Name: Wizualizacja replikacji pojedynczej cząsteczki DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: Poznaj technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki do wizualizacji replikacji DNA w czasie rzeczywistym. Metoda umożliwia badanie koordynowanych aktywności syntezy DNA na poziomie pojedynczych kompleksów replikacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

W opracowaniu tej techniki pomógł Samir Hamdan. Białka E. coli pochodzą z laboratorium prof. Nicka Dixona z University of Wollongong, a białka T7 od prof. Charlesa Richardsona z Harvard Medical School. Praca jest wspierana przez National Institutes of Health (GM077248 dla A.M.v.O.) oraz Jane Coffin Childs Foundation (J.J.L.).

Przed przeprowadzeniem eksperymentu z replikacją pojedynczej cząsteczki należy wcześniej przygotować kilka materiałów.
1. Matryca replikacji DNA
Substratem dla reakcji replikacji jest biotynilowany, ogonowany M13 typu rolling circle przygotowany przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej1,2.
Materiały: jednoniciowy DNA M13mp18, biotynilowany starter oligonukleotydowy ogona (5'-Biotin-T36AATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCT-3'), polimeraza DNA T7, blok grzejny, fenol/alkohol izoamylowy/chloroform
<ol>
 <li>Przyłącz biotynilowany oligonukleotyd ogona do M13, dodając 10-krotny nadmiar oligonu w buforze TBS (330 nM oligonu ogona, 33 nM M13).</li>
 <li>Podgrzej mieszaninę do 65 °C w bloku grzewczym. Po osiągnięciu tej temperatury wyłącz blok i pozwól na powolne schłodzenie, aby zapewnić prawidłowe przyłączenie startera.</li>
 <li>Dodaj M13 z przyłączonym starterem do mieszaniny zawierającej 64 nM polimerazy DNA T7 oraz buforu do replikacji T7 z dNTPs i MgCl2.</li>
 <li>Inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C przez 12 minut, a następnie przerwij ją, dodając 100 mM EDTA.</li>
 <li>Oczyść uzupełniony produkt DNA za pomocą ekstrakcji fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie przeprowadź dializę do buforu TE lub innego odpowiedniego buforu do przechowywania i wyznacz stężenie DNA (przeprowadź reekstrakcję każdej fazy organicznej, aby odzyskać pozostałe M13 z przyłączonym starterem).</li>
 <li>Jedna iteracja przygotowania matrycy pozwala na łatwe otrzymanie kilku mililitrów matrycy o stężeniu nanomolarnym, co wystarcza na setki lub tysiące eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami.</li>
</ol>
2. Funkcjonalizowane szkiełka nakrywkowe
Aby przytwierdzić DNA do szkiełka podstawowego, szkło jest najpierw funkcjonalizowane aminosilanem, który następnie jest sprzęgany z biotynowanymi cząsteczkami PEG. Powłoka ta pomaga ograniczyć niespecyficzne oddziaływania DNA i białek replikacyjnych z powierzchnią1,3.
Materiały: szkiełka nakrywkowe, słoiki do barwienia, 3-aminopropylotrietoksysilan, ester Methoxy-PEG5k-NHS, ester Biotin-PEG5k-NHS, aceton, 1M KOH, etanol, piec, myjka ultradźwiękowa
<ol>
 <li>Dokładnie oczyść szklane laminki, umieszczając je w naczyniach do barwienia i wypełniając naczynia etanolem. Poddaj działaniu myjki ultradźwiękowej przez 30 minut, a następnie wypłucz naczynia i napełnij je 1 M KOH. Poddaj działaniu myjki ultradźwiękowej przez 30 minut. Powtórz oba etapy mycia.</li>
 <li>Przed pierwszą reakcją funkcjonalizacji należy usunąć wszelkie ślady wody. Napełnij naczynia acetonem i poddaj działaniu myjki ultradźwiękowej przez 10 min. Ponownie wypłucz naczynia acetonem.</li>
 <li>Przygotuj 2 % v/v roztwór odczynnika silanowego w acetonie. Dodaj go do naczyń do barwienia i mieszaj przez 2 minuty. Reakcja ta łączy grupę alkoksylową aminosilanu ze szkłem, pozostawiając reaktywną grupę aminową do kolejnego etapu sprzęgania. Przerwij reakcję, dodając duży nadmiar wody. </li>
 <li>Wysusz laminki, wypiekając je w piekarniku w temperaturze 110 °C przez 30 minut. </li>
 <li>Przygotuj mieszaninę PEG metoksylowanego i biotynilowanego w stosunku 50:1 w 100 mM NaHCO3 pH 8.2. Dąż do uzyskania stężenia biotynilowanego PEG na poziomie około 0.2 % w/v. </li>
 <li>Nanieś pipetą 100 μL mieszaniny PEG na suchą, silanizowaną laminkę i przykryj ją drugą laminką. Zastosowanie szklanego dystansu pozwoli na późniejsze rozdzielenie laminek.</li>
 <li>Inkubuj laminki w roztworze PEG przez 3 godziny, a następnie rozdziel każdą parę laminek i dokładnie wypłucz wodą. Należy uważać, aby trzymać laminki stroną funkcjonalizowaną do góry, ponieważ tylko jedna strona zostanie pokryta warstwą PEG.</li>
 <li>Wysusz laminki i przechowuj w próżni. Powierzchnie pozostają stabilne przez co najmniej miesiąc, dzięki czemu w jednej partii można przygotować dziesiątki laminek i używać ich w miarę potrzeb.</li>
</ol>
Materiały te należy przygotować z wyprzedzeniem, a następnie wykorzystać w każdym eksperymencie. Aby rozpocząć każdy eksperyment z pojedynczą cząsteczką, należy zacząć od montażu komory przepływowej.
3. Przygotowanie komory przepływowej
Eksperyment jest przeprowadzany z użyciem prostej komory przepływowej skonstruowanej z funkcjonalizowanej lamellipse, dwustronnej taśmy klejącej, szkiełka kwarcowego i rurek. Dla każdego eksperymentu z pojedynczą cząsteczką przygotowuje się jedną komorę przepływową1,4.
Materiały: Taśma dwustronna, żyletka, szkiełko kwarcowe z otworami na rurki, szybkoschnący epoksyd, funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe (patrz wyżej), roztwór streptawidyny (25 μL w stężeniu 1 mg/mL w PBS), rurki, bufor blokujący (20 mM Tris pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.2 mg/mL BSA, 0.005% Tween-20)
<ol>
 <li>Zacznij od umieszczenia 20-25 mL buforu blokującego w eksykatorze, aby usunąć pęcherzyki powietrza przed kolejnymi etapami.</li>
 <li>Pobierz szkiełko nakrywkowe funkcjonalizowane PEG i rozprowadź na jego powierzchni 125 µL roztworu streptawidyny rozcieńczonego w PBS. Pozostaw do inkubacji na 20 minut podczas przygotowywania pozostałych części komory, aby umożliwić związanie streptawidyny z biotynami na powierzchni.</li>
 <li>Dotnij kawałek dwustronnej taśmy tak, aby odpowiadał rozmiarowi płytki kwarcowej. Zaznacz ołówkiem na taśmie położenie otworów na rurki, tak aby można było narysować na niej obrys komory przepływowej (1 mg/mL).</li>
 <li>Wyznacz prostokąt o szerokości 2 mm wokół otworów. Będzie on pełnić funkcję kanału przepływowego, dlatego należy zadbać o proste krawędzie i pozostawienie wolnego miejsca wokół wlotu i wylotu rurek. W razie potrzeby można zastosować wiele kanałów lub różne rozmiary.</li>
 <li>Wytnij wzdłuż narysowanego obrysu, wykonując proste i czyste cięcia, aby upewnić się, że żadna część kleju nie wystaje do wnętrza kanału.</li>
 <li>Dokładnie oczyść kwarc za pomocą acetonu lub etanolu, aby usunąć pozostałości kleju z poprzedniej konstrukcji celi przepływowej.</li>
 <li>Znajdź optymalne wyrównanie obrysu kanału, usuń jedną stronę warstwy ochronnej kleju i ostrożnie przyklej taśmę do płytki kwarcowej. Należy zadbać o prawidłowe wyrównanie taśmy, ponieważ otwory wlotowe i wylotowe muszą pozostać niezablokowane.</li>
 <li>Dotnij odcinki rurek na wlot i wylot celi przepływowej. Warto uciąć koniec rurki pod kątem około 30°, aby nie przylegała ona płasko do dna komory. Umieść rurki na jakimś podłożu, aby zawiesić je dla łatwego przytwierdzenia do celi przepływowej w kolejnych krokach.</li>
 <li>Dokładnie wypłucz szkiełko nakrywkowe pokryte streptawidyną wodą i osusz sprężonym powietrzem. Pamiętaj, że funkcjonalizowana jest tylko jedna strona; uważaj, aby nie obrócić szkiełka nakrywkowe. Usuń drugą stronę warstwy ochronnej taśmy i połóż płytkę kwarcową na szkiełku nakrywkowym.</li>
 <li>Lekko dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wypchnąć uwięzione w kleju powietrze. Pomoże to uniknąć przedostania się pęcherzyków powietrza do kanału przepływowego.</li>
 <li>Uszczelnij boki komory żywicą epoksydową. Wsuń docięte rurki w otwory w kwarcu i utwierdź je żywicą epoksydową. Musi ona schnąć przez kilka minut.</li>
 <li>Po wyschnięciu rozpocznij blokowanie powierzchni, przepuszczając część odgazowanego buforu blokującego przez jedną z rurek. Igła o rozmiarze 21-gauge idealnie pasuje do rurki o średnicy 0.76 mm. Przepłucz kilka razy, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i pozostaw komorę do inkubacji na co najmniej pół godziny.</li>
</ol>
4. Eksperyment replikacji pojedynczej cząsteczki
Materiały: Przygotowana komora przepływowa, SYTOX Orange, mikroskop TIRF, laser 532 nm, kamera CCD, komputer z oprogramowaniem do akwizycji obrazu, substrat DNA w formie pętli toczącej się (rolling-circle), białka replikacyjne
<ol>
<li>Po zablokowaniu celi przepływowej wszystko jest gotowe do rozpoczęcia eksperymentu z pojedynczymi cząsteczkami.</li>
<li>Należy wziąć celę przepływową i umieścić ją na stoliku mikroskopu. Komorę należy przymocować za pomocą klipsów stolika, upewniając się, że kanał przepływowy jest ustawiony prostopadle wzdłuż osi y.</li>
<li>Należy połączyć rurkę wylotową celi przepływowej z pompą strzykawkową za pomocą rurki łączącej o większej średnicy lub igły. Wlot należy umieścić w buforze blokującym i odciągnąć tłok strzykawki, aby usunąć powietrze z rurki. Delikatne potrząśnięcie rurką wylotową pomoże usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w celi przepływowej.</li>
<li>Należy rozcieńczyć zapas matrycy DNA do stężenia 25 pM w 1 mL buforu blokującego. Roztwór należy wprowadzić do komory z umiarkowaną prędkością przepływu, aby zapewnić dobre pokrycie powierzchni przez DNA. Dobrze sprawdza się prędkość 0,025 mL/min przez 30 minut. Parametr ten można zmieniać w zależności od tego, ile cząsteczek DNA znajduje się na powierzchni dla każdej partii szkiełek podstawowych lub ile jest wymaganych do eksperymentu.</li>
<li>Po wprowadzeniu DNA należy wypłukać nadmiar DNA za pomocą buforu blokującego. Płukanie powinno trwać przez co najmniej 200 objętości celi przepływowej, aby usunąć całe wolne DNA.</li>
<li>Należy rozpocząć odgazowywanie buforu do replikacji. W przypadku eksperymentów z replikacją E. coli należy wykonać to w temperaturze 37 °C, aby zmniejszyć ryzyko powstania pęcherzyków powietrza w podgrzewanej komorze przepływowej.</li>
<li>Należy włączyć laser i kamerę. Chłodzona matryca CCD musi osiągnąć odpowiednią temperaturę przed rozpoczęciem pracy.</li>
<li>W przypadku przeprowadzania eksperymentu w 37 °C należy włączyć grzałkę. Należy upewnić się, że obiektyw styka się z celą przepływową, w przeciwnym razie będzie on działał jako radiator.</li>
