Name: Przygotowanie zbiorczego ludzkiego lizatu płytek krwi (pHPL) jako skutecznego suplementu dla hodowli ludzkich komórek macierzystych wolnych od surowicy zwierzęcej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-30T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę przygotowania ludzkiego lizatu płytek krwi z bogatego w płytki osocza. Protokół obejmuje cykle zamrażania-rozmrażania i odwirowywanie fragmentów płytek, zapewniając czysty suplement bogaty w czynniki wzrostu do hodowli komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została wsparta przez Austriacką Fundację Badawczą (FWF, grant N211-NAN dla DS) oraz Austriacką Agencję Promocji Badań (FFG, grant N200 dla DS). Autorzy dziękują Claudii Url za doskonałą pomoc techniczną oraz Monice Farrell za redakcję językową.

1. Materiał wyjściowy
Należy rozpocząć od jednostek osocza bogatopłytkowego (PRP) przygotowanych metodą cytaferezy lub pochodzących z warstwy leukocytarnej (buffy coat).
2. Kontrola sterylności
W celu sprawdzenia sterylności pobierz próbkę 20 mL z każdej jednostki PRP, przenosząc tę objętość do podłączonego małego worka (Baxter). Odłącz worek poprzez zgrzewanie.
3. Zamrażanie jednostek PRP
Bezpośrednio po przygotowaniu zamroź jednostki PRP do temperatury co najmniej -20°C w oryginalnej torbie do przechowywania, bez dalszych manipulacji.
4. Rozmrażanie jednostek HPL
W przypadku negatywnych wyników testów bakteryjnych, rozmrozić jednostki ludzkiego lizatu płytek krwi, zwane dalej jednostkami HPL, w temperaturze 37°C (kąpiel wodna), aż do całkowitego rozpuszczenia grudek lodu. Nie podgrzewać HPL.
5. Poolowanie jednostek HPL
Aby przygotować ustandaryzowany produkt, należy pobrać co najmniej dziesięć do piętnastu rozmrożonych jednostek HPL na jedną pulę lizatu płytek krwi. Po kolejności podłącz worki HPL do podwójnego worka do łączenia (MacoPharma) i przenieś HPL do tych dwóch worków. Odłącz puste worki HPL poprzez zgrzewanie. Poprzez zmieszanie zawartości obu worków uzyskaj końcową objętość od 3 do 4 L połączonego ludzkiego lizatu płytek krwi (pHPL). Podłącz mały worek (Baxter) i pobierz próbkę 20 mL pHPL w celu sprawdzenia sterylności połączonego produktu. Odłącz ten worek poprzez zgrzewanie.
6. Porcjowanie pHPL
Podziel pHPL na odpowiednie alikwoty do dalszej obróbki. Podłącz małe worki (Baxter) do podwójnego worka do łączenia (Macopharma) i przenieś objętości do 250 mL do małych worków do przechowywania (Baxter). Odłącz wypełnione worki poprzez zgrzewanie.
7. Ponowne zamrażanie aliquotów pHPL
Zwiększ tempo fragmentacji płytek oraz ilość uwalnianych czynników wzrostu poprzez dodatkowy cykl zamrażania i rozmrażania. Ponownie zamroź małe woreczki z podzielonym pHPL w temperaturze co najmniej -20°C.
8. Ponowne rozmrażanie i porcjowanie alikwotów pHPL
Rozmrozić worki z pHPL w temperaturze 37°C (kąpiel wodna). Przenieść zawartość do probówek 50 mL (Falcons BD), odcinając rurkę worka sterylnymi nożyczkami i przelewając pHPL do probówek. Krok ten należy wykonać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego lub grzybiczego.
