Izolacja komórek z jamy otrzewnej myszy
28 stycznia 2010
Jama otrzewnowa u ssaków zawiera różne populacje komórek odpornościowych, które są kluczowe dla wrodzonych odpowiedzi immunologicznych. Do biochemicznych i funkcjonalnych analiz tych komórek niezbędna jest wydajna metoda izolacji. W niniejszej pracy przedstawiamy kompleksową metodę izolacji komórek jamy otrzewnowej u myszy.
Izolację komórek jamy otrzewnej rozpoczyna się od ułożenia uśpionej myszy na grzbiecie. Nacięto skórę zewnętrzną otrzewnej i delikatnie odchylono ją, aby odsłonić skórę wewnętrzną. Do jamy otrzewnej wstrzyknięto PBS z 3% FBS, a następnie delikatnie masowano otrzewną. Ciecz zawierająca komórki otrzewnej zebrano i umieszczono w probówce o pojemności 15 mililitrów na lodzie.
Komórki przemywa się raz, a następnie zlicza za pomocą cytometru hematologicznego. Cześć, jestem Oji z laboratorium dr. Bona w Instytucie Badań nad Krwią w Blood Center of Wisconsin. Dzisiaj przedstawimy procedurę izolacji komórek z jamy otrzewnej myszy.
Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu pozyskania komórek do różnych analiz fenotypowych, biochemicznych i immunologicznych. Interesują nas przede wszystkim populacje limfocytów B z otrzewnej. Zatem przejdźmy do realizacji.
Przed rozpoczęciem izolacji komórek odpornościowych z jamy otrzewnej należy przygotować wszystkie niezbędne materiały. W pierwszej kolejności należy zgromadzić wiaderko z lodem, strzykawkę o pojemności 5 ml z igłą 27 G, strzykawkę o pojemności 5 ml z igłą 25 G, blok styropianowy oraz piny do unieruchomienia myszy. Przed sekcją należy przygotować również tackę do umieszczenia bloku montażowego, nożyczki, pęsetę oraz probówki do zbierania materiału.
Wstępnie schłodź PBS zawierający 3% płodowej surowicy cielęcej. Przechowuj ten roztwór oraz probówki do pobierania próbek w lodzie przez cały czas trwania eksperymentu. Po podaniu środka znieczulającego i przeprowadzeniu odpowiedniej eutanazji, spryskaj mysz 70% etanolem i ułóż ją na grzbiecie na bloku styropianowym lub podkładce sekcyjnej. Za pomocą pęsety i nożyczek rozetnij skórę zewnętrzną otrzewnej.
Delikatnie odciągnij skórę, aby odsłonić wewnętrzną warstwę wyścielającą jamę otrzewną. Zachowując ostrożność, by nie przebić żadnego z narządów, powoli wprowadź igłę 27 G do otrzewnej. Wstrzyknij 5 mL lodowatego PBS do jamy otrzewnej.
Teraz delikatnie masuj otrzewną, aby pobudzić komórki do odłączenia się od ściany otrzewnej i opadnięcia do roztworu PBS. Następnie załóż na strzykawkę o pojemności 5 ml igłę 25 G ściętym końcem do góry i wprowadź igłę do otrzewnej. Zbierz jak najwięcej płynu, aby zwiększyć uzysk komórek.
Podczas wykonywania tej czynności należy delikatnie poruszać końcówką, aby zapobiec zapchaniu igły przez tkankę tłuszczową lub inne organy. Należy usunąć igłę i przelać zawiesinę komórkową do polipropylenowych probówek zbiorczych. Pozostały płyn z jamy należy zebrać, wykonując nacięcie wewnętrznej warstwy skóry otrzewnej.
Użyj pęsety, aby rozsunąć skórę, a następnie za pomocą plastikowej pipety tylnej pobierz pozostałą ciecz. Na koniec odwiruj zawiesinę komórkową przez osiem minut przy 1500 RPM, odlej nadsącz i ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach PBS. Wykonaj zliczenie komórek za pomocą komory licznikowej krwi.
Zastosowanie metody wykluczania błękitu trypanu pozwoli na oznaczenie liczby komórek. Zazwyczaj z niepoddanej manipulacjom myszy można wyizolować od 5 do 10 milionów komórek z jamy otrzewnej. Od 50 do 60% całkowitej populacji komórek będą stanowiły limfocyty B.
Około 40% będą stanowić makrofagi i granulocyty, a od 5 do 10% limfocyty T. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób izolacji komórek z jamy otrzewnej myszy. Podczas stosowania tej procedury ważne jest ograniczenie ilości krwi w populacji komórek z jamy otrzewnej poprzez ostrożną eutanazję myszy i unikanie przebijania organów znajdujących się w jamie otrzewnej.
