Produkcja lentiwirusów
2 października 2009
Aby wytworzyć lentiwirusy, wektory DNA są transfekowane do ludzkich 293 komórek. Po zbiorach i zagęszczeniu supernatantu, miano wirusa określa się przez ekspresję fluorescencji za pomocą cytometru przepływowego.
Procedura ta rozpoczyna się od transeksacji 2 9 3 limfocytów T z lentiwirusem, plazmidem i wektorami pakowania wirusa, supernatant wirusa jest pobierany po co najmniej 48-godzinnym okresie inkubacji. Snat jest filtrowany w celu zagęszczenia za pomocą ultrawirówki po ultrawirowaniu. Osad wirusa jest ponownie zawieszany za pomocą PBS w celu uzyskania miana wirusa, najpierw rozcieńcza skoncentrowany wirus w kompletnej pożywce, a następnie przeprowadza seryjne rozcieńczanie w celu zakażenia komórek lentiwirusem.
Cześć, nazywam się Shein Wong i pracuję w laboratorium Michaela McManusa w Centrum Diabetologicznym na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Nazywam się Michael McManus. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę produkcji lentiwirusów.
Stosujemy tę procedurę w laboratorium do wytwarzania lentiwirusów do interferencji RNA. Więc zacznijmy. Aby rozpocząć ten protokół, przygotuj DNA, za pomocą którego chcesz transfekować 2 9 3 limfocyty T.
Najpierw rozcieńczony odczynnik do transfekcji genu szóstego FU w probówce o pojemności 1,5 mililitra, mieszając 30 mikrolitrów Fuji six z 600 mikrolitrami wolnego podłoża surowicy. Uważaj, aby Fuji nie dotknęła boku probówki podczas dostarczania jej do podłoża o temperaturze pokojowej inkubacji przez pięć minut. Następnie w nasadce probówki wymieszaj cztery mikrogramy plazmidu lentiwirusowego z 1,33 mikrograma.
Wektory opakowań wirusowych co trzeciej generacji. Plazmid lentiwirusowy zawiera DNA. Wirus wszczepi się do genomu każdej zakażonej komórki, podczas gdy wektory opakowania zawierają geny wszystkich innych białek wymaganych do tego, aby wirus soczewicy zamknął pokrywę i wymieszał się poprzez kilkukrotne odwrócenie probówki.
Inkubować DNA i odczynnik do transfekcji przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej. Teraz nadszedł czas, aby transfekować 2 9 3 komórki z przygotowanym DNA, użyj komórek, które posiałeś 24 godziny wcześniej i które osiągnęły 50 do 70% biegłości w kapturze do hodowli tkankowej, odpipetuj całe przygotowane DNA na płytkę 2 9 3 delikatnie wymieszać, przechylając płytkę do przodu i do tyłu, Umieść komórki z powrotem w inkubatorze i pozwól produkcji wirusa kontynuować przez 48 do 96 godzin przed pobraniem. Podczas inkubacji komórki 2 9 3 wytwarzają lentiwirusy, których genomy zawierają kopię RNA interesującego Cię DNA.
Teraz nadszedł czas, aby zebrać wirusa. Wyjmij komórki z inkubatora. Przygotuj w kapturze do hodowli tkankowej, filtr strzykawkowy 0,4 lub 5 mikronów, jednorazową strzykawkę o pojemności 10 mililitrów i probówkę wirówkową Beckman UltraClear.
Użyj jednorazowej strzykawki, aby usunąć supernatant, który teraz zawiera wirusa. Podłącz filtr strzykawkowy o średnicy 0,45 mikrona do końcówki i przefiltruj wirusa do probówki wirówkowej UltraClear Beckman. Filtr przepuszcza tylko wirusy, a nie komórki, przed odrzuceniem, inkubuje wszystkie komórki produkujące wirusa.
Płytki hodowlane, strzykawki i filtry w 10% wybielaczu przez 45 minut. Teraz, gdy zebrałeś i przefiltrowałeś wirusa, nadszedł czas, aby najpierw zagęścić wirusa przez ultrawirowanie. Użyj DMEM bez surowicy, aby zrównoważyć wszystkie probówki zawierające wirusa z dokładnością do 0,2 grama od siebie.
Następnie załaduj wyważone probówki wirówkowe do wiader wirnika SW 41 TI lub SW 28. Uszczelnij wiadra wirnika i zaczep je na wirniku. Następnie umieść wirnik w ultrawirówce.