9. Usuwanie fragmentów płytek krwi
Ponieważ fragmenty płytek krwi mają tendencję do agregacji i mogą indukować alloimmunizację, należy usunąć je z pHPL. W związku z tym probówki z pHPL należy odwirować przy 4,000g (15 minut, 4°C). W komorze z laminarnym przepływem powietrza pipetować supernatant osocza do końcowych probówek do przechowywania (Falcons BD), a osady płytek krwi usunąć, aby uniknąć obecności fragmentów w hodowli komórkowej.
10. Przechowywanie pHPL
Ponownie zamroź alikwoty w fiolkach pHPL o pojemności 50 mL w temperaturze co najmniej -20°C i przechowuj je do użytku eksperymentalnego.
11. Zastosowanie pHPL w hodowlach komórkowych
W pierwszej kolejności należy dodać do pożywki heparynę bez konserwantów, aby zapobiec tworzeniu się żelu. Rozmrozić alikwot pHPL w temperaturze 37°C i uzupełnić pożywkę hodowlaną, dodając 8 – 10%.
Pożywki
Pożywka do MSC:
Należy użyć 500 mL a-MEM, dodać 56 mL rozmrożonego pHPL (szczegóły znajdują się w odniesieniu 1) oraz Heparynę bez konserwantów w stężeniu 2 IU/mL (=224 μl roztworu zapasu), aby zapobiec koagulacji medium poprzez agregację fibrynogenu w osoczu i uzyskać końcowe stężenie 10% pHPL. Dodatkowo należy dodać roztwór Penicyliny (100U/mL) /Streptomycyny (100μg/mL) oraz 2mM L-Glutaminy (oba od Sigma).
Przefiltruj pożywkę przez filtr próżniowy o rozmiarze porów 20 μm (Millipore). Odpowiednio opisz butelkę (zawartość, data).
Pożywka ECFC:
Użyć jednej butelki (500 mL) EBM, dodać alikwoty cytokin, 56 mL pHPL, Heparynę bez konserwantów w stężeniu 10 IU/ml (=1120μl roztworu zapasu), roztwór Penicyliny (100U/mL) / Streptomycyny (100 g/mL) oraz 2mM L-Glutaminy do podłoża podstawowego, a następnie przefiltrować za pomocą filtra próżniowego o rozmiarze porów 20 μl (Millipore). Odpowiednio oznakować butelkę (zawartość, data).
<img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig1.jpg" alt="Schemat przygotowania plazmy z warstwy leukocytarnej; wirowanie krwi, rozdzielenie na plazmę i warstwę leukocytarną." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1:Przygotowanie plazmy bogatopłytkowej z donacji krwi pełnej z lokalnego banku krwi lub innego uprawnionego dostawcy. Po wirowaniu krew można rozdzielić na plazmę, warstwę leukocytarną oraz erytrocyty. Przed wirowaniem w celu wyizolowania plazmy bogatopłytkowej można połączyć cztery jednostki warstwy leukocytarnej grupy krwi O oraz jedną jednostkę plazmy grupy krwi AB. Standardowa jednostka plazmy bogatopłytkowej o objętości około 300mL powinna zawierać 1x109 płytkaczek na mL lub łącznie 3x1011 płytkaczek.
<img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig2.jpg" alt="Schemat przygotowania pożywki do hodowli MSC; zawiera heparynę, L-glutaminę, penicylinę i pHPL." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2">
<img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig3.jpg" alt="Metoda hodowli kolonii endotelialnych; schemat z dodatkami EBM-2, EGM-2 + pHPL dla wzrostu ECFC." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3">

<ol><li>Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Platelets and wound healing.</a> Front Biosci. 13, 3532-3548 (2008).</li>
<li>Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+and+cytokines+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Growth factors and cytokines in wound healing.</a> Wound Repair Regen. 16, 585-601 (2008).</li>
<li>Giacco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin-activated+platelets+induce+proliferation+of+human+skin+fibroblasts+by+stimulating+autocrine+production+of+insulin-like+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Thrombin-activated platelets induce proliferation of human skin fibroblasts by stimulating autocrine production of insulin-like growth factor-1.</a> FASEB J. 20, 2402-2404 (2006).</li>
<li>Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+AB+serum+and+thrombin-activated+platelet-rich+plasma+are+suitable+alternatives+to+fetal+calf+serum+for+the+expansion+of+mesenchymal+stem+cells+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue.</a> Stem Cells. 25, 1270-1278 (2007).</li>
<li>Kakudo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation-promoting+effect+of+platelet-rich+plasma+on+human+adipose-derived+stem+cells+and+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts.</a> Plast Reconstr Surg. 122, 1352-1360 (2008).</li>
<li>Doucet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+lysates+promote+mesenchymal+stem+cell+expansion%3A+A+safety+substitute+for+animal+serum+in+cell-based+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: A safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications.</a> J Cell Physiol. 205, 228-236 (2005).</li>
<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+can+replace+fetal+bovine+serum+for+clinical-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells.</a> Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+system+to+propagate+cord+blood-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application.</a> Regen Med. 2, 371-382 (2007).</li>
<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+large-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+unmanipulated+bone+marrow+without+animal+serum+Tissue+Eng+Part%5BTitle%5D)+AND+%22C+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum Tissue Eng Part.</a> C Methods. 14, 185-196 (2008).</li>
<li>Lange, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+and+safe+expansion+of+human+mesenchymal+stromal+cells+in+animal+serum-free+medium+for+transplantation+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine.</a> J Cell Physiol. 213, 18-26 (2007).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. 113, 6716-6725 (2009).</li>
<li>Bernardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+in+vitro+expansion+of+human+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+cell-therapy+approaches%3A+further+insights+in+the+search+for+a+fetal+calf+serum+substitute%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute.</a> J Cell Physiol. 211, 121-130 (2007).</li>
<li>Carrancio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+mesenchymal+stem+cell+expansion+procedures+by+cell+separation+and+culture+conditions+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Optimization of mesenchymal stem cell expansion procedures by cell separation and culture conditions modification.</a> Exp Hematol. 36, 1014-1021 (2008).</li>
<li>Muller, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+lysate+as+a+serum+substitute+for+2D+static+and+3D+perfusion+culture+of+stromal+vascular+fraction+cells+from+human+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Platelet lysate as a serum substitute for 2D static and 3D perfusion culture of stromal vascular fraction cells from human adipose tissue.</a> Tissue Eng Part A. 15, 869-875 (2009).</li>
<li>Anitua, E., Sanchez, M., Orive, G., Andia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+impact+of+the+preparation+rich+in+growth+factors+%28PRGF%29+in+different+medical+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields.</a> Biomaterials. 28, 4551-4560 (2007).</li>
<li>Anitua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+and+novel+applications+for+platelet-rich+fibrin+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies.</a> Trends Biotechnol. 24, 227-234 (2006).</li>
<li>Martinez-Zapata, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+the+use+of+autologous+plasma+rich+in+platelets+for+tissue+regeneration%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of the use of autologous plasma rich in platelets for tissue regeneration: a systematic review.</a> Transfusion. 49, 44-56 (2009).</li>
<li>Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+levels+in+platelet-rich+plasma+and+correlations+with+donor+age%2C+sex%2C+and+platelet+count%5BTitle%5D)+AND+%22J+Craniomaxillofac+Surg%22%5BJournal%5D)">Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count.</a> J Craniomaxillofac Surg. 30, 97-102 (2002).</li>
<li>Frechette, J. P., Martineau, I. &amp, Gagnon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-rich+plasmas%3A+growth+factor+content+and+roles+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing.</a> J Dent Res. 84, 434-439 (2005).</li>
<li>Seghatchian, J., Krailadsiri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+platelet+storage+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Med+Rev%22%5BJournal%5D)">The platelet storage lesion.</a> Transfus Med Rev. 11, 130-144 (1997).</li>
<li>Selvaggi, T. A., Walker, R. E., Fleisher, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+antibodies+to+fetal+calf+serum+with+arthus-like+reactions+in+human+immunodeficiency+virus-infected+patients+given+syngeneic+lymphocyte+infusions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions.</a> Blood. 89, 776-779 (1997).</li>
<li>Tonti, G. A., Mannello, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bone+marrow+to+therapeutic+applications%3A+different+behaviour+and+genetic%2Fepigenetic+stability+during+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+autologous+and+foetal+bovine+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From bone marrow to therapeutic applications: different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera.</a> Int J Dev Biol. 52, 1023-1032 (2008).</li>
<li>Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Alternatives+to+Fetal+Bovine+Serum+for+the+Expansion+of+Mesenchymal+Stromal+Cells+from+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human Alternatives to Fetal Bovine Serum for the Expansion of Mesenchymal Stromal Cells from Bone Marrow.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
<li>Rohde, E., Schallmoser, K., Bartmann, C., Reinisch, A. GMP-Compliant Propagation of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRohde%2C+E+%22Pharmaceutical+Manufacturing+Handbook%3A+Regulations+and+Quality%22">Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Regulations and Quality</a>. Gad, S. C. , John Wiley and Sons, Inc. 97-115 (2008).</li>
</ol>