Należy pamiętać o utylizacji wszystkich próbek, które zostaną zanieczyszczone krwią. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółową metodę izolacji komórek z jamy otrzewnej myszy, która jest niezbędna do badania odpowiedzi immunologicznych. Procedura została opracowana tak, aby zapewnić integralność populacji komórek do późniejszych analiz.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Biochemia
Wstęp
- Jama otrzewna zawiera różne typy komórek odpornościowych.
- Komórki te odgrywają kluczową rolę w wrodzonych odpowiedziach immunologicznych.
- Metody izolacji są kluczowe dla badań funkcjonalnych i biochemicznych.
- Zrozumienie roli tych komórek może pomóc w badaniach immunologicznych.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej metody izolacji komórek z jamy otrzewnowej.
- Ułatwienie badania populacji komórek odpornościowych u myszy.
- Zwiększenie dokładności późniejszych analiz immunologicznych.
Zastosowane metody
- Eutanazja myszy i przygotowanie do sekcji.
- Wstrzykiwanie PBS z 3% FBS do jamy otrzewnej.
- Zbieranie płynu zawierającego komórki otrzewnej.
- Wirowanie i liczenie wyizolowanych komórek.
Główne wyniki
- Pomyślnie wyizolowano od 5 do 10 milionów komórek z jamy otrzewnej.
- Stwierdzono, że 50-60% komórek to limfocyty B.
- Około 40% stanowią makrofagi i granulocyty.
- Od 5 do 10% komórek to limfocyty T.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w izolowaniu komórek odpornościowych z jamy ciałatnej.
- Staranne uśmiercenie i sekcja są kluczowe, aby uniknąć zanieczyszczenia krwią.
- Procedura ta może być zastosowana w różnych badaniach immunologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja komórek odpornościowych z jamy otrzewnej umożliwia wczesną walidację punktów uchwytu poprzez zapewnienie dostępu do fenotypowo zdefiniowanych subpopulacji limfocytów B oraz makrofagów. Wspiera to ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach odkrywania leków, dostarczając powtarzalnych pierwotnych populacji komórkowych do analiz funkcjonalnych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących kandydatów na leki dzięki standaryzowanemu odzyskiwaniu populacji odpornościowych istotnych dla przesiewowych badań nad lekami immunomodulującymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie podzbiorów komórek B1a i B1b w celu testowania hipotez terapeutycznych w modelach autoimmunizacji i infekcji.
- Wartość naukowa: Dostarcza naiwnych makrofagów tkankowych do wyjaśniania szlaków w badaniach nad wrodzoną odpowiedzią immunologiczną.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez spójną izolację populacji komórek odpornościowych do badań przesiewowych w zakresie angażowania celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do analizy fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej i testów biochemicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki kontrolowanej liczbie uzyskanych komórek (5–10 milionów komórek na mysz).
- Wartość operacyjna: Umożliwia wiarygodną ocenę związków dzięki ilościowemu odzyskiwaniu limfocytów B (50–60%), makrofagów (40%) i limfocytów T (5–10%).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla chorób poprzez izolację autoreaktywnych komórek B1 oraz regulacyjnych podzbiorów produkujących IL-10.
- Wartość operacyjna: Ułatwia dopasowanie translacyjnych biomarkerów poprzez izolację naturalnych komórek B1 wydzielających IgM.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ciągłość badań przedklinicznych poprzez dostarczenie pierwotnych komórek odpornościowych do analiz mechanistycznych w modelach chorób.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając pierwotne komórki immunologiczne do walidacji celu, opracowywania testów oraz przedklinicznych badań mechanistycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez izolację określonych subpopulacji limfocytów B i makrofagów.
- Screening: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki standaryzowanej izolacji komórek i odzyskiwaniu żywych populacji odpornościowych.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie subpopulacji komórek przy użyciu liczenia w hemocytometrze i metod wykluczania martwych komórek.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez izolację komórek B1 związanych z odpornością naturalną i regulacją.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość powtarzalnego pozyskiwania komórek odpornościowych w ramach programów badawczych z zakresu immunologii i onkologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Wiarygodność prognostyczna w walidacji celu dzięki dostępowi do fenotypowo scharakteryzowanych podzbiorów komórek odpornościowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki określonej wydajności komórkowej i rozkładowi podzbiorów.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje typu go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach przesiewowych immunomodulatorów.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko dzięki niezawodnym wkładom pierwotnych komórek dla paneli testów funkcjonalnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w sekcji myszy oraz stosowania technik aseptycznych, aby zapobiec przebiciu organów i kontaminacji krwią.
- Zależność od aparatury, w tym strzykawek, igieł, wirówki i komory countingowej (hemocytometru), niezbędnych do przetwarzania i liczenia komórek.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania PBS/FBS oraz przestrzeganie łańcucha chłodniczego w ramach zespołu w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy zastosowaniu w modelach chorobowych, które zmieniają komórkowość jamy otrzewnej.
- Ograniczenie wynikające z konieczności przeprowadzenia starannej eutanazji i sekcji, aby uniknąć kontaminacji krwią, która narusza integralność próbki.