<li>Po płukaniu i odgazowaniu można przygotować mieszaninę reakcyjną. Należy wymieszać nukleotydy, DTT i SYTOX w buforze do replikacji. Następnie należy dodać białka i delikatnie wymieszać.</li>
<li>Mieszaninę reakcyjną należy wprowadzić do celi przepływowej. Prędkość przepływu musi być wystarczająca do rozciągnięcia dsDNA. Dla kanału przepływowego o szerokości 2 mm i wysokości 100 µm dobrze sprawdza się prędkość 0,04 mL/min.</li>
<li>Należy odczekać, aż mieszanina wypełni komorę, a następnie rozpocząć obrazowanie. Przydatną wskazówką jest przesunięcie pola widzenia na bok kanału i ustawienie ostrości na materiale klejącym. Zapewni to znalezienie się w pobliżu powierzchni podczas ustawiania ostrości.</li>
<li>Należy dostosować moc lasera, ostrość mikroskopu i kąt TIRF. Moc powinna pozostać niska, aby uniknąć fotolizy barwionego DNA. Akwizycję należy prowadzić z częstotliwością 1-5 klatek/sekundę przez kilka minut, w zależności od tempa replikacji DNA. W razie potrzeby można powtórzyć procedurę, aby uzyskać dłuższe trajektorie replikacji lub przenieść się do nowego pola widzenia, aby zaobserwować więcej cząsteczek.</li>
<li>Gdy mieszanina reakcyjna jest prawie wyczerpana, zaleca się wprowadzenie większej ilości buforu z SYTOX, aby obejrzeć inne pola widzenia. Wykonanie wielu obrazów różnych replikowanych cząsteczek pozwala na uzyskanie statystyk niezbędnych do określenia procesywności.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Aktywnie replikujące się cząsteczki są łatwo widoczne jako rosnące linie barwionego DNA. W naszych eksperymentach przepływ 25 pM substratu M13 daje 100-1000 cząsteczek w polu widzenia o rozmiarach 125 μm x 125 μm przy powiększeniu 60x (Rysunek 1). Przeprowadzenie eksperymentów replikacyjnych z użyciem białek replisomu E. coli w temperaturze 37 °C (szczegóły w sekcji Materiały) daje 5-50 replikujących się cząsteczek na pole widzenia. Przy równoważnych stężeniach replisomu T7, który inicjuje replikację na substracie znacznie wydajniej, obserwujemy, że replikuje &gt;70% cząsteczek w polu widzenia. Warunki te prowadzą do tak wysokiej gęstości produktu, że poszczególne cząsteczki są trudne do rozróżnienia i analizy, dlatego eksperymenty z T7 są przeprowadzane przy niższych stężeniach białek.
Analiza danych: Aby uzyskać dane dotyczące szybkości, należy narysować wykres punktu końcowego DNA w funkcji czasu i obliczyć nachylenie prostej (Rysunek 2). W celu określenia procesywności należy wyznaczyć całkowitą długość DNA. Obie te wartości muszą zostać przeliczone na pary zasad. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy znać rozmiar piksela kamery przy odpowiednim powiększeniu. Dobrym przybliżeniem przy konwersji na pary zasad jest przeliczenie oparte na krystalograficznej długości DNA, wynoszącej 2,9 bp/nm. Jednak przepływ laminarny nie rozciągnie DNA całkowicie, dlatego należy przeprowadzić kalibrację długości DNA, wykorzystując fragment DNA o znanej długości, np. 48 502 bp λ DNA, przytwierdzając go do komory przepływowej za pomocą biotynulowanego oligonukleotydu i mierząc jego długość po barwieniu SYTOX przy szybkości przepływu stosowanej w eksperymencie replikacji. Wyznaczenie liczby par zasad/piksel pozwoli na dokładne obliczenie szybkości replikacji i procesywności. Wykonanie licznych zdjęć i filmów dostarczy dużej liczby cząsteczek produktu, co umożliwi narysowanie rozkładów szybkości i procesywności (Rysunek 2)1.
<img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Schemat replikacji DNA i obraz mikroskopowy przedstawiający syntezę nici prowadzącej i opóźnionej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: (Z Ref. 1) a) Schemat testu replikacji toczącego się koła. (SA, streptawidyna). Synteza nici prowadzącej wydłuża ogon łączący koło z powierzchnią. Ogon jest przekształcany w dsDNA przez polimerazę nici opóźnionej i rozciągany przez przepływ laminarny. 
b) Przykładowe pole widzenia z barwnikiem SYTOX Orange i wzbudzeniem 532 nm. Małe fluorescencyjne punkty to przytwierdzone, niereplikowane substraty. Zwróć uwagę na ekstremalną długość produktów oraz ich dużą liczbę w jednym polu (każda komora przepływowa zawiera &gt;5000 takich pól).
<img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Równowaga statyczna w eksperymencie przepływu DNA; żel elektroforetyczny, wyniki wykresów dla analizy T7 i E. coli." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: (adaptacja z Ref. 1) a,b) Kymografy typowych replikujących się cząsteczek z eksperymentów T7 (a) oraz E. coli (b). c) Trajektorie końcowe cząsteczek z a) i b) przedstawione w funkcji czasu. Trajektorie dopasowano za pomocą regresji liniowej w celu wyznaczenia szybkości replikacji. Przedstawione przykłady to 99.4 bp s-1 oraz 467.1 bp s-1. d) Rozkłady długości produktów replikacji, dopasowane do pojedynczego zaniku wykładniczego w celu wyznaczenia procesywności: 25.3 ± 1.7 kbp (T7), 85.3 ± 6.1 kbp (E. coli). e) Rozkłady szybkości trajektorii pojedynczych cząsteczek, dopasowane do pojedynczych rozkładów Gaussa. Średnie: 75.9 ± 4.8 bp s-1 (T7), 535.5 ± 39 bp s-1 (E. coli).

<ol><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27(2009).</li>
<li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+grafted+to+silicon+surfaces%3A+Grafting+density+and+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanner%2C+NA+%22DNA+replication%3A+Methods+and+protocols%22">DNA replication: Methods and protocols</a>. Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. 521, Humana Press. New York. 397-410 (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li>
</ol>

Kluczową kontrolą jest zbadanie wpływu barwnika SYTOX Orange na analizowane białka replikacyjne. Prostym sposobem wykonania tej kontroli jest przeprowadzenie eksperymentu replikacji w komorze przepływowej zgodnie z opisem, ale z pominięciem SYTOX. Po przepływie mieszaniny reakcyjnej przez komorę należy dodać bufor z SYTOX w celu zabarwienia DNA i zbadać rozkład długości zreplikowanych cząsteczek. Alternatywnie można wykorzystać standardowe reakcje w układzie bulk, aby sprawdzić ewentualny wpływ SYTOX na szybkość i wydajność replikacji.
Opisany tutaj eksperyment wykorzystuje tylko jeden kanał przepływowy. Można to łatwo zmienić, tworząc wielokanałowe komory przepływowe lub wykorzystując urządzenia mikroprzepływowe z PDMS lub podobnych materiałów. Zwiększenie liczby kanałów znacznie ułatwia przesiewanie stężeń białek, mutantów lub cząsteczek inhibitorów oraz przyspiesza gromadzenie danych z powtórzeń.
Jak wspomniano, eksperymenty dotyczące replikacji E. coli przeprowadzamy w temperaturze 37 °C, wykorzystując własnoręcznie zbudowany grzejnik do aluminiowej celi przepływowej, rezystancyjny element grzejny (grzałkę patronową) oraz regulowany zasilacz. Zapewnia to dobrą stabilność temperatury i pozwala uniknąć zakupu grzejnika obiektywu. Aby skalibrować grzejnik, po prostu wywierciliśmy otwór w centrum górnej części kwarcowej celi przepływowej, wstawiliśmy termoparę do kanału przepływowego i przepuszczaliśmy bufor w standardowy sposób. Pomiar temperatury buforu w celi przepływowej przy zwiększaniu napięcia pozwala na precyzyjne ogrzewanie.

