Przygotowanie puli lizatu płytek krwi ludzkich (pHPL) jako wydajnego suplementu do bezzernowych hodowli ludzkich komórek macierzystych

Niniejszy protokół przedstawia proces przygotowania dużej puli lizatu płytek krwi ludzkich, zaczynając od osocza bogatego w płytki krwi. Poprzez przeprowadzenie jednego cyklu zamrażania i rozmrażania płytki krwi ulegają lizie. Następnie co najmniej 10 jednostek lizatu płytek krwi ludzkich zostaje połączonych w jedną partię pulowanego lizatu płytek krwi ludzkich lub PHPL.

Tę objętość wynoszącą około trzech litrów dzieli się na aliquoty i ponownie zamraża, aby usunąć fragmenty płytek krwi. Alikwoty te są rozmrażane, przenoszone do probówek i wirowane. Nadosad jest PHPL pozbawionym fragmentów płytek krwi, zawierającym pochodzące z płytek czynniki wzrostu, które stosuje się jako suplement do hodowli komórkowych.

Pozostały osad fragmentów płytek krwi zostaje usunięty. Witam, nazywam się Kadina Sharmo i pracuję w laboratorium dr. TRO w jednostce badań nad komórkami macierzystymi na Uniwersytecie Medycznym w Grads. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przygotowania puli izolatów ludzkich płytek krwi.

Zaczniemy od osocza bogatego w płytki krwi, poddamy je kilku cyklom zamrażania i rozmrażania, a następnie usuniemy fragmenty płytek. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu uzyskania odpowiedniego suplementu do hodowli komórkowych jako alternatywy dla płodowej surowicy bydlęcej. Zatem możemy zaczynać.

Niniejszy protokół rozpoczyna się od zastosowania osocza bogatopłytkowego, zwanego PRP. Osocze to mogło zostać przygotowane za pomocą aferezy lub pozyskane z warstw leukocytarnych (tzw. buffy coats). Osoby spoza dziedziny medycyny transfuzjologicznej powinny nabyć PRP z lokalnego banku krwi lub od innego autoryzowanego dostawcy.

Sprawdź sterylność jednostki PRP, przenosząc 20 mililitrów z każdej jednostki do małej połączonej torby, a następnie odłączając torbę za pomocą zgrzewarki. Alikwot ten można wysłać do laboratorium mikrobiologicznego w celu przeprowadzenia testu sterylności natychmiast po przygotowaniu. Ważne jest, aby zamrozić jednostki PRP do temperatury co najmniej -20°C w oryginalnej torbie do przechowywania.

Gdy testy bakteryjne okażą się negatywne, można przejść do następnego etapu. Dbając o to, aby lizat płytek krwi ludzkich, zwany odtąd HPL, nie nagrzał się nadmiernie, należy umieścić jednostki HPL w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C aż do momentu zniknięcia grudek lodu. Po tym etapie zamrażania i rozmrażania płytki powinny zostać poddane lizie, aby przygotować standaryzowany produkt dla każdej puli lizatu płytek.

Zebrać od 10 do 15 rozmrożonych jednostek PRP. Każdą kolejną torebkę HPL połączyć z podwójną torebką do łączenia, a następnie przenieść HPL do tych dwóch torebek. Odłączyć puste torebki HPL za pomocą zgrzewarki.

Wymieszaj zawartość obu worków, aby uzyskać końcową objętość od trzech do czterech litrów połączonego lizatu płytek krwi człowieka. Od tego momentu nazywany PHPL. Podłącz mały worek i pobierz 20 mililitrów próbki PHPL w celu sprawdzenia sterylności połączonego produktu.

Podziel próbki PHPL na alikwoty do dalszego przetwarzania, podłączając małe worki do zbiorczego podwójnego worka. Przenieś objętości około 250 mililitrów do małych worków do przechowywania, a następnie odłącz wypełnione worki za pomocą zgrzewarki. Teraz przeprowadź dodatkowy cykl zamrażania i rozmrażania, aby zwiększyć stopień fragmentacji płytek krwi oraz ilość uwolnionych czynników wzrostu.

Należy to zrobić, zamrażając małe woreczki z porcjowanym PHBL w temperaturze -20°C, a następnie rozmrażając je w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Za pomocą sterylnych nożyczek przetnij i otwórz probówkę każdego worka, a następnie przelej PHPL do fiolek o pojemności 50 ml. Fragmenty płytek krwi mają tendencję do agregacji płytek, co może również indukować alloimmunizację. Aby uniknąć tych zjawisk, usuń fragmenty z PHPL poprzez wirowanie przy 4 000 GS przez 15 minut w wirówce chłodzącej.

Następnie przenieś supernatant plazmy pipetą do końcowych probówek do przechowywania i odrzuć osad płytkowe, aby uniknąć obecności fragmentów w hodowlach komórkowych. Alikwoty PHPL o objętości 50 ml zamroź ponownie w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Po przygotowaniu PHPL pozbawionego fragmentów płytek można przystąpić do analizy charakterystyki lizatu.

Funkcję i jakość pululowanego lizatu płytek krwi testuje się w hodowlach komórkowych i potwierdza poprzez efektywną stymulację proliferacji komórek, namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych lub MSCs oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie, E CFCs, co udaje się osiągnąć przy użyciu PHPL pozbawionego fragmentów płytek. Przepisy na pożywki znajdują się w naszym protokole pisanym tutaj. Dwa zastosowania pululowanego ludzkiego lizatu płytek krwi.

W hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych pokazano MSC od pierwszego dawcy, które hodowano z PHPL lub PHPL pozbawionym fragmentów płytek krwi. Jak wskazano, w tym przypadku widoczne jest większe zanieczyszczenie fragmentami w porównaniu z samym PHPL pozbawionym fragmentów. Fragmenty płytek krwi nie zapewniają wystarczającego wsparcia dla wzrostu MSC.

Wszystkie trzy obrazy wykonano po 13 dniach hodowli. MSC od drugiego dawcy hodowano przez dziewięć dni w PHPL pozbawionym fragmentów płytek zamiast w osoczu bogatym w płytki krwi. Zauważmy, że PRP bez lizy płytek nie wspiera w wystarczającym stopniu wzrostu MSC.

Prosimy również o zapoznanie się z protokołem JoVE autorstwa Andreasa Reisha, który opisuje zastosowanie PHPL pozbawionego fragmentów do izolacji i hodowli MSC pochodzących z krwi pępowinowej człowieka. Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować PHPL, aby w pełni zastąpić surowicę zwierzęcą w hodowlach komórek macierzystych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o usunięciu fragmentów płytek krwi przed dodaniem heparyny i PHPL do pożywki hodowlanej.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.