Zastosowanie zestawu do wykrywania fluorescencyjnego proteazy w celu określenia aktywności proteazy

Protokół ten rozpoczyna się od dodania buforu inkubacyjnego, roztworu kazeiny FXI i próbki zawierającej badaną proteazę do mikroprobówki wirówkowej, a następnie delikatnego wymieszania i inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut w ciemności. Aby zatrzymać reakcję proteolityczną pod koniec okresu inkubacji, dodaj roztwór TCA, delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut ponownie w ciemności. Ten krok spowoduje wytrącenie się niereaktywnego podłoża.

Odwirować próbkę przez 10 minut. Przy 10 000 G usunąć supernatant, który zawiera rozpuszczalne w kwasie fragmenty znakowane FXI. Przenieść supernatant do weterynarza lub płytki wielodołkowej rozcieńczonej buforem do oznaczania i odczytać próbkę na fluorymetrze.

Cześć, nazywam się Carrie Cup Vineyard i jestem naukowcem w naszym zakładzie Sigma Aldridge DeKalb w St. Louis w stanie Missouri. Dzisiaj pokażę Wam procedurę oznaczania aktywności proteazy fluorometrycznej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium kontroli jakości, aby określić niską aktywność proteazy.

Więc zacznijmy W tej procedurze bufor do inkubacji, bufor do oznaczania i 0,6 normalnego roztworu kwasu trichlorooctowego lub TCA są dostarczane jako roztwory gotowe do użycia. Roztwór fite oznaczonego jako Cain podzielić na mniejsze objętości i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Upewnij się, że chronisz przed światłem, używając bursztynowych fiolek lub owijając przezroczyste probówki w folię Ali.

Cytowanie substratu fite Cain minimalizuje potrzebę powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania lub energicznego potrząsania lub mieszania fite Cain może prowadzić do oddzielenia się fite od Cain, co skutkuje wyższym tłem. W przypadku kalibracji fluorymetru lub określania zakresu liniowego dla sygnału dopasowania e, należy przygotować roztwór kontrolny dopasowania. Przygotować świeży roztwór, odtwarzając go w buforze do oznaczania do odpowiedniego stężenia.

Gdy roztwór będzie gotowy, należy go chronić przed światłem. Na koniec przygotuj kontrolę proteazy trypyny, dodając 100 mikrolitrów jednego milimolowego kwasu solnego do fiolki liofilizowanej trypsyny i krótko wymieszaj, aby upewnić się, że trypsyna jest rozpuszczona. Przechowywanie tripsin w kwaśnych warunkach zwiększa jego stabilność.

Należy pamiętać, że roztwór kontrolny Tripsin jest wrażliwy na temperaturę i nie jest stabilny w niskich stężeniach. Następnie zacznij przygotowywać wszystkie próbki testowe, które obejmują próbki testowe oraz próbki kontrolne i ślepą próbę przez cały czas trwania testu. Próbki należy chronić przed światłem w odniesieniu do każdej próbki do badań.

Połączyć w mikroprobówce wirówkowej 20 mikrolitrów buforu inkubacyjnego, 20 mikrolitrów substratu fit c kian i 10 mikrolitrów próbki testowej. Można użyć klarownej mikrowirówki, o ile próbka jest inkubowana w ciemności. Należy również pamiętać, że próbki testowe, które mają wysoką aktywność proteazy, będą musiały zostać rozcieńczone.

Próbkę kontrolną trypiny stosuje się jako kontrolę pozytywną, którą test przeprowadza prawidłowo, w celu określenia granicy wykrywalności lub stworzenia ogólnej krzywej wzorcowej w celu przygotowania kontroli tripsyny, połączenia jednej części zakwaszonej trypsyny z dziewięcioma częściami buforu inkubacyjnego lub buforu używanego do próbek testowych i dobrze wymieszać. Końcowe stężenie robocze trypsyny wynosi 20 mikrogramów na mililitr. W przypadku stosowania innej specyficznej proteazy należy przygotować roztwór kontrolny z tą konkretną proteazą i odpowiednim buforem.

Kontynuować przygotowanie próbki kontrolnej, łącząc 20 mikrolitrów buforu inkubacyjnego, 20 mikrolitrów substratu fz kainy i 10 mikrolitrów kontroli trypsyny w probówce do mikrowirówki. Zaleca się przeprowadzenie co najmniej jednej próbki kontrolnej składającej się z pięciu nanogramów trypsyny przy każdym teście lub stosowanie rozcieńczania seryjnego. Ostatnią próbką jest ślepa próba przygotowana przez połączenie 20 mikrolitrów buforu inkubacyjnego, 20 mikrolitrów substratu Fitz Caine'a i 10 mikrolitrów ultraczystej wody w mikroprobówce wirówkowej.

Mając gotowe trzy rodzaje próbek, delikatnie wymieszaj każdą probówkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności przez 60 minut. Należy uważać, aby nie mieszać zbyt energicznie, ponieważ nadmierne turbulencje mogą powodować wysoką fluorescencję tła i zmniejszać czułość testu. Można inkubować do 24 godzin, aby zwiększyć czułość, ale dłuższe inkubacje nie są zalecane, ponieważ kazeina FXI może zacząć ulegać degradacji.

Ponownie, co prowadzi do wysokiej fluorescencji tła po zakończeniu inkubacji, należy użyć odpowiedniego sprzętu ochronnego, aby dodać 150 mikrolitrów roztworu TCA do każdej probówki mikrowirówki. Podczas inkubacji z TCA należy zauważyć białą mgiełkę obecną w probówce, która jest wytrąconą, niestrawioną i nierozpuszczalną mieszanką kainy delikatnie i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności przez 30 minut. Pod koniec inkubacji z roztworem TCA odwirować probówki przez 10 minut w temperaturze 10 000 G w temperaturze pokojowej.

Supernatant zawiera rozpuszczalne w kwasie znakowane fite fragmenty Cainy używane do pomiaru fluorescencji pipeta delikatnie od góry probówki, tak aby żaden osad z osadu nie został wciągnięty do końcówki pipety, co spowoduje fałszywie dodatni odczyt podczas następnego wykrywania fluorescencyjnego w celu zmierzenia aktywności proteazy za pomocą fluorymetru połączonego z 10 mikrolitrami supernatantu TCA z jednym mililitrem buforu testowego w probówce i delikatnie wymieszaj. Ponadto rozcieńczyć wzorzec FE do analizy, dodając 10 mikrolitrów FE do jednego mililitra buforu testowego. Wzorzec kontroli FE i tripsyny podają poziom fluorescencji, że próbka nie powinna przekraczać roztworu TC. Supernatant i bufor do oznaczania mogą być przechowywane w ciemności w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza przez okres do 24 godzin przed pomiarem fluorescencji.

W przypadku pomiaru za pomocą płytki weterynaryjnej należy przenieść jeden mililitr roztworu do odpowiedniego urządzenia do urządzenia do pomiaru fluoru, a w przypadku badania dużej liczby próbek, do uzyskania danych fluorometrycznych można użyć 96-dołkowej płytki i czytnika płytek fluorescencyjnych. W tym teście izotiocyjanian fluoresceiny jest dostarczany jako kontrola do ewentualnej kalibracji przyrządu. Pokazany tutaj jest reprezentatywny zakres liniowości sygnału FS e zgodnie z opisaną procedurą.

Użycie tego zestawu z czasem inkubacji wynoszącym 30 minut na pierwszym etapie inkubacji daje tę typową krzywą standardową dla trypsyny i próbek kontrolnych w zakresie od 1,5 nanograma do 25 nanogramów. Pomiary fluorescencji wykonano na płytce wielodołkowej. Granicą wykrywalności testu jest ilość proteazy, która powoduje znaczny odczyt fluorescencji powyżej wartości uzyskanej dla próbki ślepej.

Dzisiaj pokazaliśmy, jak używać zestawu do oznaczania proteazy Sigma Aldridge do wykrywania aktywności proteazy metrycznej Fluor w próbce biologicznej. Chociaż ten zestaw jest zoptymalizowany pod kątem Twojego użytku, ważne jest, aby pamiętać, że w przypadku konkretnych proteaz możesz potrzebować niewielkich modyfikacji. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.