<table><tbody><tr><td>ssDNA M13mp18</td><td>New England Biolabs</td><td>N4040</td><td></td></tr><tr><td>biotynilowany oligonukleotyd ogonowy</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T7</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274</td><td>Do przygotowania substratu należy użyć buforu do replikacji T7</td></tr><tr><td>fenol/alkohol izoamylilowy/chloroform</td><td>Grupa Roche</td><td>03117987001</td><td>24:24:1 v/v</td></tr><tr><td>3-aminopropylotrietoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>Można zastosować inne aminosilany lub zmieszać je z silanami niereaktywnymi wobec amin w celu uzyskania rzadszego rozmieszczenia cząsteczek na powierzchni</td></tr><tr><td>Propionian PEG z grupą sukcynimidylową</td><td>Nektar</td><td></td><td>Podobne PEG-i można nabyć w firmach Nanocs, CreativePEGWorks itp.</td></tr><tr><td>Biotyna-PEG-NHS</td><td>Nektar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>SA-S-1L</td><td>100 &amp;#x03BC;grubość m</td></tr><tr><td>Przedmiotowy szkiełko kwarcowe</td><td>Szkło techniczne</td><td>20 mm (szer.) x 50 mm (dł.) x 1 mm (wys.)</td><td>Przyciąć do rozmiaru szkiełek podstawowych. Wywiercić otwory za pomocą wierteł z końcówką diamentową (DiamondBurs.net).</td></tr><tr><td>Przewody polietylenowe</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>śr. wewn. 0,76 mm, śr. zewn. 1,22 mm&lt;br/&gt;Można zastosować rurki o innych rozmiarach.</td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td>Przygotować roztwór o stężeniu 1 mg/ml, 25 &amp;#x03BC;alikwoty L w PBS pH 7,3</td></tr><tr><td>Mieszanina roztworów dideoksyrybonukleotydotrifosforanów</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Roztwory rybonukleotydotrifosforanów</td><td>Amersham</td><td>272056 272066 272076 272086</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td>Można zastosować inny barwnik do dsDNA</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny z obiektywem TIRF 60x</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-71</td><td>Mikroskop, kamera itp. mogą zostać zastąpione podobnym sprzętem</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>11 Plus</td><td>Pracuj w trybie uzupełniania (refill mode), aby ułatwić wymianę roztworów</td></tr><tr><td>laser 532 nm</td><td>Coherent Inc.</td><td>Compass 215M-75</td><td>Wybierz długość fali odpowiadającą wybranemu barwnikowi</td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>Obraz</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>HQ600/75m</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Opisujemy prostą metodę w czasie rzeczywistym, opartą na mikroskopii fluorescencyjnej, służącą do obserwacji replikacji DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Kolisty, rozwidlony matrycowy DNA jest przytwierdzony do funkcjonalizowanej szkiełka podstawowego i ulega intensywnej replikacji po wprowadzeniu białek replikacyjnych oraz nukleotydów (Rycina 1). Powstający produkt w postaci dwuniciowego DNA (dsDNA) jest wydłużany przy zastosowaniu przepływu laminarnego i wizualizowany przy użyciu barwnika interkalującego. Pomiar pozycji rosnącego końca DNA w czasie rzeczywistym pozwala na precyzyjne określenie szybkości replikacji (Rycina 2). Ponadto długość ukończonych produktów DNA dostarcza informacji o procesywności replikacji. Eksperyment ten można przeprowadzić bardzo łatwo i szybko; wymaga on jedynie mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednio czułą kamerą.&quot;&gt;&lt;strong&gt;Replikacja T7&lt;/strong&gt;: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM glutaminianu potasu, 10 mM chlorku magnezu, 100 &amp;#x03BC;g/ml BSA, z 5 mM ditiotreitolem, 600 &amp;#x03BC;M dNTP, 300 &amp;#x03BC;M ATP, 300 &amp;#x03BC;M CTP oraz 15 nM SYTOX Orange dodane bezpośrednio przed użyciem. Białka dodane w następujących stężeniach: 5 nM gp4 (heksamer), 40 nM polimeraza (1:1 gp5: tioredoksyna), 360 nM gp2.5&lt;sup&gt;1,5&lt;/sup&gt;.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Opisujemy prostą metodę w czasie rzeczywistym, opartą na mikroskopii fluorescencyjnej, służącą do obserwacji replikacji DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek. Kolisty, rozwidlony szablon DNA zostaje przytwierdzony do funkcjonalizowanej szkiełka podstawowego i poddany intensywnej replikacji po wprowadzeniu białek replikacyjnych oraz nukleotydów (Rysunek 1). Powstający produkt w postaci dwuniciowego DNA (dsDNA) jest wydłużany w przepływie laminarnym i wizualizowany przy użyciu barwnika interkalującego. Pomiar pozycji rosnącego końca DNA w czasie rzeczywistym pozwala na precyzyjne określenie szybkości replikacji (Rysunek 2). Ponadto długość ukończonych produktów DNA dostarcza informacji o procesywności replikacji. Eksperyment ten można przeprowadzić w sposób bardzo łatwy i szybki, a wymaga on jedynie mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednio czułą kamerą.&quot;&gt;&lt;strong&gt;&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;strong&gt; Replikacja: &lt;/strong&gt;50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM octanu magnezu, 80 mM chlorku potasu, 100 &amp;#x03BC;g/ml BSA z 10 mM ditiotreitolem, 40 &amp;#x03BC;M dNTPs, 200 &amp;#x03BC;M rNTP oraz 15 nM SYTOX Orange dodane bezpośrednio przed użyciem. Białka dodane w następujących stężeniach: 30 nM DnaB (heksamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM &amp;alpha;&amp;epsilon;&amp;theta;, 15 nM &amp;#964;&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#947;&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;&amp;#948;&amp;#948;&amp;rsquo;&amp;#967;&amp;#968; lub &amp;#964;&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;#948;&amp;#948;&amp;rsquo;&amp;#967;&amp;#968;, 30 nM &amp;#946; (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT&lt;sup&gt;1,6&lt;/sup&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Opisujemy prostą metodę w czasie rzeczywistym, opartą na mikroskopii fluorescencyjnej, służącą do obserwacji replikacji DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Kolisty, rozwidlony szablon DNA jest przytwierdzony do funkcjonalizowanej szkiełka podstawowego i poddawany intensywnej replikacji po wprowadzeniu białek replikacyjnych oraz nukleotydów (Rysunek 1). Powstający produkt w postaci dwuniciowego DNA (dsDNA) jest wydłużany przy zastosowaniu przepływu laminarnego i wizualizowany za pomocą barwnika interkalującego. Pomiar pozycji rosnącego końca DNA w czasie rzeczywistym pozwala na precyzyjne określenie szybkości replikacji (Rysunek 2). Ponadto długość ukończonych produktów DNA dostarcza informacji o procesywności replikacji. Eksperyment ten można przeprowadzić w sposób bardzo łatwy i szybki, a wymaga on jedynie mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednio czułą kamerą.&quot;&gt;&lt;strong&gt;&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;strong&gt; Replikacja: &lt;/strong&gt;50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM octanu magnezu, 80 mM chlorku potasu, 100 &amp;#x03BC;g/ml BSA z 10 mM ditiotreitolem, 40 &amp;#x03BC;M dNTP, 200 &amp;#x03BC;M rNTP oraz 15 nM SYTOX Orange dodane bezpośrednio przed użyciem. Białka dodane w stężeniach: 30 nM DnaB (heksamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM &amp;alpha;&amp;epsilon;&amp;theta;, 15 nM &amp;#964;&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#947;&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;&amp;#948;&amp;#948;&amp;rsquo;&amp;#967;&amp;#968; lub &amp;#964;&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;#948;&amp;#948;&amp;rsquo;&amp;#967;&amp;#968;, 30 nM &amp;#946; (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT&lt;sup&gt;1,6&lt;/sup&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek dna za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Opisujemy prostą metodę czasu rzeczywistego opartą na mikroskopii fluorescencyjnej, służącą do obserwacji replikacji DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek. Kolisty, rozwidlony matrycowy DNA jest przytwierdzony do funkcjonalizowanej szkiełka podstawowego i poddawany intensywnej replikacji po wprowadzeniu białek replikacyjnych i nukleotydów (Rycina 1). Rosnący produkt w postaci dwuniciowego DNA (dsDNA) jest rozciągany za pomocą przepływu laminarnego i wizualizowany przy użyciu barwnika interkalującego. Pomiar pozycji rosnącego końca DNA w czasie rzeczywistym umożliwia precyzyjne określenie szybkości replikacji (Rycina 2). Ponadto długość gotowych produktów DNA pozwala na ocenę procesywności replikacji. Eksperyment ten można przeprowadzić w sposób bardzo prosty i szybki, a wymaga on jedynie mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednio czułą kamerą.