W niektórych regionach osocze bogate w płytki krwi (PRP) może być pozyskiwane z warstw leukocytarnych (buffy-coats), które w przeciwnym razie stanowią produkt odpadowy przy produkcji zagęszczonych erytrocytów z przebadanych donacji krwi (Rycina 1). Optymalnie PRP należy wykorzystać niezwłocznie do dalszego przygotowania pHPL, ponieważ w przeterminowanych koncentratach płytek dostępność czynników wzrostu może być ograniczona z powodu uszkodzeń płytek podczas przechowywania oraz ich degradacji20. Ponadto zaleca ...

<table><tbody><tr><td>Podwójna torba (2 x 3,5L)</td><td>MacoPharma</td><td>VDL 8000XQ</td><td>pierwotnie do punkcji wodobrzusza</td></tr><tr><td>Probówka Falcon 50 mL</td><td>Falcon BD</td><td>2098</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Stripettes 50 mL</td><td>Costar</td><td>4501</td><td></td></tr><tr><td>Worki do osocza (600mL)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>R4R2021</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny zgrzewacz drenów</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>TSCD-II</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do zgrzewania</td><td>Fresenius Kabi</td><td>Compo Seal</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zaciski</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie puli lizatu płytek krwi ludzkich (phpl) jako wydajnego suplementu do bezzernowych hodowli ludzkich komórek macierzystych

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Wykazano, że czynniki wzrostu pochodzące z płytek krwi skutecznie stymulują proliferację komórekin vivo1,2iin vitroEfekt ten opisano w przypadku mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), fibroblastów oraz endotelialnych komórek kolonogennych w obecności płytek krwi aktywowanych trombiną3-5lub poddane lizie poprzez cykle zamrażania i rozmrażania6-14przed dodaniem uwalnianych składników płytkowych do pożywki hodowli komórkowej. Troficzny efekt czynników wzrostu pochodzenia płytkowego został już przetestowany w kilku badaniach nad inżynierią tkankową i terapią regeneracyjną.1,15-17Uważa się, że różna wydajność wynika przynajmniej częściowo z indywidualnych różnic w stężeniach czynników wzrostu18,19oraz obecny brak zestandaryzowanych protokołów przygotowania płytek krwi.15,16Niniejszy protokół przedstawia praktyczną procedurę generowania puli ludzkiego lizatu płytek krwi (pHPL) pochodzącego z rutynowo otrzymywanej osocza bogatopłytkowego (PRP) z czterdziestu do pięćdziesięciu pojedynczych donacji krwi. Poprzez kilka cykli zamrażania i rozmrażania błony płytek krwi ulegają uszkodzeniu, a czynniki wzrostu zostają efektywnie uwolnione do osocza. Na koniec fragmenty płytek są usuwane poprzez wirowanie, aby uniknąć rozległego tworzenia agregatów i usunąć potencjalne antygeny. Wdrożenie pHPL do standardowych protokołów hodowli stanowi obiecujące narzędzie dla dalszego rozwoju terapii komórkowych namnażanych w systemach wolnych od białek zwierzęcych.

Ludzki lizat płytek krwi jest bogatym źródłem czynników wzrostu i silnym suplementem w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia proces przygotowania dużej puli ludzkiego lizatu płytek krwi, rozpoczynając od osocza bogatopłytkowego, przeprowadzając kilka cykli zamrażania i rozmrażania oraz usuwając fragmenty płytek.

