego użycia przy gęstości komórek wynoszącej 10⁷ komórek/ml, co określa się empirycznie. Większość przeciwciał stosuje się w zakresie od 0,1 do 10 µg/ml. Do usuwania limfocytów T ze śledziony stosujemy przeciwciało monoklonalne specyficzne dla TH1.

Aby rozpocząć proces usuwania dopełniacza, należy rozcieńczyć komórki w pożywce do hodowli komórkowych zawierającej 5% inaktywowanej ciepłem płatkowej surowicy bydlęcej, tak aby początkowa populacja komórek wynosiła 2 × 10⁷ komórek/ml. Na przykład 5 × 10⁷ komórek należy rozcieńczyć w 2,5 ml pożywki. Ta objętość komórek stanowi połowę objętości końcowej, a zatem jest dwukrotnością stężenia komórek stosowanego podczas usuwania dopełniacza, które będzie wynosić 1 × 10⁷ komórek/ml.

W tym momencie należy zachować do 1 × 10⁶ komórek, aby na koniec eksperymentu móc określić ilość ubytku. Dodatkowo należy rozmrozić wymaganą ilość dopełniacza w temperaturze pokojowej. Ustaliliśmy, że przy stosowaniu dopełniacza króliczego firmy Pereze Biologicals dla 5 × 10⁷ komórek odpowiednie jest rozcieńczenie 1:15; wystarczające jest 1,5 ml zamrożonego preparatu Eloqua.

Teraz należy dodać odpowiednią ilość przeciwciała do zawiesiny komórkowej i wymieszać. W celu wysterylizowania dopełniacza należy użyć filtra końcówki strzykawki o niskim wiązaniu białek. Napełnić strzykawkę od jednego do dwóch mililitrów medium.

Przed dodaniem dopełniacza do 5 × 10⁷ komórek, należy przygotować 340 ml dopełniacza w rozcieńczeniu 1:15. Następnie przefiltrować dopełniacz bezpośrednio do probówki zawierającej komórki i przeciwciała. Teraz należy dostosować końcową objętość w probówce tak, aby stężenie komórek wynosiło 1 × 10⁷ komórek/ml.

Następnie inkubować komórki w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Należy pamiętać o mieszaniu komórek co 15 minut poprzez delikatne odwracanie probówki. Po inkubacji odwirować komórki z prędkością, która nie wpłynie na ich żywotność.

Następnie w komorze z laminarnym przepływem powietrza odrzuć supernatant. W dalszej kolejności przemyj komórki dwukrotnie 10 mililitrami pożywki. Zwróć uwagę, jak zbierają się szczątki komórkowe, z których część przykleja się do ścianek probówek polistyrenowych.

Po ostatnim przemyciu przefiltruj komórki przez sterylni rurkę filtrującą z nylonu o oczkach 70 µm. Na koniec sprawdź czystość komórek, porównując populację komórek zainteresowania przed i po przepływowym usuwaniu.

Cytometria i immunohistochemia są preferowanymi metodami służącymi do określenia czystości komórek przed rozpoczęciem eksperymentów. Przy zastosowaniu przeciwciała monoklonalnego o wysokiej wydajności aktywacji dopełniacza, pierwsza runda usuwania dopełniacza usunie ponad 95% komórek. Przykładowo, wykorzystując cytometrię przepływową do pomiaru procentowego udziału komórek T $\alpha\beta$ w preparacie komórek z pleurocyta myszy, stwierdzono, że po usunięciu dopełniacza za pomocą anty-CD51, który jest ekspresowany przez wszystkie komórki T, ale nie przez inne leukocyty, zawierały one 32,2% komórek T $\alpha\beta$. Populacja TCR $\beta$ została zredukowana o 95% do końcowego stężenia 1,56%.

Przedstawiłem właśnie szybką i skuteczną metodę usuwania specyficznych populacji komórek przy użyciu przeciwciał swoistych dla antygenu w procesie deplecji zależnej od dopełniacza. Przeprowadzając tę procedurę, należy pamiętać o przetestowaniu skuteczności każdego przeciwciała oraz o miareczkowaniu dopełniacza w eksperymencie pilotażowym przed rozpoczęciem właściwych badań. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.