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy prostą metodę czasu rzeczywistego opartą na mikroskopii fluorescencyjnej, służącą do obserwacji replikacji DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek. Kolista, rozwidlona cząsteczka DNA...

W tej technice szklane krateczki przykrywki są funkcjonalizowane mieszaniną obojętnych cząsteczek PEG oraz cząsteczek PEG z biotyną. Z tej funkcjonalizowanej powierzchni tworzy się komorę przepływową, która zostaje umieszczona na mikroskopie TIRF. Biotynilowane matryce do amplifikacji metodą kroczącego kręgu są przytwierdzane do powierzchni przy użyciu wielowartościowej streptawidyny.Kiedy substraty są replikowane poprzez dodanie białek strefy replikacji i nukleotydów, powstały dwuniciowy DNA jest wydłużany za pomocą przepływu laminarnego i obrazowany w czasie rzeczywistym przy użyciu barwnika interpolującego. Cześć, jestem Nathan Tanner z laboratorium Antoine'a Van Dykna w Katedrze Chemii Biologicznej i Farmakologii Molekularnej w Harvard Medical School. Jestem Joe Laro, również z laboratorium Van Dykna.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę obrazowania fluorescencyjnego replikacji DNA w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczych cząsteczek. Wykorzystujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania skoordynowanej aktywności syntezy DNA poszczególnych kompleksów replikacyjnych. Zapraszamy do oglądania.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przeprowadzić hybrydyzację biotynilowanego oligonukleotydu ogonowego z jednoniciowym DNA M 13, dodając dziesioprotokną nadmiar oligonukleotydu w buforze TBS i podgrzewając do 65 °C, a następnie wyłączając blok grzejny, aby umożliwić powolne chłodzenie w celu prawidłowej hybrydyzacji primera. Po przygotowaniu primera M 13, należy dodać go do mieszaniny 64 nM polimerazy DNA T7 oraz buforu do replikacji T7 zawierającego dNDP i chlorek magnezu, a następnie inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 12 minut. Po zakończeniu inkubacji reakcję należy przerwać, dodając 100 mM EDTA.Następnie oczyść uzyskany produkt DNA za pomocą ekstrakcji fenolo-chloroformowo-izoamylalkoholowej i poddaj dializie do buforu TE lub innego odpowiedniego buforu do przechowywania, ponownie ekstrahując każdą fazę organiczną w celu odzyskania wszelkich pozostałości primera M 13. Po dializie określ stężenie DNA za pomocą spektrofotometru UV-vis. Jedna iteracja przygotowania matrycy pozwala uzyskać nanomolowe stężenie matrycy wystarczające do przeprowadzenia od setek do tysięcy eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami.Po przygotowaniu DNA należy przystąpić do przygotowania funkcjonalizowanych szkiełek nakrywkowych. DNA przeznaczone do replikacji jest przytwierdzone do szkiełek nakrywkowych zfunkcjonalizowanych aminolanem; grupa tlenkowa aminolanu wiąże się ze szkłem, pozostawiając grupę aminową dostępną do wiązania biotynylowanych cząsteczek PEG. Powłoka ta pomaga zredukować niespecyficzne wiązanie z powierzchnią.Aby dokładnie oczyścić szkiełka nakładkowe, należy umieścić je w naczyniach do barwienia i napełnić je etanolem, a następnie poddać sonikacji. Po 30 minutach naczynia należy wypłukać i napełnić jednomolowym wodorotlenkiem potasu. Następnie należy sonikować przez 30 minut i powtórzyć oba etapy mycia. Przed pierwszą reakcją funkcjonalizacji należy usunąć wszelkie ślady wody.Napełnić naczynia do barwienia acetonem i poddać działaniu ultradźwięków przez 10 minut. Opróżnić naczynia i ponownie napełnić je acetonem. Następnie dodać do naczyń odczyn sine i mieszać przez dwie minuty.Następnie przeprowadzić hartowanie, dodając duży nadmiar wody. Potem osuszyć szkiełkach nakrywkowych, wygrzewając je w piekarniku w temperaturze 110 °C przez 30 minut. Następnie przygotować mieszaninę PEG o stężeniu około 0,2% masy na objętość; użycie szklanego dystansera pozwoli na oddzielenie szkiełek nakrywkowych. Nanieść pipetą 100 µL na suche, sylinizowane szkiełko nakrywkowe.Na wierzchu umieść drugie szkiełko cover slip. Inkubuj szkiełka w roztworze PEG przez trzy godziny. Następnie rozdziel każdą parę szkiełek i dokładnie przemyj je wodą.Należy pamiętać, aby trzymać szkiełka nakrywki stroną funkcjonalizowaną do góry, ponieważ tylko jedna strona zostanie pokryta peg. Na koniec należy osuszyć szkiełka nakrywki sprężonym powietrzem i przechowywać je w próżni w eksykatorze; powierzchnie pozostają stabilne przez co najmniej miesiąc. Dzięki temu można przygotować kilkadziesiąt szkiełek nakrywek w jednej partii i wykorzystywać je w miarę potrzeb.Po przygotowaniu szkiełek podstawowych można złożyć komorę przepływową do eksperymentu z pojedynczymi cząsteczkami. Należy rozpocząć od przelania 20 do 25 ml buforu blokującego zawierającego BSA do desykatora, aby usunąć pęcherzyki powietrza niezbędne w kolejnych krokach. Następnie należy rozcieńczyć 25 µl streptawidyny w 100 µl PBS i rozprowadzić roztwór na powierzchni funkcjonalizowanego PEG szkiełka podstawowego; inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić związanie streptawidyny z biotyną powierzchniową, przygotowując w tym czasie pozostałe elementy komory.Podczas inkubacji szkiełka nakrywkowego utnij kawałek dwustronnej taśmy z podkładką po obu stronach, tak aby odpowiadał on rozmiarowi płytki kwarcowej użytej do montażu komory przepływowej. Ołówkiem zaznacz na taśmie położenie otworów na rurki, aby narysować na niej zarys komory przepływowej. Po zaznaczeniu otworów narysuj wokół nich prostokąt o szerokości dwóch milimetrów.Ten prostokąt będzie pełnił funkcję kanału przepływowego, dlatego należy zadbać o proste krawędzie i pozostawić miejsce wokół wlotu oraz wylotu rurki. Teraz przetnij zaznaczoną taśmę wzdłuż narysowanego obrysu, wykonując proste i czyste cięcia, aby mieć pewność, że żaden klej nie wystaje do wnętrza kanału. Dokładnie oczyść szkiełko kwarcowe acetonem, aby usunąć pozostałości kleju z konstrukcji komory przepływowej użytej w poprzednich doświadczeniach.Znajdź optymalne dopasowanie obrysu kanału. Zdejmij pasek zabezpieczający z jednej strony warstwy klejącej i ostrożnie przyłóż taśmę do szkiełka przedmiotowego. Pamiętaj o prawidłowym wyrównaniu taśmy, aby otwory wlotowe i wylotowe pozostały niezablokowane.Następnie przygotuj odpowiednie odcinki rurek o średnicy 0,76 milimetra dla wlotu i wylotu celi przepływowej. Zaleca się przycięcie końców rurek pod kątem około 30 stopni, aby zapobiec ich całkowitemu przyleganiu do dna komory. Zawieś rurki na statywach do probówek, co ułatwi ich podłączenie do celi przepływowej w kolejnych krokach.W tym momencie inkubacja szkiełka nakrywki dobiegła końca. Dokładnie wypłucz pokrytą przeciwciałem strep avid ENC nakrywkę wodą i osusz ją sprężonym powietrzem. Należy uważać, aby nie odwrócić nakrywki, ponieważ funkcjonalizowana jest tylko jedna jej strona.Na koniec zakończ montaż komory przepływowej, usuwając zabezpieczenie z drugiej strony taśmy i kładąc płytkę kwarcową na szkiełku nakrywce. Delikatnie naciśnij szkiełko nakrywce, aby usunąć uwięzione w kleju powietrze. Pomoże to zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanału przepływowego.Uszczelnij boki komory żywicą epoksydową. Wprowadź przecięte rurki do otworów w kwarcu, uszczelnij je żywicą epoksydową i pozostaw do wyschnięcia na kilka minut. Po wyschnięciu uszczelnienia z żywicy rozpocznij blokowanie powierzchni.Używając igły o rozmiarze 21 G, przepuść niewielką ilość buforu blokującego Degas przez jedną z rurek. Przepłucz układ kilka razy, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie pozostaw komorę do inkubacji przez co najmniej pół godziny przed przejściem do eksperymentu replikacji pojedynczych cząsteczek.Po zablokowaniu komory przepływowej należy umieścić ją na stoliku mikroskopu. Przymocować komorę za pomocą uchwytów stolika, upewniając się, że kanał przepływowy jest wyrównany wzdłuż osi y. Połączyć rurkę wylotową komory przepływowej z pompą strzykawkową, używając łącznika o większej średnicy.Umieść wlot w buforze blokującym i odciągnij tłok strzykawki, aby usunąć powietrze z rurki. Delikatne stuknięcie rurki wylotowej pomoże usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w celi przepływowej. Następnie dodaj DNA; rozcieńcz zapasowy matrycowy DNA do stężenia 25 picomolar w jednym mililitrze buforu blokującego i wprowadź go do komory z umiarkowaną prędkością przepływu, np. 0,025 mililitrów na minutę przez 30 minut, aby zapewnić odpowiednie pokrycie powierzchni przez DNA.Gdy DNA znajdzie się w komorze, wypłucz nadmiar DNA, stosując bufor blokujący przez co najmniej 200 objętości ogniwa przepływowego. Aby usunąć całe wolne DNA, włącz laser i kamerę. Chłodzony detektor CCD musi osiągnąć odpowiednią temperaturę przed rozpoczęciem pracy.Po wypłukaniu nadmiaru DNA i odgazowaniu buforu do replikacji, przygotuj mieszaninę do reakcji replikacji, zawierającą nukleotydy, DTT i cytoksynę w buforze do replikacji. Następnie dodaj białka i delikatnie wymieszaj. Po tym wprowadź mieszaninę reakcyjną do komory przepływowej.Prędkość przepływu w tym miejscu musi być wystarczająca, aby rozciągnąć dwuniciowy DNA. Dla kanału przepływowego o szerokości 2 mm i wysokości 100 µm odpowiednia wartość to 0,04 ml/min. Należy odczekać około 10 minut, aż mieszanina przedostanie się do komory.Przesuń pole widzenia na bok kanału i ustaw ostrość na materiale adhezyjnym, aby upewnić się, że obszar ostrzenia znajduje się blisko powierzchni przed rozpoczęciem obrazowania. Dostosuj moc lasera, ostrość mikroskopu oraz kąt nachylenia. Utrzymuj niską moc, aby uniknąć fotolizy barwionego DNA.Należy przeprowadzać akwizycję w tempie od jednej do pięciu klatek na sekundę przez kilka minut, w zależności od szybkości replikacji DNA. Czynność tę należy powtórzyć, aby uzyskać dłuższe trajektorie replikacji, lub przenieść się do nowego pola widzenia, aby zaobserwować więcej cząsteczek, gdy prawie cała mieszanina reakcyjna zostanie wpompowana do komórki; w celu obejrzenia innych pól widzenia należy dopompować więcej buforu z cyt. Wykonanie wielu obrazów różnych replikowanych cząsteczek pozwala na uzyskanie statystyk niezbędnych do określenia wydajności.W teście replikacji typu rolling circle synteza prowadząca wydłuża ogon łączący koło z powierzchnią; ogon ten zostaje przekształcony w dwuniciowe DNA przez polimerazę nici opóźnionej i rozciągnięty przez przepływ laminarny. Oto przykład pola widzenia z wykorzystaniem Cy3 orange przy pobudzeniu 532 nanometrami.Małe fluorescencyjne punkty to przywiązane substraty niepodzielone. Zwróć uwagę na ekstremalną długość produktów oraz ich dużą liczbę w jednym polu widzenia. Typowe pole widzenia wykaże liczne replikujące się cząsteczki, widoczne jako rosnące, jasne linie barwionego DNA. Eksperymenty z E Coli w 37 °C dają od pięciu do 50 cząsteczek na pole, w zależności od gęstości powierzchni.Strefa replikacji T7 inicjuje proces znacznie wydajniej i zreplikuje ponad 50% cząsteczek w polu widzenia. Przy tak wysokiej gęstości trudno jest rozdzielić poszczególne cząsteczki, co widać tutaj. Należy zatem przeprowadzić eksperyment z T7 przy niższych stężeniach białka lub mniejszej gęstości powierzchniowej. Wykresy Chime dla typowych replikujących się cząsteczek z e coli oraz eksperymentów T7 obejmują trajektorie końcowe cząsteczek z e coli i T7 wykreślone w funkcji czasu. Trajektorie dopasowano za pomocą regresji liniowej w celu uzyskania szybkości replikacji, które w tym przykładzie wynoszą 467,1 pz/s dla e coli oraz 99,4 pz/s dla T7.W przypadku T7 rozkłady prędkości trajektorii pojedynczych cząsteczek dopasowane do pojedynczych rozkładów Gaussa dają średnią wynoszącą 535,5 ± 39 par zasad na sekundę dla e coli oraz 75,9 ± 4,8 par zasad na sekundę. Dla T7 rozkłady długości produktów replikacji dopasowano do pojedynczego wykładniczego zaniku w celu wyznaczenia produktywności, która wynosi 85,3 ± 6,1 kilopar zasad dla e coli oraz 25,3 ± 1,7 kilopar zasad dla G7. W ten sposób zaprezentowaliśmy metodę pomiaru skoordynowanej replikacji DNA z wykorzystaniem pojedynczych cząsteczek.Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o prawidłowej funkcjonalizacji szkiełek nakrywkowych i stworzeniu czystych, prostych kanałów przepływu. Należy dbać o utrzymanie niskiej mocy lasera i minimalizację fotolizy długich cząsteczek DNA. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

