Name: Rozprzestrzenianie się chromosomów Przygotowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do kariotypowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj metodę przygotowania rozprzestrzenień chromosomowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do kariotypowania. Protokół umożliwia monitorowanie integralności genetycznej komórek w kulturze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

WYPOSAŻENIE
<ul>
 <li>Inkubator do hodowli tkankowych, 37°C, 5% CO2</li>
 <li>Wirówka</li>
 <li>Zestaw mikropipet (100, 100μL)</li>
 <li>Kąpiel wodna 37°C</li>
 <li>Kąpiel wodna 90°C jako źródło pary wodnej</li>
 <li>Mikroskop kontrastowy</li>
</ul>
PIERWSZY KROK
Traktowanie komórek kolcemidem
W tej procedurze wykorzystano linię hESC H9 hodowaną na embrionalnych fibroblastach mysich (mEF) inaktywowanych mitomycyną C (Sigma) i utrzymywaną w DMEM/F12 (Invitrogen) uzupełnionym o 20% knockout serum replacement (KSR, Gibco) oraz 8ng/mL czynnika wzrostu fibroblastów (FGF-2, R&amp;D).
W celu uzyskania dużej liczby preparatów metafaz, zaleca się stosowanie kultur o wysokim indeksie mitotycznym, w których znajduje się wiele dzielących się komórek.
<ol>
<li>Wyjąć kolbę z hodowlą z inkubatora i w komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać Colcemid do stężenia końcowego 0,1μg/mL.</li>
<li>Przenieść kolbę z powrotem do inkubatora i odczekać 3 godziny, aby inhibitor mógł wywołać zatrzymanie mitozy w metafazie, gdy chromosomy są silnie skondensowane i mogą być łatwo wizualizowane pod mikroskopem.</li>
</ol>
Fiksacja komórek
<ol start="3">
<li>Usunąć medium i dodać tripsynę/EDTA 0,05% w ilości wystarczającej do pokrycia powierzchni komórek. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dezaktywować enzym, dodając medium hodowlane zawierające surowicę lub dodając surowicę bezpośrednio do komórek.
 UWAGA: Ważne jest upewnienie się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek, aby otrzymać dobre preparaty metafazowe.</li>
<li>Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL i wirować przy 122 g przez 5 minut.</li>
<li>Odlać nadsącz, pozostawiając około 200 µL, a następnie delikatnie resuspender osad poprzez opukiwanie probówki, tak jak pokazano na filmie. Upewnić się, że komórki są dobrze zdysocjowane i w roztworze nie widać żadnych skupisk.</li>
<li>Następnie należy powoli dodać 5 mL roztworu hipotonicznego (KCl 75mM) podgrzanego wcześniej do 37°C, spływając po ściance probówki zgodnie z poniższym opisem. Najpierw dodać 3 mL, odwrócić probówkę do pozycji poziomej, aby wymieszać komórki z roztworem hipotonicznym, a następnie dodać pozostałe 2 mL i inkubować w temperaturze 37°C przez 15 minut. UWAGA: Na tym etapie roztwór hipotoniczny spowoduje zwiększenie objętości komórkowej i pomoże w rozplątaniu chromosomów. Czas inkubacji jest kluczowy dla uzyskania dobrych preparatów chromosomowych. Jeśli czas będzie zbyt długi, błona komórkowa może pęknąć zbyt wcześnie, co doprowadzi do utraty chromosomów. Jeśli będzie zbyt krótki, uzyskanie preparatów chromosomowych może być trudne, ponieważ błona komórkowa może nie ulec przerwaniu.</li>
<li>Dodać 3 krople roztworu utrwalającego (metanol/lodowaty kwas octowy 3:1), delikatnie odwrócić probówkę, aby wymieszać utrwalacz z komórkami, i wirować przy 122 g przez 5 minut bez hamowania. 
UWAGA: Roztwór utrwalający powinien być świeżo przygotowany. 
UWAGA: Ważne jest stosowanie wirowania bez hamowania, aby uniknąć uszkodzenia komórek i zapobiec utracie materiału.</li>
<li>Odlać nadsącz, pozostawiając około 200 µL, i delikatnie resuspender osad, opukując dno probówki.
 UWAGA: Ponownie należy upewnić się, że komórki są dobrze zdysocjowane i w roztworze nie widać żadnych skupisk.</li>
<li>Dodać pierwsze 3 mL roztworu utrwalającego, powoli po ściance probówki, obracając ją jednocześnie. Odwrócić probówkę do pozycji poziomej, aby wymieszać komórki, a następnie dodać kolejne 2 mL roztworu utrwalającego po ściance probówki, aby opuścić komórki na dno. Przechowywać w temperaturze 4°C przez noc.
 UWAGA: Utrwalone komórki można przechowywać w roztworze utrwalającym przez wiele miesięcy w temperaturze 4°C. Poza ochroną komórek w ich obrzękniętym stanie, roztwór utrwalający usuwa lipidy i denaturuje białka. Procesy te sprawiają, że błona komórkowa staje się krucha, co w konsekwencji ułatwia rozcieranie chromosomów.</li>
</ol>
CZYSZCZENIE SZKIEŁEK PRZEDMIOTOWYCH
Przed przystąpieniem do przygotowywania preparatów z rozprzestrzenionymi chromosomami należy upewnić się, że szkiełka są odpowiednio oczyszczone, w przeciwnym razie może dojść do utraty części jąder komórkowych oraz metafaz. Krok ten jest również istotny w przypadku planowanego zastosowania jakiejkolwiek techniki hybrydyzacji 9.
