Name: Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek biomolekuł unieruchomionych powierzchniowo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Poznaj metodę FRET dla pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych w komórce mikroprzepływowej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki kwasów nukleinowych i ich interakcji z enzymami w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Chandranowi Sabanayagamowi za pomoc w opracowaniu systemu, Joshui Edel za porady dotyczące projektowania urządzenia mikroprzepływowego oraz pracownikom Instytutu Rowlanda na Uniwersytecie Harvarda za wykonanie części zestawu. Podziękowania kierujemy również do członków grupy Meller w Instytucie Rowlanda i na Uniwersytecie Bostońskim, a także do członków grupy T. Ha na UIUC za pomocne informacje i wartościowe dyskusje. Na koniec wyrażamy wdzięczność za wsparcie finansowe z National Science Foundation (PHY-0701207) oraz National Institute of Health (GM075893).

1 - Montaż celi mikrofluidycznej
Komora mikroprzepływowa jest wykonana poprzez połączenie wzorowanego dysku z polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 2 mm z nowo oczyszczonym szkiełkiem kwarcowym. Dysk PDMS zawiera cztery prostokątne komory o pojemności 30 μl, do których dostęp prowadzi poprzez elastyczne kapilary wlotowe i wylotowe, odpowiednio podłączone do zbiornika z buforem i pompy strzykawkowej, w celu kontrolowanego przepływu buforu. Komora przepływowa jest wsparta od tyłu szklanym okienkiem i umieszczona w specjalnie wykonanym uchwycie komory zawierającym chłodzony wodą element termoelektryczny do regulacji temperatury.
<ol>
 <li>Aby przygotować wzorowany dysk PDMS, wymieszać 10 części bazy elastomeru silikonowego z 1 częścią utwardzacza, dokładnie wymieszać i pozostawić do odpowietrzenia w próżni przez 1 godzinę.</li>
 <li>ostrożnie wylać mieszaninę elastomeru na formę komórki mikrofluidycznej. W naszym przypadku jest to podłoże krzemowe o średnicy 1", z czterema pasmami (1x104 x 1x103 x 300 μm) wykonanymi z negatywowego fotorezystu. Pozostawić do utwardzenia na płycie grzewczej w temperaturze 70° C przez dwie godziny.</li>
 <li>Ostrożnie oddzielić utwardzony dysk PDMS od formy za pomocą żyletki. Przymocować dysk do okienka szklanego o średnicy 1" (zawierającego 8 nawierconych otworów o średnicy 2 mm na obu końcach kanałów) poprzez utlenianie obu powierzchni plazmą przez 30 sekund. Przymocować okienka szklane do płaskiej strony dysku PDMS (strony nie zawierającej kanałów).</li>
 <li>Wprowadzić elastyczną kapilarę z topionego kwarcu o długości 2 cali przez każdy otwór w okienku szklanym, aż dotrze ona do kanału. Wprowadzenie najpierw igły, a następnie kapilary może ułatwić ten proces. Uszczelnić otwory w okienku szklanym za pomocą szybko utwardzającej się silikonowej masy odlewniczej, takiej jak Kwik-Cast.</li>
 <li>Przepłukać kanały etanolem i wodą, a następnie aktywować plazmą komórkę wraz ze świeżo oczyszczonym, okrągłym szkiełkiem kwarcowym o średnicy 1" przez 30 sekund. Sugerujemy oczyszczenie tego szkiełka za pomocą roztworu piranha*. Przymocować szkiełko do strony komórki zawierającej kanały, uszczelniając komory.</li>
 <li>Pozostawić zmontowaną komórkę do utwardzenia przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
* Piranha to roztwór H2O2 i H2SO4 w proporcjach 1:2,5. Aby oczyścić szkiełka nakrywki, zanurz je w roztworze piranha w temperaturze 90° C na 20 min.
2 - Aktywacja powierzchni w celu immobilizacji cząsteczek
W badaniach nad kwasami nukleinowymi najprostszy schemat immobilizacji powierzchniowej polega na uprzednim pokryciu szklanego lub kwarcowego szkiełka przedmiotowego biotynilowaną albuminą surowicy bydlęcej (BSA), a następnie streptawidyną. Pozwala to na immobilizację biotynilowanej próbki z wysoką specyficznością przez wiele dni w temperaturze pokojowej.
