Name: Izolacja i ekspansja na dużą skalę kolonii śródbłonka dorosłego człowieka tworzącej komórki progenitorowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-28T07:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Poznaj metodę izolacji i ekspansji kolonii śródbłonka dorosłego człowieka tworzącej komórki progenitorowe bez użycia surowicy zwierzęcej. Technika ta umożliwia bezpieczniejsze badania nad homeostazą naczyń krwionośnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Katharinie Schallmoser za udostępnienie pHPL oraz Margarethei Frühwirth i Danieli Thaler za doskonałą pomoc techniczną.

A.) IZOLACJA ECFC
DZIEŃ 1:
 <ol>
 <li>Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotować pożywkę do hodowli komórek Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2). 500 ml Endothelial Basal Medium-2 uzupełnić heparyną (1 ml stężenia 1000 U/ml), 5 ml 100-krotnym roztworem penicyliny/streptomycyny (wszystkie od Sigma, St. Louis, MO; <a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a>), L-glutaminą (stężenie końcowe 2 mM) oraz 50 ml puli ludzkiego lizatu płytek krwi (pHPL). Następnie dodać 0,2 ml hydrokortyzonu, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml VEGF, 0,5 ml EGF, 0,5 ml IGF-1 i 0,5 ml kwasu askorbinowego (dostarczone jako SingleQuots, wszystkie od Lonza, Walkersville, MD; <a href="http://www.lonzabioscience.com/">http://www.lonzabioscience.com/</a>). Pożywkę przefiltrować sterylnie przez 500 ml próżniowy filtr Millipore o rozmiarze porów 0,2 µm. Ponieważ pHPL tworzy małe skrzepy, do jednej porcji pożywki może być potrzebnych dwa filtry. Przefiltrowane EGM-2 wstępnie ogrzać do 37°C w łaźni wodnej</li>
 <li>Pobrać próbki krwi, pobierając 5 ml obwodowej krwi ludzkiej od osoby dorosłej z żyły łokciowej do 6 ml probówki vacutainer z heparyną sodową bez konserwantów. Próbki krwi należy przetworzyć w ciągu maksymalnie dwóch godzin.</li>
 <li>Rozpocząć od przygotowania w komorze z laminarnym przepływem powietrza jednej kolby 75 cm2 (T75; Costar) z nakrętką z filtrem, jednej pipety 25 ml i dwóch pipet 5 ml.</li>
 <li>Do kolby wlać 15 ml wstępnie ogrzanej uzupełnionej pożywki EGM-2 za pomocą pipety 25 ml. Następnie otworzyć fiolkę z krwią i pobrać całe 5 ml pipetą 5 ml do kolby. Pustą fiolkę z krwią wypłukać 5 ml dodatkowej pożywki EGM-2 za pomocą drugiej pipety 5 ml. Całkowita objętość w kolbie T75 wynosi 25 ml. Zamknąć nakrętkę z filtrem kolby i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C, przy 5% CO2 i 95% wilgotności na 24 godziny.</li>
</ol>
DZIEŃ 2:
 <ol>