visualizing-single-molecule-dna-replication-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja replikacji DNA pojedynczej molekuły za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

DT40, modelowy system genetyczny kręgowców, stanowi potężne narzędzie do analizy funkcji białek. Opisujemy tutaj prostą metodę umożliwiającą jakościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S w komórkach DT40 na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Wizualizacja replikacji DNA w kręgowym systemie modelowym DT40 z wykorzystaniem techniki włókien DNA

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

To badanie przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną do pomiaru dynamiki pętli dwuniciowego DNA za pomocą jednocząsteczkowego transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). Protokół opisuje również, w jaki sposób wyodrębnić zapętloną gęstość prawdopodobieństwa zwaną współczynnikiem J.

Badanie pętli DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji DNA-białko za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) przy użyciu specyficznie zmodyfikowanego substratu DNA λ i białka znakowanego kropkami kwantowymi.

Wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie modyfikowanym λ DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Protokół ten zapewnia szczegółowe operacje dotyczące przygotowania próbek, zbierania danych oraz analizy widm fluorescencji wewnętrznej DNA.

Spektroskopowe obrazowanie cząsteczek DNA z użyciem kontrastu wewnętrznego

Poznaj technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki do wizualizacji replikacji DNA w czasie rzeczywistym. Metoda umożliwia badanie koordynowanych aktywności syntezy DNA na poziomie pojedynczych kompleksów replikacyjnych.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów