Name: Zamrażanie i rozmrażanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Naucz się zamrażania i rozmrażania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w celu zachowania ich żywotności. Protokół obejmuje kąpiel wodną, wirowanie oraz hodowlę na warstwie podporowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Rozmrażanie komórek hES
Przygotowanie przed eksperymentem
<ol>
 <li>Na jeden dzień przed rozmrożeniem komórek hES, wysiej warstwę wspierającą z napromieniowanych embrionalnych fibroblastów mysich (MEF), szczep CF1, do jednej studni żelatynowanej 6-dołkowej płytki hodowlanej w pożywce do hodowli MEF (podstawowa pożywka D-MEM uzupełniona o 10% inaktywowanego termicznie FBS i 1% niezasadniczych aminokwasów). Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
 <li>Przed wyjęciem komórek hES z ciekłego azotu upewnij się, że cały niezbędny sprzęt i odczynniki są przygotowane i gotowe do użycia, aby zapewnić sprawne i pomyślne rozmrożenie.</li>
</ol>
Rozmrażanie komórek hES
 <ol start="3">
 <li>Za pomocą metalnej pincety wyjmij probówkę kriogeniczną z komórkami hES z pojemnika do przechowywania w ciekłym azocie.</li>
 <li>Tocz probówkę między dłońmi w rękawiczkach przez 3-5 sekund, aby usunąć szron.</li>
 <li>Zapisz informacje znajdujące się na etykiecie probówki.</li>
 <li>Używając metalnej pincety, zanurz probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Delikatnie obracaj probówkę i często (ale szybko!) sprawdzaj postęp rozmrażania, podnosząc ją pod światło, aby ocenić wielkość kryształków lodu. Nie zanurzaj zakrętki probówki w kąpieli wodnej, aby uniknąć kontaminacji komórek.</li>
 <li>Gdy pozostanie już tylko mały kryształek lodu, zanurz całą probówkę w etanolu w celu sterylizacji.</li>
 <li>W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieś zawartość probówki kriogenicznej bezpośrednio na dno stożkowej probówki o pojemności 15 mL.</li>
 <li>Do probówki powoli dodaj 4 mL pożywki do hodowli komórek hES (podstawowa pożywka D-MEM/F-12 uzupełniona o 20% Knockout serum replacement, 1% nieessentialnych aminokwasów, 1% L-glutaminy, 0,2% β-merkaptoetanolu oraz 4 ng/mL bFGF). Delikatnie kołysz probówką, aby stale mieszać komórki podczas dodawania nowej pożywki.</li>
 <li>Wiruj komórki przez 5 minut przy 200 x g.</li>
 </ol>
Wysiewanie komórek hES
<ol start="11">
 <li>Podczas wirowania komórek hES, przygotuj płytkę z komórkami karmionymi MEF, opisując ją odpowiednimi informacjami o komórkach hES: linią komórkową, numerem pasażu oraz datą rozmrożenia.</li>
 <li>Gdy do końca wirowania pozostaną około 2 minuty, odessaj pożywkę hodowlaną MEF i dodaj do dołka 1,0 mL PBS.</li>
 <li>Przenieś osad komórek hES z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie odessaj nadsącz. Należy uważać, aby nie odessać osadu komórkowego, ale usunąć jak najwięcej nadsączu, ponieważ roztwór ten zawiera DMSO z medium do mrożenia.</li>
 <li>Bardzo delikatnie resuspenduj osad, dodając 2,5 mL pożywki do hodowli komórek hES za pomocą szklanej pipety 5 mL i pipetując 3-4 razy.</li>
 <li>Odessaj PBS z dołka z komórkami karmionymi MEF i powoli dodaj całe 2,5 mL zawiesiny komórek hES do przygotowanego dołka na płytce 6-dołkowej.</li>
 <li>Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C i ostrożnie przesuwaj płytkę przód-tył oraz na boki, aby równomiernie rozmieścić komórki w całym dołku. Nie wykonuj ruchów okrężnych płytką, aby uniknąć koncentracji kolonii w centrum.</li>
 <li>Pozostaw komórki do przytwierdzenia w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez noc.</li>
 <li>Dzień po rozmrożeniu usuń pożywkę (wraz z wszelkimi pływającymi komórkami) i dodaj do dołka 2,5 ml świeżej pożywki do hodowli komórek hES.</li>
 <li>Opcjonalnie: Usuniętą pożywkę wraz z komórkami można przenieść na osobną, przygotowaną płytkę z komórkami karmionymi MEF. Ten krok często prowadzi do powstania nowych kolonii, które można hodować równolegle z komórkami z pierwotnego rozmrożenia.</li>
 <li>Inkubuj płytki w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez noc.</li>
</ol>
2. Zamrażanie komórek hES
<ol>
 <li>Podczas wirowania komórek hES, opisz fiolki kriogeniczne wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza, podając linię komórkową, numer pasażu oraz datę zamrażania. Typowa gęstość przy zamrażaniu komórek hES to zawartość jednego dołka (z płytki 6-dołkowej) na jedną fiolkę kriogeniczną.</li>
 <li>Po zakończeniu wirowania komórek hES, przenieś probówki z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Odessań nadsącz z probówki, uważając, aby nie naruszyć luźnego osadu komórkowego.</li>
 <li>Resuspenduj osad komórkowy odpowiednią ilością pożywki do hodowli komórek hES: 0,5 mL pożywki do hodowli komórek hES na jedną fiolkę kriogeniczną. Podczas pipetowania zachowaj szczególną ostrożność, ponieważ komórki hES lepiej regenerują się po rozmrożeniu, jeśli zostaną zamrożone w stosunkowo dużych fragmentach kolonii.</li>
 <li>Powoli, delikatnie potrząsając probówką, dodaj do komórek odpowiednią ilość (0,5 mL na fiolkę kriogeniczną) 2X pożywki do zamrażania komórek hES (60% zdefiniowanego FBS, 20% pożywki do hodowli komórek hES i 20% DMSO). Po dodaniu pożywki do zamrażania, bardzo delikatnie pipetuj roztwór jeden lub dwa razy w celu wymieszania.</li>
 <li>Szybko, lecz ostrożnie, przelej 1 mL zawiesiny komórkowej do każdej fiolki kriogenicznej.</li>
 <li>Przenieś fiolki do pojemnika do zamrażania z izopropanolem i umieść w zamrażarce w temperaturze -80°C na noc. W pojemniku do zamrażania z izopropanolem komórki będą zamrażać się w tempie 1°C na minutę.</li>
 <li>Następnego dnia szybko przenieś zamrożone fiolki za pomocą pęsety metalowej do zbiornika z ciekłym azotem.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
W pierwszym dniu po rozmrożeniu ludzkich komórek ES małe kolonie mogą być przezroczyste i trudne do zauważenia pod mikroskopem. Ponieważ świeżo rozmrożone komórki ES mają tendencję do powolnej proliferacji, może minąć kilka dni, zanim pojawią się jako uformowane kolonie (Rycina 1).
Rysunek 1. Odzyskiwanie i wzrost komórek. Komórki hES rozmrożone z ciekłego azotu obrazowano &nbsp;1, 7 i 11 dni po rozmrożeniu.