<ol>
 <li>Podłączyć elastyczne rurki do kapilar, aby umożliwić łatwe wstrzykiwanie buforu za pomocą strzykawki i igły.</li>
 <li>Wstrzyknąć do kanału roztwór biotinylowanego BSA o stężeniu 0.1 mg/ml w buforze A (10 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, przefiltrowanym przez filtry 0.02 μm) i inkubować przez co najmniej 30 min.</li>
 <li>Przepłukać kanał 300-500 μl buforu A, aby usunąć wolny biotinylowany BSA, uważając, aby w komorze nie powstały pęcherzyki powietrza.</li>
 <li>Wstrzyknąć roztwór streptawidyny o stężeniu 0.1 mg/ml w buforze A i inkubować przez 15 min. Następnie powtórzyć krok 3.</li>
 <li>Przepuścić roztwór biotinylowanej próbki o stężeniu 3-5 pM. Wykonać skanowanie powierzchni, aby sprawdzić stopień pokrycia cząsteczkami fluorescencyjnymi. W razie potrzeby zwiększyć stężenie próbki w celu uzyskania lepszego pokrycia. Inkubować przez 10 min i powtórzyć krok 3.</li>
</ol>
Komórka mikroprzepływowa jest zamontowana na zmotoryzowanym stoliku x-y, który umożliwia ruchy grube (do 25 mm) za pomocą silników DC z kodowaniem optycznym oraz ruchy precyzyjne (1 nm) za pomocą dwóch zamkniętych piezoaktuatorów (Physik Instrumente model M-014 lub podobny). Można to wykonać zarówno przed, jak i po aktywacji powierzchni w celu unieruchomienia próbki.
3 - Przygotowanie buforu obrazowania (IB)
IB składa się z enzymatycznego układu usuwającego tlen oraz wygaszacza tripletów, takiego jak Trolox. Ponieważ IB jest stale przepłukiwany przez całą noc, należy wcześniej przygotować co najmniej 10 ml.
<ol>
 <li>Przygotować 10 ml 0,8% w/v D-glukozy, co najmniej 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 oraz 50 mM NaCl w wodzie dejonizowanej. Wyższe stężenie buforu jest istotne z dwóch powodów: rozpuszczenie Troloxu zakwasi roztwór, a reakcja enzymatyczna również spowoduje obniżenie pH roztworu w czasie. Ponieważ roztwór ten ma długi okres trwałości, można go przechowywać jako roztwór zapasowy.</li>
 <li>Rozpuścić 5 mg Troloxu w buforze przygotowanym w kroku 1, mieszając go na wirówce typu vortex przez kilka minut, a następnie wstrząsając przez &gt;10 min. Trolox nie jest bardzo rozpuszczalny w wodzie przy pH &gt; 7, dlatego nie należy przyspieszać tego etapu. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i pozostawić do odgazowania w próżni przez 10 minut.</li>
 <li>Przygotować enzymatyczny roztwór „gloxy”, mieszając 60 μl wody, 20 μl buforu A 5X, 20 μl katalazy, 1 mg oksydazy glukozowej oraz 100 μl BSA w stężeniu 10 mg/ml. Przefiltrować roztwór za pomocą wirówkowego filtra 0,22 μm.</li>
 <li>Delikatnie zmieszać bufor z kroku 2 z roztworem „gloxy” z kroku 3, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Przeprowadzić IB przez kanał ze stałą prędkością 5 μl/min, używając mechanicznej pompy strzykawkowej do kontrolowania szybkości przepływu. Przebąblować zbiornik IB argonem, aby zapobiec ponownemu rozpuszczaniu tlenu atmosferycznego w buforze.</li>
</ol>
Skanowanie powierzchni, lokalizacja cząsteczek i akwizycja śladów intensywności pojedynczych cząsteczek są sterowane programem LabView, który umożliwia zautomatyzowany pobór danych1. Program skanuje obszary o wielkości 20x20 μm2 z rozdzielczością 0,2 μm i prędkością 0,1 μm/ms. Dane są natychmiast przetwarzane w celu uzyskania lokalizacji ważonych intensywnością dla wszystkich pikseli przekraczających poziom tła. Po zlokalizowaniu unieruchomionych cząsteczek są one sukcesywnie przesuwane do objętości konfokalnej, a intensywności fluoroforu donora i akceptora są rejestrowane w funkcji czasu aż do fotowyblechowania obu fluoroforów. Następnie stolik jest programowany tak, aby przesunąć się do nowego punktu początkowego oddalonego o 100 μm, a proces skanowania zostaje powtórzony.
