Przygotowanie rozprzestrzenionego preparatu chromosomów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do analizy kariotypu

Wstęp. Witajcie. Reprezentujemy Instytut Nauk Biometrycznych na Federalnym Uniwersytecie w Fajzie w Brazylii. W tym filmie przygotujemy preparaty rozłożonych chromosomów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w celu wykrycia ewentualnych aberracji chromosomowych. Chociaż wykazano, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste posiadają stabilny kariotyp, liczne badania wskazują, że w zależności od warunków hodowli mogą one być podatne na nabywanie anomalii chromosomowych, takich jak dodanie całych chromosomów lub ich fragmentów.

Charakterystyka integralności genetycznej HASS in vitro jest kluczowa, biorąc pod uwagę jej istotne znaczenie dla badań nad embriogenezą oraz testowania leków. Ponadto, w kontekście przyszłych propozycji terapeutycznych, zmiany chromosomalne stanowią realne zagrożenie, ponieważ często są one powiązane z kancerogenezą. Przejdźmy zatem do części praktycznej.

Traktowanie komórek ate. W tej procedurze wykorzystujemy go. Przez osiem do dziewięciu dni hodowano je w pożywce F 12 uzupełnionej o 20% zamiennika surowicy bezserowej oraz 80 do 9 g/ml czynnika wzrostu fibroblastów. Należy rozpocząć od wyjęcia kolby hodowlanej z inkubatora i pod maską z laminarnym przepływem powietrza dodać coit do końcowego stężenia 0,1 µg/ml.

Dodanie kolchicyny do pożywki indukuje mitozę, zatrzymuje ją i wprowadza komórki w fazę metafazy. Gdy chromosomy są odpowiednio skondensowane i można je łatwiej zwizualizować pod mikroskopem, należy pamiętać o stosowaniu technik sterylnych, aby uniknąć kontaminacji. Po dodaniu kolchicyny należy zamknąć kolbę i przenieść komórki z powrotem do inkubatora.

Utrwalanie komórek po okresie inkubacji; na tym etapie komórki nie są jeszcze gotowe do utrwalenia. Praca w warunkach sterylnych nie jest konieczna. Rozpocznij od odessania pożywki, a następnie dodaj trypsynę.

Dodaj 0,05% DTA do kolby. Upewnij się, że dodano wystarczającą ilość trypsyny, aby pokryć dolną powierzchnię z komórkami. Zakręć kolbę i delikatnie potrząśnij, aby równomiernie rozprowadzić preparat.

Po dodaniu trypsyny należy inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach inkubacji w temperaturze pokojowej komórki nie powinny być już przytwierdzone do dna kolby i należy dezaktywować trypsynę, dodając pożywkę hodowlaną zawierającą serum lub ostrożnie dodając samo serum do komórek. Należy ostrożnie zdjąć korek kolby i dodać pożywkę hodowlaną lub serum, pozwalając cieczy spłynąć na dno kolby na komórki.

Kilka razy pipetuj zawiesinę komórkową w górę i w dół, aby całkowicie rozdzielić komórki. Przenieś komórki do 15 mililitrowej probówki stożkowej, upewniając się przed tym, że komórki zostały dobrze rozdzielone, a w zawiesinie nie widać żadnych skupisk komórek. Po zakończeniu przenoszenia zakręć probówkę i odwiruj.

Mieszać zawiesinę przez pięć minut. Po wirowaniu przy 800 RPM na dnie probówki powinien powstać pellet komórkowy. Należy uważać, aby nie naruszyć pelletu komórkowego.

Odssać roztwór za pomocą pipety P 1000, aż pozostanie około 200 µL. Jest to objętość pośrednia do resuspensji. Zresuspender osad.

Zresuspenduj osad. Delikatnie opukaj probówkę palcami kilka razy. Upewnij się, że komórki zostały dobrze zresuspendowane, sprawdzając, czy w roztworze nie pozostały skupiska komórek.

Na tym etapie roztwór powinien być mętny. Następnie należy dodać 5 mL 75 mM roztworu chlorku potasu, uprzednio ogrzanego do 37 °C. Roztwór hipotoniczny należy dodawać bardzo powoli przez ściankę probówki, jednocześnie nią obracając.

Po dodaniu pierwszych trzech mililitrów szczelnie i ostrożnie zakręć probówkę. Zhomogenizuj zawiesinę komórkową z roztworem hipotonicznym, powoli i delikatnie obracając probówkę w poziomie.

Następnie powoli dodaje się pozostałe dwa mililitry w ten sam sposób co poprzednio. Zastosowanie roztworu hipotonicznego ma na celu zwiększenie objętości komórek, aby umożliwić rozplątanie się chromosomów. W związku z tym ten okres inkubacji jest kluczowy dla uzyskania dobrych preparatów rozprzestrzenionych chromosomów. Po dodaniu pełnych pięciu mililitrów zamyka się probówkę i inkubuje komórki w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut.

Po zakończeniu 15 minutowego okresu inkubacji wyjmij probówkę z kąpieli wodnej. Na tym etapie należy pracować pod dygestorium, ponieważ opary powstające z roztworu utrwalającego są toksyczne. Jeśli nie masz dostępu do dygestorium, upewnij się, że pracujesz w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.