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique</a>. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
</ol>

Towarzyszący film prezentuje metodę rozmrażania i zamrażania komórek hES. Komórki zamrożone w ciekłym azocie należy rozmrozić tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać jak najlepszą przeżywalność. Należy zachować szczególną ostrożność podczas pipetowania rozmrażanych komórek: należy ograniczyć manipulacje komórkami i pipetować je delikatnie. Jedną fiolkę komórek hES można wysiać albo do jednego dołka płytki 6-dołkowej, albo do wszystkich dołków płytki 4-dołkowej, a następnie niezwłocznie umieścić w inkubatorze. Ponieważ hodowla w czterech oddzielnych dołkach zmniejsza ryzyko utraty całej kultury w wyniku kontaminacji oraz ułatwia lokalizację kolonii komórek hES na mniejszej powierzchni, przy pierwszym rozmrażaniu komórek hES zaleca się stosowanie płytki 4-dołkowej.
W pierwszym dniu po rozmrożeniu komórek hES kolonie są małe i mogą być przezroczyste. Należy codziennie uzupełniać pożywkę do hodowli komórek hES, nawet jeśli kolonie nie są widoczne pod mikroskopem, ponieważ pojawienie się uformowanych kolonii komórek hES w hodowli może zająć kilka dni. Podczas rozmrażania komórek ważne jest zastosowanie świeżo wysianej warstwy feederowej MEF, ponieważ kolonie często nie osiągają odpowiedniej wielkości do pasażowania aż do 10 12 dni po rozmrożeniu.
Podczas rozmrażania ampułki z komórkami hES o niskim numerze pasażu, dobrą praktyką jest namnożenie i zamrożenie dodatkowych ampułek, aby zachować zapas komórek o niskim pasażu do przyszłych hodowli i eksperymentów. Warto również rutynowo zamrażać wszystkie „nadmiarowe” zdrowe komórki hES w celu utrzymania zapasów mrożonych. Najbardziej udane rozmrażania i późniejsze hodowle dotyczyły zamrożonych, wysokiej jakości, niezróżnicowanych i aktywnie dzielących się kolonii komórek hES. Komórki hES regenerują się po zamrożeniu bardziej efektywnie, jeśli są traktowane delikatnie w postaci większych agregatów komórkowych. Końcowa wielkość agregatu powinna być zbliżona do (lub nieco większa od) wielkości agregatów wysiewanych po rutynowym pasażu.

