Name: Transfekcja DNA mięśni szkieletowych ssaków za pomocą elektroporacji in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 56 s
Description: Poznaj metodę transfekcji DNA do mięśni szkieletowych myszy za pomocą elektroporacji in vivo. Technika umożliwia wizualizację ekspresji białek i badanie funkcji genów w żywym organizmie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr T. Otis z Katedry Neurobiologii UCLA za udostępnienie zaplecza TPLSM, dr C. Fahlke z Instytutu Fizjologii RWTH Aachen w Niemczech za przekazanie plazmidu pEYFP-ClC1 oraz panu R. Serrano za wsparcie techniczne. Praca ta była finansowana z grantów NIH/NIAMS AR047664 i AR54816.

Procedury eksperymentalne dla elektroporacji in vivo mięśni FDB i IO
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem protokołów elektroporacji in vivo, należy namnożyć plazmidy ekspresyjne ssaków, aby uzyskać stężenie w zakresie 2-5 μg plazmidu/μl w buforze TE. Uwaga: rutynowo stosujemy komercyjne zestawy do amplifikacji i postępujemy zgodnie z procedurami producenta. Komercyjne plazmidy ekspresyjne zawierające promotor CMV bardzo dobrze sprawdzają się w transfekcjach in vivo w mięśniach szkieletowych. </li>
<li>Odmierz niezbędną objętość (10-20 μl) roztworu plazmidu i przechowuj ją w dwóch probówkach Eppendorf o pojemności 0,5 ml (jedna dla każdej łapy myszy).</li>
<li>Przygotuj roztwór zawierający 2 mg/ml hialuronidazy w sterylnym roztworze Tyrode'a.</li>
<li>Używając komory anestezjologicznej, wprowadź mysz w stan głębokiej narkozy, stosując 4% izofluranu w O2 za pomocą zatwierdzonej aparatury do znieczuleń gazowych. Umieść zwierzę na podkładce grzewczej (37 °C) i utrzymuj anestezię za pomocą maski dla gryzoni. Monitoruj głębokość narkozy za pomocą odruchu zaciśnięcia palca.</li>
<li>Pod kontrolą mikroskopu sekcyjnego wstrzyknij 10 μL roztworu hialuronidazy pod poduszki łap jednej z kończyn myszy, używając sterylnej igły 33G o długości 1”. Przebij skórę w punkcie bliskim pięcie i wprowadź igłę podskórnie w kierunku podstawy palców na ok. 1/4”.</li>
<li>W razie potrzeby powtórz procedurę w drugiej łapie.</li>
<li>Odłącz aparat do znieczulenia i umieść mysz w klatce. Pozwól jej w pełni wybudzić się z narkozy.</li>
<li>Po godzinie ponownie znieczul zwierzę i umieść je na podkładce grzewczej. Postępując zgodnie z procedurą opisaną dla roztworu hialuronidazy, wstrzyknij łącznie 20-50 μg plazmidowego DNA (w zależności od wielkości konstruktu plazmidowego). Całkowita objętość wstrzykniętego roztworu powinna być mniejsza niż 20 μL/łapa. Uwaga: gdy konieczne jest podanie 15-20 μL, zaleca się zamknięcie miejsca wkłucia igły za pomocą kleju tkankowego.</li>
<li>Odłącz aparat do znieczulenia i umieść mysz w klatce. Pozwól jej w pełni wybudzić się z narkozy i odczekaj 10-15 min.</li>
<li>Znieczul zwierzę po raz trzeci i umieść je na podkładce grzewczej.</li>
<li>Wybierz jedną łapę zwierzęcia. Umieść jedną pozłacaną igłę akupunkturową pod skórą w okolicy pięty, a drugą u podstawy palców. Elektrody powinny być ustawione równolegle do siebie i prostopadle do długiej osi łapy.</li>
<li>Połącz głowice igieł (elektrody) ze stymulatorem elektrycznym za pomocą mikroklipsów. Przeprowadź elektroporację mięśni, aplikując 20 impulsów o czasie trwania 20 ms każdy, z częstotliwością 1 Hz. W zależności od rozstawu elektrod, amplitudę napięcia impulsów należy dostosować (monitorując za pomocą oscyloskopu), aby uzyskać pole elektryczne o natężeniu ~100 V/cm. Uwaga: przy odpowiednim poziomie znieczulenia nie powinny być obserwowane skurcze w odpowiedzi na bodźce. </li>
<li>W razie potrzeby powtórz powyższe procedury w przeciwległej łapie zwierzęcia.</li>
<li>Wróć zwierzę do klatki i po pełnym wybudzeniu z narkozy utrzymuj je pod obserwacją. Uwaga: jeśli procedura przebiegła prawidłowo, zwierzę powinno odzyskać pełną sprawność w ciągu 30 minut, po czym może zostać przeniesione z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt w zootechnikum. Wstrzyknięcia hialuronidazy i DNA w poduszki łap nie wywołują zauważalnych działań niepożądanych u zwierząt.
Po wybudzeniu z narkozy myszy są w stanie normalnie poruszać się po klatce. Jako dodatkową ostrożność, dodaj do wody pitnej zwierzęcia karprofen w stężeniu 0,0027 mg/ml przez 2 dni jako lek przeciwbólowy.</li>
<li>Ekspresję białka można ocenić 2-8 dni po transfekcji. Jednak w przypadku wielu białek obserwowano trwałą ekspresję przez wiele miesięcy.</li>
</ol>
UWAGA: Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Kanclerza UCLA, zgodnie z wymogami Ustawy o Dobrostanie Zwierząt (Animal Welfare Act) oraz polityki PHS w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
Reprezentatywne wyniki:
