Name: Technika jednoczesnej wizualizacji specyficznych dla wirusa limfocytów T CD8+ i komórek zakażonych wirusem in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 47 s
Description: Poznaj technikę ISTH do wizualizacji przestrzennych relacji między limfocytami T CD8+ a zakażonymi komórkami w tkankach. Metoda ta umożliwia badanie dynamiki odpowiedzi immunologicznej in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy J. Sedgewickowi za pomoc w konfiguracji mikroskopu konfokalnego do rejestracji obrazów ziaren srebra; Wspierane częściowo przez granty badawcze NIH AI48484 (A.T.H.), AI20048 (R.A.) i AI066314 (C.J.M.); Grant Narodowego Centrum Zasobów Badawczych RR00169 (CNPRC, University of California, Davis).

Metoda ta została wykorzystana w badaniach opisanych w pracy <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1726">Li et al., Science 323, 1726-1729 (2009)</a>.
Procedury połączonego barwienia tetramerami in situ i hybrydyzacji in situ (ISTH)
Procedury ISTH można podzielić na 4 etapy: 1) barwienie IST antygenowo-specyficznych limfocytów T CD8+ w tkankach; 2) ISH w celu wykrycia komórek z obecnością RNA wirusa zainfekowanych przez wirusa; 3) obrazowanie mikroskopowe konfokalne komórek zabarwionych metodą IST oraz komórek RNA+ wirusa; 4) analiza obrazów, obejmująca tworzenie montaży obrazów oraz mapowanie komórek tetramer+ i komórek RNA+ wirusa.
1. Barwienie IST swoistych dla antygenu limfocytów T CD8+ w przekrojach tkanek.
 <ol>
 <li>Przygotować świeże tkanki, wycinając sekcje o grubości 200 µm za pomocą wibratomu lub skalpela.</li>
 <li>Kąpiel wibratoma należy schłodzić sterylnym PBS-H do temperatury 0-2°C. Ustawić kąt ostrza wibratoma na dość stromy, wynoszący 27°. W miarę możliwości utrzymać tkanki w niskiej temperaturze na lodzie, aby zminimalizować degradację. Schłodzona świeża tkanka jest również łatwiejsza do sekcjonowania za pomocą wibratoma.</li>
 <li>Wyciąć tkankę nożyczkami chirurgicznymi lub skalpelem na małe kawałki o szerokości około 0,5 cm i wysokości 0,25 cm. Umieścić kawałki tkanki w naczyniu do ważenia lub małej szalce i przykryć roztopioną w temperaturze ~40°C 4% agarozą o niskiej temperaturze topnienia w buforze PBS. Upewnić się, że tkanka styka się z dnem naczynia. Docisnąć kawałki tkanki, jeśli wypływają na powierzchnię. Pozostawić na lodzie do zastygnięcia, co zazwyczaj zajmuje 3-5 minut.</li>
 <li>Pokryć blok tkankowy do wibratoma klejem Loctite. Wyciąć agarozę wokół tkanki skalpelem, a następnie za pomocą pęsety ostrożnie przenieść delikatną tkankę zatopioną w agarozie na blok wibratoma pokryty klejem. Nie przesuwać kawałka tkanki po jego osadzeniu na bloku. Pozostawić do wyschnięcia przez około 10 minut na lodzie.</li>
 <li>Zamocować blok tkankowy w wibratomie i wyciąć sekcje o grubości 200 µm, stosując bardzo małą prędkość przesuwu do przodu i stosunkowo dużą amplitudę. Ustawienia prędkości i amplitudy różnią się w zależności od wibratoma. Jeśli wibratom nie jest dostępny lub tkanka nie nadaje się do sekcjonowania wibratomem, pociąć tkanki na cienkie paski za pomocą skalpela.</li>
 <li>Przenieść sekcje pędzlem do komór tkankowych umieszczonych w dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek zawierającej 1 ml schłodzonego PBS-H. Umieścić do czterech sekcji tkanki w każdej komorze. Opisać pokrywkę płytki informacjami o próbce badawczej i zabezpieczyć ją gumką recepturką.</li>
 <li>Alternatywnie, w przypadku tkanek, które nie dają się dobrze ciąć wibratomem (np. jelito), można wyciąć skalpelem lub żyletką paski tak cienkie, jak to możliwe. W przypadku sekcji ciętych skalpelem umieszczać tylko jedną sekcję na dołek.</li>