<table><tbody><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Do pożywki MEFjavascript:void(0);</td></tr><tr><td>Surowica cielęca (FBS), certyfikowana</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>Inaktywowana ciepłem&lt;br/&gt;Do pożywki MEF</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy Knockout</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Wstępna weryfikacja w celu zapewnienia wsparcia dla komórek hES</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>Stężenie końcowe [4 ng/mL]</td></tr><tr><td>Niezasadnicze aminokwasy</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 mM (100X)&lt;br/&gt;Stężenie końcowe [1X]</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>Bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; lub Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>Przygotować świeży roztwór o stężeniu 1 mg/mL w D-MEM/F-12</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Typ A, wieprzowa</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2560</td><td>Do pożywki do zamrażania</td></tr><tr><td>Surowica cielęca (FBS), definiowana</td><td>Hyclone</td><td>SH300.70.01</td><td>Do pożywki do zamrażania</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140675</td><td>Do ogólnej hodowli</td></tr><tr><td>Płytki 4-dołkowe</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td>Do rozmrażania</td></tr><tr><td>Szklane pipety 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27E</td><td>Pakowane indywidualnie</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td>Polipropylenowe</td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5000-1020</td><td>Pojemność 1,5 mL</td></tr><tr><td>Kontener do zamrażania</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5100-0001</td><td>Mr. Frosty&amp;#8221;</td></tr></tbody></table>

mrożenie i rozmrażanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Od czasu Jamesa Thomsonai wsp.opracowano technikę w 1998 roku w celu izolacji i hodowli hES in vitro; mrożenie komórek do późniejszego wykorzystania oraz rozmrażanie i namnażanie komórek z zamrożonego banku stały się istotnymi procedurami wykonywanymi w rutynowej hodowli komórek hES. Ponieważ komórki hES są bardzo wrażliwe na stresy związane z mrożeniem i rozmrażaniem, należy zachować szczególną ostrożność. W niniejszym materiale prezentujemy właściwą technikę szybkiego rozmrażania komórek hES z zapasów w ciekłym azocie, ich wysiewania na komórki karmicielskie z zarodka myszy oraz powolnego mrożenia w celu długoterminowego przechowywania.

Od czasu opracowania przez Jamesa Thomsona i współpracowników w 1998 roku techniki izolacji i hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hES) in vitro, zamrażanie komórek do późniejszego wykorzystania oraz rozmrażanie i namnażanie komórek z zapasów mrożonych stały się istotnymi procedurami wykonywanymi w rutynowej hodowli komórek hES. Ponieważ komórki hES są bardzo wrażliwe na stresy towarzyszące zamrażaniu i rozmrażaniu, należy zachować szczególną ostrożność. W niniejszym materiale prezentujemy właściwą technikę szybkiego rozmrażania komórek hES z zapasów przechowywanych w ciekłym azocie, ich wysiewania na mysie embrionalne komórki karmidła oraz powolnego zamrażania w celu długoterminowego przechowywania.

Mrożenie i rozmrażanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Odkąd James Thomson i inni opracowali w 1998 roku technikę izolacji i hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hES) in vitro, zamrażanie komórek do późniejszego wykorzystania, a następnie ich rozmrażanie i namnażanie...

Witam, jestem Leah Kent ze STEM Gen. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak rozmrażać i zamrażać ludzkie embrionalne komórki macierzyste. Zatem zacznijmy.Aby rozmrozić ludzkie embrionalne komórki macierzyste, kryfiolkę wyjmuje się z ciekłego azotu i szybko rozmraża. W kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C zawiesinę komórkową przenosi się z kryfiolki do probówki stożkowej, rozcieńcza pożywką do hodowli ludzkich komórek ES i wiruje. W celu uzyskania niewielkiego osadu komórkowego usuwa się nadsącz, a osad komórkowy w probówce resuspensuje w świeżej pożywce do hodowli ludzkich komórek ES przed wysianiem do jednego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej, w której wcześniej wysiano napromieniowaną warstwę zasilającą meth.Na jeden dzień przed rozmrożeniem ludzkich komórek ES należy wysiać warstwę pokarmową z napromieniowanych embrionalnych fibroblastów mysich lub MEF w medium hodowlanym w jednym dołku sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej pokrytej żelatyną. Płytkę należy inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.Aby zapewnić efektywne i pomyślne rozmrażanie, należy upewnić się, że cały niezbędny sprzęt i odczynniki są przygotowane. Przed wyjęciem ludzkich ESL z ciekłego azotu, za pomocą metalnej pęsety wyjmij fiolkę kriogeniczną z ludzkimi E ESL z pojemnika do przechowywania w ciekłym azocie.Tocz fiolkę między dłońmi w rękawiczkach przez trzy do pięciu sekund. Aby usunąć szron, zeskrob informacje z etykiety fiolki za pomocą pęsety metalowej. Zanurz fiolkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.Delikatnie zakręć fiolką i często, lecz krótko, obserwuj postępy rozmrażania, trzymając fiolkę pod światło, aby ocenić wielkość kryształków lodu. Nie zanurzaj zakrętki fiolki w kąpieli wodnej, ponieważ może to doprowadzić do kontaminacji komórek.Gdy pozostanie jedynie mały kryształ lodu, zanurz fiolkę w etanolu w celu jej wysterylizowania w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie przenieś zawartość fiolki kriogenicznej bezpośrednio na dno 15 ml probówki stożkowej. Do probówki powoli dodaj 4 ml pożywki do hodowli ludzkich komórek ES.Delikatnie kołysz probówką, aby stale mieszać komórki w trakcie dodawania do niej nowego medium. Wirować ludzkie komórki E es przez pięć minut przy 200 Gs. Wyjąć wcześniej przygotowaną płytkę z feederem meth z inkubatora ustawionego na 37 °C i opisać ją odpowiednimi informacjami dotyczącymi ludzkich komórek ESL, takimi jak linia komórkowa, numer pasażu oraz data rozmrożenia.Odssać pożywkę hodowlaną MEF i dodać jeden mililitr PBS do dołka. Przenieść osad ludzkich komórek E ESL z powrotem do komory bezpiecznej biologicznie i ostrożnie odessać nadosad. Należy uważać, aby nie odessać osadu komórkowego, ale usunąć jak najwięcej nadosadu, ponieważ roztwór ten zawiera DMSO z medium do zamrażania. Resus.Bardzo delikatnie resuspenduj osad, dodając 2,5 ml pożywki do hodowli ludzkich ESL. Używając szklanej pipety o pojemności 5 ml i pipetując trzy do czterech razy, odciągnij PBS z dołka z komórkami karmionymi MEF. Następnie powoli dodaj całe 2,5 ml zawiesiny ludzkich komórek ES do przygotowanego dołka na płytce 6-dołkowej.Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i ostrożnie przesuwaj ją w przód i w tył oraz z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić komórki w dołku. Należy tego dokonać, aby uniknąć koncentracji kolonii w centrum. Nie potrząsaj płytką w sposób kolisty.Pozostawić komórki do przytwierdzenia w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla przez noc w dniu następującym po rozmrażaniu. Usunąć pożywkę wraz z komórkami niedeprymowanymi i dodać do dołka 2,5 ml świeżej pożywki do hodowli ludzkich komórek ES.Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez noc i kontynuować hodowlę do momentu, gdy kolonie będą gotowe do pasażowania. Protokół zamrażania ludzkich komórek ES rozpoczyna się od zdrowych, średniej wielkości kolonii ludzkich komórek ES hodowanych na płytce sześciodołkowej. Po inkubacji hodowli z enzymem collagenase four, kolonie należy zebrać za pomocą szklanej pipety 5 mL do probówki stożkowej, a następnie odwirować w celu uzyskania luźnego osadu komórkowego.Po odessaniu supernatantu osad komórkowy zostaje resuspendTime. Najpierw w pożywce do hodowli ludzkich komórek ES, a następnie rozcieńczony dwukrotnym Medium do kriokonserwacji. Komórki są równomiernie rozdzielone w aliquotach o objętości 1 mL i zamrażane w fiolkach kriogenicznych.Podczas wirowania komórek, wewnątrz komory bezpieczeństwa, opisz probówki kriogeniczne, podając numer pasażu linii komórkowej oraz datę zamrażania. Typowa gęstość przy zamrażaniu ludzkich komórek es wynosi jedna studzienka komórek z płytki sześciodołkowej na jedną probówkę kriogeniczną. Po odwirowaniu ludzkich E ESL, przenieś probówkę z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego.Odssać nadosad z probówki. Uważając, aby nie naruszyć luźno uformowanego osadu komórkowego, zawiesić go w odpowiedniej ilości pożywki do hodowli ludzkich ESL.Medium 0,5 mililitrów pożywki hodowlanej ludzkich komórek hESC na fiolkę kriogeniczną. Należy pipetować bardzo delikatnie, ponieważ ludzkie komórki hESC regenerują się lepiej, gdy są mrożone w stosunkowo dużych fragmentach kolonii; powoli, delikatnie potrząsając probówką, dodać do komórek odpowiednią ilość dwukrotnie stężonego (2x) medium do mrożenia ludzkich komórek hESC.Po dodaniu medium do zamrażania i wymieszaniu roztworu poprzez bardzo delikatne pipetowanie, jeden lub dwa razy, szybko, lecz ostrożnie przenieś 1 mL zawiesiny komórkowej do każdej fiolki kriogenicznej. Przenieś fiolki do pojemnika do zamrażania z izopropanolem i umieść w zamrażarce w temperaturze -80 °C na noc. Dzięki zastosowaniu pojemnika z izopropanolem komórki będą zamrażać się w tempie 1 °C na minutę. Następnego dnia.Szybko przenieś zamrożone fiolki do zbiornika z ciekłym azotem, używając pęsety metalowej. Pierwszego dnia po rozmrożeniu ludzkich komórek ES małe kolonie mogą wydawać się przezroczyste i mogą być trudne do zauważenia pod mikroskopem. Ponieważ nowo rozmrożone ludzkie komórki ESL mają tendencję do dość wolnej proliferacji.Mogą one potrzebować kilku dni w hodowli, aby pojawić się jako uformowane kolonie. Właśnie pokazaliśmy, jak rozmrażać i zamrażać hodowle ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

freezing-and-thawing-human-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zamrażanie i rozmrażanie ludzkich komórek macierzystych zarodkowych

Tutaj pokazujemy, jak w naszym laboratorium zawiesza barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych.

Zamrażanie komórek ES człowieka

Tutaj pokazujemy, jak w naszym laboratorium rozpoczyna odcienie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych kultury linii mrożonych ręki.

Człowieka komórek ES: Kultura Od mrożone komórki

Zdolność ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do samoodnawiania oraz różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu sprawia, że stanowią one ogromną obietnicę zarówno w zastosowaniach medycznych, jak i jako narzędzie badawcze służące do odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i chorób. W niniejszym materiale przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z embrionów poprzez immunosurgicalną izolację masy komórkowej...

Wytwarzanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych metodą immunochirurgii

Różnicowanie ESC zbiega się z charakterystycznymi dla danego typu komórek zmianami w strukturze i składzie chromatyny. Wykrycie tych zmian dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów definiujących pluripotencję oraz różnicowanie komórek. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi wartościową metodę analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek macierzystych. <br...

Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę transplantacji ludzkich komórek macierzystych do różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego zarodka kurczaka. Stanowi to model in vivo do oceny proliferacji i różnicowania różnych typów ludzkich komórek macierzystych w środowisku tkanki embrionalnej.

Ksenotransplantacja ludzkich komórek macierzystych do zarodka kurczaka

Pomimo podejmowanych wysiłków w celu przejścia na warunki hodowli bez komórek podporowych, izolacja i hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) pozostają w dużej mierze zależne od kokultur z embrionalnymi fibroblastami mysimi (MEFs). W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodologię szybkiego usuwania komórek podporowych z kultur hESC przed przystąpieniem do eksperymentów.

Szybkie usuwanie fibroblastów z gęstych kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten film pokazuje procedurę rozmrażania zeszklonych zarodków królika oraz kroki zapobiegawcze dla optymalnego odzyskiwania zarodków.

Rozmrażanie zarodków królików: procedura rozgrzewająca w celu odzyskania kriokonserwowanych zarodków królików do transferu zarodków

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

To badanie dostarcza szczegółowego protokołu do efektywnej kriokonserwacji komórek nabłonkowych barwnika siatkówki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych.

Kriokonserwacja ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych w optymalnym stadium

Naucz się zamrażania i rozmrażania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w celu zachowania ich żywotności. Protokół obejmuje kąpiel wodną, wirowanie oraz hodowlę na warstwie podporowej.

Mrożenie i rozmrażanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów