Mrożenie i rozmrażanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Witam, jestem Leah Kent ze STEM Gen. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak rozmrażać i zamrażać ludzkie embrionalne komórki macierzyste. Zatem zacznijmy.

Aby rozmrozić ludzkie embrionalne komórki macierzyste, kryfiolkę wyjmuje się z ciekłego azotu i szybko rozmraża. W kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C zawiesinę komórkową przenosi się z kryfiolki do probówki stożkowej, rozcieńcza pożywką do hodowli ludzkich komórek ES i wiruje. W celu uzyskania niewielkiego osadu komórkowego usuwa się nadsącz, a osad komórkowy w probówce resuspensuje w świeżej pożywce do hodowli ludzkich komórek ES przed wysianiem do jednego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej, w której wcześniej wysiano napromieniowaną warstwę zasilającą meth.

Na jeden dzień przed rozmrożeniem ludzkich komórek ES należy wysiać warstwę pokarmową z napromieniowanych embrionalnych fibroblastów mysich lub MEF w medium hodowlanym w jednym dołku sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej pokrytej żelatyną. Płytkę należy inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.

Aby zapewnić efektywne i pomyślne rozmrażanie, należy upewnić się, że cały niezbędny sprzęt i odczynniki są przygotowane. Przed wyjęciem ludzkich ESL z ciekłego azotu, za pomocą metalnej pęsety wyjmij fiolkę kriogeniczną z ludzkimi E ESL z pojemnika do przechowywania w ciekłym azocie.

Tocz fiolkę między dłońmi w rękawiczkach przez trzy do pięciu sekund. Aby usunąć szron, zeskrob informacje z etykiety fiolki za pomocą pęsety metalowej. Zanurz fiolkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.

Delikatnie zakręć fiolką i często, lecz krótko, obserwuj postępy rozmrażania, trzymając fiolkę pod światło, aby ocenić wielkość kryształków lodu. Nie zanurzaj zakrętki fiolki w kąpieli wodnej, ponieważ może to doprowadzić do kontaminacji komórek.

Gdy pozostanie jedynie mały kryształ lodu, zanurz fiolkę w etanolu w celu jej wysterylizowania w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie przenieś zawartość fiolki kriogenicznej bezpośrednio na dno 15 ml probówki stożkowej. Do probówki powoli dodaj 4 ml pożywki do hodowli ludzkich komórek ES.

Delikatnie kołysz probówką, aby stale mieszać komórki w trakcie dodawania do niej nowego medium. Wirować ludzkie komórki E es przez pięć minut przy 200 Gs. Wyjąć wcześniej przygotowaną płytkę z feederem meth z inkubatora ustawionego na 37 °C i opisać ją odpowiednimi informacjami dotyczącymi ludzkich komórek ESL, takimi jak linia komórkowa, numer pasażu oraz data rozmrożenia.

Odssać pożywkę hodowlaną MEF i dodać jeden mililitr PBS do dołka. Przenieść osad ludzkich komórek E ESL z powrotem do komory bezpiecznej biologicznie i ostrożnie odessać nadosad. Należy uważać, aby nie odessać osadu komórkowego, ale usunąć jak najwięcej nadosadu, ponieważ roztwór ten zawiera DMSO z medium do zamrażania. Resus.

Bardzo delikatnie resuspenduj osad, dodając 2,5 ml pożywki do hodowli ludzkich ESL. Używając szklanej pipety o pojemności 5 ml i pipetując trzy do czterech razy, odciągnij PBS z dołka z komórkami karmionymi MEF. Następnie powoli dodaj całe 2,5 ml zawiesiny ludzkich komórek ES do przygotowanego dołka na płytce 6-dołkowej.

Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i ostrożnie przesuwaj ją w przód i w tył oraz z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić komórki w dołku. Należy tego dokonać, aby uniknąć koncentracji kolonii w centrum. Nie potrząsaj płytką w sposób kolisty.

Pozostawić komórki do przytwierdzenia w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla przez noc w dniu następującym po rozmrażaniu. Usunąć pożywkę wraz z komórkami niedeprymowanymi i dodać do dołka 2,5 ml świeżej pożywki do hodowli ludzkich komórek ES.

Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez noc i kontynuować hodowlę do momentu, gdy kolonie będą gotowe do pasażowania. Protokół zamrażania ludzkich komórek ES rozpoczyna się od zdrowych, średniej wielkości kolonii ludzkich komórek ES hodowanych na płytce sześciodołkowej. Po inkubacji hodowli z enzymem collagenase four, kolonie należy zebrać za pomocą szklanej pipety 5 mL do probówki stożkowej, a następnie odwirować w celu uzyskania luźnego osadu komórkowego.

Po odessaniu supernatantu osad komórkowy zostaje resuspendTime. Najpierw w pożywce do hodowli ludzkich komórek ES, a następnie rozcieńczony dwukrotnym Medium do kriokonserwacji. Komórki są równomiernie rozdzielone w aliquotach o objętości 1 mL i zamrażane w fiolkach kriogenicznych.

Podczas wirowania komórek, wewnątrz komory bezpieczeństwa, opisz probówki kriogeniczne, podając numer pasażu linii komórkowej oraz datę zamrażania. Typowa gęstość przy zamrażaniu ludzkich komórek es wynosi jedna studzienka komórek z płytki sześciodołkowej na jedną probówkę kriogeniczną. Po odwirowaniu ludzkich E ESL, przenieś probówkę z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego.

Odssać nadosad z probówki. Uważając, aby nie naruszyć luźno uformowanego osadu komórkowego, zawiesić go w odpowiedniej ilości pożywki do hodowli ludzkich ESL.

Medium 0,5 mililitrów pożywki hodowlanej ludzkich komórek hESC na fiolkę kriogeniczną. Należy pipetować bardzo delikatnie, ponieważ ludzkie komórki hESC regenerują się lepiej, gdy są mrożone w stosunkowo dużych fragmentach kolonii; powoli, delikatnie potrząsając probówką, dodać do komórek odpowiednią ilość dwukrotnie stężonego (2x) medium do mrożenia ludzkich komórek hESC.

Po dodaniu medium do zamrażania i wymieszaniu roztworu poprzez bardzo delikatne pipetowanie, jeden lub dwa razy, szybko, lecz ostrożnie przenieś 1 mL zawiesiny komórkowej do każdej fiolki kriogenicznej. Przenieś fiolki do pojemnika do zamrażania z izopropanolem i umieść w zamrażarce w temperaturze -80 °C na noc. Dzięki zastosowaniu pojemnika z izopropanolem komórki będą zamrażać się w tempie 1 °C na minutę. Następnego dnia.

Szybko przenieś zamrożone fiolki do zbiornika z ciekłym azotem, używając pęsety metalowej. Pierwszego dnia po rozmrożeniu ludzkich komórek ES małe kolonie mogą wydawać się przezroczyste i mogą być trudne do zauważenia pod mikroskopem. Ponieważ nowo rozmrożone ludzkie komórki ESL mają tendencję do dość wolnej proliferacji.

Mogą one potrzebować kilku dni w hodowli, aby pojawić się jako uformowane kolonie. Właśnie pokazaliśmy, jak rozmrażać i zamrażać hodowle ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.