 <li>Po około 24 godzinach (przez noc) należy usunąć mieszaninę pożywki z krwią, aby pozbyć się komórek nieprzylegających. W tym celu przygotuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza dwie pipety 25 ml i trzy pipety 5 ml, a następnie podgrzej w kąpieli wodnej do 37°C 20 ml uzupełnionej pożywki EGM-2 (przygotowanej poprzedniego dnia) oraz 30 ml PBS.</li>
 <li>Wyjmij z inkubatora kolbę z próbką i usuń cały nadosad za pomocą pipety 25 ml. Należy uważać, aby nie zarysować powierzchni kolby, by uniknąć uszkodzenia potencjalnych kolonii. Przemyj wewnętrzną powierzchnię adhezyjną kolby trzykrotnie, ostrożnie dodając 10 ml podgrzanego PBS i przechylając kolbę z jednej strony na drugą. Za każdym razem natychmiast usuń i wylej PBS.</li>
 <li>Do kolby dodaj 20 ml świeżej, podgrzanej pożywki EGM-2 i umieść ją z powrotem w inkubatorze. Proces ten należy przeprowadzić tak szybko i delikatnie, jak to możliwe, aby komórki przytwierdzone nie oddzieliły się od podłoża. ECFC łatwo ulegają odklejeniu, jeśli są zbyt długo utrzymywane w PBS lub w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Systematycznie przeglądaj kolbę co drugi dzień, zaczynając od drugiego dnia, używając mikroskopu świetlnego przy małym powiększeniu w celu poszukiwania wzrostu ECFC. Po znalezieniu kolonii zaznacz jej położenie na zewnętrznej górnej ściance kolby. Należy pamiętać, że kolby nie powinny pozostawać poza inkubatorem dłużej niż 5 minut.</li>
</ol>
DZIEŃ 5:
 <ol>
 <li>Piątego dnia po wysianiu przeprowadź całkowitą wymianę medium, aby usunąć komórki nieprzylegające. W tym celu podgrzej 20 ml EGM-2 do 37°C w kąpieli wodnej i przygotuj dwie pipety o pojemności 25 ml.</li>
 <li>Usuń medium za pomocą pipety 25 ml i jak najszybciej dodaj świeże, uprzednio podgrzane, uzupełnione EGM-2. Aby uniknąć wysychania, komórki nie powinny pozostawać bez medium przez więcej niż minutę. Umieść naczynia z powrotem w inkubatorze i codziennie monitoruj kolbę.</li>
 <li>Dokarmiaj komórki, wymieniając 30% medium na świeże, uzupełnione EGM-2 dwa razy w tygodniu.</li>
 </ol>
DZIEŃ 14-28:
<ol>
<li>Typowe kolonie o morfologii brukowanej powinny pojawić się około 12. dnia. Zaznacz górną zewnętrzną ściankę kolby, aby wskazać położenie każdej kolonii. Pozostaw kolonie do wzrostu aż do 28. dnia, chyba że pojedyncze komórki zaczną się odrywać. Po zidentyfikowaniu kolonii pierwotnych można je zebrać między 14. a 28. dniem, w zależności od ich wielkości.</li>
</ol>
B.) ZBIERANIE ECFC
<ol>
 <li>Podgrzej wstępnie 5 ml trypsyny 0,05%/EDTA, 20 ml PBS oraz 5 ml świeżego, uzupełnionego medium EGM-2.</li>
 <li>Całkowicie usuń medium z kolby do probówki typu Falcon (należy uważać, aby nie dotknąć powierzchni kolby, by uniknąć uszkodzenia potencjalnych kolonii) i ostrożnie przemyj komórki 10 ml podgrzanego PBS.</li>
 <li>Dodaj 5 ml trypsyny/EDTA i inkubuj przez 5 minut w inkubatorze. Komórki nie powinny być eksponowane na trypsynę dłużej niż przez 7 min, ponieważ staje się ona toksyczna. Dokładne opukiwanie ścianek kolby pomaga w odklejeniu komórek. Zahamuj aktywność proteazy trypsyny, dodając około 10 ml zachowanego, użytego medium hodowlanego.</li>
 <li>Przenieś zawiesinę komórkową do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. Przemyj kolbę raz 10 ml PBS, który następnie dodaj do zebranej zawiesiny komórkowej. Centryfuguj zawiesinę komórkową przy 300 g przez 7 min w temperaturze 4°C, aby zebrać komórki i usunąć trypsynę. Odlej nadosad i niezwłocznie resuspenduj osad komórkowy w 1 ml PBS. Przechowuj w lodzie.</li>
 <li>Określ liczbę komórek zgodnie z opisem w protokole JoVE opracowanym przez R. Ricardo i K. Phelani.5</li>
</ol>
C.) EKSPANSJA ECFC
 <ol>
 <li>Uzupełnić 500 ml EGM-2 zgodnie z opisem w A 1.1). Podgrzać wstępnie do 37°C w łaźni wodnej.</li>
 <li>Dla powierzchni hodowlanej wynoszącej około 2500 cm2 przygotować albo 11 naczyń T220 (225 cm2), albo 15 naczyń T175 (175 cm2), albo jedną czterowarstwową fabrykę komórek (CF-4; Nunc, Naperville, IL; <a href="http://www.nuncbrand.com/">http://www.nuncbrand.com</a>). Dodatkowo w komorze z laminarnym przepływem powietrza będą potrzebne dwa nowe korki wentylacyjne oraz specjalny sterylny lejek.</li>
 <li>Aby zasiać ECFC z początkową gęstością komórek 100 c/cm2, konieczne jest obliczenie liczby komórek. Dla jednej fabryki CF-4 252 800 komórek resuspenduje się w 500 ml świeżego EGM-2 i przelewa do CF-4 za pomocą sterylnego lejka. Zamknąć jeden otwór korkiem wentylacyjnym i przechylić CF-4 na jedną z dłuższych stron, aby umożliwić równomierny rozkład medium pomiędzy wszystkimi 4 warstwami. Następnie przywrócić komorę do pozycji poziomej i otworzyć pokrywkę korka wentylacyjnego. Umieścić CF-4 w inkubatorze.</li>
 <li>Wymieniać 20% medium co najmniej raz w tygodniu, aż do momentu uzyskania konfluencji w CF-4.</li>
 <li>Zebrać komórki zgodnie z opisem w B.), używając 70 ml trypsyny/EDTA i około 200 ml PBS.</li>
</ol>
REPREZENTATYWNE WYNIKI
Stosując tę metodę izolacji, zaobserwowaliśmy tworzenie się kolonii pierwotnych w 12. dniu. W poprzednim badaniu udało się odzyskać średnio 4,0 ± 0,8 kolonii ECFC z każdego ml krwi obwodowej.4 Komórki ECFC wykazywały typowy wygląd brukowany. Po szeroko zakrojonej ekspansji, przy gęstości wysiewu 100 cells/cm2, uzyskaliśmy > 1 x 108 komórek w łącznym czasie około 30 dni od 3 ochotników płci męskiej i 1 ochotniczki płci żeńskiej (w wieku od 26 do 50 lat).
Wykazano, że ECFC hodowane w tych warunkach wykazują zdolność do proliferacji, są funkcjonalne i stabilne genomowo.4 Ponadto komórki mogą być przechowywane (w 10 % DMSO) w ciekłym azocie do późniejszego użycia. 3,4