Prawidłowe przeprowadzenie opisanych powyżej procedur elektroporacji in vivo powinno skutkować efektywną transfekcją plazmidów w mięśniach FDB i IO. Należy jednak pamiętać, że wydajność ekspresji transgenicznych wariantów białek będzie zależeć od plazmidu, wielkości i złożoności białka, właściwości funkcjonalnych białka oraz szeregu innych zmiennych niezależnych od badacza. Jak pokazano na Rysunku 1 dla mięśnia FDB poddanego elektroporacji w obecności komercyjnego plazmidu (pmR-mCherry) kodującego białko mCherry , większość włókien mięśniowych została poddana transfekcji zgodnie z naszym protokołem, co potwierdza fakt, że większość z nich wykazuje czerwoną fluorescencję. Nie wyklucza to możliwości, że poszczególne włókna wykazują różny stopień ekspresji białka lub że niektóre włókna nie zostały poddane transfekcji w ogóle 3. Należy zauważyć, że efektywna ekspresja dużych ilości białek fluorescencyjnych, takich jak mCherry, EGFP, ECFP i EYFP, nie upośledza pobudliwości włókien mięśniowych ani właściwości sprzężenia wzbudzenia ze skurczem. W rzeczywistości są one nieodróżnialne od włókien w mięśniach poddanych transfekcji pozornej (wyniki nie pokazane).
Praktyczne podejścia stosowane w celu weryfikacji lokalnej ekspresji białek znakowanych fluorescencyjnie w włóknach mięśni szkieletowych.
Wewnątrzkomórkową lokalizację białek transgenicznych wyrażanych di novo rutynowo ocenia się poprzez jednoczesne pozyskiwanie, przy użyciu TPLSM, obrazów fluorescencyjnych odpowiednich znaczników oraz obrazów dobrze zidentyfikowanych markerów struktur komórkowych. Najbardziej typowe z tych ostatnich to: a) obrazy generacji drugiej harmonicznej (SHG), wynikające z anizotropii miozyny w pasmach A sarkomerów (wycentrowanych w liniach M)9,10 oraz b) obrazy fluorescencyjne di-8-ANEPPS, które można uzyskać poprzez znakowanie powierzchni oraz błon systemu kanalików poprzecznych (kanalików T) włókien mięśniowych tym nieprzenikalnym barwnikiem potencjometrycznym11. Na obrazach fluorescencyjnych włókien mięśniowych barwionych di-8-ANEPPS kanaliki T jawią się jako wąskie pasma fluorescencji zorientowane niemal prostopadle do długiej osi włókna. Pasma te są rozmieszczone nierównomiernie: dzieli je długi odcinek rozciągający się przez linie M oraz krótki odcinek rozciągający się przez linię Z11.
Ekspresja i lokalizacja α-actinin-EGFP w włóknach mięśni szkieletowych.
Przykład ekspresji wariantu z etykietą białka strukturalnego mięśni α-aktyniny przedstawiono na Rycynie 2. Białko to jest znane jako główny składnik linii Z i w związku z tym jest rutynowo stosowane jako marker tej struktury12. Przeprowadziliśmy transfekcję mięśni FDB i IO plazmidem pEGFPN1-α-actinin1 kodującym ludzką (pozaprzekładkową) α-aktyninę z etykietą EGFP na C-końcu. Sześć dni po transfekcji stwierdzono, oceniając rozmieszczenie fluorescencji EGFP, że α-aktynina jest wyrażana głównie w postaci wąskich pasm rozmieszczonych równomiernie wzdłuż osi włókna. Widoczny jest pojedynczy pas na sarkomer (Ryciny 2A i 2D). Kolokalizacja tych pasm z liniami Z została wykazana poprzez porównanie rozkładu fluorescencji EGFP z obrazami SHG (Rycina 2B) oraz di-8-ANEPPS (Rycina 2E). Jak pokazano na obrazie nakładkowym (Rycina 2C), pasma α-aktyniny-EGFP przeplatają się z pasmami SHG, co wskazuje, że znajdują się one w połowie drogi między dwoma kolejnymi pasmami M, pokrywając się z położeniem linii Z. W przetransfekowanych włóknach mięśniowych barwionych di-8-ANEPPS pasma α-aktyniny-EGFP są widoczne w centrum każdej pary kanalików T (Rycina 2F), które wiadomo, że flankują linie Z (tj. są oddalone o krótszy dystans), co wskazuje na ukierunkowanie transgenicznej α-aktyniny do linii Z.
Ekspresja DHPRα1s z tagiem EGFP na N-końcu
Wydajność transfekcji mięśni wektorem pEGFPC1.1-DHPR α1s została zweryfikowana na obrazach TPLSM (np. rysunek 3A), które wykazują, że większość włókien wykazuje ekspresję EGFP-DHPRα1s (białka błonowego). Najbardziej charakterystyczną cechą transfekowanych włókien jest dwupasmowy wzór fluorescencji EGFP (rysunki 3A i 3B), co jest zgodne z oczekiwaniami w przypadku białka skierowanego do kanalików T. Na rysunku 3 można również zauważyć, że mimo różnego poziomu intensywności fluorescencji w zależności od włókna, pasmowy wzór fluorescencji poszczególnych włókien wydaje się być jednorodny na całej ich długości. Przy większym powiększeniu (rysunek 3B) wyraźnie widać, że nierównomierne odstępy między pasmami są podobne do tych zaobserwowanych we włóknach barwionych di-8-ANEPPS (np. rysunek 2E). Obrazy nałożone (rysunek 3B i 3E) ilustrują, że pasma SHG znajdują się w większych odstępach między pasmami EGFP-DHPRα1s, co potwierdza obecność tego białka w kanalikach T. Dodatkowe pomiary FRET z wykorzystaniem niefluorescencyjnego lipofilnego anionu DPA- (dane niepokazane) dodatkowo wykazują, że część EGFP znajduje się w odległości kilku nanometrów od wewnętrznej warstwy błon kanalików T.
Lokalizacja i ocena funkcjonalna ekspresji EYFP-ClC1
Włókna przetransfekowane pEYFP-ClC1, które koduje konstrukt z EYFP (na N-końcu) kanału chlorkowego mięśni szkieletowych (ClC1), wykazują pasma fluorescencji EYFP (Rysunek 4A) o wzorze podobnym do tego, który zaobserwowano dla ekspresji EGFP-DHPRα1s (Rysunek 3A) i odpowiadającym układowi kanalików poprzecznych, zilustrowanemu barwieniem di-8-ANEPPS (Rysunek 2E). Zgodnie z oczekiwaniami, nałożenie obrazów EYFP-ClC1 (Rysunek 4A) i SHG (Rysunek 4B), przedstawione na obrazie złożonym (Rysunek 4C), pokazuje, że pasma SHG są centrycznie położone w szerokich odstępach pomiędzy pasmami fluorescencji EYFP.
Aby ocenić, czy ekspresja EYFP-ClC1 prowadzi do znaczącego wzrostu przewodnictwa spoczynkowego włókien mięśniowych, co jest oczekiwane w przypadku nadekspresji funkcjonalnych kanałów chlorkowych, poddano włókna mięśniowe z przetransfekowanego mięśnia FDB dysocjacji enzymatycznej, a następnie badano ich właściwości elektrofizjologiczne przy użyciu dwumikroelektrodowego układu eksperymentalnego opisanego wcześniej6,11,13. Rysunek 5 przedstawia wyniki z dwóch włókien: jedno wykazuje dużą ilość EYFP-ClC1, co oceniono na podstawie pomiarów całkowitej intensywności fluorescencji w standardowym mikroskopie fluorescencyjnym (nie pokazano), natomiast drugie stanowi kontrolę nietransfekowaną. Zapis napięcia na Rysunku 5A (uzyskany z włókna mięśniowego wykazującego ekspresję EYFP-ClC1) pokazuje, że ze względu na nadmierne przewodnictwo spoczynkowe włókno jest niemal niewzbudliwe. W celu wywołania bardzo słabej odpowiedzi aktywnej (brak przestrzału, Rysunek 5A) konieczne było zastosowanie impulsów stymulujących prądem do 400 nA (0,5 ms). Po zastąpieniu zewnętrznego roztworu Tyrodego roztworem zawierającym 500 μM blokera kanałów chlorkowych 9-ACA, impulsy prądowe o natężeniu 200 nA były wystarczające do wywołania potencjału czynnościowego (Rysunek 5B), choć znacznie wolniejszego i szerszego niż te zarejestrowane w włóknie kontrolnym (Rysunek 5C). Zgodnie z oczekiwaniami, dodatek 9-ACA miał minimalny wpływ na to włókno kontrolne (Rysunek 5D).
<img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="Obrazy SHG i Di-8-ANEPPS, schemat włókna mięśniowego, wzbudzenie optyczne, analiza spektroskopowa." border="0" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Wydajność transfekcji metodą elektroporacji in-vivo. Obrazy w świetle przechodzącym (A) i fluorescencyjne (B) mięśnia FDB poddanego transfekcji pmR-mCherry. Liczba dni po protokole elektroporacji: 12 dni. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.
<img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna: znakowanie EGFP, SHG, Di-8-ANEPPS, nałożenie struktury białka." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Ekspresja i celowanie α-actininy-EGFP w włóknach FDB. Panele A i B przedstawiają odpowiednio obrazy fluorescencyjne EGFP oraz SHG włókna wykazującego ekspresję α-actininy-EGFP. Panel C przedstawia superpozycję obrazów z paneli A i B. Panele D i E przedstawiają odpowiednio obrazy fluorescencyjne innego włókna wykazującego ekspresję α-actininy-EGFP oraz włókna barwionego di-8-ANEPPS. Panel F przedstawia superpozycję obrazów z paneli D i E. Liczba dni po protokole elektroporacji: 6 dni.
<img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna EGFP-α1s-DHPR, obrazowanie SHG, analiza nałożenia z powiększeniem włókien mięśniowych." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Ekspresja i celowanie EGFP-DHPRα1s we włóknach FDB. Panel A: obraz fluorescencji EGFP grupy włókien wykazujących ekspresję EGFP-DHPRα1s. Panel B: powiększenie obszaru zaznaczonego kwadratem w panelu A w celu lepszego zobrazowania pasmowego wzorca ekspresji białka. Panel C: obraz SHG odpowiadający obrazowi w panelu A. Panel D: nałożenie obrazów A i C. Panel E: powiększenie obszaru wskazanego w panelu D. Dni po protokole elektroporacji: 20 dni. 
<img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe włókien mięśniowych oraz wykres zależności natężenia światła od odległości dla analizy białka." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Ekspresja i lokalizacja EYFP-ClC1 we włóknach mięśnia zginacza głębokiego palców (FDB). Panele A i B przedstawiają odpowiednio fluorescencję EYFP oraz obrazy SHG włókien wykazujących ekspresję EYFP-ClC1. Panel C przedstawia superpozycję obrazów z paneli A i B. Panel D przedstawia profil natężenia zmierzony wzdłuż białej linii zaznaczonej na obrazie w panelu C. Liczba dni po protokole elektroporacji: 7 dni.
<img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt='&lt;a href="https://europepmc.org/article/MED/20018887"&gt;Wykresy eksperymentu patch-clamp: Vm w czasie dla komórek transfekowanych i kontrolnych z zastosowaniem roztworu Tyroda/9-ACA.&lt;/a&gt;' data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5. Ocena elektrofizjologiczna włókien wykazujących ekspresję transgenicznego EYFP-ClC1. Panele A i B przedstawiają zapisy napięcia z włókna wykazującego ekspresję EYFP-ClC1 w odpowiedzi na impulsy prądowe odpowiednio przed i po zastosowaniu 9-ACA. Panele C i D przedstawiają zapisy napięcia (potencjały czynnościowe) wywołane w odpowiedzi na impulsy prądowe we włóknie nietransfekowanym odpowiednio przed i po zastosowaniu 9-ACA.