<ol>
 <li>Umieść preparaty w zlewce zawierającej 6M HCl na co najmniej 3 h w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Po tym czasie myj preparaty pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.</li>
 <li>Opłucz preparaty wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Gotowe preparaty można przechowywać w 96% etanolu, a bezpośrednio przed użyciem osuszyć ściereczką niepozostawiającą włókien.</li>
</ol>
UWAGA: W przypadku metod hybrydyzacji in situ preparaty nie mogą być przechowywane w 96% etanolu przez więcej niż 2 dni
KROK DRUGI
Przemywanie komórek
<ol start="10">
<li>Następnego dnia odwiruj komórki przy 122 g przez 5 minut bez hamowania.</li>
<li>Odrzuć nadsącz, pozostawiając około 200 ml. Resuspenduj osad, delikatnie potrząsając probówką, a następnie powoli, po ściance probówki i obracając ją, dodaj 5 ml świeżego roztworu utrwalającego (metanol/lodowaty kwas octowy 3:1). Powtórz ten etap płukania jeszcze 2 razy, tak aby łącznie wykonać trzy płukania. 
UWAGA: Roztwór utrwalający powinien być świeżo przygotowany.</li>
</ol>
Przygotowanie szkiełek
<ol start="12">
<li>Podczas ostatniego etapu wirowania pozostaw wystarczającą ilość roztworu, aby zhomogenizować osad komórkowy i uzyskać odpowiednią gęstość komórek na szkiełkach (patrz: rycina 1).</li>
<li>Nanieś 20-30 μL zawiesiny komórkowej na czyste, suche szkiełko, prowadząc pipetę bardzo blisko i równolegle do powierzchni. W miarę odparowywania roztworu utrwalającego powierzchnia szkiełka staje się ziarnista.</li>
<li>Natychmiast wystaw szkiełko stroną górną do pary wodnej z gorącej wody (90°) na 30 sekund, aby doprowadzić do rozpęcznienia komórek.
 UWAGA: W tym momencie metanol z roztworu utrwalającego odparowuje, co prowadzi do zwiększenia stężenia kwasu octowego, który wraz z wodą stymuluje rozprzestrzenianie się chromosomów.</li>
<li>Sprawdź preparat pod mikroskopem kontrastowym, aby upewnić się, że stężenie oraz rozmieszczenie komórek są prawidłowe (patrz: rycina 1).</li>
<li>Szkiełka są teraz gotowe do analizy zestawu chromosomów za pomocą metod cytogenetycznych, takich jak pasmowanie G (Giemsa), FISH, SKY lub CGH.</li>
</ol>
WAŻNE WSKAZÓWKI
Jak wybrać odpowiednią metafazę do analizy
Wybierając okrągłe i odizolowane metafazy (rycina 2D), można uniknąć błędnego uznania za aneuploidie przyrostu liczby chromosomów wynikający z nałożenia się dwóch lub więcej preparatów lub utraty chromosomów spowodowanej ich wypadnięciem poza obszar analizy. Należy zatem unikać wyboru metafaz znajdujących się w pobliżu jąder komórkowych, ponieważ niektóre chromosomy mogą być przez nie zasłonięte (rycina 2A i 2B). Ponadto należy poszukiwać okrągłych metafaz i upewnić się, że każdy chromosom jest oddzielony od pozostałych w obrębie metafazy (rycina 2C).
Komórki karmące i kariotyp hESC
W przypadku analizy prążkowania G (G-banding) oraz SKY obecność komórek karmia w hodowli hESC nie zakłóca wyników, ponieważ komórki karmia nie znajdują się w stanie podziału (zostały dezaktywowane za pomocą mitomycyny C lub napromieniowania) i nie będą stanowić części populacji w metafazie. Jednakże w przypadku zastosowania techniki FISH w jądrach interfazowych zaleca się oddzielenie populacji hESC od komórek karmia poprzez manualne pobranie kolonii przed trypsynizacją do analizy FISH.
<img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig1tmb.jpg" alt="Obraz mikroskopowy porównujący hodowle komórkowe; panel A pokazuje rozproszone komórki, panel B wyróżnia kolonie." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Jak określić odpowiednią gęstość komórek na preparatach. Obrazy z mikroskopu fazowego przy użyciu obiektywu 10x. (A) Gęstość komórek jest zbyt wysoka. Strzałki wskazują rozprzestrzenia metafaz zbyt blisko jąder. (B) Preparat o dobrej gęstości komórek. Okręgi pokazują rozprzestrzenia metafaz odizolowane od jąder lub innych metafaz. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.
<img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig2tmb.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna chromosomów w metafazie, metoda barwienia DNA, analiza badań genetycznych." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: Jak wybrać odpowiednią metafazę do analizy. Chromosomy są zabarwione DAPI, a obrazy zostały uzyskane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 100x. (A) (B) Należy unikać metafaz znajdujących się w pobliżu jąder (wskazanych strzałkami) (C) oraz metafaz niesymetrycznych, w których chromosomy są rozdzielone (okrąg). (D) Okrągła metafaza jest odpowiednią metafazą do analizy. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig2.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 2.