Wiruj wirusem przez około 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 25 000 obr./min w wirniku SW 41 TI lub 24 000 obr./min w wirniku SW 28. Po odwirowaniu wróć do okapu do hodowli tkankowej i odwróć probówkę, aby wlać SNAT do pojemnika zawierającego 10% wybielacza. Użyj chusteczki Kim, aby wchłonąć nadmiar płynu wokół granulki i odwróć rurkę w wygodnym stojaku na nie dłużej niż pięć minut, aż będziesz gotowy do ponownego wymieszania granulki.
Aby ponownie zawiesić osad wirusa, użyj końcówki filtra, aby dodać 100 mikrolitrów sterylnego, wstępnie przefiltrowanego PBS do probówki. Następnie pipetuj w górę i w dół około 20 razy. Pozostaw wirusa w temperaturze czterech stopni na noc do całkowitego zawieszenia.
Preparaty wirusowe można przechowywać w temperaturze czterech stopni przez około tydzień, a w temperaturze minus 80 stopni przez okres do jednego roku. Pamiętaj, aby przed wyrzuceniem potraktować wszystkie puste tubki 10% wybielaczem. Jeśli zamierzasz używać preparatu wirusowego dłużej niż tydzień, będzie on przechowywany w lodówce.
Wykonać minimalne porcje od pięciu do 20 mikrolitrów do przyszłych eksperymentów i jedną podwielokrotność od trzech do pięciu mikrolitrów do miareczkowania, zamrozić i przechowywać podwielokrotności w temperaturze około minus 80. Następnym krokiem jest określenie miana wirusa. Jeśli w plazmidzie lentiwirusowym został włączony fluorescencyjny gen reporterowy, zakażone komórki będą fluoryzować i można określić miano wirusa za pomocą cytometrii przepływowej.
Na początek rozcieńczyć trzy mikrolitry skoncentrowanego wirusa w 1,5 mililitra kompletnej pożywki w studzienkach, od jednego do sześciu. W jednym rzędzie płytki 96-dołkowej. Wykonaj następujące seryjne rozcieńczenia wszystkich sześciu studzienek w 100 mikrolitrach pełnej DM.To pierwszym dołku dodaj 100 mikrolitrów pożywki bez wirusa.
To jest twoja nieskalana kontrola. Do drugiego dobrze dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa do trzeciego. Dobrze dodaj 100 mikrolitrów mieszanki z drugiej studzienki do czwartej.
Dobrze dodaj 100 mikrolitrów z trzeciego dołka do piątego. Dobrze dodaj 100 mikrolitrów z czwartej studzienki i do szóstej. Cóż, dodaj 100 mikrolitrów od piątego.
Cóż, w końcu wyjmij 100 mikrolitrów z szóstej studzienki i wyrzuć, a wybielacz doprowadź całkowitą objętość we wszystkich studzienkach do 200 mikrolitrów za pomocą DMEM. Z każdym rozcieńczeniem stężenie wirusa zmniejsza się o połowę. Należy pamiętać, że są to tylko sugerowane rozcieńczenia, które powinny dobrze działać w przypadku mianowania najbardziej skoncentrowanych wirusów.
Jeśli wirus ma niskie miano lub jest nieskoncentrowany, może być konieczne dostosowanie rozcieńczeń. Niewykorzystany rozcieńczony wirus należy traktować 10% wybielaczem przez 45 minut przed wyrzuceniem do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Dodaj około 15 000 zdrowych, aktywnie dzielących się 2 9 3 limfocytów T do każdej z sześciu studzienek.
Możesz użyć pojedynczej płytki 96-dołkowej do mianowania 16 preparatów wirusowych, uzupełnić studzienki do 200 mikrolitrów, zwrócić komórki do inkubatora i pozwolić, aby infekcja postępowała przez co najmniej 48 godzin. Po inkubacji przeanalizować fluorescencję komórek za pomocą cytometru przepływowego. Możesz użyć procentu komórek fluorescencyjnych na studzienkę, aby określić miano lub liczbę zakaźnych cząstek wirusowych na mililitr dodanego wirusa.
Oblicz liczbę jednostek zakaźnych na mililitr za pomocą następującego wzoru podczas interpretacji przepływu. Wyniki cytometru. Należy pamiętać, że dokładne obliczenia miana można uzyskać tylko wtedy, gdy zakażone komórki otrzymały nie więcej niż jedną integrację wirusa na komórkę.
