Name: Zastosowanie zestawu do wykrywania fluorescencyjnego proteazy w celu określenia aktywności proteazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-04T16:40:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj metodę fluorometrycznego oznaczania aktywności proteaz za pomocą zestawu z substratem kazeiny znakowanej FITC. Technika umożliwia wykrywanie śladowych zanieczyszczeń proteaz w próbkach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Instrukcje przygotowania
Bufor inkubacyjny, bufor do analizy oraz 0,6 N roztwór TCA są dostarczane jako gotowe do użycia roztwory.
Podłoże FITC-Kazeina – zaleca się rozdzielenie podłoża FITC-Kazeina na mniejsze aletikoty po otrzymaniu produktu, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Jeśli podłoże FITC-Kazeina zostanie poddane wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania, nastąpi niewielki wzrost tła, co obniży czułość analizy. Alikwoty należy przechowywać w temperaturze -20 °C, chroniąc je przed światłem. Każda reakcja z próbką, próbą jałową lub kontrolą wymaga 20 μl podłoża FITC-Kazeina. Zamrażanie i rozmrażanie, a także intensywne mieszanie lub wstrząsanie mogą spowodować oddzielenie FITC od kazeiny, co doprowadzi do uzyskania wyższych odczytów tła oraz zmniejszenia ilości podłoża dostępnego do rozszczepienia przez proteazę.
Roztwór kontrolny izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) – kontrolę FITC można zrekonstytuować w buforze do analizy (Assay Buffer) do odpowiedniego stężenia. Roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i chronić przed światłem.
Przygotowanie końcowego Roztworu Kontrolnego Trypsyny – do fiolki z Trypsin, Protease Control (kod produktu T 6567) dodać 100 μl 1 mM HCl. Krótko wymieszać, aby upewnić się, że trypsyna została rozpuszczona. Dodać 900 μl Buforu Inkubacyjnego i dokładnie wymieszać. Ewentualnie do analizy można zastosować inne bufory. Końcowe stężenie robocze trypsyny wynosi 20 μg/μl. W celu przygotowania Roztworu Kontrolnego Trypsyny należy połączyć alikwot zakwaszonego roztworu trypsyny z odpowiednią ilością Buforu Inkubacyjnego (1 część zakwaszonej trypsyny na 9 części buforu). Przechowywanie trypsyny w warunkach kwasowych zwiększa jej stabilność. Roztwór kontrolny trypsyny jest wrażliwy na temperaturę i nie jest stabilny przy niskich stężeniach. Prosimy o zapoznanie się z biuletynem technicznym zestawu w zakresie przechowywania i stabilności tych przygotowanych roztworów.
Procedura
<ol>
<li>Najłatwiej jest przygotować kontrole, próbki ślepe i próbki badawcze jednocześnie. Do każdej próbki badawczej dodaj 20 μl Buforu Inkubacyjnego, 20 μl Substratu FITC-Kazeina oraz 10 μl próbki badawczej do probówki do mikrocentryfugi. W przypadku próbek o wysokiej aktywności proteazy może być wymagane ich rozcieńczenie.</li>
<li>Przygotuj odpowiednie próbki kontrolne (patrz Próbki Kontrolne), dodając 20 μl Buforu Inkubacyjnego, 20 μl Substratu FITC-Kazeina oraz 10 μl próbki kontrolnej do probówki do mikrocentryfugi.</li>
<li>Przygotuj próbkę ślepą, dodając 20 μl Buforu Inkubacyjnego, 20 μl Substratu FITC-Kazeina oraz 10 μl wody ultrapure do probówki do mikrocentryfugi.</li>
<li>Delikatnie wymieszaj zawartość każdej probówki i inkubuj w temperaturze 37 °C w ciemności przez 60 minut. Należy unikać zbyt energicznego mieszania, ponieważ nadmierna turbulencja może spowodować wysokie tło fluorescencyjne i zmniejszyć czułość testu. Uwaga: Czas inkubacji można wydłużyć do 24 godzin w celu zwiększenia czułości. Należy jednak uważać, aby nie przekroczyć 24 godzin, ponieważ FITC-Kazeina może zacząć ulegać degradacji, co prowadzi do wysokiego tła fluorescencyjnego.</li>
<li>Po inkubacji dodaj 150 μl 0,6 N Roztworu Kwasu Trichlorooctowego do każdej probówki do mikrocentryfugi. TCA jest substancją silnie żrącą i należy z nią pracować w odpowiednim sprzęcie ochronnym.</li>
<li>Delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 °C w ciemności przez 30 minut.</li>
<li>Wiruj probówki przez 10 minut przy 10,000 x g. Nadosad zawiera rozpuszczalne w kwasie fragmenty znakowane FITC i służy do pomiaru fluorescencji.</li>
