Technika jednoczesnej wizualizacji specyficznych dla wirusa limfocytów T CD8+ i komórek zakażonych wirusem in situ

Łącząc hybrydyzację in situ i barwienie tetra w technice znanej jako ISTH, można określić względne liczby i relacje przestrzenne między komórkami efektorowymi specyficznymi dla antygenu wirusowego a komórkami i tkankami zakażonymi wirusem. ISTH rozpoczyna się od osadzenia świeżej tkanki zakażonej SIV w agros. Tkanka jest cięta na odcinki o grubości 200 mikronów za pomocą vibrato i barwiona na antygen wirusowy.

Specyficzne CD osiem dodatnich komórek przy użyciu tetramerów MHC znakowanych C w kształcie litery C. Po zamrożeniu te skrawki plam są dalej cięte na odcinki o grubości ośmiu mikrometrów za pomocą kriostatu i przeprowadza się hybrydyzację in situ w celu zlokalizowania komórek zakażonych wirusem. Mikroskopia konfokalna służy do obrazowania podwójnych skrawków barwienia i ostatecznie rekonstrukcji oryginalnych grubych odcinków, aby ujawnić związek między efektorem immunologicznym a komórkami docelowymi.

Zastosowanie tej procedury do badania wczesnego zakażenia SIV okazało się dobrym predyktorem ciężkości wynikającej z niej choroby. Cześć, nazywam się Chinen Lee i pracuję w laboratorium Ashley HA na Wydziale Mikrobiologii Uniwersytetu Minnesoty. Nazywam się Pam Skinner i jestem adiunktem na Wydziale Nauk Biomedycznych Weterynarii Uniwersytetu Minnesoty.

Dzisiaj pokażemy Wam procedurę hybrydyzacji wewnątrz w instytucie, w skrócie ISTH. Oprócz stosowania barwienia inci teer w połączeniu z hybrydyzacją inci, jak pokazujemy dzisiaj, rutynowo stosujemy również barwienie inci teer w połączeniu z immunohistochemią w celu określenia lokalizacji, obfitości i profilu ekspresji białek specyficznych dla antygenu limfocytów T CD eight in situ u. Pomogą nam dzisiaj w barwieniu in situ temer za pomocą grubych odcinków będą Dr.Heon Kim i Terry Matala i pomogą nam w przygotowaniu cienkiego przekroju i hybrydyzacji in situ Więc zacznijmy.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy schłodzić kąpiel Vibram zawierającą sterylny PBSH do temperatury dwóch stopni Celsjusza. Ustaw kąt ostrza wibratora na 27 stopni. Jeśli to możliwe, przechowuj świeże tkanki schłodzone na lodzie i rozpocznij procedurę w ciągu 24 godzin po pobraniu tkanek.

W celu zminimalizowania schładzania degradacji, vibram ułatwia również cięcie świeżej tkanki, przycinanie tkanki łącznej i cięcie próbki skalpelem na małe kawałki, a następnie umieszczanie kawałków w łódce serwatkowej i przykrywanie 4% niskim stopniem. Agros w PBS topił się w temperaturze około 40 stopni Celsjusza. Upewnij się, że chusteczka styka się z dnem naczynia i wepchnij kawałki chusteczki w dół, jeśli unoszą się na wodzie, zestalają się na lodzie przez trzy do pięciu minut.

W tym przypadku wykorzystuje się tkankę śledziony, ale za pomocą skalpela można również użyć węzłów chłonnych, pochwy, szyjki macicy, macicy lub innych świeżych tkanek. Przetnij agros wokół tkanki i za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś osadzoną tkankę agros do bloku tkankowego. Kontynuuj, pokrywając blok tkanki Vibram klejem Loctite.

Nie przesuwaj kawałka tkanki po jego umieszczeniu na bloku tkanki. Pozostaw do wyschnięcia na około 10 minut na lodzie. Następnie zamontuj blok tkanki w wibratorze i pokrój tkankę na odcinki o grubości 200 mikrometrów, używając martwej niskiej prędkości do przodu i stosunkowo dużej amplitudy.

Za pomocą pędzla przenieś wycięte fragmenty do specjalistycznej komory na tkanki umieszczonej w studzience 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej wstępnie wypełnionej jednym mililitrem schłodzonego PBSH. Umieść do czterech odcinków tkanki w każdej komorze tkankowej. Oznaczyć próbki i przymocować pokrywkę do płytki gumką recepturką w celu zabarwienia skrawków tkanek pod kątem wirusowych limfocytów T.

Tetramery sprzężone ZI są najpierw rozcieńczane w buforze blokującym do nwt 0,5 mikrograma na mililitr. Roztwór pipetuje się do 24-dołkowej płytki w ilości jednego mililitra na dołek. Świeżo ściętą tkankę przenosi się na płytkę w komorach na chusteczki i pozostawia się na noc do kołysania w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Utrzymuj pustą studzienkę między komorami na chusteczki zawierającymi różne próbki, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu roztworów w kolejnych etapach. Na tym etapie można dodać przeciwciała skierowane przeciwko białkom zewnątrzkomórkowym lub powierzchniowym komórki. Do przemywania należy przygotować 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą schłodzony PBSH po wstępnej inkubacji.

Umyj dwukrotnie, przenosząc komory na tkanki na wstępnie napełnioną płytkę na 20 minut za każdym razem, pamiętaj, aby przed przeniesieniem spuścić większość płynu z komór na tkanki. Nie należy również kapać zawartości jednej próbki do drugiej podczas przesuwania komór na tkanki i monitorować skrawki w komorach tkankowych, aby upewnić się, że nie przyklejają się do boków. Utrwalić skrawki świeżym 4% paraldehydem w PBS przez dwie godziny w temperaturze pokojowej po utrwaleniu.

Przemywa się dwukrotnie zimnym PBSH przez pięć minut za każdym razem, aby wzmocnić sygnał z tetramerów. Inkubować skrawki z króliczymi przeciwciałami przeciw fitzy w stosunku 1 do 10 000 w buforze blokującym przez jeden do trzech dni. Na tym etapie można dodać przeciwciała przeciwko epitopom wewnątrzkomórkowym.

Upewnij się, że komórki przenikają i blokują niespecyficzne miejsca przed dodaniem przeciwciała. Pobranie antygenu może być również wymagane po drugiej długiej inkubacji mającej na celu wzmocnienie sygnału. Umyj skrawki w PBSH trzy razy przez co najmniej 20 minut i za każdym razem do kilku godzin.

Przeprowadzić końcową inkubację z odpowiednimi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Na przykład można użyć koziego anty królika SI trzy, aby związać królicze przeciwciała anty fitzy, aby komórki barwiące tetrameru fluoryzowały na czerwono. Jeśli przeciwciała myszy zostały użyte do przeciwdziałania barwieniu białek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak CD eight, w celu wizualizacji limfocytów T zabójców, można użyć koziego anty-US Alexa 488 do związania się z przeciwciałami myszy i spowodowania, że komórki barwiące przeciwciało będą fluoryzować na zielono, rozcieńczenia każdego przeciwciała muszą być określone empirycznie.

Inkubować przez jeden do trzech dni, chronić sekcje przed światłem, owijając płytki i folię aluminiową podczas tej inkubacji, a następnie, gdy światło gaśnie, flora opada. Na koniec ponownie zamocuj sekcje, aby zabezpieczyć tetramery i przeciwciała na miejscu. Umyć i zamontować na szkiełku mikroskopowym żelatyną glicerolową zawierającą cztery miligramy na mililitr galusanu profilu N do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do przygotowania cienkich skrawków do hybrydyzacji na miejscu.

Skrawki barwienia tetrameru insitu można teraz analizować za pomocą mikroskopu konfokalnego w celu określenia lokalizacji, obfitości i wzorca ekspresji białka specyficznych dla antygenu CD ośmiu dodatnich limfocytów T na pokazanym obrazie: skrawki tkanki śledziony z zachyłka zakażonego SIV MEAC zostały wybarwione tetramerami gag w celu oznaczenia specyficznych dla SIV CD osiem dodatnich limfocytów T, przeciwciała CD 20 i przeciwciała CD trzy. Ponieważ liczniki barwienia przeciwciałami zostaną utracone w następnym kroku. Ważne jest, aby przeanalizować tetramery in situ przed kontynuowaniem prac.

Procedurę cienkiego cięcia należy rozpocząć od podgrzania odcinków o grubości 200 mikronów w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut na bloku grzewczym w celu oddzielenia grubych odcinków od szkiełka. Po odłączeniu sekcji osadź je w OCT na suchym lodzie, najpierw wypełniając spód plastikowej formy OCT. Następnie umieść tkankę na wierzchu OCT i przykryj ją OCT.

Użyj kriostatu, aby wyciąć sekcje o grubości ośmiu mikronów z osadzonych sekcji OCT i przyklej sekcje o grubości ośmiu mikronów do silosowych szkiełek. Szkiełka można następnie przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w szczelnie zamkniętym pudełku w celu późniejszej hybrydyzacji in situ. Standardowa hybrydyzacja in situ służy do wykrywania komórek zakażonych wirusem za pomocą sond żebrowych specyficznych dla wirusa znakowanych S 35.

Procedura obejmuje również powlekanie odcinków emulsją torów jądrowych oraz szkiełkami montażowymi. W światłowrocie kompatybilnym z fluorescencją obrazy konfokalne są uzyskiwane za pomocą mikroskopu konfokalnego BioRad MRC 1000, który jest wyposażony w urządzenie do odbijania niebieskiego światła w lampie epi. Barwienie insitu tetra jest wizualizowane za pomocą EPI one 605 dla czerwonego tetrafluorochromu i EPI 2 522 DF 32 dla zielonego fluorochromu CD eight do hybrydyzacji insitu.

Użyj dwóch niebieskich odbić EPI dla srebrnych ziaren powstałych w wyniku sygnału hybrydyzacji in-situ w opracowanych autografach radiowych. Aby rozpocząć akwizycję obrazu, zbierz obrazy z każdej sekcji od lewej do prawej i od góry do dołu i upewnij się, że każdy obraz nakłada się w około 20% na sąsiednie obrazy. Aby uniknąć luk w zrekonstruowanym obrazie montażu, nazwij każdy obraz zgodnie z jego wierszem i kolumną w pliku Excel.

Po zakończeniu zbierania danych ze slajdów użyj oprogramowania asystenta konfokalnego, aby wyświetlić obrazy szeregowe Z dla każdego kanału na pojedynczy obraz, korzystając z procedury Photoshop seven action dostępnej u autorów, automatycznie scal wyświetlany obraz z trzech kanałów w jeden obraz RGB. Następnie złącz scalone obrazy w warstwy, aby wygenerować obraz montażowy całej sekcji. Powiąż poszczególne ziarna srebra i barwienie tetrameru z komórkami w montażu za pomocą metamorfu lub Photoshopa.

Przypisz współrzędne XY centrów lub OID komórek wirusowo-dodatnich RNA i tetramerowo-dodatnich. Eksportuj dane OID do plików programu Excel jako liczby liczbowe dla każdej komórki i wykorzystaj dane zebrane w plikach programu Excel do określenia stosunku komórek efektorowych lub e do celów wirusowych lub limfocytów T z całkowitej liczby komórek tetramerowo-dodatnich i wirusowych RNA w sekcji, aby uchwycić relacje przestrzenne między komórkami tetramerowo-dodatnimi i RNA dodatnimi. Skopiuj i wklej odpowiednie wykresy z plików Excela do dokumentu programu Photoshop w programie Photoshop.

Zmniejsz krycie warstwy, aby wyrównać i przeskalować siatki tak, aby pokrywały się kolorem, zaznacz ją, a następnie skopiuj i wklej do nowej warstwy. Pozycje niebieskich komórek dodatnich RNA odrzucają warstwę używaną do wyrównania siatek, a pozycje komórek tetramerowo-dodatnich i wirusowych RNA zostaną ujawnione na spłaszczonym obrazie. Korzystając z przedstawionej tutaj metody ISTH, jesteśmy w stanie śledzić odpowiedź immunologiczną na zakażenie SIV po inokulacji dopochwowej w tym portalu wejścia oraz w tkankach limfatycznych, do których rozprzestrzenia się infekcja.

W tych miejscach tkanek po 10 dniach od zakażenia znajduje się duża liczba zakażonych komórek, ale dopiero trzy dni później pojawiają się komórki CD A z zielonym zabarwieniem, ale jeszcze nie teraz. Zabarwione na czerwono komórki tetra-dodatnie specyficzne dla SIV. Odpowiedź immunologiczna jest więc zbyt późna, aby usunąć infekcję.

Jednak po trzech tygodniach od zakażenia wyraźnie widoczny jest spadek liczby zakażonych komórek, zwłaszcza w miejscu wrota wejścia. Użyliśmy ISTH, aby pokazać, że zakres redukcji był skorelowany z bliskością przestrzenną i względną liczbą tetramerów dodatnich komórek efektorowych odpornościowych. N-S-I-V-R-N-A dodatnie komórki docelowe, nazywamy to stosunkiem E do T in vivo.

Relacje przestrzenne można łatwo zobrazować za pomocą tej metody z komórkami efektorowymi w kolorze czerwonym i celami wirusowymi w kolorze niebieskim w tym zakażonym węźle chłonnym. Wiele komórek efektorowych i docelowych znajduje się w bliskiej odległości i są obszary, w których wiele komórek efektorowych otacza pojedynczą komórkę dodatnią S-I-V-R-N-A, podczas gdy w innych obszarach komórka dodatnia S-I-V-R-N-A stoi samodzielnie. Stosunek ETT jest po prostu obliczany, gdy pozycje komórek są określane i rejestrowane przez numery każdej z nich w pliku Excel.

Najlepsza kontrola infekcji wirusowej koreluje z dużą nadwyżką czerwonych efektorów w stosunku do zielonych celów 43 do jednego. W tym przypadku w szyjce macicy i pochwie, gdzie rozpoczęła się infekcja, wskaźniki ETT były niższe w węzłach chłonnych. Pozytywna korelacja między wysokimi wskaźnikami ETT a zmniejszeniem wiremii od szczytu wskazuje, że silniejsza odpowiedź immunologiczna na wrotu wejścia przekłada się na lepszą kontrolę infekcji.

Właśnie pokazaliśmy, jak jednocześnie wykrywać bardzo specyficzne komórki CDAT i komórkę infekcji wirusowej in situ. Technika ta pozwala nam jednocześnie wizualizować limfocyty T specyficzne dla antygenu i komórki zakażone wirusem w tkankach. Technika ta może być zastosowana do oceny szczepionki opartej na limfocytach T CD 8 dodatnich oraz innych niewartościowych interakcji patogenu i gospodarza podczas wykonywania tej procedury.

Ważne jest, aby wszystkie odczynniki RNA były wolne od wglądu w hybrydyzację. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.