Aby upewnić się, że tak jest, do obliczeń użyj komórek o wskaźniku infekcji mniejszym niż 15%. Komórki o wyższym wskaźniku infekcji prawdopodobnie otrzymały wiele integracji wirusowych na komórkę. Rozcieńczenie sugerowane w kroku drugim powinno dać kilka próbek w tym zakresie infekcji.
Najlepiej użyć kilku próbek do wygenerowania wykresu miareczkowania, na podstawie którego można obliczyć końcowe miano. Obliczony wzór z dopasowanej linii liniowej może być użyty do obliczenia miana wirusa, ale w razie potrzeby można obliczyć miano przy użyciu pojedynczej próbki. Można oczekiwać miana od jednego do 10 do siódmych jednostek transdukcyjnych na mililitr dla nieskoncentrowanego wirusa i od jednego razy 10 do ósmych jednostek transdukcyjnych na mililitr dla skoncentrowanego wirusa.
Właśnie pokazaliśmy, jak wytwarzać lentiwirusy podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby przestrzegać wszystkich przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego i odpowiednio utylizować odpady. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł szczegółowo opisuje procedurę produkcji lentiwirusów z użyciem ludzkich komórek 293. Proces obejmuje transfekcję komórek wektorami DNA, pozyskiwanie nadstaniku wirusowego oraz oznaczanie tytru wirusa poprzez ekspresję fluorescencji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Terapia genowa
- Biologia komórki
Tło
- Lentiwirusy są cennym narzędziem do dostarczania genów.
- Ludzkie komórki 293 są powszechnie stosowane do produkcji wirusów.
- Rozumienie tytru wirusa jest kluczowe dla skutecznych zastosowań.
- Ekspresja fluorescencji umożliwia ilościową ocenę cząstek wirusowych.
Cel badania
- Aby zademonstrować niezawodną metodę produkcji lentiwirusów.
- Aby zapewnić wgląd w procesy transfekcji i pozyskiwania.
- Aby ułatwić stosowanie lentiwirusów w badaniach i zastosowaniach terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Transfekcja komórek 293T lentiwirusami i wektorami pakowniczymi.
- Inkubacja przez co najmniej 48 godzin, aby umożliwić produkcję wirusa.
- Pozyskiwanie i filtrowanie nadstaniku wirusowego.
- Ultrawirowanie w celu skoncentrowania wirusa.
Główne wyniki
- Udana produkcja lentiwirusów z komórek 293T.
- Skuteczna koncentracja cząstek wirusowych za pomocą ultrawirowania.
- Dokładne oznaczenie tytru wirusa poprzez seryjne rozcieńczenia.
- Demonstracja niezawodności procedury dla przyszłych zastosowań.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w produkcji lentiwirusów.
- Oznaczanie tytru na podstawie fluorescencji jest efektywne.
- Ten protokół można dostosować do różnych potrzeb badawczych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Lentivirus production enables robust gene silencing and functional genomics studies across diverse cell types, supporting early discovery and target validation in biopharma R&D. Quantitative titering via flow cytometry ensures reproducibility and scalability for downstream screening and mechanistic studies. This capability underpins predictive confidence and risk-adjusted decision-making at key portfolio inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables stable gene knockdown for interrogation of gene function in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by allowing precise modulation of target expression.
- Facilitates functional target validation through reproducible delivery of shRNA constructs.
Screening & Assay Development
- Provides standardized lentiviral stocks for consistent assay development and compound screening.
- Delivers quantitative viral titers to ensure reproducible infection rates across experiments.
- Enables scalable production for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Supports continuity from in vitro discovery to preclinical model validation when gene silencing is required.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling pathway interrogation in relevant cell systems.
- Reduces biological ambiguity in preclinical studies through controlled gene modulation.
Pipeline & Workflow Integration
Lentivirus production integrates into the discovery-to-preclinical continuum, providing a reusable platform for gene modulation and functional studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification via targeted gene knockdown.
- Screening: Supplies reproducible, titered viral stocks for assay readiness and quantitative outputs.
- Analytics: Enables precise measurement of infection efficiency and gene silencing via flow cytometry.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models through consistent gene modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable across multiple targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible lentiviral preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust functional studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and biosafety procedures.
- Needs access to ultracentrifugation and flow cytometry infrastructure for concentration and titering.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible viral production and quantification.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for specific systems.
- Strict biosafety and waste disposal protocols must be followed throughout the workflow.