4 - Reprezentatywne wyniki
Poniżej znajdują się obrazy przedstawiające zmontowaną komórkę mikrofluidyczną przed aktywacją powierzchni oraz po zamontowaniu na mikroskopie w celu immobilizacji cząsteczek. Jeśli kanał zostanie pomyślnie aktywowany, skany powierzchni powinny być zbliżone do przedstawionych poniżej skanów, wykazujących emisję barwnika donora (zielony) i akceptora (czerwony) po bezpośrednim wzbudzeniu donora. Cząsteczki te są wprowadzane pojedynczo do objętości sondowania, a fluorescencja jest rejestrowana w czasie aż do fotowybielenia obu barwników, co pokazano na śladach pojedynczych cząsteczek. Z takich śladów można wyznaczyć wydajność FRET, która dostarcza informacji o chwilowym oddaleniu donora od akceptora, co z kolei jest wykorzystywane do badania struktury i dynamiki cząsteczek o znaczeniu biologicznym.
<img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Schemat urządzenia mikrofluidycznego, metoda chromatograficzna, przedstawiająca kanały płynowe i działanie kapilarne." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Komórka mikrofluidyczna z czterema kanałami, każdy z kapilarami wlotowymi/wylotowymi. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.
<img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Układ wzbudzenia optycznego z komponentami spektroskopowymi, schemat analizy emisji i dopasowania widma." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2: Komórka zamontowana na mikroskopie, gotowa do pomiarów. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.
<img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Układ spektroskopii absorpcji przejściowej; system pomiaru wzbudzenia optycznego i emisji." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3: Układ do pomiarów sm-FRET. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 3.
<img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, rozkład komórek, mapa intensywności, eksperyment z biologii komórkowej." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; analiza rozkładu białek w macierzy komórkowej; skala intensywności." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> Ryciny 4 i 5: Kanał czerwony i zielony skanu powierzchni unieruchomionych cząsteczek FRET wzbudzonych zielonym laserem. Proszę kliknąć, aby zobaczyć powiększoną wersję <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">ryciny 4</a> lub <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">ryciny 5</a>.
<img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Wykres czasu emisji fotonów; ślad czerwono-zielony w pomiarze optycznym; analiza fluktuacji danych." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Wykres detekcji fotonów; liczba fotonów na ms w funkcji czasu, legenda dla analizy wzbudzenia optycznego." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Wykres analizy emisji fotonów pokazujący intensywność w funkcji czasu, ilustrujący przemiany absorpcji przejściowej." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Wykres liczby fotonów, czas w funkcji liczby fotonów na ms, emisja fluorescencyjna, analiza danych." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 9"> Ryciny 6, 7, 8 i 9: Trajektorie intensywności fluoroforów donora (zielony) i akceptora (czerwony) przyłączonych do cząsteczki DNA w odległościach 8, 10, 16 i 18 par zasad. Kliknij, aby zobaczyć powiększoną wersję 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">ryciny 6</a>, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">ryciny 7</a>,<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">ryciny 8</a> lub <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">ryciny 9</a>.

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules%3A+Corrections+due+to+nonideal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li>
<li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

Chociaż powyższy protokół został zoptymalizowany dla naszego konkretnego układu oraz dla specyficznego doboru barwników (TMR i ATTO647N), nie jest on jedyną sprawdzoną metodą. Niedawno wykazano, że alternatywny system usuwania tlenu, składający się z kwasu protokatechowego (PCA)/protokatechuranu-3,4-dioksygenazy (PCD), zwiększa fotostabilność niektórych barwników4. Podobnie, zamiast Troloxu można zastosować inne wygaszacze stanu tripletowego, takie jak β-merkaptoetanol (BME), choć mogą one nie hamować długotrwałego migotania niektórych barwników, w szczególności Cy55.
Choć unieruchomienie poprzez biotynę-streptawidynę-biotynilowaną albuminę surowicy bydlęcej (BSA) jest preferowaną metodą w badaniach kwasów nukleinowych, powierzchnia powleczona glikolem polietylenowym (PEG) jest bardziej odpowiednia do badań białek, ponieważ zapobiega niespecyficznej adhezji1. Dodatkowo w przypadkach, gdy cząsteczka biologiczna może ulegać oddziaływaniom powierzchniowym, można zastosować pęcherzyki o rozmiarze poniżej limitu dyfrakcyjnego do enkapsulacji badanej biomolekuły6.
W niniejszym artykule wykorzystaliśmy układ konfokalny wyposażony w krzemowe fotodiody lawinowe do rejestracji przebiegów intensywności fluorescencji. Protokół ten sprawdza się równie dobrze w mikroskopach fluorescencyjnych z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) wyposażonych w kamery CCD. Niezależnie od zastosowanej metody mikroskopii, sm-FRET może dostarczać informacji o rozdzielczości przestrzennej zbliżonej do angstremów, pod warunkiem właściwej korekty sygnału donora i akceptora7.

<table><tbody><tr><td>Kapilary z topionego szkła kwarcowego</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>Kryszalka z topionego szkła kwarcowego</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>Przewody</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowana BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw elastomerowy Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>Zestaw elastomeru silikonowego</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz Kwik-Cast</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>Silikonowa masa odlewnicza</td></tr></tbody></table>

zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Mikroskopia z wykorzystaniem transferu energii między fluoroforami (FRET) jest powszechnie stosowana do badania struktury i dynamiki cząsteczek o znaczeniu biologicznym, takich jak kwasy nukleinowe i białka. Pomiary FRET na pojedynczych cząsteczkach (sm-FRET) unieruchomionych cząsteczek umożliwiają długotrwałe obserwacje układu – skutecznie aż do czasu fotowybielenia obu barwników – co pozwala na uzyskanie przebiegów czasowych informujących o dynamice biomolekularnej w szerokim zakresie skal czasowych, od milisekund do minut. Aby ułatwić pozyskanie dużej liczby przebiegów do analiz statystycznych, proces ten musi zostać zautomatyzowany, a środowisko próbki powinno być ściśle kontrolowane przez cały czas pomiaru (~12 godzin). Jest to realizowane przy użyciu zautomatyzowanego skanującego mikroskopu konfokalnego, który pozwala na badanie tysięcy pojedynczych cząsteczek w ciągu nocy, oraz komórki mikroprzepływowej, która umożliwia kontrolowaną wymianę buforu z ograniczoną zawartością tlenu i utrzymuje stałą temperaturę przez cały okres pomiarowy. W niniejszej pracy pokazujemy, jak złożyć urządzenie mikroprzepływowe i jak aktywować jego powierzchnię w celu unieruchomienia DNA. Następnie wyjaśniamy, jak przygotować bufor, aby zmaksymalizować fotostabilność i czas życia fluoroforów. Na koniec przedstawiamy kroki niezbędne do przygotowania układu do zautomatyzowanego pozyskiwania rozdzielczych w czasie przebiegów sm-FRET dla cząsteczek DNA.

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Mikroskopia z wykorzystaniem transferu energii między fluorescencyjnymi donorami i akceptorami (FRET) jest powszechnie stosowana do badania struktury i dynamiki cząsteczek o znaczeniu biologicznym, ...

