Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Aby zbadać dynamikę pojedynczych cząsteczek w dłuższym przedziale czasowym, cząsteczki te muszą zostać najpierw zlokalizowane w przestrzeni. Osiągamy to poprzez ich unieruchomienie na powierzchni komory mikrofluidycznej. Procedura rozpoczyna się od montażu komory, która zawiera cztery obszary, w których zostaną utrwalone biomolekuły.

Komory są połączone z zewnętrzem za pomocą kapilar wlotowych i wylotowych. Ogniwo wykonuje się poprzez połączenie strukturyzowanej płytki z PDMS z szkiełkiem podstawowym z kwarcu. Zmontowane ogniwo zostaje następnie umieszczone na mikroskopie fluorescencyjnym, a do kapilar podłącza się elastyczne rurki, co umożliwia łatwą wymianę roztworów w komorach; aby najpierw aktywować powierzchnię pod immobilizację cząsteczek, należy przepuścić roztwór biotynilowanego BSA przez jeden z kanałów.

BSA zaadsorbuje się do komory. Następnie na powierzchnie należy przepuścić roztwór streptawidyny, która z kolei zwiąże się z biotyną. Na koniec przepuść biotynilowany oligonukleotyd, który zwiąże się ze streptawidyną, kotwicząc w ten sposób interesującą cząsteczkę na powierzchni kwarcowej lamellki.

Bufor obrazujący, zaprojektowany w celu maksymalizacji stabilności czasowej i intensywności fluoroforów, jest przepływany przez komorę ze stałą prędkością przez cały okres akwizycji. Zautomatyzowany układ skanuje różne sekcje powierzchni w poszukiwaniu cząsteczek posiadających zarówno fluorofor donora, jak i akceptora, a następnie przesuwa je pojedynczo do objętości sondowania, uzyskując dla każdej z nich przebieg intensywności fluorescencji w czasie aż do fotowybielenia obu fluoroforów. Cześć, jestem Nicholas Dfi z laboratorium profesora Millera na wydziale inżynierii biomedycznej na Boston University.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę uzyskiwania śladów F pojedynczych cząsteczek z unieruchomionych kwasów nukleinowych przy użyciu układu konfokalnego. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania dynamiki kwasów nukleinowych oraz oddziaływań między kwasami nukleinowymi a enzymami. Zapraszamy do oglądania.

Urządzenie Microfluid Excel powstaje poprzez połączenie wzorowanego krążka z polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 2 mm z uprzednio oczyszczonym szkiełkiem kwarcowym. Aby przygotować wzorowany krążek PDMS, należy połączyć 10 części bazy elastomeru silikonowego z jedną częścią utwardzacza, dokładnie wymieszać i odgazować przez jedną godzinę w próżni. Po odgazowaniu bazy elastomerowej, należy ostrożnie wlać ją do formy komórki mikrofluidycznej.

Pozostaw mieszankę elastomeru do utwardzenia na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C przez dwie godziny. Po utwardzeniu ostrożnie oddziel krążek PDMS od formy za pomocą żyletki. Krążek PDMS zawiera cztery prostokątne komory o pojemności 30 µL każda.

Przytrawcie i połączcie płaską stronę dysku z PDMS (tą, która nie zawiera kanałów) z jednocalowym okienkiem szklanym poprzez utlenianie obu powierzchni plazmą przez 30 sekund. Okienko szklane posiada osiem wcześniej wywierconych otworów o średnicy 2 mm, znajdujących się na obu końcach kanałów. Następnie przez każdy otwór w okienku szklanym wprowadza się elastyczną kapilarę z topionej krzemionki o długości dwóch cali.

Aby to zrobić, najpierw wprowadź igłę, a następnie wsuń rurkę kapilarną, aż dotrze ona do kanału. Uszczelnij otwory w szklanym okienku, używając szybko utwardzającego się silikonowego związku odlewniczego, takiego jak quick cast. Przepłucz kanały etanolem i wodą po aktywacji plazmowej komórki oraz świeżo oczyszczonego w roztworze piranhy okrągłego szkiełka zakrywy kwarcowego o średnicy jednej cala przez 30 seconds.

Przytop szkiełko nakrywkowe do boku celi zawierającej kanały. Komory są teraz uszczelnione. Pozostaw zmontowaną celę do utwardzenia na noc w temperaturze pokojowej.

Po utwardzeniu zmontowanej komórki mikroprzepływowej w ciągu nocy, należy umieścić ją w specjalnie wykonanym uchwycie i zamontować na stole mikroskopu konfokalnego, aby rozpocząć aktywację powierzchni komórki. W celu unieruchomienia cząsteczek należy podłączyć elastyczne rurki do kapilar komórki, co ułatwi wstrzykiwanie buforu za pomocą strzykawki i igły. Następnie należy wstrzyknąć do kanału roztwór biotynilowanej BSA o stężeniu 0,1 mg/mL w buforze A i inkubować przez co najmniej 30 minut.

Po 30-minutowej inkubacji przepuść od 300 do 500 µL buforu A, aby usunąć z kanału niezwiązane biotynylowane BSA, uważając, aby w komorze nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Następnie wstrzyknij roztwór STR din w stężeniu 0,1 mg/mL w buforze A i inkubuj przez 15 minut.

Po 15-minutowej inkubacji przepuść od 300 do 500 µL buforu A, aby usunąć z kanału wszelkie niezaabsorbowane streptawidyny. Podobnie jak wcześniej, należy unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza w komorze. Na koniec przepuść roztwór biotynilowanej próbki o stężeniu od trzech do pięciu pM.

Aby sprawdzić pokrycie cząsteczkami fluorescencyjnymi, przeprowadza się skanowanie powierzchni. Próbkę biotynilowaną inkubuje się przez 10 minut, a następnie powtarza przepływ buforu. Jak wykazano wcześniej, bufor obrazujący (IB) składa się z enzymatycznego układu usuwającego tlen oraz wygaszacza tripletów, takiego jak trolox, aby najpierw rozpuścić IB.

Pięć miligramów TRO lock rozpuszczono w 10 mililitrach buforu glukozowego poprzez mieszanie w wirówce typu vortex przez kilka minut oraz wstrząsanie przez co najmniej 10 minut. Roztwór przefiltrowano i poddano odgazowaniu w próżni przez 10 minut. Roztwór TRO lock delikatnie zmieszano z roztworem enzymatycznym Glocky, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.

Napełnić zbiornik roztworem IB. Następnie, używając mechanicznej pompy strzykawkowej, kontrolować szybkość przepływu, przepływając IB przez kanał ze stałą prędkością 5 µL/min; do zbiornika IB wprowadzać argon, aby zapobiec rozpuszczaniu tlenu atmosferycznego w buforze. Skanowanie powierzchni, lokalizacja cząsteczek i pozyskiwanie śladów intensywności pojedynczych cząsteczek są kontrolowane przez program LabVIEW, który skanuje obszary o wymiarach 20 x 20 µm² z rozdzielczością 0,2 µm przy prędkości 0,1 µm/ms.

Dane z mapowania powierzchni są natychmiast przetwarzane w celu wyznaczenia lokalizacji wszystkich pikseli powyżej poziomu tła, ważonych intensywnością. Po odnalezieniu unieruchomionych cząsteczek są one kolejno przenoszone do objętości konfokalnej, a intensywności fluorescencji donora i akceptora są rejestrowane w funkcji czasu, aż do momentu fotowyblechania obu fluoroforów. Następnie stolik jest programowany tak, aby przenieść się do nowego punktu początkowego w odległości 100 mm, a proces mapowania zostaje powtórzony.

Tutaj przedstawiono zmontowany układ MICROFLUID Excel. Są to skany powierzchni ukazujące pojedyncze cząsteczki w zielonym kanale donora i czerwonym kanale akceptora. Przedstawiono również kilka typowych śladów pojedynczych cząsteczek, na których intensywność akceptora zaznaczono na czerwono, a donora na zielono.

Właśnie pokazaliśmy, jak uzyskać ślady pojedynczych cząsteczek z unieruchomionych biomolekuł przy użyciu układu konfokalnego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby każdy krok przeprowadzić starannie i bez pośpiechu, ponieważ jest to wymagający eksperyment. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.