Przygotowanie puli lizatu płytek krwi ludzkich (pHPL) jako wydajnego suplementu do bezzernowych hodowli ludzkich komórek macierzystych

Wykazano, że czynniki wzrostu pochodzenia płytkowego skutecznie stymulują proliferację komórek in vivo1,2 oraz in vitro. Efekt ten opisano w odniesieniu do ...

Niniejszy protokół przedstawia proces przygotowania dużej puli lizatu płytek krwi człowieka, zaczynając od osocza bogatopłytkowego. Poprzez przeprowadzenie jednego cyklu zamrażania i rozmrażania dochodzi do lizy płytek krwi. Następnie co najmniej 10 jednostek lizatu płytek krwi człowieka jest łączonych w jedną partię puli lizatu płytek krwi człowieka (PHPL).Tę objętość wynoszącą około trzech litrów dzieli się dalej na alikwoty, które ponownie zamraża się w celu usunięcia fragmentów płytek krwi. Alikwoty te rozmraża się, przenosi do probówek i wiruje. Nadsącz stanowi PHPL pozbawiony fragmentów płytek krwi, zawierający czynniki wzrostu pochodzenia płytkowego, które są wykorzystywane jako suplementy do hodowli komórkowych.Pozostały osad z fragmentami płytek krwi zostaje usunięty. Dzień dobry, nazywam się Kadina Sharmo i reprezentuję laboratorium dr TRO w jednostce badań nad komórkami macierzystymi na Uniwersytecie Medycznym w Grads. Dzisiaj przedstawimy procedurę przygotowania puli izolatów ludzkich płytek krwi.Zaczniemy od osocza bogatopłytkowego, przeprowadzimy kilka cykli zamrażania i rozmrażania, a następnie usuniemy fragmenty płytek krwi. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu uzyskania odpowiedniego suplementu do hodowli komórkowych jako alternatywy dla płodowej surowicy bydlęcej. Zatem zacznijmy.Protokół ten rozpoczyna się od osocza bogatopłytkowego, zwanego PRP. Osocze to mogło zostać przygotowane za pomocą aferezy lub pozyskane z warstwy leukocytarnej (Buffy coat). Osoby spoza obszaru medycyny transfuzjologicznej powinny nabyć PRP z lokalnego banku krwi lub od innego autoryzowanego dostawcy.Sprawdź sterylność jednostki PRP, przenosząc 20 ml z każdej jednostki do małego podłączonego worka, a następnie odłączając worek za pomocą zgrzewarki. Alikwot ten można wysłać do laboratorium mikrobiologicznego w celu przeprowadzenia testów sterylności bezpośrednio po przygotowaniu. Ważne jest, aby zamrozić jednostki PRP w temperaturze co najmniej -20 °C w oryginalnym worku do przechowywania.Po uzyskaniu negatywnych wyników testów bakteriologicznych można przejść do kolejnego kroku. Należy uważać, aby lizat płytek krwi pochodzenia ludzkiego (zwany odtąd HPL) nie nagrzał się nadmiernie; jednostki HPL należy umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C do momentu rozpuszczenia się skrzepów lodowych. Po tym etapie zamrażania i rozmrażania płytki powinny zostać poddane lizie w celu przygotowania zestandaryzowanego produktu dla każdej puli lizatu płytek.Zebrać od 10 do 15 rozmrożonych jednostek PRP. Podłączyć kolejno każdą workowidą jednostkę HPL do podwójnego worka do łączenia, a następnie przenieść HPL do tych dwóch worków. Odłączyć puste worki HPL za pomocą zgrzewarki.Wymieszać zawartość obu worków, aby uzyskać końcową objętość od trzech do czterech litrów połączonego lizatu płytek krwi człowieka. Produkt ten nazywany jest od teraz PHPL. Podłączyć mały worek i pobrać 20 mililitrów próbki PHPL w celu sprawdzenia jałowości połączonego produktu.Przenieś alikwoty PHPL do mniejszych worków połączonych z podwójnym workiem do łączenia w celu dalszej obróbki. Przenieś objętości wynoszące około 250 milliliters do małych worków do przechowywania, a następnie odłącz wypełnione worki za pomocą zgrzewarki. Następnie przeprowadź dodatkowy cykl zamrażania i rozmrażania, aby zwiększyć stopień fragmentacji płytek krwi oraz ilość uwalnianych czynników wzrostu.Należy to zrobić, zamrażając małe woreczki z porcjowanym PHBL w temperaturze -20 °C. Następnie woreczki należy rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Za pomocą sterylnych nożyczek przetnij i otwórz końcówkę każdego worka, a następnie przelej PHPL do probówek o pojemności 50 ml. Fragmenty płytek krwi często wykazują tendencję do agregacji i mogą również indukować alloimmunizację. Aby zapobiec tym zjawiskom, usuń fragmenty z PHPL poprzez wirowanie przy 4 000 GS przez 15 minut w wirówce chłodzącej.Następnie przenieś pipetą nadsącz plazmy do końcowych probówek do przechowywania, a osady płytek krwi odrzuć, aby uniknąć obecności fragmentów w kulturach komórkowych. Zamroź alikwoty PHPL o objętości 50 ml ponownie w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Po otrzymaniu PHPL pozbawionego fragmentów płytek krwi można przystąpić do analizy charakterystyki lizatu.Funkcję i jakość puli lizatu platelets testuje się w hodowlach komórkowych, co potwierdza efektywna stymulacja proliferacji komórek, propagacja mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie (ECFCs) przy użyciu PHPL pozbawionego fragmentów platelets. Przepisy na pożywki znajdują się w naszym protokole pisemnym tutaj. Dwa zastosowania puli ludzkiego lizatu platelets.W hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych pokazano MSC z pierwszego dawcy, które były hodowane w PHPL lub w PHPL pozbawionym fragmentów płytek krwi. Jak wskazano, widoczne jest tutaj większe zanieczyszczenie fragmentami w porównaniu do samego PHPL pozbawionego fragmentów. Fragmenty płytek krwi nie wspierają wzrostu MSC w stopniu wystarczającym.Wszystkie trzy obrazy zostały wykonane po 13 dniach hodowli. MSC od drugiego dawcy były hodowane przez dziewięć dni w PHPL pozbawionym fragmentów płytek zamiast w osoczu bogatopłytkowym. Należy zauważyć, że PRP bez lizy płytek nie zapewnia wystarczającego wsparcia dla wzrostu MSC.Prosimy również o zapoznanie się z protokołem JoVE opracowanym przez Andreasa Reisha, który opisuje zastosowanie PHPL pozbawionego fragmentów do izolacji i hodowli MSC pochodzących z krwi pępowinowej człowieka. Właśnie zaprezentowaliśmy, jak przygotować PHPL w celu całkowitego zastąpienia surowicy zwierzęcej w hodowlach komórek macierzystych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o usunięciu fragmentów płytek krwi przed dodaniem heparyny i PHPL do pożywki hodowlanej.To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

preparation-pooled-human-platelet-lysate-phpl-as-an-efficient

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie zbiorczego ludzkiego lizatu płytek krwi (pHPL) jako skutecznego suplementu dla hodowli ludzkich komórek macierzystych bez surowicy zwierzęcej

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), oparte na wzroście pojedynczych komórek bez typu kolonijnego (NCM) zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ta nowa metoda, wykorzystująca inhibitory kinaz związane z Rho lub izoformę lamininy 521 (LN-521), jest odpowiednia do wytwarzania dużych ilości jednorodnych hPSC, manipulacji genetycznych i odkrywania leków.

Alternatywne hodowle do produkcji, utrzymania i analizy genetycznej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisane protokoły pozwalają laboratoriom na przeprowadzanie skalowalnych, przylegających hodowli komórek macierzystych z dużą wydajnością przy minimalnym nakładzie pracy, doświadczenia i inwestycji w sprzęt przy użyciu programowalnego robota do obsługi cieczy i 96-dołkowych płytek.  iPSC pasażowane ponad 20 razy w tym systemie utrzymywały pluripotencję, prawidłowe kariotypy i różnicowały się w kardiomiocyty.

Skalowalna hodowla i produkcja iPSC na 96-dołkowych płytkach przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy

Ten protokół zapewnia prosty i skuteczny sposób namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) przy użyciu wyłącznie kondycjonowanych pożywek pochodzących z ludzkiego łożyska w naczyniu pokrytym żelatyną, bez dodatkowej suplementacji egzogennej lub syntetycznych substratów specyficznych dla hPSC.

Nowy model hodowli do namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie w pożywkach kondycjonowanych łożyskiem

Ten protokół opisuje półautomatyczne podejście do produkcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płytki 96-dołkowej. Proces ten jest szybki i opłacalny, co pozwala na produkcję partii komórek podobnych do hepatocytów o gwarantowanej jakości do podstawowych i stosowanych badań na ludziach.

Półautomatyczna produkcja komórek podobnych do hepatocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje podejście do produkcji hepatosfer z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu hodowli i samoorganizacji komórek. Protokół ten jest powtarzalny w wielu liniach komórkowych, jest opłacalny i pozwala na produkcję stabilnych ludzkich hepatosfer do zastosowań biomedycznych.

Produkcja trójwymiarowych ludzkich hepatosfer bez surowicy z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół przedstawia urządzenie, które wytwarza PRP, aby przyspieszyć ekspansję in vitro komórek w 100% autologicznym systemie hodowli fibroblastów.

Produkcja autologicznego osocza bogatopłytkowego w celu zwiększenia ekspansji ludzkich fibroblastów in vitro

Aby uniknąć ograniczeń związanych z enzymatycznym lub mechanicznym pasażowaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) hodowanych na komórkach żywicielskich, ustaliliśmy szybką, skuteczną, ekonomiczną, wysokowydajną metodę zbierania kolonii hESC lub hiPSC utrzymywanych na warstwie komórek zasilających ludzkie fibroblasty napletka za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA.

Szybkie, ekonomiczne, bezenzymatyczne pasażowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na komórkach zasilających przez dysadhezję za pośrednictwem kwasu etylenodiaminotetraoctowego

Ten protokół opisuje tworzenie samoorganizujących się naczyń krwionośnych z ludzkich pluripotencjalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Te sieci naczyń krwionośnych wykazują rozległą i połączoną sieć śródbłonka otoczoną perycytami, aktyną mięśni gładkich i ciągłą błoną podstawną.

Wytwarzanie organoidów ludzkich naczyń krwionośnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Produkty ksenogeniczne (chemiczne lub pochodzenia zwierzęcego) wprowadzone do etapów przygotowania/manipulacji terapii komórkowej są związane ze zwiększonym ryzykiem reaktywności immunologicznej i transmisji patogennej u pacjentów gospodarza. W tym artykule opisano całkowicie wolną od ksenogenów metodę izolacji i ekspansji in vitro ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi

Ostatnie osiągnięcia techniczne umożliwiły skalowaną produkcję platformy in vitro do zastosowań związanych z metabolizmem leków i toksycznością. Całkowicie ludzki układ wątrobowy 2D+ (TV2D+) zapewnia fizjologicznie istotne wyniki przy użyciu tradycyjnych metod hodowli dwuwymiarowej. Protokół ten będzie wspierał użytkowników końcowych w konfiguracji, konserwacji i stosowaniu systemu.

Całkowicie ludzki system hodowli wątroby do zastosowań związanych z opracowywaniem leków

Poznaj metodę przygotowania ludzkiego lizatu płytek krwi z bogatego w płytki osocza. Protokół obejmuje cykle zamrażania-rozmrażania i odwirowywanie fragmentów płytek, zapewniając czysty suplement bogaty w czynniki wzrostu do hodowli komórek macierzystych.

Przygotowanie zbiorczego ludzkiego lizatu płytek krwi (pHPL) jako skutecznego suplementu dla hodowli ludzkich komórek macierzystych wolnych od surowicy zwierzęcej (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie puli lizatu płytek krwi ludzkich (pHPL) jako wydajnego suplementu do bezzernowych hodowli ludzkich komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów