Wizualizacja replikacji pojedynczej cząsteczki DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

W tej technice szkiełka nakrywkowe są funkcjonalizowane mieszaniną cząsteczek obojętnych i biotyny. Z tej funkcjonalizowanej powierzchni tworzona jest komórka przepływowa i umieszczana pod mikroskopem darniowym. Biotynylowane szablony toczących się kół są mocowane do powierzchni za pomocą wielowartościowej streptawidyny.

Kiedy substraty są replikowane przez dodanie białek i nukleotydów strefy repli, powstały dwuniciowy DNA jest rozszerzany z przepływem laminarnym i obrazowany w czasie rzeczywistym przy użyciu barwnika zbierającego krzyżowo. Cześć, nazywam się Nathan Tanner i pracuję w laboratorium Antoine'a Van Iana na Wydziale Chemii Biologicznej i Farmakologii Molekularnej w Harvard Medical School. Nazywam się Joe Laro i również pochodzę z laboratorium Van Noian.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę obrazowania fluorescencyjnego replikacji DNA w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej cząsteczki. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania skoordynowanych działań syntezy DNA poszczególnych kompleksów replikacyjnych. Więc zacznijmy.

Aby rozpocząć tę procedurę, anhiluj biotynylowany oligo ogona do jednoniciowego DNA M 13, dodając dziesięciokrotny nadmiar oligo w podgrzewaniu buforowym TBS do 65 stopni Celsjusza, a następnie wyłączając blok grzewczy, aby umożliwić powolne chłodzenie w celu prawidłowego nawarstwienia startera. Teraz, gdy prime M 13 jest gotowy, dodaj go do mieszaniny 64 nanomolowej polimerazy DNA T 7 i buforu replikacyjnego T 7 zawierającego D NDP i chlorek magnezu i inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 minut. Pod koniec inkubacji schłodzić 100 milimolowym EDTA.

Następnie należy oczyścić wypełnione DNA produktu chloroformem alkoholu fenolowo-izoamylowego, dokonać ekstrakcji i dializować w buforze TE lub innym odpowiednim buforze do przechowywania, ekstrahować z powrotem każdą fazę organiczną w celu odzyskania wszelkich pozostałości zagruntowanych. M 13 po dializie oznaczyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru UV vis. Jedna iteracja przygotowania matrycy może zapewnić wystarczające stężenie nanomolowe matrycy dla setek do tysięcy eksperymentów z pojedynczą cząsteczką.

Teraz, gdy DNA jest gotowe, przystąp do przygotowania funkcjonalizowanych szkiełek nakrywkowych. DNA, które ma zostać zreplikowane, jest przyłączone do szklanych szkiełek nakrywkowych funkcjonalizowanych Amil Lane, grupa tlenowa Amil wiąże się ze szkłem, pozostawiając aminę dostępną do wiązania biotynylowanych cząsteczek peg. Powłoka ta pomaga zmniejszyć niespecyficzne wiązanie z powierzchnią.

Aby dokładnie wyczyścić szkiełka pokrywy, umieść je w słoikach do barwienia i napełnij słoiki sonikatem etanolu. Przez 30 minut wypłukiwać słoiki i napełniać jednym molowym wodorotlenkiem potasu Sonicate przez 30 minut i powtórzyć oba mycia. W pierwszej reakcji funkcjonalizacji należy usunąć wszelkie ślady wody.

Napełnij słoiki do barwienia acetonem i sonikuj przez 10 minut. Opróżnij słoiki i ponownie napełnij acetonem. Kontynuuj dodawanie odczynnika sinusoidalnego do słoików i mieszaj przez dwie minuty.

Następnie ugasić dużym nadmiarem wody. Następnie osusz szkiełka przykrywkowe, piecząc je w piekarniku w temperaturze 110 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przygotuj mieszaninę PEG o masie około 0,2% na objętość za pomocą wbudowanego kołka, w tym szklana przekładka szkiełka nakrywkowego, która umożliwi oddzielenie szkiełek nakrywkowych, odpipetuj 100 mikrolitrów na suche, silosowe szkiełko nakrywkowe.

Umieść drugi szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze PEG przez trzy godziny. Następnie oddziel każdą parę szkiełek nakrywkowych i obficie umyj wodą.

Uważaj, aby szkiełka nakrywkowe były funkcjonalnie skierowane do góry, ponieważ tylko jedna strona będzie pokryta kołkiem. Na koniec wysusz szkiełka nakrywkowe sprężonym powietrzem i przechowuj je w próżni w suchym miejscu, powierzchnie pozostają stabilne przez co najmniej miesiąc. W ten sposób można wykonać dziesiątki szkiełek nakrywkowych w partii i wykorzystać w razie potrzeby.

Teraz, gdy szkiełka nakrywkowe są gotowe, można zmontować komorę przepływową do eksperymentu z pojedynczą cząsteczką. Zacznij od umieszczenia od 20 do 25 mililitrów buforu blokującego zawierającego BSA w osuszaczu, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza do późniejszych kroków. Następnie rozcieńczyć 25 mikrolitrów streptawidyny w 100 mikrolitrach PBS i rozprowadzić roztwór na powierzchni funkcjonalizowanego kołkiem Szkiełko nakrywkowe inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby streptawidyna mogła związać się z powierzchniową biotyną podczas przygotowywania innych części komory.

Podczas inkubacji szkiełka nakrywkowego należy wyciąć kawałek taśmy dwustronnej z obustronnym podkładem tak, aby odpowiadał rozmiarowi szkiełka kwarcowego użytego do montażu komory przepływowej. Zaznacz ołówkiem położenie otworów na rurki na taśmie, aby na taśmie można było narysować kontur komory przepływowej. Po zaznaczeniu otworów wykonaj prostokąt o szerokości dwóch milimetrów wokół oznaczeń.

Ten prostokąt będzie służył jako kanał przepływowy, więc pamiętaj, aby zrobić proste boki i pozostawić miejsce wokół wlotu i wylotu rurki. Teraz przetnij zaznaczoną taśmę wzdłuż narysowanego konturu, wykonując proste, czyste cięcia, aby upewnić się, że żaden klej nie wystaje do kanału. Dokładnie wyczyść szkiełko kwarcowe za pomocą acetonu, aby usunąć klej z konstrukcji komory przepływowej używanej w poprzednich eksperymentach.

Znajdź najlepsze wyrównanie konturu kanału. Usuń jedną stronę podkładu samoprzylepnego i ostrożnie umieść taśmę na prowadnicy kortu. Uważaj, aby prawidłowo wyrównać taśmę, ponieważ otwory wlotowe i wylotowe muszą pozostać niezablokowane.

Następnie przygotuj odcinki rurek o średnicy 0,76 milimetra do wlotu i wylotu komory przepływowej. Pomaga przeciąć koniec rurki pod kątem około 30 stopni, aby rurka nie naciskała płasko na dno komory. Zawieś rurki na stojakach na probówki, aby łatwo przymocować je do komory przepływowej w kolejnych krokach.

Do tej pory inkubacja szkiełek nakrywkowych została zakończona. Szkiełko nakrywkowe pokryte strep avid ENC należy dokładnie spłukać wodą i osuszyć sprężonym powietrzem. Uważaj, aby nie obrócić szkiełka nakrywkowego, ponieważ działa tylko jedna strona.

Na koniec zakończ montaż komory przepływowej, usuwając drugą stronę podkładu taśmy i umieszczając szkiełko kwarcowe na szkiełku nakrywkowym. Lekko dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wypchnąć powietrze uwięzione w kleju. Pomoże to zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanału przepływowego.

Uszczelnij boki komory żywicą epoksydową. Włóż wyciętą rurkę do otworów kwarcu i uszczelnij ją żywicą epoksydową i pozostaw do wyschnięcia na kilka minut. Po wyschnięciu uszczelki epoksydowej rozpocznij blokowanie powierzchni.

Za pomocą igły o rozmiarze 21. Przeciągnij część bufora blokującego Degasa przez jedną z rurek. Przepłukać kilka razy, aby usunąć pęcherzyki powietrza i pozostawić komorę do inkubacji przez co najmniej pół godziny przed przejściem do replikacji pojedynczej cząsteczki. Eksperyment.

Teraz, gdy komórka przepływowa została zablokowana, umieść ją na stoliku mikroskopu. Przytrzymaj komorę na miejscu za pomocą stage zaciski i upewnij się, że kanał przepływu jest wyrównany wzdłuż osi y. Podłącz rurkę wylotową komory przepływowej do pompy strzykawkowej za pomocą rurki łączącej o większej średnicy.

Umieścić wlot w buforze blokującym i pociągnąć strzykawkę do tyłu, aby usunąć powietrze z rurki. Delikatne przesunięcie rurki wylotowej pomoże usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w komorze przepływowej. Teraz dodaj DNA, rozcieńcz podstawową matrycę DNA do 25 pikomolarów w jednym mililitrze blokującym przepływ buforu do komory przy umiarkowanym natężeniu przepływu, takim jak 0,025 mililitra na minutę przez 30 minut, aby umożliwić dobre pokrycie powierzchni DNA.

Gdy DNA znajdzie się w komorze, wypłucz nadmiar DNA za pomocą blokującego płukania buforowego dla co najmniej 200 objętości komórek przepływowych. Aby pozbyć się całego wolnego DNA, włącz laser i kamerę. Schłodzona matryca CCD musi osiągnąć temperaturę, zanim będzie można jej użyć.

Po zmyciu nadmiaru DNA i odgazowaniu buforu replikacyjnego należy przygotować reakcję replikacji, wymieszać nukleotydy DTT i cytoksynę bufor replikacyjny. Następnie dodaj białka i delikatnie wymieszaj. Następnie przelej mieszaninę reakcyjną do komory przepływowej.

Prędkość przepływu musi być tutaj wystarczająca, aby rozciągnąć dwuniciowe DNA na szerokość dwóch milimetrów. Dobrze sprawdza się kanał przepływu o wysokości 100 mikrometrów 0,04 mililitra na minutę. Odczekaj, aż mieszanina dostanie się do komory, około 10 minut.

Przesuń pole widzenia na bok kanału i skoncentruj się na materiale klejącym, aby upewnić się, że znajduje się on blisko powierzchni w celu ustawienia ostrości i rozpoczęcia obrazowania. Dostosuj moc lasera, mikroskop, ostrość i kąt murawy. Utrzymuj moc na niskim poziomie, aby uniknąć rozszczepienia fotograficznego wybarwionego DNA.

Akwizycja z prędkością od jednej do pięciu klatek na sekundę przez kilka minut, w zależności od szybkości replikacji DNA. Powtórz, aby uzyskać dłuższe trajektorie replikacji lub przejdź do nowego pola, aby zobaczyć więcej cząsteczek, gdy prawie cała mieszanina reakcyjna została wpompowana do przepływu komórkowego w większym buforze z cyt, aby zobaczyć inne pola widzenia. Wykonywanie wielu obrazów różnych replikowanych cząsteczek dostarcza danych statystycznych do określania produktywności.

W toczącym się kręgu. Test replikacji, synteza siły wiodącej, wydłuża ogon, łącząc okrąg i powierzchnię, ogon jest przekształcany w dwuniciowy DNA przez polimerazę o opóźnionej nici i rozciągany przez przepływ laminarny, pokazano. Oto przykładowe pole widzenia z cyt orange przy wzbudzeniu 532 nanometrów.

Małe fluorescencyjne plamki są na uwięzi, niereplikowanymi podłożami. Zwróć uwagę na ekstremalną długość produktów i dużą liczbę produktów na pole. Typowe pole widzenia pokaże liczne replikujące się cząsteczki widoczne jako rosnące jasne linie barwionego DNAE Coli, eksperymenty w temperaturze 37 stopni Celsjusza dają od pięciu do 50 cząsteczek na pole, w zależności od gęstości powierzchni.

Strefa repla T seven inicjuje się znacznie wydajniej i replikuje ponad 50% cząsteczek w polu. Przy tak dużej gęstości trudno jest rozdzielić pojedyncze cząsteczki, jak widać tutaj. Tak więc przeprowadź eksperyment T seven przy niższych stężeniach białka lub gęstości powierzchniowej Wykresy dzwonka typowych replikujących się cząsteczek z E coli i T siedem eksperymenty obejmują trajektorie końcowe cząsteczek z E coli i T seven wykreślone w funkcji czasu trajektorie są wyposażone w regresję liniową w celu uzyskania szybkości replikacji, które w tym przykładzie wynoszą 467,1 par zasad na sekundę dla e coli i 99,4 par zasad na sekundę

Dla T seven rozkłady szybkości trajektorii pojedynczych cząsteczek pasują do pojedynczych gaussianów dają średnią 535,5 plus minus 39 par zasad na sekundę dla E coli i 75,9 plus minus 4,8 par zasad na sekundę. W przypadku T seven rozkłady długości produktów replikacji są dopasowane do pojedynczego rozkładu wykładniczego w celu uzyskania produktywności, która wynosi 85,3 plus minus 6,1 kilopar zasad dla E coli i 25,3 plus minus 1,7 kilo par zasad dla G seven. Właśnie pokazaliśmy, jak mierzyć skoordynowaną replikację DNA za pomocą pojedynczych cząsteczek.

Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o prawidłowym funkcjonowaniu szkiełek nakrywkowych i wykonaniu czystych kanałów o prostym przepływie. Upewnij się, że utrzymujesz obciążenie lasera i minimalizujesz rozszczepienie fotograficzne długiego DNA. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.