</ol>
Pomiary fluorescencji
Metody te można skalować w zależności od wymagań dotyczących dostępnej aparatury. W celu porównania z krzywą standardową przygotowaną z odpowiednich próbek kontrolnych, należy od wartości każdej próbki badawczej (FLUtest) odjąć odczyt fluorescencji próbki ślepej (FLUblank).
Kuwety
<ol>
<li>Do odpowiedniej kuwety pipetować 10 μl supernatantu (krok 7) oraz 1 ml buforu do analizy (Assay Buffer), a następnie delikatnie wymieszać. Uwaga: Roztwór supernatantu i buforu do analizy można przechowywać w ciemności w temperaturze 2-8 °C przez maksymalnie 24 godziny przed pomiarem fluorescencji.</li>
<li>Zarejestrować natężenie fluorescencji przy wzbudzeniu przy 485 nm i monitorowaniu długości fali emisji 535 nm.</li>
</ol>
Płytki wielodołkowe
<ol>
<li>Do odpowiedniej probówki lub fiolki pipetować 10 μl supernatantu (krok 7) oraz 1 ml buforu do testu (Assay Buffer), a następnie delikatnie wymieszać. Uwaga: Roztwór supernatantu i buforu do testu można przechowywać w ciemności w temperaturze 2-8 °C do 24 godzin przed pomiarem fluorescencji.</li>
<li>Przenieść 200 μl do dołka czarnej płytki 96-dołkowej. Zmierzyć intensywność fluorescencji przy wzbudzeniu 485 nm i monitorowaniu długości fali emisji 535 nm. 
Lub</li></ol><ol>
<li>Do dołka czarnej płytki 96-dołkowej pipetować 2 μl supernatantu (krok 7) oraz 200 μl buforu do analizy (Assay Buffer). Uwaga: Roztwór supernatantu i buforu do analizy można przechowywać w ciemności w temperaturze 2-8 °C przez maksymalnie 24 godziny przed pomiarem fluorescencji.</li>
<li>Zarejestrować natężenie fluorescencji przy wzbudzeniu przy 485 nm i monitorowaniu długości fali emisji 535 nm.</li>
</ol>
Próbki kontrolne
Roztwór kontrolny trypsyny może być wykorzystany do potwierdzenia prawidłowego przebiegu analizy, wyznaczenia granicy wykrywalności lub stworzenia ogólnej krzywej wzorcowej. W przypadku analizy innej, specyficznej proteazy, zaleca się przygotowanie roztworu kontrolnego zawierającego tę specyficzną proteazę w odpowiednim buforze inkubacyjnym.
Granica wykrywalności testu to ilość proteazy, która generuje znaczący odczyt fluorescencji powyżej wartości uzyskanej dla próbki ślepej. Granica wykrywalności będzie różnić się w zależności od czułości aparatury. Do przygotowania roztworów kontrolnych można wykorzystać rozcieńczenia seryjne roztworu kontrolnego trypsyny.
Za istotny uznaje się odczyt równy 120% wartości uzyskanej dla próby ślepej. Przy zastosowaniu tej procedury rutynowo uzyskiwano granicę wykrywalności na poziomie 5 ng trypsyny. Zaleca się, aby w każdym teście przeprowadzić kontrolę z użyciem co najmniej 5 ng trypsyny. Roztwór kontrolny trypsyny o stężeniu 0,5 μg/ml pozwoli na uzyskanie wymaganych 5 ng trypsyny w teście. 40-krotne rozcieńczenie roztworu kontrolnego trypsyny (20 μg/ml) pozwala na przygotowanie roztworu kontrolnego o stężeniu 0,5 μg/ml, tj. jednej części roztworu kontrolnego trypsyny na 39 części buforu inkubacyjnego.
<img src="/files/ftp_upload/1514/figure1.jpg" alt="Typowa krzywa aktywności trypsyny; wykres jednostek fluorescencji w funkcji stężenia trypsyny." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1 (Krzywa wzorcowa aktywności trypsyny): Roztwór kontrolny trypsyny (20 μg/ml) może być również wykorzystany do sporządzenia krzywej wzorcowej poprzez wykonanie rozcieńczeń seryjnych (patrz Rysunek 1). Odczyt fluorescencji każdej próbki kontrolnej skorygowano poprzez odjęcie odczytu fluorescencji próbki ślepej (FLUblank) od wartości każdej próbki kontrolnej (FLUcontrol).
Typowa krzywa wzorcowa dla trypsyny (kod produktu T 6567) z wykorzystaniem tego zestawu i próbek kontrolnych w zakresie od 0,15 μg/ml (1,5 ng) do 2,5 μg/ml (25 ng). Krzywa ta została wygenerowana zgodnie z opisaną procedurą, z czasem inkubacji wynoszącym 30 minut w kroku 4. Pomiary fluorescencji wykonano na płytce wielodołkowej.
Izotiocyjanian fluoresceiny służy jako kontrola do ewentualnej kalibracji urządzenia (patrz odpowiednie instrukcje producenta) lub do określenia zakresu liniowości sygnału FITC.

<ol><li>Twining, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Casein+Assay+for+Proteolytic+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes.</a> Anal. Biochem. 143, 30-34 (1984).</li>
</ol>

Autor jest pracownikiem firmy Sigma Aldrich, która produkuje odczynniki i narzędzia wykorzystane w niniejszym artykule.

Właśnie zaprezentowaliśmy przykładowy test z wykorzystaniem zestawu Protease Fluorescent Detection Kit do wykrywania aktywności proteaz w próbce biologicznej. Zestaw ten został zoptymalizowany do wykrywania szerokiego zakresu proteaz występujących w zastosowaniach fizjologicznych. Nadaje się on do wykrywania proteaz serynowych, cysteinowych, metaloproteaz oraz proteaz aspartylowych; jednak w przypadku wykrywania niektórych specyficznych proteaz mogą być wymagane modyfikacje.

<table><tbody><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=PF0100%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Zestaw do fluorescencyjnego wykrywania proteaz&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=H1758%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Kwas solny&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie zestawu do fluorescencyjnego wykrywania proteaz w celu oznaczenia aktywności proteazy

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Zestaw do fluorescencyjnego wykrywania proteaz zawiera gotowe do użycia odczynniki do wykrywania aktywności proteaz. Ten prosty test wykrywania aktywności proteaz wykorzystuje kazeinę znakowaną izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) jako substrat.
Aktywność proteazy prowadzi do rozszczepienia znakowanej FITC kazeiny (substratu) na mniejsze fragmenty, które nie wytrącają się w warunkach kwasowych. Po inkubacji próbki proteazy z substratem, reakcję zakwasza się poprzez dodanie kwasu trójchlorooctowego (TCA). Następnie mieszaninę poddaje się wirowaniu, w wyniku czego nierozłożony substrat tworzy osad, a mniejsze, rozpuszczalne w kwasie fragmenty pozostają w roztworze. Nadsadczyn neutralizuje się, a następnie mierzy fluorescencję fragmentów znakowanych FITC.
Opisana procedura zestawu pozwala na wykrycie kontrolnej proteazy trypsyny w stężeniu około 0,5 μg/ml (do analizy dodano 5 ng trypsyny). Czułość tę można zwiększyć poprzez wydłużenie czasu inkubacji do 24 godzin. Analizę przeprowadza się w probówkach do mikrocentryfugi, a procedury obejmują detekcję fluorescencyjną z wykorzystaniem kuwet lub płytek wielodołkowych.

Zestaw do fluorescencyjnego wykrywania proteaz został opracowany do pomiaru aktywności proteaz metodą fluorometrii. Nadaje się on również do wykrywania śladowych ilości zanieczyszczeń proteazami. Metoda opiera się na proteolitycznej hydrolizie opatentowanej formulacji substratu kazeinowego znakowanego FITC.

Zastosowanie zestawu do fluorescencyjnego wykrywania proteaz w celu oznaczenia aktywności proteazy

Zestaw do fluorescencyjnej detekcji proteaz zawiera gotowe do użycia odczynniki służące do wykrywania aktywności proteaz. Ten prosty test do detekcji ...

Protokół ten rozpoczyna się od dodania buforu inkubacyjnego, roztworu kazeiny FXI oraz próbki zawierającej badaną proteazę do probówki do mikrocentryfugi, a następnie delikatnego wymieszania i inkubacji w temperaturze 37 °C przez 60 minut w ciemności. Aby zatrzymać reakcję proteolityczną po zakończeniu okresu inkubacji, należy dodać roztwór TCA, delikatnie wymieszać i ponownie inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności. Krok ten spowoduje wytrącenie nierakiwnego substratu.Wiruj próbkę przez 10 minut przy 10 000 Gs. Usuń nadsącz zawierający fragmenty FXI znakowane, rozpuszczalne w kwasie. Przenieś nadsącz do probówki lub wielodołkowej płytki, rozcieńcz buforem do analizy i odczytaj wynik próbki na fluorymetrze.Witam, nazywam się Carrie Cup Vineyard i jestem naukowcem w zakładzie Sigma Aldridge DeKalb w St. Louis w stanie Missouri. Dzisiaj zaprezentuję procedurę fluorometrycznego oznaczania aktywności proteazy. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium kontroli jakości do oznaczania niskiej aktywności proteazy.Zacznijmy zatem. W tej procedurze bufor inkubacyjny, bufor do analizy oraz 0,6 N roztwór kwasu trichlorooctowego (TCA) są dostarczone jako roztwory gotowe do użycia. Rozdziel roztwór fite oznaczony jako Cain na mniejsze objętości i przechowuj w temperaturze -20 °C. Należy pamiętać o ochronie przed światłem, używając bursztynowych fiolek lub owijając przezroczyste probówki folią aluminiową.Stosowanie podłoża fite Cain minimalizuje konieczność wielokrotnego zamrażania i rozmrażania; powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania lub intensywne wstrząsanie bądź mieszanie fite Cain mogą doprowadzić do oddzielenia fite od Cain, co skutkuje wyższym tłem. W przypadku kalibracji fluorometru lub wyznaczania zakresu liniowego dla sygnału fit, należy przygotować roztwór kontrolny fit. Przygotuj świeży roztwór, przeprowadzając rekonstytucję w buforze do analizy do odpowiedniego stężenia.Po przygotowaniu należy chronić roztwór przed światłem. Na koniec należy przygotować kontrolę proteazy trypsyny, dodając 100 µL 1 mM kwasu solnego do fiolki z liofilizowaną trypsyną, a następnie krótko wymieszać, aby upewnić się, że trypsyna jest rozpuszczona. Przechowywanie trypsyny w warunkach kwasowych zwiększa jej stabilność.Należy pamiętać, że roztwór kontrolny trypsyny jest wrażliwy na temperaturę i nie jest stabilny w niskich stężeniach. Następnie należy przystąpić do przygotowania wszystkich próbek do analizy, w tym próbek badawczych, kontrolnych oraz ślepych, stosowanych w trakcie całego testu. Każdą próbkę badawczą należy chronić przed światłem.W probówce do mikrocentryfugi połączyć 20 µL buforu inkubacyjnego, 20 µL substratu fit c kian oraz 10 µL próbki badawczej. Można zastosować przezroczystą probówkę do mikrocentryfugi, pod warunkiem że próbka będzie inkubowana w ciemności. Należy również pamiętać, że próbki badawcze o wysokiej aktywności proteazy będą wymagały rozcieńczenia.Próbka kontrolna trypsyny służy jako kontrola dodatnia potwierdzająca prawidłowe działanie analizy w celu określenia granicy wykrywalności lub stworzenia ogólnej krzywej wzorcowej. Aby przygotować kontrolę trypsyny, należy połączyć jedną część zakwaszonej trypsyny z dziewięcioma częściami buforu inkubacyjnego lub buforu użytego do próbek testowych i dokładnie wymieszać. Końcowe stężenie robocze trypsyny wynosi 20 µg/mL. W przypadku użycia innej specyficznej proteazy, należy przygotować roztwór kontrolny z tą konkretną proteazą i odpowiednim buforem.Kontynuuj przygotowywanie próbki kontrolnej, łącząc 20 µL buforu inkubacyjnego, 20 µL substratu fz cain oraz 10 µL kontroli trypsyny w probówce do mikrocentryfugi. Zaleca się przeprowadzenie co najmniej jednej próbki kontrolnej zawierającej 5 ng trypsyny przy każdym teście lub zastosowanie rozcieńczeń seryjnych. Ostatnią próbką jest ślepa próba, przygotowana poprzez połączenie 20 µL buforu inkubacyjnego, 20 µL substratu Fitz Caine i 10 µL wody ultrapurej w probówce do mikrocentryfugi.Po przygotowaniu trzech rodzajów próbek, delikatnie wymieszaj każdą probówkę i inkubuj w temperaturze 37 °C w ciemności przez 60 minut. Należy uważać, aby nie mieszać zbyt intensywnie, ponieważ nadmierna turbulencja może spowodować wysokie tło fluorescencyjne i obniżyć czułość analizy. W celu zwiększenia czułości można inkubować próbki do 24 godzin, jednak nie zaleca się dłuższego inkubowania, ponieważ kazeina FXI może zacząć ulegać degradacji.Ponownie, aby zapobiec wysokiemu tłu fluorescencyjnemu po zakończeniu inkubacji, stosując odpowiedni sprzęt ochronny, należy dodać 150 µL roztworu TCA do każdej probówki do mikrocentryfugi. Po inkubacji z TCA w probówce powinna pojawić się biała mgiełka, która stanowi wytrąconą, niestrawioną i nierozpuszczalną kazeinę; delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności przez 30 minut. Po zakończeniu inkubacji z roztworem TCA wirować probówki przez 10 minut przy 10 000 ×g w temperaturze pokojowej.Nadpływ zawiera rozpuszczalne w kwasie fragmenty fite znakowane Cain, które są wykorzystywane do pomiaru fluorescencji; należy je ostrożnie pobrać pipetą z górnej części probówki, aby do końcówki pipety nie dostał się żaden osad z pelletu, co spowodowałoby fałszywie dodatni wynik podczas następnej detekcji fluorescencyjnej. Aby zmierzyć aktywność proteazy za pomocą fluorymetru, należy połączyć 10 µL nadpływu TCA z jednym ml buforu do analizy w probówce i delikatnie wymieszać. Dodatkowo, należy rozcieńczyć standard FE do analizy, dodając 10 µL FE do jednego ml buforu do analizy. Kontrola FE oraz standard trypsyny wyznaczają poziom fluorescencji, którego próbka nie powinna przekroczyć. Roztwór nadpływu TCA i buforu do analizy można przechowywać w ciemności w temperaturze od 2 do 8 °C przez maksymalnie 24 godziny przed pomiarem fluorescencji.W przypadku pomiaru z użyciem kuwety, przenieś jeden mililitr roztworu do odpowiedniej kuwety; jeśli analizowane jest duże liczba próbek, do pozyskania danych fluorometrycznych można wykorzystać płytkę 96-dołkową oraz fluorescencyjny czytnik płytek. W tym teście izotiocyjanian fluoresceiny służy jako kontrola do ewentualnej kalibracji urządzenia. Przedstawiono tutaj reprezentacyjny zakres liniowości sygnału FS e po zastosowaniu opisanego procesu.Użycie tego zestawu z czasem inkubacji wynoszącym 30 minut w pierwszym etapie inkubacji pozwala na uzyskanie typowej krzywej wzorcowej dla trypsyny i próbek kontrolnych w zakresie od 1,5 nanogramów do 25 nanogramów. Pomiary fluorescencji wykonano na płytce wielodołkowej. Granicą wykrywalności testu jest ilość proteazy, która generuje istotny odczyt fluorescencji powyżej wartości uzyskanej dla próbki ślepej.W dzisiejszym filmie pokazaliśmy, jak użyć zestawu do oznaczania proteaz Sigma Aldridge w celu wykrycia fluorometrycznej aktywności proteaz w próbce biologicznej. Chociaż zestaw ten jest zoptymalizowany do powszechnego użytku, należy pamiętać, że w przypadku konkretnych proteaz mogą być wymagane niewielkie modyfikacje. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.

use-protease-fluorescent-detection-kit-to-determine-protease

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie zestawu do wykrywania fluorescencyjnego proteazy w celu określenia aktywności proteazy

W tym filmie wykonujemy zymografię, technikę elektroforetyczną, aby przeanalizować aktywność proteolityczną w próbkach biologicznych.

Fluorescencyjna zymografia peptydów: zmodyfikowana technika wykrywania aktywności proteazy za pomocą substratów fluorogennych w żelach zymogramowych

Ten film demonstruje test do badania proteolitycznego aktywności proteaz za pomocą peptydów fluorogennych. Proteaza rozpoznaje miejsce jego rozszczepienia na peptydzie, rozszczepiając go i oddzielając wygaszacz od fluoroforu, umożliwiając jego emisję fluorescencyjną. Sygnał fluorescencyjny jest wykrywany i analizowany w celu sprawdzenia wydajności rozszczepienia różnych wariantów peptydów.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych w celu zbadania aktywności proteolitycznej proteaz

Ten film demonstruje test in vitro do ilościowego określenia aktywności proteazy neutrofilowej seryny w próbkach plwociny. Próbka zawierająca wydzielaną proteazę jest inkubowana z fluorescencyjnym reporterem z motywem rozpoznania. Rozszczepienie motywu przez proteazę umożliwia indywidualną emisję fluorescencji przez fluorofor donorowy i akceptorowy reportera, wskazując na aktywność proteazy w próbce.

Test in vitro do pomiaru aktywności proteazy neutrofilowej seryny za pomocą reportera fluorescencyjnego

Ten film pokazuje, jak mierzyć aktywność proteasomu w różnych subkomórkowych przedziałach bocznego ciała migdałowatego z mózgów szczurów kondycjonowanych strachem i kontrolnych za pomocą testu peptydów fluorogennych. Proteasom rozszczepia substrat peptydu fluorogenicznego, uwalniając cząsteczki fluorescencyjne, które są oznaczane ilościowo za pomocą czytnika płytek w celu oceny aktywności proteasomu we frakcjach białek jądrowych i synaptycznych. Zwiększona aktywność jądrowa sugeruje zmiany w...

Pomiar aktywności proteasomu w różnych subkomórkowych przedziałach mózgu szczura

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Proteazy są ściśle regulowanymi enzymami zaangażowanymi w podstawowe procesy biologiczne, a rozregulowana aktywność proteazy napędza postęp złożonych chorób, takich jak rak. Celem tej metody jest stworzenie nanoczujników, które mierzą aktywność proteazy in vivo, wytwarzając sygnał rozszczepienia, który jest wykrywalny w moczu gospodarza i dyskryminuje chorobę.

Nanoczujniki do wykrywania aktywności proteazy in vivo w diagnostyce nieinwazyjnej

Tutaj prezentujemy szczegółową procedurę niedawno opracowanej platformy do testowania proteazy, wykorzystującej N-końcowe białko wiążące heksahistydynę/maltozę oraz rekombinowane substraty z fluorescencyjną fuzją białek przyczepione do powierzchni magnetycznych kulek agarozy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego. Przedstawiono również późniejszą analizę w żelu próbek testowych oddzielonych elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu.

Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu

Prezentujemy test rozszczepienia peptydów fluorogennych, który pozwala na szybkie badanie przesiewowe aktywności proteolitycznej proteaz na peptydach reprezentujących miejsce cięcia peptydów fuzji wirusów. Metoda ta może być również stosowana na dowolnym innym motywie aminokwasowym w sekwencji białka w celu zbadania aktywności proteazy.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół dla zmodyfikowanej techniki zymograficznej, w której peptydy fluorescencyjne są używane jako degradowalny substrat zamiast natywnych białek. Elektroforeza próbek biologicznych w fluorescencyjnych zymogramach peptydowych umożliwia wykrycie szerszego zakresu proteaz niż dotychczasowe techniki zymograficzne.

Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

Poznaj metodę fluorometrycznego oznaczania aktywności proteaz za pomocą zestawu z substratem kazeiny znakowanej FITC. Technika umożliwia wykrywanie śladowych zanieczyszczeń proteaz w próbkach biologicznych.

Zastosowanie zestawu do fluorescencyjnego wykrywania proteaz w celu oznaczenia aktywności proteazy

Przeglądaj więcej filmów