Aby zbadać dynamikę pojedynczych cząsteczek w dłuższym przedziale czasowym, cząsteczki te muszą zostać najpierw zlokalizowane w przestrzeni. Osiągamy to poprzez ich unieruchomienie na powierzchni komory mikrofluidycznej. Procedura rozpoczyna się od montażu komory, która zawiera cztery obszary, w których zostaną utrwalone biomolekuły.Komory są połączone z zewnętrzem za pomocą kapilar wlotowych i wylotowych. Ogniwo wykonuje się poprzez połączenie strukturyzowanej płytki z PDMS z szkiełkiem podstawowym z kwarcu. Zmontowane ogniwo zostaje następnie umieszczone na mikroskopie fluorescencyjnym, a do kapilar podłącza się elastyczne rurki, co umożliwia łatwą wymianę roztworów w komorach; aby najpierw aktywować powierzchnię pod immobilizację cząsteczek, należy przepuścić roztwór biotynilowanego BSA przez jeden z kanałów.BSA zaadsorbuje się do komory. Następnie na powierzchnie należy przepuścić roztwór streptawidyny, która z kolei zwiąże się z biotyną. Na koniec przepuść biotynilowany oligonukleotyd, który zwiąże się ze streptawidyną, kotwicząc w ten sposób interesującą cząsteczkę na powierzchni kwarcowej lamellki.Bufor obrazujący, zaprojektowany w celu maksymalizacji stabilności czasowej i intensywności fluoroforów, jest przepływany przez komorę ze stałą prędkością przez cały okres akwizycji. Zautomatyzowany układ skanuje różne sekcje powierzchni w poszukiwaniu cząsteczek posiadających zarówno fluorofor donora, jak i akceptora, a następnie przesuwa je pojedynczo do objętości sondowania, uzyskując dla każdej z nich przebieg intensywności fluorescencji w czasie aż do fotowybielenia obu fluoroforów. Cześć, jestem Nicholas Dfi z laboratorium profesora Millera na wydziale inżynierii biomedycznej na Boston University.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę uzyskiwania śladów F pojedynczych cząsteczek z unieruchomionych kwasów nukleinowych przy użyciu układu konfokalnego. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania dynamiki kwasów nukleinowych oraz oddziaływań między kwasami nukleinowymi a enzymami. Zapraszamy do oglądania.Urządzenie Microfluid Excel powstaje poprzez połączenie wzorowanego krążka z polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 2 mm z uprzednio oczyszczonym szkiełkiem kwarcowym. Aby przygotować wzorowany krążek PDMS, należy połączyć 10 części bazy elastomeru silikonowego z jedną częścią utwardzacza, dokładnie wymieszać i odgazować przez jedną godzinę w próżni. Po odgazowaniu bazy elastomerowej, należy ostrożnie wlać ją do formy komórki mikrofluidycznej.Pozostaw mieszankę elastomeru do utwardzenia na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C przez dwie godziny. Po utwardzeniu ostrożnie oddziel krążek PDMS od formy za pomocą żyletki. Krążek PDMS zawiera cztery prostokątne komory o pojemności 30 µL każda.Przytrawcie i połączcie płaską stronę dysku z PDMS (tą, która nie zawiera kanałów) z jednocalowym okienkiem szklanym poprzez utlenianie obu powierzchni plazmą przez 30 sekund. Okienko szklane posiada osiem wcześniej wywierconych otworów o średnicy 2 mm, znajdujących się na obu końcach kanałów. Następnie przez każdy otwór w okienku szklanym wprowadza się elastyczną kapilarę z topionej krzemionki o długości dwóch cali.Aby to zrobić, najpierw wprowadź igłę, a następnie wsuń rurkę kapilarną, aż dotrze ona do kanału. Uszczelnij otwory w szklanym okienku, używając szybko utwardzającego się silikonowego związku odlewniczego, takiego jak quick cast. Przepłucz kanały etanolem i wodą po aktywacji plazmowej komórki oraz świeżo oczyszczonego w roztworze piranhy okrągłego szkiełka zakrywy kwarcowego o średnicy jednej cala przez 30 seconds.Przytop szkiełko nakrywkowe do boku celi zawierającej kanały. Komory są teraz uszczelnione. Pozostaw zmontowaną celę do utwardzenia na noc w temperaturze pokojowej.Po utwardzeniu zmontowanej komórki mikroprzepływowej w ciągu nocy, należy umieścić ją w specjalnie wykonanym uchwycie i zamontować na stole mikroskopu konfokalnego, aby rozpocząć aktywację powierzchni komórki. W celu unieruchomienia cząsteczek należy podłączyć elastyczne rurki do kapilar komórki, co ułatwi wstrzykiwanie buforu za pomocą strzykawki i igły. Następnie należy wstrzyknąć do kanału roztwór biotynilowanej BSA o stężeniu 0,1 mg/mL w buforze A i inkubować przez co najmniej 30 minut.Po 30-minutowej inkubacji przepuść od 300 do 500 µL buforu A, aby usunąć z kanału niezwiązane biotynylowane BSA, uważając, aby w komorze nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Następnie wstrzyknij roztwór STR din w stężeniu 0,1 mg/mL w buforze A i inkubuj przez 15 minut.Po 15-minutowej inkubacji przepuść od 300 do 500 µL buforu A, aby usunąć z kanału wszelkie niezaabsorbowane streptawidyny. Podobnie jak wcześniej, należy unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza w komorze. Na koniec przepuść roztwór biotynilowanej próbki o stężeniu od trzech do pięciu pM.Aby sprawdzić pokrycie cząsteczkami fluorescencyjnymi, przeprowadza się skanowanie powierzchni. Próbkę biotynilowaną inkubuje się przez 10 minut, a następnie powtarza przepływ buforu. Jak wykazano wcześniej, bufor obrazujący (IB) składa się z enzymatycznego układu usuwającego tlen oraz wygaszacza tripletów, takiego jak trolox, aby najpierw rozpuścić IB.Pięć miligramów TRO lock rozpuszczono w 10 mililitrach buforu glukozowego poprzez mieszanie w wirówce typu vortex przez kilka minut oraz wstrząsanie przez co najmniej 10 minut. Roztwór przefiltrowano i poddano odgazowaniu w próżni przez 10 minut. Roztwór TRO lock delikatnie zmieszano z roztworem enzymatycznym Glocky, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.Napełnić zbiornik roztworem IB. Następnie, używając mechanicznej pompy strzykawkowej, kontrolować szybkość przepływu, przepływając IB przez kanał ze stałą prędkością 5 µL/min; do zbiornika IB wprowadzać argon, aby zapobiec rozpuszczaniu tlenu atmosferycznego w buforze. Skanowanie powierzchni, lokalizacja cząsteczek i pozyskiwanie śladów intensywności pojedynczych cząsteczek są kontrolowane przez program LabVIEW, który skanuje obszary o wymiarach 20 x 20 µm² z rozdzielczością 0,2 µm przy prędkości 0,1 µm/ms.Dane z mapowania powierzchni są natychmiast przetwarzane w celu wyznaczenia lokalizacji wszystkich pikseli powyżej poziomu tła, ważonych intensywnością. Po odnalezieniu unieruchomionych cząsteczek są one kolejno przenoszone do objętości konfokalnej, a intensywności fluorescencji donora i akceptora są rejestrowane w funkcji czasu, aż do momentu fotowyblechania obu fluoroforów. Następnie stolik jest programowany tak, aby przenieść się do nowego punktu początkowego w odległości 100 mm, a proces mapowania zostaje powtórzony.Tutaj przedstawiono zmontowany układ MICROFLUID Excel. Są to skany powierzchni ukazujące pojedyncze cząsteczki w zielonym kanale donora i czerwonym kanale akceptora. Przedstawiono również kilka typowych śladów pojedynczych cząsteczek, na których intensywność akceptora zaznaczono na czerwono, a donora na zielono.Właśnie pokazaliśmy, jak uzyskać ślady pojedynczych cząsteczek z unieruchomionych biomolekuł przy użyciu układu konfokalnego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby każdy krok przeprowadzić starannie i bez pośpiechu, ponieważ jest to wymagający eksperyment. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Automatyczny system pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek zmobilizowanych na powierzchni biocząsteczek

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Przedstawiamy konfigurację i eksperymentalną procedurę uzyskiwania danych smFRET z dużych sieci donor-akceptor za pomocą mikroskopu TIRF. Analiza tych pomiarów krok po kroku za pomocą oprogramowania do wnioskowania bayesowskiego Fast-NPS pozwala uzyskać informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dzięki zastosowaniu dostosowanych modeli barwników.

Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Ten artykuł zawiera instrukcje krok po kroku, jak wykonać w pełni poprawione, dokładne pomiary FRET na indywidualnych, swobodnie dyfuzujących biomolekułach za pomocą niedrogiego smfBoxa o otwartym kodzie źródłowym, od włączenia, przez wyrównanie i skupienie, aż po zbieranie i analizę danych.

Wykonywanie precyzyjnych i dokładnych pomiarów fret pojedynczych cząsteczek za pomocą smfBox typu Open-Source

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Poznaj metodę FRET dla pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych w komórce mikroprzepływowej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki kwasów nukleinowych i ich interakcji z enzymami w czasie rzeczywistym.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Przeglądaj więcej filmów