Przygotowanie rozprzestrzenionego preparatu chromosomów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do analizy kariotypu

Wstęp. Dzień dobry. Reprezentujemy Instytut Nauk Biometrycznych na Uniwersytecie Federalnym w Faja w Brazylii. W tym filmie przygotujemy preparaty rozproszonych chromosomów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w celu wykrycia możliwych aberracji chromosomowych. Choć wykazano, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste posiadają stabilny kariotyp, liczne badania donoszą, że w zależności od warunków hodowli mogą one stać się podatne na nabywanie anomalii chromosomowych, takich jak dodanie całych chromosomów lub ich fragmentów.

Charakterystyka integralności genetycznej HASS in vitro jest kluczowa, biorąc pod uwagę jej istotną rolę w badaniach nad embriogenezą oraz testach leków. Ponadto, w kontekście przyszłych propozycji terapeutycznych, zmiany chromosomalne stanowią istotny problem, ponieważ są one często powiązane z kancerogenezą. Przejdźmy zatem do części praktycznej.

Traktowanie komórek ate. W tej procedurze stosujemy tę metodę. Komórki hodowano przez osiem do dziewięciu dni w medium F 12 uzupełnionym o 20% zamiennika surowicy bezcielesnej oraz 80 do 9 g/ml czynnika wzrostu fibroblastów. Należy rozpocząć od wyjęcia kolby hodowlanej z inkubatora i w komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać coit do końcowego stężenia 0,1 µg/ml.

Dodanie Colcemidu do medium indukuje mitozę, zatrzymując komórki w metafazie. Gdy chromosomy są dobrze skondensowane i można je łatwiej zwizualizować pod mikroskopem, należy pamiętać o stosowaniu technik sterylnych, aby uniknąć kontaminacji. Po dodaniu Colcemidu należy zamknąć kolbę i zwrócić komórki do inkubatora.

Utrwalanie komórek po okresie inkubacji; w tym momencie komórki nie są jeszcze gotowe do utrwalenia. Nie ma konieczności pracy w warunkach sterylnych. Rozpocznij od odessania medium, a następnie dodaj trypsynę.

Do kolby dodaje się 0,05% DTA. Należy upewnić się, że dodano wystarczającą ilość trypsyny, aby pokryć całą powierzchnię dna z komórkami. Zakręca się kolbę i delikatnie nią potrząsa, aby równomiernie rozprowadzić reagent.

Po dodaniu trypsyny należy inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach inkubacji w temperaturze pokojowej komórki nie powinny już przylegać do dna kolby; należy wówczas dezaktywować trypsynę, dodając pożywkę kompletną zawierającą surowicę lub delikatnie dodając surowicę do komórek. Ostrożnie zdejmij korek kolby i dodaj pożywkę kompletną lub surowicę, pozwalając cieczy spłynąć na dno kolby na komórki.

Kilkukrotnie pipetuj zawiesinę komórkową, aby całkowicie rozdzielić komórki. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, upewniając się przed tym, że komórki zostały dobrze rozdzielone, a zawiesina nie zawiera widocznych skupisk komórkowych. Po zakończeniu przenoszenia zakręć probówkę i odwiruj.

Mieszaj zawiesinę przez pięć minut. Po wirowaniu przy 800 RPM na dnie probówki powinien powstać granulat komórkowy. Należy uważać, aby nie naruszyć granulatu komórkowego.

Odssać nadsącz za pomocą pipety P 1000, aż pozostanie tylko około 200 µL. Jest to objętość medium do resuspensji. Resuspendować osad w medium do resuspensji.

Zresuspenduj osad. Delikatnie i kilkukrotnie opukaj probówkę palcami. Upewnij się, że komórki zostały dobrze zresuspendowane, sprawdzając, czy w roztworze nie pozostały żadne grudki komórek.

Na tym etapie roztwór powinien być mętny. Następnie należy dodać pięć mililitrów 75 mM roztworu chlorku potasu, uprzednio podgrzanego do 37 °C. Roztwór hipotoniczny należy dodawać bardzo powoli przez dolną część probówki, jednocześnie nią obracając.

Po dodaniu pierwszych 3 ml ściśle i ostrożnie zakręć probówkę. Homogenizuj zawiesinę komórkową w roztworze hipotonicznym, delikatnie obracając probówkę w poziomie i powoli ją rotując.

Następnie powoli dodaje się pozostałe dwa mililitry w ten sam sposób co wcześniej. Zastosowanie roztworu hipotonicznego ma na celu zwiększenie objętości komórek, aby umożliwić rozplątanie się chromosomów. Ten okres inkubacji jest zatem kluczowy dla uzyskania dobrych preparatów rozprzestrzeni chromosomowej. Po dodaniu pełnych pięciu mililitrów należy zamknąć probówkę i inkubować komórki w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut.

Po zakończeniu 15-minutowego okresu inkubacji wyjmij probówkę z kąpieli wodnej. Na tym etapie należy pracować pod dygestorium, ponieważ opary powstające z roztworu utrwalającego są toksyczne. W przypadku braku dostępu do dygestorium należy upewnić się, że prace odbywają się w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.