<ol><li>Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+activated+endothelial+cells+in+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia.</a> N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).</li>
<li>Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+large-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+unmanipulated+bone+marrow+without+animal+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum.</a> Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. , (2009).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Ta nowatorska metoda izolacji i ekspansji jest prostym i wydajnym procesem, który jest bardziej efektywny i mniej czasochłonny dzięki uniknięciu separacji komórek (brak konieczności stosowania gradientu gęstości) oraz tańszy niż techniki konwencjonalne. Dzięki zastosowaniu kontaktu pHPL z antygenami bydlęcymi, ewentualna późniejsza ksenoimmunizacja zostaje wykluczona. W okresie hodowli mogą tworzyć się małe skrzepy wywołane przez pHPL. W oparciu o nasze doświadczenie, skrzepy te nie wpływają na tworzenie kolonii, prolife...

<table><tbody><tr><td>Pożywka podstawowa dla komórek śródbłonka Endothelial basal Medium-2</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>500ml</td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, hydrokortyzon, kwas askorbinowy</td></tr><tr><td>Heparyna bez konserwantów</td><td>Biochrom AG</td><td></td><td>10U/ml na EGM-2</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>2mM na EGM-2</td></tr><tr><td>Penicylina i streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100U/mL penicyliny i&lt;br/&gt;100&amp;#x03BC;g/mL streptomycyny na&lt;br/&gt;EGM-2</td></tr><tr><td>Trypsyna/1mM EDTA </td><td>Invitrogen</td><td></td><td>7ml dla kolby T75&lt;br/&gt;70ml dla CF-4</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czterowarstwowa fabryka komórek (CF-4) </td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lejek sterylny</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolba hodowlana T75cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; (z nakrętką z filtrem)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki vacutainer 6 mL (z heparyną sodową bez konserwantów) </td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>wypełnione 108 IU/6ml&lt;br/&gt;heparyny sodowej bez konserwantów</td></tr><tr><td>Probówki Falcon 50ml</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety Stripetts 5ml</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety Stripetts 25ml</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wyciskarka</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr o rozmiarze porów 0,2</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>2x 500ml na EGM-2</td></tr></tbody></table>

izolacja i wielkoskalowa ekspansja dorosłych ludzkich endotelialnych komórek progenitorowych zdolnych do tworzenia kolonii

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Niniejsza praca przedstawia nową strategię izolacji komórek progenitorowych tworzących kolonie śródbłonka (ECFC) z heparynizowanej, w pozostałym zakresie nieprzetworzonej krwi obwodowej dorosłego człowieka w średnim czasie 12 dni. Po ekspansji na dużą skalę można uzyskać &gt;1x108 komórek ECFC do dalszych badań. Dzięki zastosowaniu pHPL można wykluczyć kontakt ludzkich komórek z antygenami surowicy bydlęcej. Za pomocą cytometrii przepływowej i immunohistochemii można scharakteryzować wyizolowane komórki jako ECFC, a ich funkcjonalność in vitro w zakresie tworzenia struktur przypominających naczynia można przetestować w teście z matrigelem. Ponadto komórki te mogą zostać wstrzyknięte podskórnie w modelu mysim w celu utworzenia funkcjonalnych, ukrwionych naczyń in vivo. Po długoterminowej ekspansji i kriokonserwacji proliferacja, funkcja oraz stabilność genomowa wydają się być zachowane. 3,4
Ta metoda izolacji i ekspansji bez użycia białek zwierzęcych jest łatwo stosowalna w celu uzyskania dużej ilości ECFC.

Endotelialne komórki progenitorowe tworzące kolonie (ECFCs) stanowią obiecujące narzędzie do badania homeostazy i regeneracji naczyń krwionośnych.1,2 Niniejsza praca przedstawia nową metodę izolacji i ekspansji ECFC z heparynowanej krwi obwodowej dorosłego człowieka bez użycia surowicy zwierzęcej, z wykorzystaniem puli lizatu płytek krwi człowieka (pHPL), co zmniejsza ryzyko immunizacji przeciwko białkom bydlęcym.

Izolacja i wielkoskalowa ekspansja dorosłych ludzkich endotelialnych komórek progenitorowych zdolnych do tworzenia kolonii

Niniejsza praca przedstawia nową strategię izolacji endotelialnych progenitorowych komórek tworzących kolonie (ECFC) z heparynowanych, lecz w pozostałym zakresie niepoddanych manipulacjom próbek od osób dorosłych ...

Poprzez prostą hodowlę krwi pełnej w zoptymalizowanym medium bez dodatku surowicy zwierzęcej. W kolbie o powierzchni 75 cm², E CFC przylegają do powierzchni kolby, co pozwala na usunięcie większości erytrocytów i leukocytów. Należy wypłukać kolbę pierwszego dnia, a pozostałe komórki usunąć poprzez wymianę całego medium w piątym dniu.Kontynuuj przegląd kolonii co drugi dzień lub, jeśli jest to wygodne, trzy razy w tygodniu. Pierwsze kolonie powinny pojawić się około 12. dnia. Cześć, nazywam się Nicole Hoffman i pochodzę z laboratorium w Jednostce Badań nad Komórkami Macierzystymi Uniwersytetu Medycznego w Grazu.Dzisiaj zaprezentujemy uproszczony proces izolacji i ekspansji progenitorowych komórek tworzących kolonie śródbłonka (ECFC) z krwi obwodowej dorosłego człowieka. W naszym laboratorium wykorzystujemy tę metodę do badania funkcji i biologii ECFC in vitro oraz in vivo. Zapraszamy do oglądania.Niniejsza sekcja rozpoczyna się od przygotowania i sterylizacji przez filtr pożywki do wzrostu komórek śródbłonka numer dwa, która zostanie wykorzystana do hodowli EFCs. Należy wstępnie ogrzać 20 ml pożywki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Następnie należy pobrać 5 ml krwi obwodowej dorosłego człowieka z żyły łokciowej do probówki typu vacutainer z heparyną sodową bez konserwantów o pojemności 6 ml.Próbki krwi muszą zostać przetworzone w ciągu dwóch godzin od pobrania w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przygotować kolbę o pojemności 75 cm² z nakrętką z filtrem, pipetę 25 ml oraz dwie pipety 5 ml w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą pipety 25 ml napełnić wcześniej kolbę 15 ml podgrzanego, uzupełnionego medium E GM two.Otwórz probówkę z krwią i za pomocą pipety 5 ml przenieś bezpośrednio całe 5 ml krwi do kolby. Użyj pipety, aby wypłukać pustą probówkę po krwi pozostałymi 5 ml schłodzonego medium E GM 2. Dodaj tę objętość do kolby.Zamknij wentylowaną zakrętkę kolby, która powinna zawierać teraz 25 ml. Umieść kolbę w inkubatorze ustawionym na 37 °C, 5% carbon dioxide i 95% wilgotności na 24 godziny. Następnego dnia podgrzej 20 ml uzupełnionej pożywki e GM two oraz 30 ml PBS w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i przygotuj dwie pipety 25 ml oraz trzy pipety 10 ml w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Wyjmij kolbę z próbką z inkubatora i za pomocą pipety 25 ml usuń mieszaninę medium z krwią zawierającą komórki nieprzylegające. Należy uważać, aby nie porysować powierzchni kolby pipetą. Aby uniknąć odrywania komórek przylegających, ostrożnie dodaj 10 ml podgrzanego wcześniej PBS na wewnętrzną powierzchnię kolby, do której przylegają komórki, a następnie przechylaj kolbę z jednej strony na drugą.Natychmiast odessać i usunąć PBS. Powtórzyć tę czynność, płucząc dwa razy. Następnie, działając szybko i delikatnie.Aby uniknąć odklejenia komórek, należy dodać do kolby 20 milliliters świeżego, uprzednio ogrzanego EGM-2 i umieścić ją z powrotem w inkubatorze. Dbając o to, aby kolba nie pozostawała poza inkubatorem dłużej niż pięć minut, należy co drugi dzień sprawdzać wzrost ECFC w kolbie za pomocą mikroskopu świetlnego przy małym powiększeniu. Rozpoczynając od drugiego do piątego dnia po wysiewie, należy ogrzać 20 milliliters EGM-2 w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i przygotować dwie pipety o pojemności 25 milliliters.Należy pracować szybko, aby zapobiec wysychaniu. Użyj tych materiałów, aby zastąpić pożywkę świeżym, uprzednio ogrzanym suplementowanym e GM two, co pozwoli na usunięcie nieprzylegających komórek. Umieść kolbę z powrotem w inkubatorze i powtarzaj proces przesiewania codziennie.Wymień 30% pożywki na świeżo uzupełnioną pożywkę EGM. Czynność tę powtarzaj dwa razy w tygodniu. Typowe kolonie o morfologii brukowanej powinny pojawić się około 12. dnia.Zaznacz górną zewnętrzną stronę kolby, aby wskazać położenie każdej kolonii. Pozostaw kolonie do wzrostu do 28. dnia, chyba że pojedyncze komórki zaczną się odrywać. Po zidentyfikowaniu kolonii pierwotnych można je zebrać między 14. a 28. dniem, w zależności od ich wielkości.Podgrzej do 37°C pięć