Name: Produkcja lentiwirusów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj metodę produkcji lentiwirusów w komórkach 293T z wykorzystaniem transfekcji i ultrawirówki. Procedura obejmuje zbieranie supernatantu, koncentrację wirusa oraz oznaczanie miana metodą fluorescencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podstawowe Centrum Badań nad Astmą im. Sandlera (SABRE) 
Fundacja Sandlera

Część 1: Transfekcja komórek HEK 293 w celu produkcji lentiwirusów
*Na 24 godziny przed transfekcją wysiać 2,5 X 106 komórek do szalki 10 cm, aby następnego dnia uzyskać konfluencję na poziomie 50-70%.
<ol>
 <li>Protokół należy rozpocząć od przygotowania DNA, którym później przeprowadzi się transfekcję komórek w celu wytworzenia wirusa. Najpierw należy rozcieńczyć odczynnik do transfekcji FuGENE 6 Roche, który jest odczynnikiem lipidowym umożliwiającym pobieranie DNA przez komórki. Do probówki o pojemności 1,5 ml należy nalać pipetą 30μl FuGENE 6 do 600ul medium bezsurowiczego (SFDMEM). Należy uważać, aby FuGENE nie dotknął ścianek probówki podczas dozowania do medium. Mieszaninę FuGENE i SFDMEM należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
 <li>W zakrętce probówki należy wymieszać 4 μg plazmidu lentiwirusowego z 4 μg każdego z wektorów pakujących wirusa 3rd generacji (pMDL, pRSV i pVSV-G). Plazmid lentiwirusowy zawiera DNA, które wirus wbuduje w genom każdej zainfekowanej komórki, natomiast wektory pakujące zawierają geny wszystkich pozostałych białek niezbędnych do wytworzenia lentiwirusa.</li>
 <li>Należy zamknąć probówkę i wymieszać zawartość, kilkakrotnie odwracając probówkę.</li>
 <li>Inkubować przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Całą zawartość probówki należy przenieść pipetą na płytkę z komórkami 293. Wymieszać delikatnie, przechylając płytkę w przód i w tył.</li>
 <li>Komórki należy zwrócić do inkubatora i pozostawić do produkcji wirusów na 48-96 godzin przed zbiorem.</li>
 <li>Podczas inkubacji komórki 293 dokonują transkrypcji interesującego DNA z plazmidu lentiwirusowego, tworząc kopię RNA konstruktu lentiwirusowego. Transkrybują i tłumaczą one również geny z wektorów pakujących na białka wirusowe. Białka te służą do tworzenia wirusów zawierających wersję RNA konstruktu lentiwirusowego, którą wirus następnie odtworzy w procesie odwrotnej transkrypcji i wbuduje w genomy wszystkich zainfekowanych komórek.</li>
</ol>
Część 2: Pozyskiwanie lentiwirusów
<ol>
 <li>Po okresie inkubacji wyjmij komórki z inkubatora i za pomocą jednorazowej strzykawki 10ml usuń nadsącz zawierający wirusa. Objętość nadsączu wyniesie około 10ml.</li>
 <li>Załóż na końcówkę strzykawki filtr strzykawkowy 0.45μM i przefiltruj wirusa do probówki do ultrawirówki Beckman. Filtr pozwala na przejście wyłącznie wirusów, zatrzymując komórki.</li>
 <li>Przed utylizacją wszystkie komórki produkujące wirusa, płytki hodowlane, strzykawki oraz filtry inkubuj w 10% roztworze wybielacza przez 45 minut.</li>
</ol>
Część 3: Zagęszczanie lentiwirusów za pomocą ultrawirowania
<ol>
 <li>Umieścić probówki wirówki w koszyczkach rotora SW-41Ti lub SW-28.</li>
 <li>Użyć bezsurowiczego DMEM do zrównoważenia wszystkich probówek zawierających wirusa z dokładnością do 0.2g.</li>
 <li>Szczelnie zamknąć koszyczki rotora i zamocować je w rotorze przed umieszczeniem rotora w ultrawirówce.</li>
 <li>Wirować wirusa przez 90 minut w ultrawirówce w temperaturze 4°C przy 25 000 rpm w rotorze SW-41Ti lub 24 000 rpm w rotorze SW-28.</li>
 <li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza odwrócić probówki do góry dnem, aby przelać nadsącz do pojemnika z 10% roztworem wybielacza.</li>
 <li>Użyć chusteczki Kimwipe do odsączenia nadmiaru cieczy wokół osadu, a następnie odwrócić probówkę i pozostawić w odpowiednim statywie nie dłużej niż przez pięć minut.</li>
 <li>Aby resuspender osad wirusowy, użyć końcówki z filtrem, aby dodać do probówki 100 μL sterylnego PBS, a następnie pipetować ciecz w górę i w dół około 20 razy.</li>
 <li>Pozostawić wirusa w temperaturze 4°C przez noc w celu całkowitej resuspensji. Preparaty wirusowe można przechowywać w temperaturze 4°C przez około 1 tydzień i w -80°C do jednego roku. Należy pamiętać o potraktowaniu wszystkich pustych probówek 10% wybielaczem przed ich wyrzuceniem.</li>
 <li>Jeśli preparat wirusowy ma być używany dłużej niż przez 1 tydzień, należy przygotować minimalne aliquoty po 5-20 μL do przyszłych eksperymentów oraz 1 aliquot o objętości od 3 do 5 μL do miareczkowania. Alikuoty należy zamrozić i przechowywać w temperaturze -80°C.</li>
</ol>
Część 4: Miareczkowanie lentiwirusów z użyciem cytometrii przepływowej
<ol>
 <li>Kolejnym krokiem jest oznaczenie miana wirusa za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta znajduje zastosowanie wyłącznie w przypadkach, gdy plazmid lentiwirusowy zawiera gen reporterowy fluorescencyjny. Zasada polega na tym, że podczas infekcji komórki wirus wprowadza DNA plazmidu lentiwirusowego do genomu tej komórki. Zainfekowana komórka będzie następnie transkrybować i transladować geny zawarte w plazmidzie lentiwirusowym; jeśli do plazmidu włączono gen reporterowy fluorescencyjny, zainfekowane komórki będą wykazywać fluorescencję. Poziom fluorescencji reprezentuje aktywność, czyli miano wirusa.</li>
 <li>Dla każdego stoku wirusa poddawanego mianowaniu, należy rozcieńczyć 3 μl stężonego wirusa w 1,5 ml pożywki kompletnej (DMEM, pen-strep, glutamina, FBS).</li>
 <li>W dołkach 1-6 w jednym rzędzie płytki 96-dołkowej należy wykonać następujące rozcieńczenia szeregowe: do wszystkich 6 dołków dodać 100 μl kompletnej pożywki DMEM. Do pierwszego dołka dodać 100 μl pożywki bez wirusa (jest to kontrola niebarwiona), do drugiego dołka dodać 100 μl rozcieńczonego wirusa (co odpowiada 1 ml nierozcieńczonego wirusa), do trzeciego dołka dodać 100 μl mieszaniny z drugiego dołka, do czwartego dołka dodać 100 μl z trzeciego dołka, do piątego dołka dodać 100 μl z czwartego dołka, a do szóstego dołka dodać 100 μl z piątego dołka. Na koniec należy odjąć 100 μl z szóstego dołka i zutylizować w roztworze wybielacza. Wykonano rozcieńczenie szeregowe, w którym każdy kolejny dołek zawiera połowę objętości wirusa w porównaniu do poprzedniego.</li>
 <li>Uzupełnić całkowitą objętość we wszystkich dołkach do 200 μl. Należy pamiętać, że są to jedynie sugerowane rozcieńczenia, które powinny być odpowiednie dla mianowania większości stężonych wirusów. W przypadku wirusów o niskim mianie lub nierozcieńczonych może być konieczne dostosowanie rozcieńczeń.</li>
 <li>Każdy niewykorzystany rozcieńczony wirus należy potraktować 10% roztworem wybielacza przez 45 minut przed wyrzuceniem do pojemnika na odpady biologiczne.</li>
 <li>Do każdego z 6 dołków dodać ok. 15 000 zdrowych, aktywnie dzielących się komórek 293. Jedna płytka 96-dołkowa może posłużyć do mianowania 16 preparatów wirusowych.</li>
 <li>Przenieść komórki do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i pozwolić na przebieg infekcji przez co najmniej 48 godzin.</li>
 <li>Po inkubacji komórki analizuje się pod kątem ekspresji reportera (w naszym przypadku fluorescencji) za pomocą cytometru przepływowego. Cząstki wirusowe są ilościowo określane na podstawie procenta komórek fluorescencyjnych w każdym dołku.</li>
</ol>
Oblicz liczbę jednostek zakaźnych na ml, korzystając z następującego wzoru:
<img src="/files/ftp_upload/1499/1499eq1.jpg" alt="Wzór na kwantyfikację komórek, analiza reportera infekcji, obliczanie objętości wektora, obliczenia naukowe." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 1">
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
Po 48-godzinnym okresie inkubacji po transfekcji, płytka z komórkami 293 powinna wykazywać około 90% fluorescencji. Wysoki odsetek fluorescencyjnych komórek wskazuje na wysoką liczbę komórek produkujących wirusa.
Po wirowaniu osad wirusowy jest ledwo widoczny podczas resuspensji. Jest to zjawisko normalne, ponieważ osad jest przezroczysty i bardzo mały.
Podczas interpretacji wyników cytometrii przepływowej należy pamiętać, że dokładne obliczenia miana są możliwe tylko wtedy, gdy zainfekowane (fluorescencyjne) komórki otrzymały nie więcej niż jedną integrację wirusową na komórkę. Aby zapewnić spełnienie tego warunku, do obliczeń należy używać komórek z poziomem infekcji &lt; 15 %. Komórki z wyższym poziomem infekcji prawdopodobnie otrzymały wiele integrantów wirusowych na komórkę. Rozcieńczenia zasugerowane w kroku 2 powinny przynieść kilka próbek mieszczących się w tym zakresie infekcji. Idealnie byłoby wykorzystać kilka próbek do wygenerowania wykresu mianowania (linia liniowa), z którego można obliczyć miano końcowe, jednak w razie potrzeby miano można obliczyć na podstawie pojedynczej próbki. Przewidywane miano wynosi 1.0 x 107 TU/ml dla wirusa niekoncentrowanego oraz 1.0 x 108 TU/ml dla wirusa skoncentrowanego.

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM, komórki HEK 293T, penicylina-streptomycyna, glutamina, PBS, FBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji FuGENE 6, pSico mCherry, pMDL, pRSV, pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-cm szalki do hodowli komórek, 96-dołkowe płytki do hodowli komórek</td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtrowane końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf 1.5ml, strzykawka, filtr strzykawkowy (0.45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówki</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych z 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor Beckman SW41T.I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Beckman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizator FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja lentiwirusa

Lentivirus Production

Interferencja RNA (RNAi) jest systemem wyciszania genów w żywych komórkach. W procesie RNAi geny o sekwencji homologicznej do krótkich interferujących RNA (siRNA) są wyciszane na etapie posttranskrypcyjnym. Krótkie RNA spinki (shRNA), będące prekursorami siRNA, mogą być ekspresowane z wykorzystaniem lentiwirusów, co umożliwia przeprowadzenie RNAi w różnych typach komórek. Lentiwirusy, takie jak ludzki wirus niedoboru odporności, są zdolne do infekowania zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się. Opiszemy procedurę pakowania lentiwirusów. Pakowanie odnosi się do przygotowania kompetentnego wirusa z wektorów DNA. Systemy produkcji wektorów lentiwirusowych opierają się na systemie „rozdzielonym”, w którym naturalny genom wirusa został podzielony na poszczególne konstrukty plazmidów pomocniczych. Rozdzielenie różnych elementów wirusowych na cztery oddzielne wektory zmniejsza ryzyko powstania wirusa zdolnego do replikacji w wyniku przypadkowej rekombinacji genomu lentiwirusowego. W tej metodzie wektor zawierający interesujące shRNA oraz trzy wektory pakujące (p-VSVG, pRSV, pMDL) są przejściowo transfekowane do ludzkich komórek 293. Po okresie inkubacji trwającym co najmniej 48 godzin supernatant zawierający wirusa jest zbierany i zagęszczany. Na koniec miano wirusa jest określane na podstawie ekspresji reporterowej (fluorescencyjnej) przy użyciu cytometru przepływowego.

W celu wytworzenia lentiwirusów wektory DNA są transfekowane do ludzkich komórek 293. Po zbiorze i skoncentrowaniu naddatku miano wirusa jest określane na podstawie ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego.

Produkcja lentiwirusa

Interferencja RNA (RNAi) to system wyciszania genów w żywych komórkach. W procesie RNAi geny homologiczne pod względem sekwencji do krótkich interferujących RNA (siRNA) są ...

Procedura ta rozpoczyna się od transdukcji komórek 2 9 3 T za pomocą lentiwirusa, plazmidu i wektorów pakujących wirusa; nadsącz wirusowy zbiera się po co najmniej 48-godzinnym okresie inkubacji. Nadsącz jest filtrowany, a następnie zagęszczany za pomocą ultrawirówki. Osad wirusowy resuspenduje się w PBS w celu oznaczenia miana wirusa; najpierw rozcieńza się zagęszczonego wirusa w pożywce kompletnej, a następnie wykonuje rozcieńczenia seryjne, aby zainfekować komórki lentiwirusem.Witam, jestem Shein Wong z laboratorium Michaela McManusa w Centrum Cukrzycy na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Jestem Michael McManus. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę produkcji lentiwirusów.Stosujemy tę procedurę w laboratorium do wytwarzania lentiwirusów do interferencji RNA. Zacznijmy więc. Aby rozpocząć ten protokół, należy przygotować DNA, którym będą transfekowane komórki 2 9 3 T.Najpierw rozcieńcz reagent do transfekcji FU gene six w probówce 1,5 ml, mieszając 30 µL Fuji six z 600 µL medium bezsurowiczego. Należy uważać, aby Fuji nie dotknął ścianek probówki podczas dodawania go do medium; inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie, w zakrętce probówki, wymieszaj 4 µg plazmidu lentiwirusowego z 1,33 µg.Każdy z wektorów opakowujących wirusa trzeciej generacji. Plazmid lentiwirusowy zawiera DNA. Wirus wbuduje się w genom każdej zainfekowanej komórki, podczas gdy wektory opakowujące zawierają geny wszystkich pozostałych białek niezbędnych do wytworzenia lentiwirusa; zamknąć probówkę i wymieszać, odwracając ją kilka razy.Inkubować DNA i odczyn do transfekcji przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy przeprowadzić transfekcję komórek 2 9 3 przygotowanym DNA; należy użyć komórek wysianych 24 godziny wcześniej, które osiągnęły 50 do 70% konfluencji. W komorze do hodowli tkankowej nanieść pipetą całą objętość przygotowanego DNA na płytkę z komórkami 2 9 3. Delikatnie wymieszać, przechylając płytkę przód i tył. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora i kontynuować produkcję wirusów przez 48 do 96 godzin przed zbiorem. Podczas inkubacji komórki 2 9 3 produkują lentiwirusy, których genomy zawierają kopię RNA badanego DNA.Nadszedł czas na zebranie wirusa. Wyjmij komórki z inkubatora. Przygotuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza filtr strzykawkowy o porach 0,4 lub 5 µm, jednorazową strzykawkę o objętości 10 mL oraz probówkę do wirówki UltraClear firmy Beckman.Za pomocą jednorazowej strzykawki usuń supernatant, który teraz zawiera wirusa. Na końcówkę strzykawki nałóż filtr o porach 0,45 mikrona i przefiltruj zawiesinę wirusową do probówki wirówkowej UltraClear Beckman. Filtr pozwala na przenikanie jedynie wirusów, a nie komórek; po odrzuceniu reszty, inkubuj wszystkie komórki produkujące wirusa.Szalki hodowlane, strzykawki i filtry w 10% wybielaczu przez 45 minut. Po zebraniu i przefiltrowaniu wirusa należy teraz w pierwszej kolejności skoncentrować go za pomocą ultrawirówki. Użyj DMEM bez surowki, aby zrównoważyć masę wszystkich probówek zawierających wirusa z dokładnością do 0,2 grama.Następnie należy umieścić zrównoważone probówki wirówkowe w koszach rotora SW 41 TI lub SW 28. Szczelnie zamknąć kosze rotora i zapiąć je na rotorze. Następnie umieścić rotor w ultrawirówce.Wirować wirusa przez około 90 minut w temperaturze four degrees Celsius przy 25 000 RPM w rotorze SW 41 TI lub przy 24 000 RPM w rotorze SW 28. Po wirowaniu przenieść próbkę z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza i odwrócić probówkę, aby wylać SNAT do pojemnika z 10% bleach. Użyć ręcznika Kim wipe, aby wchłonąć nadmiar cieczy wokół osadu, a następnie umieścić probówkę dnem do góry w odpowiednim statywie na maksymalnie pięć minut, aż do momentu ponownego zawieszenia osadu.Aby resuspender osad wirusowy, użyj końcówki z filtrem, aby dodać 100 µL sterylnego, przefiltrowanego PBS do probówki. Następnie pipetuj ciecz w górę i w dół około 20 razy. Pozostaw wirusa w temperaturze 4 °C przez noc w celu całkowitej resuspensji.Preparaty wirusowe można przechowywać w temperaturze 4°C przez około jeden tydzień oraz w temperaturze -80°C do jednego roku. Należy pamiętać, aby wszystkie puste probówki potraktować 10% wybielaczem przed ich wyrzuceniem. Jeśli zamierzasz używać preparatu wirusowego przez okres dłuższy niż tydzień, można go przechowywać w lodówce.Przygotuj minimalne alikwoty od 5 do 20 µL do przyszłych eksperymentów oraz jedną alikwotę od 3 do 5 µL do miareczkowania; zamroź i przechowuj alikwoty w temperaturze około -80 °C. Kolejnym krokiem jest oznaczenie miana wirusa. Jeśli w plazmidzie lentiwirusowym zastosowano fluorescencyjny gen reporterowy, zainfekowane komórki będą fluorescować, co pozwoli na oznaczenie miana wirusa za pomocą cytometrii przepływowej.Na początek należy rozcieńczyć 3 µL stężonego wirusa w 1,5 ml pełnej pożywki w dołkach od jeden do sześć, w jednym rzędzie płytki 96-dołkowej. W wszystkich sześciu dołkach należy wykonać następujące rozcieńczenia seryjne, używając 100 µL pełnego DM. Do pierwszego dołka należy dodać 100 µL pożywki bez wirusa.Jest to kontrola niebarwiona. Do drugiej studzienki dodajemy 100 µL rozcieńczonego wirusa, a do trzeciej 100 µL mieszaniny z drugiej studzienki. Następnie do czwartej studzienki dodajemy 100 µL mieszaniny z trzeciej studzienki.Do piątego dołka dodajemy 100 µL z trzeciego dołka. Do szóstego dołka dodajemy 100 µL z czwartego dołka. Dodajemy 100 µL z piątego dołka.Na koniec należy pobrać 100 µL z szóstego dołka i je usunąć, a następnie poddać działaniu wybielacza. Doprowadź całkowitą objętość we wszystkich dołkach do 200 µL za pomocą DMEM. Przy każdym rozcieńczeniu stężenie wirusa zmniejsza się o połowę. Należy pamiętać, że są to jedynie sugerowane rozcieńczenia, które powinny dobrze sprawdzić się przy miareczkowaniu większości stężeń wirusów.Jeśli miano wirusa jest niskie lub wirus nie został skoncentrowany, może być konieczne dostosowanie rozcieńczeń. Wszelkie niewykorzystane rozcieńczenia wirusa należy traktować 10% podchlorynem sodu przez 45 minut przed wyrzuceniem do pojemnika na odpady biologiczne. Do każdego z sześciu dołków należy dodać około 15 000 zdrowych, aktywnie dzielących się komórek 2 9 3 T.Do miareczkowania 16 preparatów wirusowych można wykorzystać jedną płytkę 96-dołkową; należy uzupełnić objętość w dołkach do 200 µL, przenieść komórki z powrotem do inkubatora i pozwolić na przebieg infekcji przez co najmniej 48 godzin. Po inkubacji należy przeanalizować fluorescencję komórek za pomocą cytometru przepływowego. Na podstawie procentowej zawartości komórek fluorescencyjnych w każdym dołku można określić miano lub liczbę zakaźnych cząsteczek wirusa na mililitr dodanego wirusa.Przy interpretacji wyników cytometrii przepływowej należy obliczyć liczbę jednostek zakaźnych na mililitr, korzystając z następującego wzoru. Należy pamiętać, że dokładne obliczenia miana są możliwe tylko wtedy, gdy zainfekowane komórki otrzymały nie więcej niż jedną integrację wirusową na komórkę.Aby zapewnić zachowanie tego warunku, do obliczeń należy wykorzystać komórki z poziomem infekcji poniżej 15%. Komórki z wyższym stopniem infekcji prawdopodobnie przyjęły wiele integr viralnych na jedną komórkę. Rozcieńczenie sugerowane w kroku drugim powinno pozwolić na uzyskanie kilku próbek w tym zakresie infekcji.W idealnym przypadku należy wykorzystać kilka próbek do wygenerowania wykresu miareczkowania, na podstawie którego można obliczyć ostateczny miano. Formuła obliczona z dopasowanej linii liniowej może służyć do wyznaczenia miana wirusa, jednak w razie potrzeby miano można obliczyć, korzystając z pojedynczej próbki. Można oczekiwać miana rzędu 1 × 10⁷ jednostek transdukcyjnych na mililitr dla wirusa niekoncentrowanego oraz 1 × 10⁸ jednostek transdukcyjnych na mililitr dla wirusa skoncentrowanego.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak wytwarzać lentiwirusy podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest przestrzeganie wszystkich zasad bezpieczeństwa biologicznego oraz prawidłowa utylizacja odpadów. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Produkcja lentiwirusu

Lentiwirusowe wektory ekspresyjne są najskuteczniejszymi nośnikami do stabilnej ekspresji różnych cząsteczek efektorowych lub konstruktów reporterowych w dzielących się i niedzielących się komórkach ssaków oraz w całych organizmach. Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący pakowania lentiwirusowych konstruktów ekspresyjnych w pseudowirusowe cząstki oraz transdukcji komórek docelowych przy użyciu tych cząstek.

Pakowanie konstruktów ekspresyjnych lentiwektorów opartych na HIV lub FIV oraz transdukcja pseudotypowanych cząsteczek wirusowych VSV-G

W niniejszym protokole opisujemy produkcję, oczyszczanie i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych. Przedstawiamy przykład dostarczania genów za pomocą wektora lentiwirusowego do pierwotnych hodowli neuronów i astrocytów. Nasze metody mogą mieć zastosowanie również do innych typów komórek in vitro oraz in vivo.

Produkcja wektorów lentiwirusem do transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego

Tutaj używamy transdukcji retrowirusowej i transfekcji konkategomerycznej, aby stworzyć linię komórkową, która może wyrażać składniki wektora lentiwirusowego (LV) przy braku tetracykliny. Ten LV koduje GFP i jest pseudotypowany glikoproteiną SVGmu, która jest specyficzna dla receptora na komórkach dendrytycznych.

Linia komórkowa regulowana tetracykliną wytwarza wektory lentiwirusowe o wysokim mianie, które są specyficznie ukierunkowane na komórki dendrytyczne

Tutaj prezentujemy protokoły, które oferują elastyczną i strategiczną podstawę do wirusowego manipulowania komórkami prekursorowymi oligodendrocytów w celu nadekspresji interesujących białek w celu specyficznego zbadania ich roli w oligodendrocytach za pomocą modelu mielinizacji ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Opisujemy strategię produkcji wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy (IDLV) jako nośników dostarczania CRISPR/Cas9 do komórek. Dzięki zdolności do pośredniczenia w szybkiej i niezawodnej edycji genów w komórkach, IDLV stanowią bezpieczniejszą i równie skuteczną platformę wektorową do dostarczania genów w porównaniu z wektorami kompetentnymi do integrazy.

Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Pokazujemy krok po kroku protokół badania funkcji genów w makrofagach rezydujących w tkance otrzewnej in vivo, przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

Atakie rdzeniowo-móżdżkowe poliglutaminowe są spowodowane ekspansjami CAG prowadzącymi do tworzenia białek predysponowanych do agregacji. Ten protokół opisuje produkcję wektorów, stereotaksyczne wprowadzenie oraz analizę inkluzji i utraty markerów neuronowych, zapewniając kontrolowaną platformę do badania mechanizmów i oceny ukierunkowanych terapii chorób neurodegeneracyjnych.

Choroba zwojów wzrokowych wywołana wirusem lentywirusowym jako prekliniczny model poliglutaminowyej rdzeniowo-móżdżkowej ataksji

Tu opisujemy metodę wizualizowania opartych na komórkach, lokalizacji subkomórkowej i analizy ilościowej ognisk wzbogaconych poli(ADP-rybozą) (PAR) w fiksowanych komórkach ssaków. Ten test umożliwia ilościową ocenę miejsc aktywacji PARP indukowanej uszkodzeniem DNA, w tym związaną z naprawą po wycinaniu zasad lub naprawą pojedynczych rozerwaniach łańcucha, w jądrach komórek narażonych na genotoksyczne substancje.

Wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej genotoksinami w komórkach z wykorzystaniem reportera opartego na białku fuzyjnym fluorescencyjnym

Poznaj metodę produkcji lentiwirusów w komórkach 293T z wykorzystaniem transfekcji i ultrawirówki. Procedura obejmuje zbieranie supernatantu, koncentrację wirusa oraz oznaczanie miana metodą fluorescencji.

Produkcja lentiwirusa

Przeglądaj więcej filmów