<ol><li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li>
<li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li>
<li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+%7Balpha%7D1s+and+%7Bbeta%7D1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li>
<li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li>
<li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li>
<li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li>
<li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li>
<li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins%2C+%7B%7Balpha%7D%7D-actinin-2+and+-3%2C+in+different+species%3A+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li>
<li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy tutaj szczegółowe kroki, które należy podjąć w celu uzyskania efektywnej transfekcji plazmidów DNA do włókien mięśni szkieletowych za pomocą elektroporacji in vivo. Głównymi zaletami naszego podejścia są prostota wykonania oraz minimalna inwazyjność, co skutkuje znikomym zagrożeniem dla zdrowia zwierząt. W rzeczywistości opisane powyżej protokoły elektroporacji nie wymagają więcej niż dwóch iniekcji podskórnych na każdą stopę, po których następuje protokół stymulacji elektrycznej; wszystkie te czynnośc...

transfekcja dna mięśni szkieletowych ssaków z wykorzystaniem elektroporacji in vivo

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Rosnącym obszarem zainteresowania w biologii komórki jest ekspresja transgenicznie zmodyfikowanych form białek istotnych dla organizmu (np. konstruktów znakowanych fluorescencyjnie i/lub wariantów zmutowanych) w celu zbadania ich endogennej dystrybucji oraz znaczenia funkcjonalnego. Ciekawym podejściem, które wdrożono w celu realizacji tego celu w w pełni zróżnicowanych komórkach, jestin vivotransfekcja plazmidów różnymi metodami do konkretnych tkanek, takich jak wątroba1, mięsień szkieletowy2,3, a nawet mózg4Przedstawiamy tutaj szczegółowy opis kroków, które należy wykonać w celu efektywnej transfekcji materiału genetycznego do włókienmięsień zginacz krótki palców(FDB) imiędzykostny (IO) mięśnie dorosłych myszy przy użyciu anin vivometoda elektroporacji. Parametry eksperymentalne zostały zoptymalizowane w celu maksymalizacji liczby przetransfekowanych włókien mięśniowych przy jednoczesnym zminimalizowaniu uszkodzeń tkanek, które mogłyby pogorszyć jakość i ilość białek ekspresowanych w poszczególnych włóknach. Potwierdziliśmy, że zastosowanie opisanej w niniejszej pracy metodologii pozwala na uzyskanie wysokiej wydajności białek rozpuszczalnych, tj. EGFP i ECFP3, kalpain, FKBP12, β2a-DHPR, itp.; białka strukturalne, t. j. minidystrofina i α-aktynina; oraz białka błonowe, t. j. α1s-DHPR, RyR1, kardiologiczny Na/Ca2+wymiennik, kanał NaV1.4 Na, SERCA1 itp., gdy są one stosowane w odniesieniu do FDB, IO i innych mięśni myszy i szczurów. Wydajna ekspresja niektórych z tych białek została zweryfikowana biochemicznie3i dowody funkcjonalne5Jednak przede wszystkim najczęściej stosowanym przez nas podejściem potwierdzającym jest standardowa mikroskopia fluorescencyjna oraz dwufotonowa laserowa mikroskopia skaningowa (TPLSM), które pozwalają zidentyfikować nie tylko ogólną ekspresję, ale także szczegółową lokalizację wewnątrzkomórkową konstruktów białkowych znakowanych fluorescencyjnie. Metoda ta może być w równym stopniu wykorzystana do transfekcji plazmidów kodujących ekspresję białek o znaczeniu fizjologicznym (jak pokazano tutaj), jak i dla interferencyjnego RNA (siRNA) mającego na celu stłumienie ekspresji białek występujących naturalnie (nie badano tego jeszcze w naszej pracy). Należy zauważyć, że transfekcja włókien mięśni FDB i IO jest szczególnie istotna dla badania fizjologii mięśni ssaków, ponieważ włókna dysocjowane enzymatycznie z tych mięśni stanowią obecnie jeden z najbardziej odpowiednich modeli do badania podstawowych mechanizmów pobudliwości oraz sprzężenia wzbudzenie-skurcz w warunkach clampy prądowej lub napięciowej.2,6-8Empty input. No HTML to translate.

