Produkcja lentiwirusa

Procedura ta rozpoczyna się od transdukcji komórek 2 9 3 T za pomocą lentiwirusa, plazmidu i wektorów pakujących wirusa; nadsącz wirusowy zbiera się po co najmniej 48-godzinnym okresie inkubacji. Nadsącz jest filtrowany, a następnie zagęszczany za pomocą ultrawirówki. Osad wirusowy resuspenduje się w PBS w celu oznaczenia miana wirusa; najpierw rozcieńza się zagęszczonego wirusa w pożywce kompletnej, a następnie wykonuje rozcieńczenia seryjne, aby zainfekować komórki lentiwirusem.

Witam, jestem Shein Wong z laboratorium Michaela McManusa w Centrum Cukrzycy na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Jestem Michael McManus. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę produkcji lentiwirusów.

Stosujemy tę procedurę w laboratorium do wytwarzania lentiwirusów do interferencji RNA. Zacznijmy więc. Aby rozpocząć ten protokół, należy przygotować DNA, którym będą transfekowane komórki 2 9 3 T.

Najpierw rozcieńcz reagent do transfekcji FU gene six w probówce 1,5 ml, mieszając 30 µL Fuji six z 600 µL medium bezsurowiczego. Należy uważać, aby Fuji nie dotknął ścianek probówki podczas dodawania go do medium; inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie, w zakrętce probówki, wymieszaj 4 µg plazmidu lentiwirusowego z 1,33 µg.

Każdy z wektorów opakowujących wirusa trzeciej generacji. Plazmid lentiwirusowy zawiera DNA. Wirus wbuduje się w genom każdej zainfekowanej komórki, podczas gdy wektory opakowujące zawierają geny wszystkich pozostałych białek niezbędnych do wytworzenia lentiwirusa; zamknąć probówkę i wymieszać, odwracając ją kilka razy.

Inkubować DNA i odczyn do transfekcji przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy przeprowadzić transfekcję komórek 2 9 3 przygotowanym DNA; należy użyć komórek wysianych 24 godziny wcześniej, które osiągnęły 50 do 70% konfluencji. W komorze do hodowli tkankowej nanieść pipetą całą objętość przygotowanego DNA na płytkę z komórkami 2 9 3. Delikatnie wymieszać, przechylając płytkę przód i tył. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora i kontynuować produkcję wirusów przez 48 do 96 godzin przed zbiorem. Podczas inkubacji komórki 2 9 3 produkują lentiwirusy, których genomy zawierają kopię RNA badanego DNA.

Nadszedł czas na zebranie wirusa. Wyjmij komórki z inkubatora. Przygotuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza filtr strzykawkowy o porach 0,4 lub 5 µm, jednorazową strzykawkę o objętości 10 mL oraz probówkę do wirówki UltraClear firmy Beckman.

Za pomocą jednorazowej strzykawki usuń supernatant, który teraz zawiera wirusa. Na końcówkę strzykawki nałóż filtr o porach 0,45 mikrona i przefiltruj zawiesinę wirusową do probówki wirówkowej UltraClear Beckman. Filtr pozwala na przenikanie jedynie wirusów, a nie komórek; po odrzuceniu reszty, inkubuj wszystkie komórki produkujące wirusa.

Szalki hodowlane, strzykawki i filtry w 10% wybielaczu przez 45 minut. Po zebraniu i przefiltrowaniu wirusa należy teraz w pierwszej kolejności skoncentrować go za pomocą ultrawirówki. Użyj DMEM bez surowki, aby zrównoważyć masę wszystkich probówek zawierających wirusa z dokładnością do 0,2 grama.

Następnie należy umieścić zrównoważone probówki wirówkowe w koszach rotora SW 41 TI lub SW 28. Szczelnie zamknąć kosze rotora i zapiąć je na rotorze. Następnie umieścić rotor w ultrawirówce.

Wirować wirusa przez około 90 minut w temperaturze four degrees Celsius przy 25 000 RPM w rotorze SW 41 TI lub przy 24 000 RPM w rotorze SW 28. Po wirowaniu przenieść próbkę z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza i odwrócić probówkę, aby wylać SNAT do pojemnika z 10% bleach. Użyć ręcznika Kim wipe, aby wchłonąć nadmiar cieczy wokół osadu, a następnie umieścić probówkę dnem do góry w odpowiednim statywie na maksymalnie pięć minut, aż do momentu ponownego zawieszenia osadu.

Aby resuspender osad wirusowy, użyj końcówki z filtrem, aby dodać 100 µL sterylnego, przefiltrowanego PBS do probówki. Następnie pipetuj ciecz w górę i w dół około 20 razy. Pozostaw wirusa w temperaturze 4 °C przez noc w celu całkowitej resuspensji.