Zdejmij zakrętkę z probówki i dodaj trzy krople roztworu utrwalającego. Jest to mieszanina metanolu i kwasu octowego w stosunku 3:1, którą należy przygotować w dniu użycia. Szczelnie zakręć probówkę i delikatnie obracaj ją w poziomie, wykonując powolne ruchy najpierw zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.

Wiruj probówkę przez pięć minut przy 800 RPM bez przerwy. Bardzo ważne jest, aby cykl wirowania zatrzymywał się powoli, aby zapobiec utracie materiału spowodowanej atrycją komórek po wirowaniu. Ten osad kardiocytowy zawiera około 200.

Aby zawiesić osad, należy kilka razy delikatnie uderzyć palcami w probówkę. Upewnij się, że komórki zostały dobrze zawieszone, sprawdzając, czy nie pozostały żadne skupiska komórek. Roztwór trzech mililitrów utrwalacza dodaj powoli po ściance probówki, obracając ją po dodaniu pierwszych trzech mililitrów.

Szczelnie zamknij probówkę T i ostrożnie zhomogenizuj zawiesinę komórkową, delikatnie obracając probówkę w płaszczyźnie poziomej i powoli ją rotując. Upewnij się, że wykonasz co najmniej jeden pełny obrót. Aby zoptymalizować proces mieszania, powtórz tę czynność.

Dwa mililitry roztworu fiksacyjnego dodaje się przy ściance probówki, aby zebrać komórki. Zawiesinę komórkową przechowuje się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Tak ufiksowane komórki można przechowywać w roztworze fiksacyjnym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez wiele miesięcy.

Następnego dnia komórki należy wyprać, wirując je przez pięć minut przy 800 rpm bez przerwy. Odrzucić nadosad i pozostawić około 200 µL. Zawiesić osad, kilkakrotnie uderzając palcami w probówkę.

Upewnij się, że komórki zostały dobrze powiązane i że zawiesina nie zawiera widocznych skupisk komórkowych. Powoli dodaj pięć mililitrów świeżego roztworu utrwalającego po ściance probówki. Zakręć probówkę i zhomogenizuj komórki, delikatnie obracając probówkę w poziomie podczas powolnej rotacji.

Oprócz ochrony komórek, roztwór fixative usuwa lipidy, a następnie białka, co w efekcie ułatwia rozprzestrzenianie się chromosomów. Odwiruj zawartość probówki przez pięć minut przy 800 RPM bez przerwy. Przygotowanie preparatów: na etapie wirowania pozostaw odpowiednią ilość roztworu, aby zhomogenizować osad komórkowy.

Ilość cieczy może zależeć od liczby komórek. Kilka razy delikatnie opukaj probówkę palcami. Upewnij się, że komórki są dobrze rozproszone, sprawdzając, czy nie występują widoczne skupiska komórek.

W tym momencie należy nanieść 20 do 30 µL zawiesiny komórkowej na czysty, suchy szkiełko, przesuwając pipetę równolegle do powierzchni szkiełka. W miarę odparowywania roztworu fiksacyjnego powierzchnia szkiełka natychmiast staje się ziarnista. Wystawić stronę z preparatem w górę na parę gorącej wody przez 30 sekund, aby doprowadzić do napęcznienia komórek.

Analiza tych preparatów. Po przygotowaniu slajdów należy przeanalizować je pod mikroskopem fazowo-kontrastowym, używając obiektywów 10x oraz 40x, aby sprawdzić, czy gęstość komórek jest odpowiednia do dalszych analiz. Ten slajd jest przykładem preparatu o zbyt dużym stężeniu.

Należy zauważyć, że jądra komórkowe znajdują się zbyt blisko preparatów metafazowych. Jeśli na preparacie gęstość komórek jest zbyt wysoka, należy rozcieńczyć zawiesinę komórkową, dodając więcej roztworu utrwalającego. Ten preparat przedstawia pożądaną gęstość komórek.

Należy zwrócić uwagę, że preparaty metafazowe są dobrze rozproszone i odizolowane. Po uzyskaniu preparatu o optymalnej gęstości komórek, można przystąpić do jego barwienia i analizy. Należy unikać wyboru metafaz znajdujących się w pobliżu jądra, ponieważ chromosomy mogą być w nich ukryte lub zasłonięte.

Szukaj metafaz o zaokrąglonym kształcie, upewniając się, że żadne chromosomy nie oddalają się od płyty metafazowej; wybieraj metafazy, które są zaokrąglone i dobrze odizolowane. Jak widać na następnym slajdzie, należy starać się unikać raportowania fałszywych IES wynikających z przyrostu liczby chromosomów spowodowanego nałożeniem się dwóch lub więcej preparatów (tzw. spreadów), ich wymieszaniem lub utraty chromosomów spowodowanej obecnością chromosomów wyprostowanych.

Mamy nadzieję, że ten film pomoże Państwu w dalszych eksperymentach. W razie jakichkolwiek wątpliwości prosimy o kontakt. Życzymy owocnej pracy i powodzenia.