<ol><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).</li>
<li>Draper, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+gain+of+chromosomes+17q+and+12+in+cultured+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).</li>
<li>Maitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+alterations+in+cultured+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).</li>
<li>Mitalipova, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).</li>
<li>Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype+of+human+ES+cells+during+extended+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Karyotype of human ES cells during extended culture.</a> Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).</li>
<li>Caisander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+integrity+maintained+in+five+human+embryonic+stem+cell+lines+after+prolonged+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture.</a> Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).</li>
<li>Imreh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+conditions+favoring+selection+of+chromosomal+abnormalities+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells.</a> J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).</li>
<li>Robin-Wesselschmidt, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobin-Wesselschmidt%2C+JL+%22Human+Stem+Cell+Manual%22">Human Stem Cell Manual</a>. Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. chwartz , Elsevier's Science & Technology Rights. California. 59-59 (2007).</li>
<li>Rooney, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRooney%2C+DE+%22Human+Cytogenetics%22">Human Cytogenetics</a>. , Third Edition, Oxford University Press. (2001).</li>
<li>Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeslop-Harrison%2C+P+%22Practical+in+situ+hybridization%22">Practical in situ hybridization</a>. Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. 51-51 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Przygotowanie rozprzestrzeń chromosomowych jest kluczowym etapem dla pomyślnej analizy stanu genetycznego embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu rutynowych technik, takich jak prążkowanie G, oraz bardziej zaawansowanych metod, takich jak FISH, SKY i CGH.
Niniejszą procedurę można zastosować w przypadku wielu typów komórek, zmieniając czas inkubacji z kolcemmidem, który zależy od długości cyklu komórkowego. W przypadku kolonii embrionalnych komórek macierzystych czas ten wynosi 3 godzi...

<table><tbody><tr><td>probówka do wirowania 15 ml</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Colcemid Karyo MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Isofar</td><td>721</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>Isofar</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Isofar</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>104.931.000</td><td></td></tr><tr><td>Przeszkiełko</td><td>Bioslide</td><td>7105-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie rozprzestrzenionego preparatu chromosomów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do analizy kariotypu

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Choć wykazano, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) posiadają stabilny diploidalny kariotyp 1, w wielu badaniach doniesiono, że w zależności od warunków hodowli stają się one podatne na nabywanie anomalii chromosomalnych, takich jak dodanie całych chromosomów lub ich części. Rzeczywiście, podczas długotrwałej hodowli obserwuje się zmiany kariotypowe przy zastosowaniu dysocjacji enzymatycznej lub chemicznej 2,3,4, podczas gdy manualna dyssekcja kolonii podczas pasażowania pozwala zachować stabilny kariotyp 5. Ponadto zmiany w środowisku, takie jak usunięcie komórek zasilających (feeder cells), wydają się również naruszać integralność genetyczną hESC 3,6. Ponieważ zmiany chromosomalne mogą wpływać na fizjologię komórkową, charakterystyka integralności genetycznej hESC in vitro jest kluczowa, biorąc pod uwagę, że hESC stanowią niezbędne narzędzie w badaniach nad embriogenezą i testowaniu leków. Co więcej, w kontekście przyszłych zastosowań terapeutycznych zmiany chromosomalne stanowią poważny problem, gdyż często są one powiązane z kancerogenezą.
Prezentujemy tutaj prostą i użyteczną metodę otrzymywania wysokiej jakości preparatów rozproszonych chromosomów do późniejszej analizy zestawu chromosomowego za pomocą technik prążkowania G, FISH, SKY lub CGH 7,8. Zalecamy rutynową kontrolę statusu chromosomalnego w odstępach co 5 pasażów w celu monitorowania pojawiania się translokacji i aneuploidii
Priscila Britto i Rafaela Sartore wniosły równy wkład w przygotowanie pracy.

Kariotypowanie jest prostą i użyteczną techniką powszechnie stosowaną do wykrywania zmian genetycznych. W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowy protokół przygotowania preparatów rozprzestrzeniających chromosomy z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w celu monitorowania stanu chromosomowego tych komórek utrzymywanych w hodowli.

Przygotowanie rozprzestrzenionego preparatu chromosomów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do analizy kariotypu

Choć wykazano, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) prezentują stabilny kariotyp diploidalny 1, wiele badań wskazuje, że w zależności od hodowli...

Wstęp. Witajcie. Reprezentujemy Instytut Nauk Biometrycznych na Federalnym Uniwersytecie w Fajzie w Brazylii. W tym filmie przygotujemy preparaty rozłożonych chromosomów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w celu wykrycia ewentualnych aberracji chromosomowych. Chociaż wykazano, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste posiadają stabilny kariotyp, liczne badania wskazują, że w zależności od warunków hodowli mogą one być podatne na nabywanie anomalii chromosomowych, takich jak dodanie całych chromosomów lub ich fragmentów.Charakterystyka integralności genetycznej HASS in vitro jest kluczowa, biorąc pod uwagę jej istotne znaczenie dla badań nad embriogenezą oraz testowania leków. Ponadto, w kontekście przyszłych propozycji terapeutycznych, zmiany chromosomalne stanowią realne zagrożenie, ponieważ często są one powiązane z kancerogenezą. Przejdźmy zatem do części praktycznej.Traktowanie komórek ate. W tej procedurze wykorzystujemy go. Przez osiem do dziewięciu dni hodowano je w pożywce F 12 uzupełnionej o 20% zamiennika surowicy bezserowej oraz 80 do 9 g/ml czynnika wzrostu fibroblastów. Należy rozpocząć od wyjęcia kolby hodowlanej z inkubatora i pod maską z laminarnym przepływem powietrza dodać coit do końcowego stężenia 0,1 µg/ml.Dodanie kolchicyny do pożywki indukuje mitozę, zatrzymuje ją i wprowadza komórki w fazę metafazy. Gdy chromosomy są odpowiednio skondensowane i można je łatwiej zwizualizować pod mikroskopem, należy pamiętać o stosowaniu technik sterylnych, aby uniknąć kontaminacji. Po dodaniu kolchicyny należy zamknąć kolbę i przenieść komórki z powrotem do inkubatora.Utrwalanie komórek po okresie inkubacji; na tym etapie komórki nie są jeszcze gotowe do utrwalenia. Praca w warunkach sterylnych nie jest konieczna. Rozpocznij od odessania pożywki, a następnie dodaj trypsynę.Dodaj 0,05% DTA do kolby. Upewnij się, że dodano wystarczającą ilość trypsyny, aby pokryć dolną powierzchnię z komórkami. Zakręć kolbę i delikatnie potrząśnij, aby równomiernie rozprowadzić preparat.Po dodaniu trypsyny należy inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach inkubacji w temperaturze pokojowej komórki nie powinny być już przytwierdzone do dna kolby i należy dezaktywować trypsynę, dodając pożywkę hodowlaną zawierającą serum lub ostrożnie dodając samo serum do komórek. Należy ostrożnie zdjąć korek kolby i dodać pożywkę hodowlaną lub serum, pozwalając cieczy spłynąć na dno kolby na komórki.Kilka razy pipetuj zawiesinę komórkową w górę i w dół, aby całkowicie rozdzielić komórki. Przenieś komórki do 15 mililitrowej probówki stożkowej, upewniając się przed tym, że komórki zostały dobrze rozdzielone, a w zawiesinie nie widać żadnych skupisk komórek. Po zakończeniu przenoszenia zakręć probówkę i odwiruj.Mieszać zawiesinę przez pięć minut. Po wirowaniu przy 800 RPM na dnie probówki powinien powstać pellet komórkowy. Należy uważać, aby nie naruszyć pelletu komórkowego.Odssać roztwór za pomocą pipety P 1000, aż pozostanie około 200 µL. Jest to objętość pośrednia do resuspensji. Zresuspender osad.Zresuspenduj osad. Delikatnie opukaj probówkę palcami kilka razy. Upewnij się, że komórki zostały dobrze zresuspendowane, sprawdzając, czy w roztworze nie pozostały skupiska komórek.Na tym etapie roztwór powinien być mętny. Następnie należy dodać 5 mL 75 mM roztworu chlorku potasu, uprzednio ogrzanego do 37 °C. Roztwór hipotoniczny należy dodawać bardzo powoli przez ściankę probówki, jednocześnie nią obracając.Po dodaniu pierwszych trzech mililitrów szczelnie i ostrożnie zakręć probówkę. Zhomogenizuj zawiesinę komórkową z roztworem hipotonicznym, powoli i delikatnie obracając probówkę w poziomie.Następnie powoli dodaje się pozostałe dwa mililitry w ten sam sposób co poprzednio. Zastosowanie roztworu hipotonicznego ma na celu zwiększenie objętości komórek, aby umożliwić rozplątanie się chromosomów. W związku z tym ten okres inkubacji jest kluczowy dla uzyskania dobrych preparatów rozprzestrzenionych chromosomów. Po dodaniu pełnych pięciu mililitrów zamyka się probówkę i inkubuje komórki w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut.Po zakończeniu 15 minutowego okresu inkubacji wyjmij probówkę z kąpieli wodnej. Na tym etapie należy pracować pod dygestorium, ponieważ opary powstające z roztworu utrwalającego są toksyczne. Jeśli nie masz dostępu do dygestorium, upewnij się, że pracujesz w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.Zdejmij zakrętkę z probówki i dodaj trzy krople roztworu utrwalającego. Jest to mieszanina metanolu i kwasu octowego w stosunku 3:1, którą należy przygotować w dniu użycia. Szczelnie zakręć probówkę i delikatnie obracaj ją w poziomie, wykonując powolne ruchy najpierw zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie przeciwnie do nich.Wiruj probówkę przez pięć minut przy 800 RPM bez przerwy. Bardzo ważne jest, aby cykl wirowania zatrzymywał się powoli, aby zapobiec utracie materiału spowodowanej atrycją komórek po wirowaniu. Ten kardiocyt żyje około 200.Aby zawiesić pelet, należy kilka razy delikatnie stuknąć w probówkę palcami. Należy upewnić się, że komórki zostały dobrze zawieszone, sprawdzając, czy nie pozostały żadne skupiska komórek. Trzy mililitry roztworu utrwalającego należy powoli dodać po ściance probówki, obracając ją po dodaniu pierwszych trzech mililitrów.Szczelnie zamknij probówkę T i ostrożnie uhomogenizuj zawiesinę komórkową, powoli obracając probówkę poziomo. Należy wykonać co najmniej jeden pełny obrót. Aby zoptymalizować proces mieszania, powtórz tę czynność.Dwa mililitry roztworu fiksacyjnego przy ściance probówki, aby zebrać komórki. Przechowywać zawiesinę komórkową w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Tak ufiksowane komórki mogą być przechowywane w roztworze fiksacyjnym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez wiele miesięcy.Następnego dnia należy wyprać komórki, odwirując je przez pięć minut przy 800 RPM bez przerwy. Odrzucić nadsącz i pozostawić około 200 µL. Resuspender osad, kilkakrotnie uderzając palcami w probówkę.Upewnij się, że komórki zostały dobrze związane i że zawiesina nie zawiera widocznych skupisk komórek. Powoli dodaj pięć mililitrów świeżego roztworu fiksacyjnego po ściance probówki. Zakręć probówkę i zhomogenizuj komórki, delikatnie obracając probówkę w poziomie podczas powolnej rotacji.Oprócz ochrony komórek, zastosowany roztwór utrwalający usuwa lipidy, a następnie białka, co w efekcie ułatwia rozprzestrzenianie się chromosomów. Wirować probówkę przez pięć minut przy 800 RPM bez przerwy. Przygotowanie preparatów: na etapie wirowania należy pozostawić wystarczającą ilość roztworu, aby zhomogenizować pellet komórkowy.Ilość cieczy może zależeć od liczby komórek. Kilka razy delikatnie stuknij palcami w probówkę. Upewnij się, że komórki są dobrze rozproszone, sprawdzając, czy nie widnieją żadne skupiska komórkowe.W tym momencie należy nanieść 20 do 30 µL zawiesiny komórkowej na czysty, suchy szkiełko, przesuwając pipetę równolegle do powierzchni szkiełka. W miarę odparowywania roztworu utrwalającego powierzchnia szkiełka natychmiast staje się ziarnista. Wystawić powierzchnię szkiełka skierowaną ku górze na strumień gorącej pary wodnej przez 30 sekund, aby doprowadzić do spęcznienia komórek.Analiza obrazu. Po przygotowaniu preparatów należy przeanalizować je pod mikroskopem fazowo-kontrastowym przy użyciu obiektywów 10x i 40x, aby sprawdzić, czy gęstość komórek jest odpowiednia do dalszej analizy. Ten preparat jest przykładem próbki o zbyt dużym stężeniu.Należy zauważyć, że jądra komórkowe znajdują się zbyt blisko preparatów metafazowych. Jeśli gęstość komórek na preparacie jest zbyt wysoka, należy rozcieńczyć zawiesinę komórkową poprzez dodanie większej ilości roztworu utrwalającego. Ten preparat wykazuje pożądaną gęstość komórek.Należy zauważyć, że preparaty metafaz są dobrze rozproszone i odizolowane. Po uzyskaniu slajdu z optymalną gęstością komórek, można go poddać barwieniu i analizie. Należy unikać wyboru metafaz znajdujących się w pobliżu jądra, ponieważ chromosomy mogą być w nich ukryte lub przesłonięte.Poszukuj metafaz o zaokrąglonym kształcie, upewniając się jednocześnie, że żadne chromosomy nie oddaliły się od płyty metafazowej; wybierz metafazy, które są zaokrąglone i dobrze odseparowane. Podobnie jak na następnym slajdzie, należy starać się unikać raportowania fałszywych IES, takich jak przyrost liczby chromosomów wynikający z nałożenia się dwóch lub więcej preparatów, ich zmieszania lub utrata chromosomów spowodowana obecnością chromosomów wyprostowanych.Mamy nadzieję, że ten materiał wideo pomoże Państwu w przeprowadzaniu dalszych eksperymentów. W przypadku jakichkolwiek wątpliwości prosimy o kontakt. Życzymy owocnej pracy i powodzenia.

chromosomal-spread-preparation-human-embryonic-stem-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie rozmazów chromosomowych ludzkich komórek macierzystych zarodkowych do karyotypowania

Różnicowanie ESC zbiega się z charakterystycznymi dla danego typu komórek zmianami w strukturze i składzie chromatyny. Wykrycie tych zmian dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów definiujących pluripotencję oraz różnicowanie komórek. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi wartościową metodę analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek macierzystych. <br...

Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Spektralne kariotypowanie (SKY) jest zaawansowaną techniką cytogenetyczną służącą do identyfikacji aberracji genomicznych i chromosomalnych. Technika ta wykorzystuje sondy do malowania chromosomów, które umożliwiają klasyfikację wszystkich chromosomów. SKY pozwala również na identyfikację złożonych aberracji chromosomalnych oraz wad segregacji u myszy i ludzi z różnymi schorzeniami, w tym z wielotorbielkową chorobą nerek.

Kariotypowanie spektralne w badaniu nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielkowatą chorobą nerek

Chromosomy mogą być izolowane z żywych komórek, takich jak limfocyty czy fibroblasty skóry, oraz z organizmów, w tym ludzi i myszy. Te preparaty chromosomowe mogą być dalej wykorzystywane do rutynowych prążków G i procedur cytogenetyki molekularnej, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY).

Przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Reporterowe linie komórkowe oferują sposób na wizualizację, śledzenie i izolowanie interesujących komórek z heterogenicznych populacji. Jednak celowanie w geny za pomocą konwencjonalnej rekombinacji homologicznej w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych jest wyjątkowo nieefektywne. W tym miejscu opisujemy celowanie w locus czynnika transkrypcyjnego PITX3 specyficznego dla OUN za pomocą EGFP przy użyciu rekombinacji homologicznej wzmocnionej nukleazą palca cynkowego.

Ukierunkowanie genów na nukleazę palca cynkowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Chociaż proliferacyjne komórki poliploidalne są niezbędne do analizy niestabilności chromosomalnej komórek poliploidalnych, tworzenie takich komórek z nieprzekształconych komórek ludzkich nie jest łatwe. Niniejszy raport opisuje stosunkowo proste procedury tworzenia proliferacyjnych komórek tetraploidalnych wolnych od diploidalnej populacji z normalnych ludzkich fibroblastów.

Tworzenie proliferacyjnych komórek tetraploidalnych z nietransformowanych ludzkich fibroblastów

Mejoza to proces rozwojowy, w którym gamety są formowane przez pojedynczą rundę replikacji DNA i dwie kolejne rundy segregacji chromosomów. Mejozę ssaków można zbadać, wykorzystując technikę przygotowania mejotycznych rozsiewów chromosomów. W tym miejscu przedstawiono metodę przygotowania jąder rozsianych powierzchniowo ze spermatocytów myszy.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów myszy

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Poznaj metodę przygotowania rozprzestrzenień chromosomowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do kariotypowania. Protokół umożliwia monitorowanie integralności genetycznej komórek w kulturze.

Przygotowanie rozprzestrzenionego preparatu chromosomów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do analizy kariotypu

Przeglądaj więcej filmów