Preparaty wirusowe można przechowywać w temperaturze 4°C przez około jeden tydzień oraz w temperaturze -80°C do jednego roku. Należy pamiętać, aby wszystkie puste probówki potraktować 10% wybielaczem przed ich wyrzuceniem. Jeśli zamierzasz używać preparatu wirusowego przez okres dłuższy niż tydzień, można go przechowywać w lodówce.

Przygotuj minimalne alikwoty od 5 do 20 µL do przyszłych eksperymentów oraz jedną alikwotę od 3 do 5 µL do miareczkowania; zamroź i przechowuj alikwoty w temperaturze około -80 °C. Kolejnym krokiem jest oznaczenie miana wirusa. Jeśli w plazmidzie lentiwirusowym zastosowano fluorescencyjny gen reporterowy, zainfekowane komórki będą fluorescować, co pozwoli na oznaczenie miana wirusa za pomocą cytometrii przepływowej.

Na początek należy rozcieńczyć 3 µL stężonego wirusa w 1,5 ml pełnej pożywki w dołkach od jeden do sześć, w jednym rzędzie płytki 96-dołkowej. W wszystkich sześciu dołkach należy wykonać następujące rozcieńczenia seryjne, używając 100 µL pełnego DM. Do pierwszego dołka należy dodać 100 µL pożywki bez wirusa.

Jest to kontrola niebarwiona. Do drugiej studzienki dodajemy 100 µL rozcieńczonego wirusa, a do trzeciej 100 µL mieszaniny z drugiej studzienki. Następnie do czwartej studzienki dodajemy 100 µL mieszaniny z trzeciej studzienki.

Do piątego dołka dodajemy 100 µL z trzeciego dołka. Do szóstego dołka dodajemy 100 µL z czwartego dołka. Dodajemy 100 µL z piątego dołka.

Na koniec należy pobrać 100 µL z szóstego dołka i je usunąć, a następnie poddać działaniu wybielacza. Doprowadź całkowitą objętość we wszystkich dołkach do 200 µL za pomocą DMEM. Przy każdym rozcieńczeniu stężenie wirusa zmniejsza się o połowę. Należy pamiętać, że są to jedynie sugerowane rozcieńczenia, które powinny dobrze sprawdzić się przy miareczkowaniu większości stężeń wirusów.

Jeśli miano wirusa jest niskie lub wirus nie został skoncentrowany, może być konieczne dostosowanie rozcieńczeń. Wszelkie niewykorzystane rozcieńczenia wirusa należy traktować 10% podchlorynem sodu przez 45 minut przed wyrzuceniem do pojemnika na odpady biologiczne. Do każdego z sześciu dołków należy dodać około 15 000 zdrowych, aktywnie dzielących się komórek 2 9 3 T.

Do miareczkowania 16 preparatów wirusowych można wykorzystać jedną płytkę 96-dołkową; należy uzupełnić objętość w dołkach do 200 µL, przenieść komórki z powrotem do inkubatora i pozwolić na przebieg infekcji przez co najmniej 48 godzin. Po inkubacji należy przeanalizować fluorescencję komórek za pomocą cytometru przepływowego. Na podstawie procentowej zawartości komórek fluorescencyjnych w każdym dołku można określić miano lub liczbę zakaźnych cząsteczek wirusa na mililitr dodanego wirusa.

Przy interpretacji wyników cytometrii przepływowej należy obliczyć liczbę jednostek zakaźnych na mililitr, korzystając z następującego wzoru. Należy pamiętać, że dokładne obliczenia miana są możliwe tylko wtedy, gdy zainfekowane komórki otrzymały nie więcej niż jedną integrację wirusową na komórkę.

Aby zapewnić zachowanie tego warunku, do obliczeń należy wykorzystać komórki z poziomem infekcji poniżej 15%. Komórki z wyższym stopniem infekcji prawdopodobnie przyjęły wiele integr viralnych na jedną komórkę. Rozcieńczenie sugerowane w kroku drugim powinno pozwolić na uzyskanie kilku próbek w tym zakresie infekcji.

W idealnym przypadku należy wykorzystać kilka próbek do wygenerowania wykresu miareczkowania, na podstawie którego można obliczyć ostateczny miano. Formuła obliczona z dopasowanej linii liniowej może służyć do wyznaczenia miana wirusa, jednak w razie potrzeby miano można obliczyć, korzystając z pojedynczej próbki. Można oczekiwać miana rzędu 1 × 10⁷ jednostek transdukcyjnych na mililitr dla wirusa niekoncentrowanego oraz 1 × 10⁸ jednostek transdukcyjnych na mililitr dla wirusa skoncentrowanego.

Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak wytwarzać lentiwirusy podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest przestrzeganie wszystkich zasad bezpieczeństwa biologicznego oraz prawidłowa utylizacja odpadów. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.