Opisujemy szczegółowe procedury wydajnej transfekcji plazmidowego DNA do włókien mięśni stop żywych myszy z wykorzystaniem elektroporacji oraz następującej po niej wizualizacji ekspresji białka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Transfekcja DNA mięśni szkieletowych ssaków z wykorzystaniem elektroporacji in vivo

Rosnące zainteresowanie w dziedzinie biologii komórki budzi ekspresja transgenicznie zmodyfikowanych form kluczowych białek (np. konstruktów z etykietą fluorescencyjną i/lub mutantów...

Elektroporację można przeprowadzić in vivo w celu transfekcji DNA i plazmidów oraz transgenicznej ekspresji w mięśniu zginaczu krótkim palców (flexor digitorum brevis lub FDB) oraz mięśniach międzykostnych (interosseous lub IO) dorosłej myszy. Procedurę rozpoczyna się od znieczulenia myszy. Powierzchnię podeszwową jednej stopy przygotowuje się do pierwszego wstrzyknięcia hialuronidazy, wprowadzając igłę w okolicy pięty i prowadząc ją podskórnie wzdłuż stopy.Po jednej godzinie zwierzę zostaje ponownie znieczulone, a osocze zostaje wstrzyknięte w ten sam obszar podskórny stopy, w którym podano hialuronidazę. Po 10 minutach podskórnie umieszcza się pozłacane igły do akupunktury, zgodnie z ilustracją. Impulsy elektroporacyjne są podawane po podłączeniu igieł do stymulatora, jeśli jest to konieczne.Procedurę można powtórzyć w przeciwległej stopie. Po okresie od dwóch do ośmiu dni zwierzę jest uśmiercane, mięśnie są wycinane, a transfekcja pożądanego białka jest weryfikowana poprzez obserwację fluorescencji pod mikroskopem. Cześć, jestem Marino DeFranco z laboratorium Julio Very w Katedrze Fizjologii w Davy Geffen School of Medicine na UCLA.Dzisiaj przedstawimy procedurę transfekcji in vivo plazmidu wykazującego ekspresję białka transgenicznego do włókien mięśniowych dorosłych myszy. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania ekspresji i lokalizacji białek transgenicznych, a także wpływu nadekspresji białek na fizjologię włókien mięśniowych. Zacznijmy zatem.Przed rozpoczęciem protokołów elektroporacji in vivo należy namnożyć ssacze plazmidy ekspresyjne, aby uzyskać stężenia w zakresie od dwóch do pięciu mikrogramów plazmidu na mikrolitr buforu TE. Rutynowo stosujemy zestawy do amplifikacji firmy Qiagen, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Sugerujemy zastosowanie komercyjnych plazmidów ekspresyjnych zawierających promotor CMV, na przykład EEG FPC one lub EEG FPN one firmy Invitrogen.Ponieważ ten promotor działa bardzo dobrze w mięśniach szkieletowych, zaprezentujemy procedurę przecięć in vivo. Przy użyciu P EEG FPN przygotowaliśmy wcześniej roztwór zawierający 2 mg/mL hialuronidazy w sterylnym roztworze Tyrode'a. Roztwór ten jest przechowywany w temperaturze pokojowej do momentu przygotowania zwierząt.Do transfekcji wykorzystujemy komorę anestezjologiczną podłączoną do zatwierdzonego aparatu do narkozy gazowej, głęboko znieczulając zwierzę 4% ISO fluorine w tlenie. Po znieczuleniu stosujemy maść w celu ochrony oczu myszy przed wysychaniem podczas kolejnych procedur anestezjologicznych. Zwierzę umieszcza się na macie grzewczej ustawionej na 37°C i podtrzymuje znieczulenie za pomocą maski twarzowej.Monitoruj głębokość znieczulenia, sprawdzając odruch zaciśnięcia palca u stopy. Gdy zwierzę zostanie głęboko znieczulone, użyj sterylnej igły o rozmiarze 33 G i długości jednej cala, aby wstrzyknąć 10 µL roztworu o wysokim stężeniu UR pod skórę poduszeczki stopy jednej z łap myszy. Obserwując pod mikroskopem stereoskopowym, przebij skórę w punkcie blisko pięty i wprowadź igłę podskórnie w kierunku podstawy palców.Przez około ćwierć cala wstrzykuj roztwór powoli, aby zapobiec nadmiernemu wybrzuszeniu skóry. Powtórz procedurę na drugiej stopie. Jeśli jest to pożądane, wstrzyknięty enzym będzie zmiękczał tkankę łączną otaczającą włókna mięśniowe poprzez hydrolizę kwasu hialuronowego w okresie około jednej godziny.Ułatwi to dyfuzję plazmidu DNA, który zostanie następnie wstrzyknięty w przestrzeń śródwłóknistą. Po wstrzyknięciu hialuronidazy należy przerwać podawanie znieczulenia i umieścić mysz w klatce. Zwierzę wybudzi się z narkozy w ciągu trzech do czterech minut.Po jednej godzinie ponownie znieczul zwierzę. Pobierz 10 µL roztworu plazmidu i nanieś kroplę na tył czystej, małej korytka do electrophoresis. Pobierz kroplę strzykawką i wstrzyknij ją w poduszkę stopy.Postępując zgodnie z procedurą opisaną dla roztworu hialuronidazy w przypadku większych białek, można wstrzyknąć większe ilości osocza. Zalecamy, aby nie wstrzykiwać więcej niż 20 µL w sytuacjach, gdy konieczne jest podanie więcej niż 15 µL. Zalecamy użycie kleju tkankowego do zamknięcia skóry w miejscu wprowadzenia igły, aby zapobiec ryzyku wycieku DNA przez punkt nakłucia.Odłącz aparat do znieczulenia i umieść mysz w klatce. Pozwól zwierzęciu całkowicie wybudzić się z narkozy i odczekaj od 10 do 15 minut w celu przygotowania do elektroporacji. Ponownie znieczul zwierzę w sposób opisany wcześniej.Wybierz jedną stopę zwierzęcia, umieść jedną pozłacaną igłę do akupunktury lub elektrodę pod skórą w okolicy pięty, a drugą u nasady palców. Igły powinny być ustawione równolegle do siebie i prostopadle do długiej osi stopy. Igły do akupunktury mają średnicę 160 µm i długość 13 mm.Są one sprzedawane w sterylnych, indywidualnych opakowaniach. W zależności od rozstawu igieł należy dostosować amplitudę impulsu w celu podania impulsów napięcia, generując pole elektryczne o natężeniu około 100 V/cm.Ustaw czas trwania impulsu na 20 milliseconds i częstotliwość na 1 hertz. Podłącz końce elektrod do stymulatora elektrycznego za pomocą mikroklipsów. Pobudź mięśnie stopy, aplikując 20 impulsów elektrycznych.Monitoruj przebieg napięcia w oscyloskopie. W odpowiedzi na bodźce nie zaobserwowano istotnych skurczów. Jeśli poziom znieczulenia jest odpowiedni, można kontynuować dalsze czynności w trakcie trwania znieczulenia.Powtórz powyższą procedurę elektroporacji w drugiej stopie. Po elektroporacji zwróć zwierzę do klatki i utrzymuj je pod obserwacją. Do czasu pełnego wybudzenia z narkozy zwierzę powinno odzyskać pełną sprawność ruchową w ciągu pięciu minut. Jeśli nie wystąpiły reakcje niepożądane i procedura przebiegła prawidłowo, jako dodatkowy środek ostrożności dodaj do wody pitnej zwierzęcia karfin w stężeniu 0,027 mg/ml przez dwa dni.Ekspresję białka analgetycznego można badać od dwóch do ośmiu dni po transfekcji. Jednak w przypadku wielu białek obserwowano trwałą ekspresję przez wiele miesięcy. Efektywność transfekcji mięśnia FDB poddanego elektroporacji komercyjnym plazmidem pEEG-FPN1 kodującym białko EGFP można łatwo zwizualizować przy użyciu światła UV pochodzącego z przenośnej lampy UV lub wysokiej intensywności diod UV.Podczas oglądania stopy myszy pod mikroskopem stereoskopowym można zauważyć, że większość włókien mięśniowych została przetransfekowana zgodnie z naszym protokołem, co potwierdza fakt, iż większość z nich wykazuje zieloną fluorescencję. Mikroskop stereoskopowy pozwala ocenić ogólny wzorzec transfekcji mięśnia. Powtórzenie tej obserwacji.Użycie mikroskopu fluorescencyjnego z oświetleniem epifluorescencyjnym umożliwia wizualizację wzorca ekspresji EGFP w pęczkach włókien mięśniowych lub nawet w pojedynczych włóknach. Efektywność ekspresji białka mCherry w włóknach mięśnia FDB może być oceniana poprzez zestawienie obrazów mięśnia w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym. W tym celu do oceny wewnątrzkomórkowej lokalizacji nowo wyekspresowanych białek transgenicznych można wykorzystać dwufotonową mikroskopię skaningową.Jednocześnie pozyskiwane są obrazy białek znakowanych fluorescencyjnie oraz obrazy dobrze zidentyfikowanych markerów struktur komórkowych. Najbardziej typowymi markerami struktury komórkowej są obrazy generowania drugiej harmonicznej (SHG), które powstają z anizotropii miozyny w sarkomerach, a konkretnie z pasm A wycentrowanych w liniach M.Obrazy fluorescencyjne aneksowe, które można uzyskać poprzez znakowanie błon powierzchniowych oraz poprzecznych systemów kanalików lub systemu kanalików T włókien mięśniowych za pomocą barwnika imperian potentia metric, przedstawiają obrazy fluorescencyjne włókien mięśniowych barwionych barwnikiem eight anep. Kanaliki T widoczne są jako wąskie pasma fluorescencji zorientowane niemal ortogonalnie do długiej osi włókna. Pasma te są rozmieszczone w nierównych odstępach od siebie.Są one oddzielone dużym dystansem, który obejmuje linie M, oraz krótkim dystansem, który obejmuje linię Z. Tutaj przedstawiono przykład ekspresji znakowanego wariantu strukturalnego białka mięśniowego alfa-aktyniny. Białko to jest głównym składnikiem linii Z i jest rutynowo stosowane jako marker tej struktury.Przeprowadziliśmy transfekcję mięśni FDB i IO plazmidem P-E-G-F-P Fpn one alpha actinin, kodującym ludzką nie mięśniową alfa-aktyninę z tagiem EGFP na C-końcu, sześć dni po transfekcji. Stwierdzono, że alfa-aktynina jest wyrażana głównie w postaci wąskich pasm rozmieszczonych równomiernie wzdłuż osi włókna. Widoczny jest pojedynczy pas na sarkomer.Kolokalizacja tych prążków z liniami Z jest potwierdzona poprzez porównanie rozkładu fluorescencji EGFP z obrazami SHG lub D eight annex, co przedstawiono na obrazie nałożonym. Prążki Alpha Acton i EGFP przeplatają się z prążkami SHG, co wskazuje, że znajdują się one w połowie drogi między dwiema kolejnymi prążkami M, pokrywając się z lokalizacją linii Z w transfektowanych włóknach mięśniowych barwionych d an up. Prążki Alpha Actinin EGFP są widoczne w centrum każdej pary kanalików T, które wiadomo, że flankują linie Z. Wykazuje to, że transgeniczna alpha actinin jest kierowana do linii Z.Ekspresja i celowanie DHPR alpha one s z tagiem EGFP na N-końcu przedstawione są na rysunku trzy. Fluorescencja EGFP jest widoczna głównie jako pary prążków rozmieszczonych w wzorze podobnym do T-tubule ES. Nałożenie obrazów SHG i EGFP-DHPR Alpha one s wykazuje, że pomiędzy każdymi dwoma kolejnymi prążkami SHG znajdują się dwa fluorescencyjne prążki EGFP, co sugeruje, że DHPR alpha one s został prawidłowo skierowany do T-tubule ES (nie pokazano obrazów z D8 i abstaining, które stanowią jednoznaczny dowód na celowanie DHPR Alpha one s do kanalików). Włókna przetransfekowane P-EYFP CLC one, kodujące konstrukt z tagiem EYFP na końcu C kanału chlorkowego mięśni szkieletowych CLC one, wykazują fluorescencję EYFP w prążkach odpowiadających układowi kanalików T, co zilustrowano za pomocą D8 i abstaining.Zgodnie z oczekiwaniami. Nałożenie obrazów EYFP CLC one i SG, przedstawione na powiększeniu, obrazuje, że pasma SHG są wycentrowane w dużych odstępach między pasmami fluorescencji EYFP. Aby ocenić, czy ekspresja EYFP CLC one prowadzi do istotnego wzrostu przewodnictwa spoczynkowego włókien mięśniowych, co jest oczekiwane przy nadekspresji funkcjonalnych kanałów chlorkowych, poddano enzymatycznej dysocjacji włókna mięśniowe z TRANSFEKOWANEGO mięśnia FDB i zbadano ich właściwości elektrofizjologiczne przy użyciu dwuelektrodowego układu pomiarowego.Na tym obrazie przedstawiono wyniki dla dwóch włókien. Jedno wykazuje wysoką ekspresję EYFP clc, co oceniono na podstawie pomiarów całkowitej intensywności fluorescencji w standardowym mikroskopie fluorescencyjnym; drugie jest kontrolą nietransfekowaną.Rejestrację napięcia uzyskano z włókna mięśniowego wykazującego ekspresję EY FP CLC one. Impuls prądowy większy niż ten wymagany do pobudzenia włókna kontrolnego wywołuje jedynie niewielką odpowiedź regeneracyjną we włóknie transfekowanym, gdy zewnętrzny roztwór tyro zastąpiono roztworem zawierającym 500 micromolar kwasu 9-fenantrenokarboksylowego (9 A CA), który jest blokerem kanałów chlorkowych. Mniejszy impuls wywołał potencjał czynnościowy, choć znacznie wolniejszy i szerszy niż te zarejestrowane we włóknie kontrolnym, co było zgodne z oczekiwaniami.Dodanie dziewięciu CA miało minimalny wpływ na włókno kontrolne. Wyciągamy wniosek, że włókno wykazujące ekspresję EY FP CLC one jest niemal niepobudliwe ze względu na nadmierne spoczynkowe przewodnictwo chlorkowe. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób transfekcji plazmidu wykazującego ekspresję białka transgenicznego do żywego włókna mięśnia szkieletowego przy użyciu elektroporacji, a także metodę oceny wydajności transfekcji oraz lokalizacji i funkcji transfektowanych białek.To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.

dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transfekcja DNA mięśni szkieletu ssaków z wykorzystaniem elektroporacji in vivo

Opisujemy in vivo protokół obrazowania fluorescencyjnego służący do monitorowania regeneracji mięśni za pomocą mioblastów znakowanych białkiem GFP po transplantacji do mięśni szkieletowych myszy zdrowych oraz dystroficznych. Protokół ten można zaadaptować do badania regeneracji mięśni poprzez transplantację innych typów komórek, a także w innych stanach chorobowych mięśni.

Śledzenie dynamiki wszczepiania mięśni u małych zwierząt za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo

Opisano mysi model przezskórnej elektrycznej stymulacji nerwowo-mięśniowej (NMES), bezpiecznej i niedrogiej metody klinicznej, zastosowany do mięśni przedziału przedniego. Model ten ma tę zaletę, że wykorzystuje zmodyfikowane, powszechnie dostępne urządzenie kliniczne w celu wywołania ukierunkowanych i specyficznych skurczów mięśni u myszy.

Mysi model treningu mięśniowego za pomocą neuromuskularnej stymulacji elektrycznej

Opisano nieinwazyjny sposób oceny sukcesu przeszczepu mioblastów. Metoda wykorzystuje zunifikowany gen reporterowy fuzyjny złożony z genów, których ekspresję można obrazować za pomocą różnych metod obrazowania. W tym przypadku wykorzystujemy sekwencję genu reporterowego fluc do celowania w komórki za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Obrazowanie molekularne w celu ukierunkowania na przeszczepione komórki progenitorowe mięśni

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.

Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni

Ten protokół wykorzystuje elektroporację do wprowadzania i ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek we włóknach mięśniowych myszy. Po rekonwalescencji po elektroporacji włókna są izolowane. Poszczególne włókna są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu wizualizacji struktury mięśni.

Elektroporacja DNA, izolacja i obrazowanie włókien mięśniowych

Tutaj prezentujemy technikę in vivo transferu genów do komórek Schwanna (SC) w nerwie kulszowym gryzoni. Ta prosta technika jest przydatna do badania mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w rozwój i utrzymanie mielinizujących się SC.

In vivo (in vivo) Transfer genów do komórek Schwanna w nerwie kulszowym gryzoni za pomocą elektroporacji

Opisujemy nowatorską technikę eksperymentalną, którą nazywamy Minimalnie Inwazyjnym Osadzaniem Mięśni (MIME), która opiera się na dowodach, że tkanka mięśni szkieletowych zawiera żywotne komórki miogenne, które mogą ułatwić miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy, gdy zostaną wszczepione do mięśnia gospodarza.

Minimalnie inwazyjne osadzanie mięśni (MIME) - nowatorska technika eksperymentalna ułatwiająca miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy

Elektroporacja plazmidowego DNA w mięśniach szkieletowych jest realną metodą modulowania ekspresji genów bez naruszania kurczliwości mięśni u myszy.

Elektroporacja plazmidowego DNA do mięśni szkieletowych myszy

Ten protokół opisuje mikroiniekcję i elektroporację in vivo dla regionalnie ograniczonej edycji genomu za pośrednictwem CRISPR w jajowodzie myszy.

Somatyczne modele myszy z inżynierią genomu przy użyciu mikroiniekcji in vivo i elektroporacji

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce to metoda badania ruchów domen białek w czasie rzeczywistym. Modyfikacja tej techniki pod kątem jej zastosowania w komórkach natywnych umożliwia teraz wykrywanie i śledzenie ruchów pojedynczego czujnika napięcia z bramkowanych napięciem kanałów Ca2+ w mysich izolowanych włóknach mięśni szkieletowych.

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

Tutaj prezentujemy protokół, który łączy elektroporację in vivo i denerwację mięśnia dźwigacza długiego czaszki (LAL). Zabieg ten umożliwia badanie potencjalnej roli białek pochodzenia mięśniowego w regeneracji synapsy nerwowo-mięśniowej.

Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki

Poznaj metodę transfekcji DNA do mięśni szkieletowych myszy za pomocą elektroporacji in vivo. Technika umożliwia wizualizację ekspresji białek i badanie funkcji genów w żywym organizmie.

Transfekcja DNA mięśni szkieletowych ssaków z wykorzystaniem elektroporacji in vivo

Przeglądaj więcej filmów