Montaż, ładowanie i wyrównywanie analitycznej celi próbki ultrawirówki
5 listopada 2009
Komórka próbki analitycznej ultrawirówki (AUC) przechowuje próbkę i bufor referencyjny oraz podczas eksperymentów i jest wystawiona na działanie wysokiej próżni i prędkości wirnika do 60 000 obr./min. Ten film zademonstruje rygorystyczną dbałość o szczegóły niezbędną do montażu, obciążenia i wyrównania tego bardzo ważnego elementu eksperymentu AUC.
Cześć, nazywam się Andrea Balbo. Pracuję w grupie Petera Shucksa w National Institutes of Health. W tym filmie zademonstrujemy nasze procedury montażu, ładowania i wyrównywania wirnika analitycznej celi ultrawirówkowej.
Zacznijmy. Zebrane. Oto elementy analitycznej celi na próbki ultrawirówki Wewnątrz obudowy ogniwa znajduje się 12-milimetrowe dwusektorowe pole węgla drzewnego, centralny element eponu, który zostanie umieszczony między dwoma zespołami okien. Każdy zespół okienny składa się z uszczelki okiennej, wykładziny okiennej i okna umieszczonego wewnątrz uchwytu okiennego.
Elementy te zostaną następnie zsunięte w dół do obudowy ogniwa, wyrównując ich rowki wpustowe z kluczem znajdującym się wewnątrz cylindra obudowy, uszczelką obudowy, a następnie pierścieniem śrubowym zamykającym celę próbki przy ciśnieniu momentu obrotowego od 120 do 140 cali funtów. Po załadowaniu próbki do odniesienia dwie uszczelki wtyczki obudowy i zaślepka obudowy uszczelniają otwory załadowcze ogniwa, aby uniknąć artefaktów skanowania, wycieków i pęknięć podczas eksperymentów, ważne jest, aby wszystkie elementy były czyste, suche, wolne od kurzu i w jak najlepszym stanie, często sprawdzane i wymieniane w razie potrzeby. Potrzebne będą również: ultrawirówka analityczna, tytanowy wirnik czterootworowy, waga laboratoryjna, klucz dynamometryczny z czytelną tarczą i stojakiem na moment obrotowy, przeciwwaga i odważniki przeciwwagi, śrubokręt płaski, para kleszczyków, pipeter o pojemności 200 mikrolitrów wyposażony w długą, stożkową końcówkę pipety, narzędzia do wyrównywania i smar do wirowania.
Budowę celi próbnej rozpoczynamy od złożenia dwóch zestawów okiennych. Najpierw umieść uszczelkę okienną w dolnej części uchwytu okiennego. Następnie umieść wykładzinę okienną, lub czasami nazywa się to poduszką okienną wewnątrz uchwytu okiennego, tak aby otwór wkładki znajdował się naprzeciwko rowka wpustowego uchwytu pod niewielkim kątem.
Następnie umieść okienko w uchwycie, wyrównując rysę na oknie z rowkiem wpustowym uchwytu okiennego. Delikatnie dociśnij na samych krawędziach po obu stronach okna. Aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie i dokładne twerkowanie celi próbki, lekko pokrywamy uszczelkę obudowy w pierścieniu śrubowym.
Za pomocą lubrykantu do spin coat rozprowadź bardzo małą ilość spin coat między kciukiem a palcem wskazującym. Pokryj gwinty pierścieni śrubowych cienką, niewidoczną warstwą powłoki spinowej. Podobnie pokryj uszczelkę obudowy.
Zetrzyj wszelkie widoczne smary. Aby rozpocząć składanie celi próbki. Wsuń jeden zespół okien z oknem skierowanym do góry do obudowy ogniwa, wyrównując rowek wpustowy z kluczem obudowy.
Dopasuj rowek wpustowy elementu środkowego do klucza obudowy i pozwól mu delikatnie opaść na zespół okienny wewnątrz obudowy. Nigdy nie używaj żadnych narzędzi do wciskania centralnego elementu w obudowę ogniwa. Może to spowodować trwałe uszkodzenie centralnego elementu, co spowoduje eksperymenty z przechowywaniem przecieków.
Obróć drugi zespół okna tak, aby okno było skierowane w stronę elementu centralnego i od Ciebie. Dopasuj rowek wpustowy do klucza obudowy i przesuń go w dół na środek. Umieść uszczelkę obudowy na górze.
Następnie pierścień śrubowy, aby słowo na zewnątrz było widoczne. Za pomocą palców. Następnie za pomocą narzędzia do wyrównywania ręcznie dokręć pierścień śrubowy.