mililitrów roztworu trypsyny z EDTA oraz 20 mililitrów PBS. Przenieś całe medium do probówki typu Falcon, uważając, aby nie dotknąć powierzchni kolby. Roztwór ten zostanie wykorzystany później do zneutralizowania aktywności trypsyny; następnie ostrożnie przemyj komórki 10 mililitrami uprzednio podgrzanego PBS.Dodaj 5 ml trypsyny EDTA i inkubuj roztwór przez około 5 minut w temperaturze 37 °C lub do momentu odklejenia się komórek. Należy uważać, aby czas inkubacji nie przekroczył 7 minut, ponieważ po tym czasie trypsyna może stać się toksyczna dla komórek; po zakończeniu reakcji energicznie opukaj ścianki kolby, aby ułatwić odklejenie się komórek. Zahamuj aktywność proteazy trypsyny, dodając około 10 ml zachowanej wcześniej pożywki hodowlanej.Przenieś zawiesinę komórkową do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. Przepłucz kolbę raz 10 ml PBS i dodaj roztwór płuczący do zebranej zawiesiny komórkowej. Wiruj zawiesinę komórkową przy 300 ×g przez siedem minut w wirówce chłodzącej, aby zebrać komórki i usunąć trypsynę, odlej nadsącz i natychmiast resuspenduj osad komórkowy w 1 ml PBS.Resuspenderowane komórki należy przechowywać w lodzie. Liczbę komórek należy określić zgodnie z opisem w innym protokole JoVE opracowanym przez Ricardo i Phelana. Następnie należy przejść do ekspansji ECFC.W przypadku odzyskania więcej niż 360 000 eCFC, należy przejść do etapu ekspansji; w przypadku odzyskania mniej niż 260 000 eCFC, należy rozważyć dalszą ekspansję komórek przed ekspansją na dużą skalę. W tym celu należy zasiać około 75 000 eCFC w 20 ml EGM-2 w kolbie hodowlanej o powierzchni 75 cm² i hodować przez kolejny tydzień lub do momentu osiągnięcia konfluencji.Uzupełnij 500 ml medium E GM two zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym i wstępnie ogrzej tę mieszaninę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Dla każdego obszaru hodowli o powierzchni około 2 500 cm², przygotuj jedną czterowarstwową fabrykę komórek (cell factory) lub CA four. Dodatkowo przygotuj dwie nowe nasadki z Tyveku oraz specjalny sterylny lejek i umieść je w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zasiać E CFCs z początkową gęstością komórek wynoszącą 100 komórek na cm².Najpierw oblicz liczbę komórek dla każdego CF four 250.2, 800. Komórki resuspenduje się w 500 ml świeżego E GM two i przelewa do CF four. Używając sterylnego lejka, zakryj jedną otworem wentylacyjnym za pomocą zakrętki Tyvek i przechyl CF four na jedną z boków wzdłużnych, aby umożliwić równomierny rozkład pożywki pomiędzy wszystkie cztery poziomy.Teraz komorę można odchylić do tyłu i otworzyć pokrywę nasadki z Tyveku. Należy pamiętać o zabezpieczeniu otwartych otworów wentylacyjnych za pomocą dwóch czerwonych zakrętek. Zakrętki te można nabyć wraz z CF four w drodze do inkubatora.Umieść CF four w inkubatorze i zdejmij czerwone zakrętki, aby umożliwić wymianę gazową. Wymieniaj 20% medium na podgrzane medium przynajmniej raz w tygodniu, aż CF four osiągnie konfluencję. Proces ten zależy od dawcy i prawdopodobnie nastąpi po 10 do 14 dniach. Na koniec komórki można zebrać zgodnie z wcześniejszym opisem, wykorzystując podgrzany Tripsin EDTA oraz użyte medium do zneutralizowania aktywności proteazy.Dodatkowo, około 12. dnia do przemywania należy użyć około 200 mililitrów PVS. Kolonie ECFC zaczną pojawiać się z typową morfologią „brukową”, co można zaobserwować w tej kolonii, lub jako kilka zgrupowanych komórek, jak w tej kolonii znalezionej w 12. dniu. W miarę wzrostu kolonii coraz więcej komórek przyjmuje typową morfologię „brukową”.Jak widać tutaj, po 15 oraz 18 dniach, w badaniu immunochemicznym wyizolowane e CFC można scharakteryzować za pomocą typowych markerów powierzchniowych komórek śródbłonka, takich jak CD 146, CD 144, CD 31 oraz czynnik von Willebranda. Przedstawiliśmy sposób izolacji i ekspansji komórek progenitorowych tworzących kolonie śródbłonka z obwodowej krwi dorosłego człowieka. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że skuteczność tego protokołu zależy od dawcy i wynosi od 50 do 70%. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

isolation-large-scale-expansion-adult-human-endothelial-colony

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i duża skalowa ekspansja dorosłych ludzkich komórek progenitorycznych tworzących kolonie śródbłonka

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Komórki endotelialne tworzące kolonie (ECFCs) to krążące komórki endotelialne o silnym potencjale proliferacyjnym klonalnym, które wykazują wrodzone in vivo zdolność do tworzenia naczyń. Fenotypowa i funkcjonalna charakterystyka komórek śródbłonka wyhodowanych z krwi pępowinowej jest istotna dla ich identyfikacji i izolacji bona fide ECFCy do potencjalnych zastosowań klinicznych w naprawie uszkodzonych tkanek.

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi pępowinowej człowieka

Ten film demonstruje technikę izolowania indukowanych nerwowych komórek progenitorowych (iNPC) pochodzących z dorosłych ludzkich fibroblastów. Przedstawiono w nim etapy związane z izolacją kolonii iNPC i hodowlą ich w wielodołkowych dołkach płytkowych pokrytych lamininą w obecności odpowiednich pożywek hodowlanych, które ułatwiają ciągłą proliferację i ekspansję populacji iNPC.

Izolowanie indukowanych kolonii nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z fibroblastów dorosłego człowieka

Zgłaszamy wiarygodną metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu z genetycznie modyfikowanych modeli mysich.

Izolacja i ekspansja hodowli komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu

Ten protokół pozwala na wiarygodne generowanie i charakteryzowanie komórek śródbłonka (BOEC) z małej objętości dorosłej krwi obwodowej. BOEC mogą być stosowane jako substytut komórek śródbłonka od pacjentów z zaburzeniami naczyniowymi oraz jako substrat do wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie i hodowla komórek śródbłonka przerostu krwi z ludzkiej krwi obwodowej

Śródbłonkowe komórki progenitorowe (EPC) są kluczowe w neowaskularyzacji niedokrwionych tkanek. Metoda ta opisuje izolację ludzkich EPC z krwi obwodowej, a także identyfikację ich potencjału migracyjnego w próbkach surowicy pacjentów kardiochirurgicznych.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych od zdrowych ochotników i ich potencjał migracyjny pod wpływem próbek surowicy po operacji kardiochirurgicznej

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Komórki śródbłonka guza są ważnymi determinantami mikrośrodowiska guza i przebiegu choroby. W tym miejscu opisano protokół izolacji czystych i żywotnych komórek śródbłonka z ludzkiego raka jelita grubego i normalnej okrężnicy, który ma być stosowany w testach narkotykowych i badaniach nad patogenezą.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka z normalnego raka jelita grubego i raka jelita grubego - ulepszony protokół

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę izolacji i ekspansji kolonii śródbłonka dorosłego człowieka tworzącej komórki progenitorowe bez użycia surowicy zwierzęcej. Technika ta umożliwia bezpieczniejsze badania nad homeostazą naczyń krwionośnych.

Izolacja i wielkoskalowa ekspansja dorosłych ludzkich endotelialnych komórek progenitorowych zdolnych do tworzenia kolonii

Przeglądaj więcej filmów