Zdejmij zakrętkę z probówki i dodaj trzy krople roztworu utrwalającego. Jest to mieszanina metanolu i kwasu octowego w stosunku 3:1, którą należy przygotować w dniu użycia. Szczelnie zakręć probówkę i delikatnie obracaj ją w poziomie, wykonując powolne ruchy najpierw zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie przeciwnie do nich.

Wiruj probówkę przez pięć minut przy 800 RPM bez przerwy. Bardzo ważne jest, aby cykl wirowania zatrzymywał się powoli, aby zapobiec utracie materiału spowodowanej atrycją komórek po wirowaniu. Ten kardiocyt żyje około 200.

Aby zawiesić pelet, należy kilka razy delikatnie stuknąć w probówkę palcami. Należy upewnić się, że komórki zostały dobrze zawieszone, sprawdzając, czy nie pozostały żadne skupiska komórek. Trzy mililitry roztworu utrwalającego należy powoli dodać po ściance probówki, obracając ją po dodaniu pierwszych trzech mililitrów.

Szczelnie zamknij probówkę T i ostrożnie uhomogenizuj zawiesinę komórkową, powoli obracając probówkę poziomo. Należy wykonać co najmniej jeden pełny obrót. Aby zoptymalizować proces mieszania, powtórz tę czynność.

Dwa mililitry roztworu fiksacyjnego przy ściance probówki, aby zebrać komórki. Przechowywać zawiesinę komórkową w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Tak ufiksowane komórki mogą być przechowywane w roztworze fiksacyjnym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez wiele miesięcy.

Następnego dnia należy wyprać komórki, odwirując je przez pięć minut przy 800 RPM bez przerwy. Odrzucić nadsącz i pozostawić około 200 µL. Resuspender osad, kilkakrotnie uderzając palcami w probówkę.

Upewnij się, że komórki zostały dobrze związane i że zawiesina nie zawiera widocznych skupisk komórek. Powoli dodaj pięć mililitrów świeżego roztworu fiksacyjnego po ściance probówki. Zakręć probówkę i zhomogenizuj komórki, delikatnie obracając probówkę w poziomie podczas powolnej rotacji.

Oprócz ochrony komórek, zastosowany roztwór utrwalający usuwa lipidy, a następnie białka, co w efekcie ułatwia rozprzestrzenianie się chromosomów. Wirować probówkę przez pięć minut przy 800 RPM bez przerwy. Przygotowanie preparatów: na etapie wirowania należy pozostawić wystarczającą ilość roztworu, aby zhomogenizować pellet komórkowy.

Ilość cieczy może zależeć od liczby komórek. Kilka razy delikatnie stuknij palcami w probówkę. Upewnij się, że komórki są dobrze rozproszone, sprawdzając, czy nie widnieją żadne skupiska komórkowe.

W tym momencie należy nanieść 20 do 30 µL zawiesiny komórkowej na czysty, suchy szkiełko, przesuwając pipetę równolegle do powierzchni szkiełka. W miarę odparowywania roztworu utrwalającego powierzchnia szkiełka natychmiast staje się ziarnista. Wystawić powierzchnię szkiełka skierowaną ku górze na strumień gorącej pary wodnej przez 30 sekund, aby doprowadzić do spęcznienia komórek.

Analiza obrazu. Po przygotowaniu preparatów należy przeanalizować je pod mikroskopem fazowo-kontrastowym przy użyciu obiektywów 10x i 40x, aby sprawdzić, czy gęstość komórek jest odpowiednia do dalszej analizy. Ten preparat jest przykładem próbki o zbyt dużym stężeniu.

Należy zauważyć, że jądra komórkowe znajdują się zbyt blisko preparatów metafazowych. Jeśli gęstość komórek na preparacie jest zbyt wysoka, należy rozcieńczyć zawiesinę komórkową poprzez dodanie większej ilości roztworu utrwalającego. Ten preparat wykazuje pożądaną gęstość komórek.

Należy zauważyć, że preparaty metafaz są dobrze rozproszone i odizolowane. Po uzyskaniu slajdu z optymalną gęstością komórek, można go poddać barwieniu i analizie. Należy unikać wyboru metafaz znajdujących się w pobliżu jądra, ponieważ chromosomy mogą być w nich ukryte lub przesłonięte.

Poszukuj metafaz o zaokrąglonym kształcie, upewniając się jednocześnie, że żadne chromosomy nie oddaliły się od płyty metafazowej; wybierz metafazy, które są zaokrąglone i dobrze odseparowane. Podobnie jak na następnym slajdzie, należy starać się unikać raportowania fałszywych IES, takich jak przyrost liczby chromosomów wynikający z nałożenia się dwóch lub więcej preparatów, ich zmieszania lub utrata chromosomów spowodowana obecnością chromosomów wyprostowanych.

Mamy nadzieję, że ten materiał wideo pomoże Państwu w przeprowadzaniu dalszych eksperymentów. W przypadku jakichkolwiek wątpliwości prosimy o kontakt. Życzymy owocnej pracy i powodzenia.