Zdarza się, że centralna część nie wsuwa się łatwo w lufę obudowy. Możesz najpierw wyrównać go, a następnie umieścić na nim drugi zespół okna. Wywierając delikatny nacisk w dół na zespół okienny.
Oba ogniwa można wsunąć do obudowy ogniwa w tym samym czasie. W ten sposób unikamy bezpośredniego naciskania na centralny element. Teraz jest dobry moment, aby przeszukać komórkę pod kątem kurzu, kłaczków i odcisków palców.
Zauważysz również pierścienie Newtona, które wskazują, że między centralnym elementem a oknami nadal jest powietrze. Znikną one po dokręceniu z pierścieniem śrubowym do góry i widocznym napisem na zewnątrz. Umieść próbkę do samego dołu wewnątrz komórki.
Tuleja reakcyjna stojaka dynamometrycznego. Przytrzymaj ogniwo na miejscu, wywierając stały nacisk na uchwyt stojaka dynamometrycznego. Jednym ciągłym ruchem dokręć pierścień śrubowy momentem od 120 do 140 cali funtów.
Zwolnij uchwyt stojaka dynamometrycznego i ostrożnie wyjmij celę próbki. Rutynowo ładujemy objętość 400 mikrolitrów do każdego sektora 12-milimetrowego elementu centralnego. Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów umieść celę próbki tak, aby otwory załadowcze znajdowały się na górze, a słowo na zewnątrz było widoczne.
Wsuń końcówkę pipety do połowy w dół do lewego środkowego sektora przez otwory załadowcze i powoli dozuj 200 mikrolitrów roztworu referencyjnego. Powtórz raz, aby uzyskać łącznie 400 mikrolitrów, używając tej samej końcówki pipety i tej samej techniki, ostrożnie i powoli. Napełnij prawy sektor centralny 400 mikrolitrami roztworu próbki.
Konieczne jest jak najdokładniejsze dopasowanie objętości roztworów referencyjnych i próbek. Mocne dopasowanie końcówki pipety do pipety, powolne ładowanie i dozowanie roztworów, unikanie ładowania pęcherzyków powietrza i używanie tej samej końcówki pipety do obu roztworów. Cała pomoc w utrzymaniu równych objętości w celu uszczelnienia komórki.
Umieść dwie czerwone uszczelki zaślepki obudowy ciasno w każdym otworze załadunkowym, upewniając się, że są one starannie umieszczone między częścią środkową a aluminiową obudową. Zakryj każdy otwór załadunkowy zaślepką obudowy i dokręć ręcznie małym płaskim śrubokrętem. Przed załadowaniem wirnika upewnij się, że przeciwwaga i ogniwo, które będzie znajdować się naprzeciwko przeciwwagi, nie przekraczają 0.5 grama wagi.
Zacznij od salda na poziomie zerowym. Najpierw zważ celę próbki, która będzie znajdować się naprzeciwko przeciwwagi. Rozerwij wagę, aby odjąć masę próbki komórki.
Następnie zważ przeciwwagę. Tutaj okazuje się, że przeciwwaga jest o 4,193 grama lżejsza niż cela próbki. Wybierz czterogramowy ciężarek przeciwwagi i przykręć go do otworu mocującego przeciwwagi, upewniając się, że nie wystaje z góry.
Zmień przeciwwagę, aby upewnić się, że ostateczna waga mieści się w granicach 0,5 grama. Za pomocą wirnika z czterema otworami umieść przeciwwagę w pozycji czwartej, tak aby biała strzałka była widoczna i skierowana w kierunku siły odśrodkowej. Za pomocą narzędzia do wyrównywania upewnij się, że jest ono całkowicie zanurzone w wirniku.
Umieść celę na próbkę wagi tak, aby zaślepki obudowy były skierowane do środka wirnika, a napis na zewnątrz był widoczny na pierścieniu. Ponownie, używając narzędzia do wyrównywania, upewnij się, że jest ono całkowicie zanurzone w wirniku. Patrząc od spodu wirnika.
Wyrównaj wnętrze. Rysik, zaznacz znak znajdujący się najbliżej środka wirnika za pomocą rysika na przeciwwadze Za pomocą narzędzia do wyrównywania. W ten sam sposób wyrównaj próbkę w pozycji drugiej.
Po wyrównaniu wszystkich komórek wirnik jest gotowy do umieszczenia w komorze wirówki.
Przegląd
To wideo demonstruje montaż, ładowanie i wyrównanie komórki próbkowej ultrawirówki analitycznej (AUC), co jest kluczowe dla eksperymentów AUC. Podkreśla się właściwe postępowanie i przygotowanie komponentów komórki próbkowej, aby zapewnić dokładne wyniki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ultrawirówka analityczna
- Metody biofizyczne
- Techniki przygotowywania próbek
Tło
- Komórka próbkowa AUC jest niezbędna do przeprowadzania eksperymentów przy wysokich prędkościach wirnika.
- Składa się z wielu komponentów, które muszą być zmontowane precyzyjnie.
- Zachowanie czystości i prawidłowego wyrównania jest kluczowe, aby uniknąć artefaktów eksperymentalnych.
- Zrozumienie procesu montażu jest niezbędne dla badaczy korzystających z AUC.
Cel badania
- Dostarczyć szczegółowego przewodnika po montażu i ładowaniu komórki próbkowej AUC.
- Podkreślić znaczenie rzetelnej przygotowania w eksperymentach AUC.
- Upewnić się, że badacze mogą dokładnie powtórzyć proces.
Zastosowane metody
- Montaż złożeń okiennych i środka komórki w komórce próbkowej.
- Zastosowanie momentu obrotowego w celu zabezpieczenia komponentów komórki próbkowej.
- Ładowanie roztworów referencyjnych i próbkowych do komórki.
- Uzbrajanie komórki próbkowej z przeciwwagą dla dokładnych pomiarów.
Główne wyniki
- Sukces montażu komórki próbkowej AUC zademonstrowany w wideo.
- Właściwe techniki ładowania zapewniają minimalne bąbelki i równe objętości.
- Korekty przeciwwagi są kluczowe dla dokładnej wydajności wirnika.
- Wizualne wskaźniki, takie jak pierścienie Newtona, pomagają ocenić jakość montażu.
Wnioski
- Uważność w detalach podczas montażu komórki próbkowej jest niezbędna dla eksperymentów AUC.
- Stosowanie się do opisany proces może zwiększyć niezawodność eksperymentu.
- Zaleca się regularną konserwację i inspekcję komponentów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Proper assembly and alignment of analytical ultracentrifuge sample cells are critical for generating reliable biophysical data on protein size, shape, purity, and oligomerization states. Meticulous sample cell preparation minimizes experimental artifacts, ensuring data integrity for target validation and mechanistic studies in early drug discovery. This procedural rigor supports predictive confidence in downstream screening and lead optimization workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise determination of protein oligomerization states and protein-protein interactions, directly informing target validation hypotheses.
- Operational Value: Provides label-free, solution-based assessment of macromolecular properties under near-native conditions.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity in target de-risking by delivering quantitative sedimentation coefficients and shape parameters.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers hydrodynamic size and shape data essential for assay buffer formulation and stability screening.
- Operational Value: Ensures sample integrity and monodispersity, critical for reproducible biochemical and cell-based assays.
- Platform Integration: Supports biophysical characterization of purified targets prior to high-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables assessment of protein complex formation and conformational changes relevant to disease mechanisms.
- Operational Value: Supports lot-to-lot consistency checks of recombinant proteins used in preclinical models.
- Translational Continuity: Bridges biophysical target characterization with functional assays in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The analytical ultracentrifuge sample cell workflow integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform go/no-go decisions based on target behavior and stability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of target oligomerization and interaction networks, enabling biological de-risking prior to assay development.
- Screening: Ensures target monodispersity and stability, directly impacting assay readiness and data quality in screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative sedimentation coefficient and molecular weight measurements that allow comparison of protein states under varying conditions.
- Translational Research: Connects purified target biophysics to functional validation in preclinical models through consistent material quality.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, reusable capability for biophysical characterization across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target properties, reduction of mechanistic ambiguity, and improved target validation rigor.
- Operational Value: Standardized sample preparation, reproducibility across runs, and scalability across laboratories.
- Strategic Value: Better-informed go/no-go decisions, reduced failure rates due to target instability, and improved capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted target prioritization based on biophysical de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biophysical techniques and precision handling of optical components.
- Dependent on analytical ultracentrifuge instrumentation, torque wrenches, alignment tools, and cleanroom-compatible sample handling.
- Necessitates cross-team standardization of cleaning, assembly, and torque application protocols.
- Involves adaptation considerations for different sample types, buffer conditions, and centerpiece geometries.
- Limited by component fragility; windows and centerpieces are susceptible to damage from particulates, improper torque, or misalignment.
