Zastosowanie zestawu do fluorescencyjnego wykrywania proteaz w celu oznaczenia aktywności proteazy

Protokół ten rozpoczyna się od dodania buforu inkubacyjnego, roztworu kazeiny FXI oraz próbki zawierającej badaną proteazę do probówki do mikrocentryfugi, a następnie delikatnego wymieszania i inkubacji w temperaturze 37 °C przez 60 minut w ciemności. Aby zatrzymać reakcję proteolityczną po zakończeniu okresu inkubacji, należy dodać roztwór TCA, delikatnie wymieszać i ponownie inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności. Krok ten spowoduje wytrącenie nierakiwnego substratu.

Wiruj próbkę przez 10 minut przy 10 000 Gs. Usuń nadsącz zawierający fragmenty FXI znakowane, rozpuszczalne w kwasie. Przenieś nadsącz do probówki lub wielodołkowej płytki, rozcieńcz buforem do analizy i odczytaj wynik próbki na fluorymetrze.

Witam, nazywam się Carrie Cup Vineyard i jestem naukowcem w zakładzie Sigma Aldridge DeKalb w St. Louis w stanie Missouri. Dzisiaj zaprezentuję procedurę fluorometrycznego oznaczania aktywności proteazy. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium kontroli jakości do oznaczania niskiej aktywności proteazy.

Zacznijmy zatem. W tej procedurze bufor inkubacyjny, bufor do analizy oraz 0,6 N roztwór kwasu trichlorooctowego (TCA) są dostarczone jako roztwory gotowe do użycia. Rozdziel roztwór fite oznaczony jako Cain na mniejsze objętości i przechowuj w temperaturze -20 °C. Należy pamiętać o ochronie przed światłem, używając bursztynowych fiolek lub owijając przezroczyste probówki folią aluminiową.

Stosowanie podłoża fite Cain minimalizuje konieczność wielokrotnego zamrażania i rozmrażania; powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania lub intensywne wstrząsanie bądź mieszanie fite Cain mogą doprowadzić do oddzielenia fite od Cain, co skutkuje wyższym tłem. W przypadku kalibracji fluorometru lub wyznaczania zakresu liniowego dla sygnału fit, należy przygotować roztwór kontrolny fit. Przygotuj świeży roztwór, przeprowadzając rekonstytucję w buforze do analizy do odpowiedniego stężenia.

Po przygotowaniu należy chronić roztwór przed światłem. Na koniec należy przygotować kontrolę proteazy trypsyny, dodając 100 µL 1 mM kwasu solnego do fiolki z liofilizowaną trypsyną, a następnie krótko wymieszać, aby upewnić się, że trypsyna jest rozpuszczona. Przechowywanie trypsyny w warunkach kwasowych zwiększa jej stabilność.

Należy pamiętać, że roztwór kontrolny trypsyny jest wrażliwy na temperaturę i nie jest stabilny w niskich stężeniach. Następnie należy przystąpić do przygotowania wszystkich próbek do analizy, w tym próbek badawczych, kontrolnych oraz ślepych, stosowanych w trakcie całego testu. Każdą próbkę badawczą należy chronić przed światłem.

W probówce do mikrocentryfugi połączyć 20 µL buforu inkubacyjnego, 20 µL substratu fit c kian oraz 10 µL próbki badawczej. Można zastosować przezroczystą probówkę do mikrocentryfugi, pod warunkiem że próbka będzie inkubowana w ciemności. Należy również pamiętać, że próbki badawcze o wysokiej aktywności proteazy będą wymagały rozcieńczenia.

Próbka kontrolna trypsyny służy jako kontrola dodatnia potwierdzająca prawidłowe działanie analizy w celu określenia granicy wykrywalności lub stworzenia ogólnej krzywej wzorcowej. Aby przygotować kontrolę trypsyny, należy połączyć jedną część zakwaszonej trypsyny z dziewięcioma częściami buforu inkubacyjnego lub buforu użytego do próbek testowych i dokładnie wymieszać. Końcowe stężenie robocze trypsyny wynosi 20 µg/mL. W przypadku użycia innej specyficznej proteazy, należy przygotować roztwór kontrolny z tą konkretną proteazą i odpowiednim buforem.

Kontynuuj przygotowywanie próbki kontrolnej, łącząc 20 µL buforu inkubacyjnego, 20 µL substratu fz cain oraz 10 µL kontroli trypsyny w probówce do mikrocentryfugi. Zaleca się przeprowadzenie co najmniej jednej próbki kontrolnej zawierającej 5 ng trypsyny przy każdym teście lub zastosowanie rozcieńczeń seryjnych. Ostatnią próbką jest ślepa próba, przygotowana poprzez połączenie 20 µL buforu inkubacyjnego, 20 µL substratu Fitz Caine i 10 µL wody ultrapurej w probówce do mikrocentryfugi.

Po przygotowaniu trzech rodzajów próbek, delikatnie wymieszaj każdą probówkę i inkubuj w temperaturze 37 °C w ciemności przez 60 minut. Należy uważać, aby nie mieszać zbyt intensywnie, ponieważ nadmierna turbulencja może spowodować wysokie tło fluorescencyjne i obniżyć czułość analizy. W celu zwiększenia czułości można inkubować próbki do 24 godzin, jednak nie zaleca się dłuższego inkubowania, ponieważ kazeina FXI może zacząć ulegać degradacji.

Ponownie, aby zapobiec wysokiemu tłu fluorescencyjnemu po zakończeniu inkubacji, stosując odpowiedni sprzęt ochronny, należy dodać 150 µL roztworu TCA do każdej probówki do mikrocentryfugi. Po inkubacji z TCA w probówce powinna pojawić się biała mgiełka, która stanowi wytrąconą, niestrawioną i nierozpuszczalną kazeinę; delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności przez 30 minut. Po zakończeniu inkubacji z roztworem TCA wirować probówki przez 10 minut przy 10 000 ×g w temperaturze pokojowej.

Nadpływ zawiera rozpuszczalne w kwasie fragmenty fite znakowane Cain, które są wykorzystywane do pomiaru fluorescencji; należy je ostrożnie pobrać pipetą z górnej części probówki, aby do końcówki pipety nie dostał się żaden osad z pelletu, co spowodowałoby fałszywie dodatni wynik podczas następnej detekcji fluorescencyjnej. Aby zmierzyć aktywność proteazy za pomocą fluorymetru, należy połączyć 10 µL nadpływu TCA z jednym ml buforu do analizy w probówce i delikatnie wymieszać. Dodatkowo, należy rozcieńczyć standard FE do analizy, dodając 10 µL FE do jednego ml buforu do analizy. Kontrola FE oraz standard trypsyny wyznaczają poziom fluorescencji, którego próbka nie powinna przekroczyć. Roztwór nadpływu TCA i buforu do analizy można przechowywać w ciemności w temperaturze od 2 do 8 °C przez maksymalnie 24 godziny przed pomiarem fluorescencji.

W przypadku pomiaru z użyciem kuwety, przenieś jeden mililitr roztworu do odpowiedniej kuwety; jeśli analizowane jest duże liczba próbek, do pozyskania danych fluorometrycznych można wykorzystać płytkę 96-dołkową oraz fluorescencyjny czytnik płytek. W tym teście izotiocyjanian fluoresceiny służy jako kontrola do ewentualnej kalibracji urządzenia. Przedstawiono tutaj reprezentacyjny zakres liniowości sygnału FS e po zastosowaniu opisanego procesu.

Użycie tego zestawu z czasem inkubacji wynoszącym 30 minut w pierwszym etapie inkubacji pozwala na uzyskanie typowej krzywej wzorcowej dla trypsyny i próbek kontrolnych w zakresie od 1,5 nanogramów do 25 nanogramów. Pomiary fluorescencji wykonano na płytce wielodołkowej. Granicą wykrywalności testu jest ilość proteazy, która generuje istotny odczyt fluorescencji powyżej wartości uzyskanej dla próbki ślepej.

W dzisiejszym filmie pokazaliśmy, jak użyć zestawu do oznaczania proteaz Sigma Aldridge w celu wykrycia fluorometrycznej aktywności proteaz w próbce biologicznej. Chociaż zestaw ten jest zoptymalizowany do powszechnego użytku, należy pamiętać, że w przypadku konkretnych proteaz mogą być wymagane niewielkie modyfikacje. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.