 <li>Przejść do barwienia natychmiast po zakończeniu cięcia tkanek. Przez cały czas do momentu utrwalenia utrzymywać sekcje w niskiej temperaturze, aby zminimalizować degradację. Nie dopuścić do wyschnięcia sekcji. Przechowywać sekcje w schłodzonym sterylnym PBS-H.</li>
 <li>Inkubować sekcje tkanek przez noc z tetramerami sprzężonymi z FITC w stężeniu 0,5 mg/ml. W tej inkubacji można zastosować przeciwciała mysie lub niekrólicze skierowane przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym, np. przeciwciała anty-CD8 rozcieńczone 1:200 w roztworze blokującym. Do tej i wszystkich kolejnych inkubacji używać 1 ml roztworu na dołek i przeprowadzać je w temperaturze 4°C na platformie kołyszącej. Komory tkankowe z różnymi próbkami badawczymi należy oddzielić od siebie co najmniej jednym pustym dołkiem, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej roztworów w kolejnych krokach.</li>
 <li>Po inkubacji pierwotnej przemyć sekcje schłodzonym PBS-H dwukrotnie (2X), po 20 minut za każdym razem. Należy to zrobić, przenosząc komory tkankowe do innej 24-dołkowej płytki zawierającej schłodzony PBS-H. Podczas przenoszenia komór uważać, aby nie wkapać zawartości jednej próbki do drugiej. Podczas wszystkich kolejnych inkubacji i płukań w podobny sposób przenosić komory tkankowe do czystej płytki z odpowiednim roztworem. Monitorować sekcje w komorach podczas procedury, aby upewnić się, że nie przywarły do ścianek komór tkankowych.</li>
 <li>Utrwalić sekcje w świeżym 4% paraformaldehydzie w buforze PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przemyć zimnym PBS-H 2X po 5 min każdorazowo.</li>
 <li>Inkubować z króliczymi przeciwciałami anty-FITC, np. Biodesign 1:10 000, w roztworze blokującym przez okres od jednego do trzech dni. W przypadku podwójnego znakowania w tej inkubacji można również zastosować przeciwciała niekrólicze skierowane przeciwko epitopom wewnątrzkomórkowym. W takim przypadku, jeśli jest to konieczne, odsłonić epitopy, a następnie permeabilizować i blokować komórki przed drugą inkubacją.</li>
 <li>W przypadku stosowania przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom wędzkomórkowym, które wymagają odzyskiwania antygenów po utrwalaniu formaldehydem, odsłonić epitopy poprzez gotowanie 3 razy w 0,01 M moczniku, po 10 sekund za każdym razem, w kuchence mikrofalowej. Odczekać 2 minuty między kolejnymi podgrzewaniami. Zachować szczególną ostrożność, ponieważ wrzący roztwór może wypchnąć sekcje z dołków. Jeśli tak się stanie, użyć pędzla, aby przesunąć sekcje ze ścianek komory tkankowej lub z pokrywki płytki z powrotem na dno odpowiedniej komory. Jeśli przeciwciała nie wymagają odzyskiwania antygenów, pominąć ten krok.</li>
 <li>W przypadku stosowania przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom wewnątrzkomórkowym, przed drugą inkubacją permeabilizować i blokować komórki w sekcjach tkanek w PBS-H zawierającym 0,3% triton X-100 i 2% normalnego surowicy koziej przez jedną godzinę. Następnie przeprowadzić pozostałe inkubacje przeciwciał w PBS-H zawierającym 0,3% triton X-100 i 2% normalnej surowicy koziej.</li>
 <li>Po drugiej inkubacji przemywać sekcje w PBS-H od 20 minut do kilku godzin. Powtórzyć dwukrotnie, łącznie wykonując trzy płukania. Przeprowadzić końcową inkubację z odpowiednimi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Na przykład kozi anty-rabbit-Cy3 i kozi anty-mouse-Alexa 488 rozcieńczone 1:1000 każdy w roztworze blokującym. Inkubować od jednego do trzech dni. Chronić sekcje przed światłem, owijając płytki folią aluminiową podczas tej inkubacji i później, ponieważ światło gasi fluorofory.</li>
 <li>Przemywać sekcje w PBS-H od 20 minut do kilku godzin. Powtórzyć dwukrotnie, łącznie wykonując trzy płukania.</li>
 <li>W przypadku połączenia IST z ISH, poddać sekcje ponownemu utrwaleniu w 4% paraformaldehydzie przez 1 godzinę, aby unieruchomić tetramery i przeciwciała, a następnie ponownie opłukać sekcje w PBS-H i zamontować.</li>
 <li>Użyć pędzla do przeniesienia sekcji na szkiełko mikroskopowe. Pokryć każdą sekcję gliceryną/żelatyną zawierającą 4 mg/ml n-propylan gallate lub innym medium montażowym zawierającym konserwant fluoroforu i przykryć szkiełkiem cover slip. Przechowywać preparaty w pojemniku chroniącym przed światłem w temperaturze -20°. Opłukać płytki do hodowli tkanek i usunąć etykiety z pokrywek za pomocą alkoholu. Płytki można ponownie wykorzystać.</li>
 <li>Przeanalizować zabarwione sekcje tkanek za pomocą mikroskopu konfokalnego. Następnie można przystąpić do ISH.</li>
</ol>
2. Wykrywanie komórek zainfekowanych wirusem RNA+ za pomocą hybrydyzacji in situ.
Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ został zmodyfikowany z naszych wcześniej opublikowanych protokołów4,5 w następujący sposób:
<ol><li>Ponowne wycinanie sekcji o grubości 5-8 µm z grubych sekcji barwionych tetramerem in situ.
<ol><li>Sekcje o grubości 200 µm podgrzewa się w temperaturze 70°C przez 5 min, aby oddzielić preparat od szkiełka. </li>
 <li>Następnie sekcję zatapia się w OCT na suchym lodzie. </li>
 <li>Z grubych sekcji za pomocą kriotomu wycina się sekcje o grubości 8 µm i przykleja je do zsilanizowanych szkiełek.</li>
 <li>Szkiełka można przechowywać w temperaturze -80°C w szczelnym pudełku do późniejszej hybrydyzacji in situ.</li>
</ol>
</li>
<li>Hybrydyzacja in situ
<ol>
 <li>Rehydratyzację sekcji tkanek przeprowadza się poprzez zanurzenie szkiełek na 3 min każdorazowo w 90% etanolu i wodzie traktowanej DEPC.</li>
 <li>Permeabilizację sekcji tkanek wykonuje się poprzez podgrzewanie w 10mM buforze cytrynianowym (pH 6.0) w temperaturze 98°C w kąpieli wodnej przez 15 min.</li>
 <li>Sekcje tkanek chłodzi się w temperaturze pokojowej przez 20-30 min. </li>
 <li>Przemywa się dwukrotnie wodą traktowaną DEPC przez 3 min.</li>
 <li>Acetylację sekcji tkanek przeprowadza się poprzez zanurzenie szkiełek w 0,25% bezwodniku octowym w 0,1 M TEA (trietanolaminie, pH 8.0) przez 10 min.</li>
 <li>Szkiełka przenosi się do 0,1 M TEA (pH 8.0) na 5 min. </li>
 <li>Sekcje hybrydyzuje się z oznakowaną 35S specyficzną dla wirusa (np. HIV-1, SIV) sondą antysensowną lub sensowną (kontrola negatywna dla HIV-1, SIV), lub oznakowanymi 35S ryboprobami LCMV (połączone sensowne i antysensowne).</li>
 <li>Po nocnej hybrydyzacji w 42°C sekcje przemywa się dwukrotnie 2xSSC przez 5 min. </li>
 <li>Sekcje przemywa się w STE (0,5 M NaCl, 1mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7.5) przez 5 min.</li>
 <li>Sekcje trawi się RNazami A i T1 w STE w 37°C przez 30 min.</li>
 <li>Sekcje przemywa się w 2x SSC z dodatkiem 50% formamidu przez 5 min.</li>
 <li>Sekcje przemywa się w 1x SSC przez 10 min.</li>
 <li>Sekcje przemywa się w 0,5 x SSC przez 15 min. </li>
 <li>Sekcje dehydratyzuje się w 70%, 80% i 100% etanolu zawierającym 0,3 M octanu amonu, po 5 min w każdym roztworze.</li>
 <li>Sekcje pokrywa się emulsją śladów jądrowych.</li>
 <li>Suszy się w ciemni przez 1 godzinę.</li>
 <li>Ekspozycję sekcji przeprowadza się w 4°C przez 11 dni (SIV) i 3 dni (LCMV).</li>
 <li>Sekcje wywołuje się w D19 (Kodak, Kat# 146 4593) przez 3 min, przemywa w dH2O przez 30 sekund, utrwala w Rapid Fixer (Kodak, Kat# 146 4106) przez 4 min i przemywa w dH2O 3 razy po 5 min.</li>
 <li>Dehydratyzuje się w 70%, 80% i etanolu absolutnym, po 5 min w każdym.</li>
 <li>Szkiełka montuje się w kompatybilnym z fluorescencją medium Permount.</li>
</ol>
</li>
</ol>
3. Pozyskanie obrazów za pomocą mikroskopu konfokalnego.
 <ol>
 <li>Należy wykonać obrazy ISTH za pomocą konfokalnego mikroskopu Bio-Rad MRC 1000 lub dowolnego innego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w urządzenie Epi2-Blue Reflection.</li>
 <li>Należy użyć Epi1-605 dla czerwonego fluorochromu tetrameru, Epi2-522 DF32 dla zielonego fluorochromu CD8 oraz Epi2-Blue Reflection dla ziaren srebra (sygnał ISH w wywołanych radiogramach) przy powiększeniu 20x (dla SIV) lub 60x (dla LCMV).</li>
 <li>Należy sekwencyjnie gromadzić obrazy seryjne w osi Z w odstępach 1-mikronowych w trzech kanałach każdego pola.</li>
 <li>Należy pozyskiwać obrazy z każdego przekroju od lewej do prawej i od góry do dołu, a następnie nazwać każdy obraz zgodnie z jego wierszem i kolumną w pliku Excel.</li>
 <li>Każdy obraz należy uchwycić z około 20% nakładaniem na obrazy sąsiednie, aby uniknąć luk w zrekonstruowanym obrazie montażowym.</li>
 </ol>
4. Analizy obrazów: rekonstrukcja obrazu mozaikowego, obliczanie centroidów komórek i analiza przestrzenna.
<ol>
 <li>Rzutuj obrazy Z-serialne w jeden obraz dla każdego kanału za pomocą programu Confocal Assistant (wersja 4.02.). </li>
 <li>Automatycznie połącz rzutowany obraz z trzech kanałów w jeden obraz RGB, stosując procedurę Action w programie Photoshop 7.0.</li>
 <li>Utwórz obraz montażowy poprzez zszywanie połączonych obrazów w warstwach w programie Photoshop 7.0. </li>
 <li>Przypisz poszczególne ziarna srebra i barwienie tetramerem do komórek oraz wyznacz współrzędne X,Y środków (centroidów) komórek SIV RNA+ i tetramer+, używając programu MetaMorph (wersja 7.1.3.) lub Photoshop (dostępny u autora). </li>
 <li>Eksportuj dane centroidów do plików Excel jako wartości numeryczne dla każdej komórki. Stosunki E:T są wyznaczane na podstawie plików Excel z całkowitej liczby komórek tetramer+ i viral RNA+ w preparacie. </li>
</ol>
Relacje przestrzenne między czerwonymi komórkami tetramer+ a niebieskimi komórkami SIV RNA+ rejestruje się poprzez kopiowanie i wklejanie odpowiednich wykresów z plików Excel do dokumentu Photoshop. Po zmniejszeniu nieprzezroczystości warstwy w celu wyrównania i przeskalowania siatek tak, aby się pokrywały, wybraniu koloru oraz skopiowaniu i wklejeniu pozycji niebieskich komórek RNA+ do nowej warstwy, a następnie usunięciu warstwy służącej do wyrównania siatek, pozycje komórek tetramer+ i viral RNA+ zostaną ujawnione na spłaszczonym obrazie.
5. Uwagi dodatkowe
W przypadku cięcia tkanki zakaźnej:
Pracuj w laboratorium klasy BSL2.5. Zachowaj szczególną ostrożność podczas posługiwania się żyletkami. Umieść żyletkę w uchwycie noża wibratomu za pomocą pęsety. Jeśli nie możesz założyć ostrza pęsetą, zrób to przed dodaniem tkanki do kąpieli i nie wymieniaj ostrza w trakcie pracy. Po zakończeniu krojenia usuń ostrze pęsetą. Przed usunięciem spryskaj ostrze 70% EtOH lub DMQ. Jak zawsze, utylizuj ostrza w pojemniku na odpady ostre. Zmieniaj zewnętrzne rękawiczki lub płucz je w środku dezynfekującym po każdym kontakcie z tkanką lub zanieczyszczonym PBS w zbiorniku. Po zakończeniu pracy, jeśli używany był materiał zakaźny, dodaj środek dezynfekujący DMQ do PBS w zbiorniku i odczekaj kilka minut przed usunięciem. Zdekontaminowany PBS wylej do odpływu. Następnie wypłucz zbiornik wodą, aby usunąć sól i środek dezynfekujący. Oczyść miejsce pracy i przyrządy za pomocą DMQ. Wypłucz przyrządy wodą.
Aby przygotować tetramery z biotynylowanych monomerów MHC:
Należy pozyskać biotynilowane cząsteczki MHC klasy I, takie jak cząsteczki HLA-A *0201/B2m/peptyd wytwarzane z peptydami Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV) lub nieistotnym peptydem MART (ELAGIGILTV) z firmy Beckman Coulter. Biotynilowane cząsteczki HLA-A *0301/B2m/peptyd wytwarzane z Gag (KIRLRPGGK) lub Nef (QVPLRPMTYK) można pozyskać z zakładu tetramerów NIAID. Tetramery generuje się poprzez dodawanie 6 aliquotów ExtraAvidyny (Sigma) znakowanej FITC do biotynilowanych monomerów Mamu A*01/B2m/peptyd w ciągu 8 godzin, aż do uzyskania końcowego stosunku molowego 4,5:1. Uzasadnieniem powolnego dodawania ExtraAvidyny jest fakt, że w początkowych punktach czasowych występuje nadmiar monomeru, co zapewnia, że cała dodana ExtraAvidyna wiąże wszystkie cztery miejsca biotyny. W późniejszej fazie reakcji proces ten jest mniej efektywny, ponieważ pozostaje mniej monomeru i wzrasta prawdopodobieństwo, że ExtraAvidyna nie będzie miała związanych wszystkich 4 miejsc. Gdyby dodać całą ExtraAvidynę naraz, reakcja byłaby mniej wydajna, a więcej cząsteczek ExtraAvidyny miałoby przyłączone tylko 2 lub 3 monomery.

<ol><li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li>
<li>Qingsheng, L. i, Skinner, P. J., Ha, S. -J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li>
<li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li>
<li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li>
<li>Li, Q. ingsheng, Estes, J. acobD., Schlievert, P. atrickM., Duan, L. ijie, Brosnahan, A. mandaJ., Southern, P. eterJ., Reilly, C. avanS., Peterson, M. arnieL., Schultz-Darken, N. ancy, Brunner, K. evinG., Nephew, K. arlaR., Pambuccian, S. tefan, Lifson, J. effreyD., &amp, J. ohnV. C. arlis, Haase, A. shleyT. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ w niniejszym raporcie RNA wirusa służy jako marker komórek zainfekowanych wirusem, wszystkie odczynniki stosowane przed hybrydyzacją powinny być wolne od RNazy. Opisana tutaj procedura hybrydyzacji in situ została zmodyfikowana w celu zachowania sygnału fluorescencyjnego z barwienia tetramerem in situ. Ponieważ sygnał radioautograficzny z komórek zainfekowanych wirusem wykrytych metodą hybrydyzacji in situ znajduje się na głębokości około średnicy jednej komórki, grube skrawki użyte do barwienia tetramerem in situ muszą zostać ponownie pocięte na skrawki o grubości 5-8 µm.
Opisana tutaj nowatorska technika łącząca tetramery in situ oraz hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia jednoczesną wizualizację, mapowanie i analizę relacji przestrzennych między swoistymi dla wirusa limfocytami T CD8+ a zainfekowanymi wirusem komórkami docelowymi. Metoda ta może być stosowana do oceny szczepionek opartych na limfocytach T CD8+ oraz w badaniach innych interakcji między gospodarzem a patogenami niebędącymi wirusami. Opisana tutaj metoda analizy obrazu może zostać również dostosowana do badania relacji przestrzennych dowolnych dwóch populacji komórek oddziałujących in situ; na przykład niedawno zastosowaliśmy procedurę mapowania centroidów w badaniu transmisji HIV-1 drogą płciową w modelu małp niehumanoidalnych zakażonych wirusem niedoboru odporności u małp u makaków rhesus6

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Roztwory i odczynniki:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;PBS-H: roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo z dodatkiem heparyny (100 µg/ml lub 18,7 U/ml) w celu zahamowania aktywności RNaz&lt;/li&gt; &lt;li&gt;pożywka do hodowli tkankowych RPMI zawierająca heparynę (100 µg/ml lub 18,7 U/ml) w celu zahamowania aktywności RNaz&lt;/li&gt; &lt;li&gt;4% nisko topiąca się agaroza w PBS&lt;/li&gt; &lt;li&gt;PBS z 2% normalnym surowicą kozią (lub surowicą gatunku, z którego pochodziły przeciwciała koniugowane z fluoroforem)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;PBS z 2% normalną surowicą kozią i 0,3% Triton X-100&lt;/li&gt; &lt;li&gt;tetramery MHC klasy I koniugowane z FITC&lt;/li&gt; &lt;li&gt;przeciwciała anty-FITC, np. królicze anty-FITC firmy BioDesign&lt;/li&gt; &lt;li&gt;koniugowane z fluoroforem przeciwciała anty-królicze IgG, silnie adsorbowane krzyżowo względem IgG innych gatunków, do zastosowania w wielokrotnym znakowaniu, np. kozie anty-królicze Cy3&lt;/li&gt; &lt;li&gt;koniugowane z fluoroforem przeciwciała anty-mysie IgG, silnie adsorbowane krzyżowo względem IgG innych gatunków, do zastosowania w wielokrotnym znakowaniu&lt;/li&gt; &lt;li&gt;świeżo przygotowana 4% paraformaldehyd w buforze PBS&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,01 M mocznika&lt;/li&gt; &lt;li&gt;mieszanina glicerolu i żelatyny zawierająca 4 mg/ml n-propylogalanianu&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Specjalistyczny sprzęt&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;Wibratom&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Skalpel&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Żyletki&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Nożyczki chirurgiczne&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Błyskawiczny klej Loctite Quick Set (produkt nr 46551)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Pinceta&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Pędzle z włosia wielbłądziego nr 2. Można przyciąć żyletką do pożądanej grubości&lt;/li&gt; &lt;li&gt;24-dołkowe płytki do hodowli tkankowej z płaskim dnem, np. Falcon katalog nr 353226&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Komory tkankowe&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Folia aluminiowa&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Tekturowe etui na szkiełka, np. Fisher katalog nr 12-587-10&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Mikroskop konfokalny&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Szybka referencja odczynników IST&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">PBS-H (roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo z heparyną)&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;450 ml 1X PBS&lt;/li&gt; &lt;li&gt;50 ml 1X PBS + 10X heparyny&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">1x PBS + 10X heparyny&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;500 ml 1X PBS &lt;/li&gt; &lt;li&gt;500 mg heparyny w proszku (przechowywanej na półce z odczynnikami suchymi) &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">PBS-H/ 2% NGS (normalna surowica kozia)&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;49 ml PBS-H w probówce Falcon &lt;/li&gt; &lt;li&gt;1 ml NGS (dostępne w 1 ml alikwotach w zamrażarce -20°C) &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">PBS-H/ 2% NGS/ 0,3% Triton X-100&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;49 ml PBS-H/ 0,3% Triton X-100 w probówce Falcon &lt;/li&gt; &lt;li&gt;1 ml NGS (dostępne w 1 ml alikwotach w zamrażarce -20°C) &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">PBS-H/ 0,3% Triton X-100&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;500 ml PBS-H &lt;/li&gt; &lt;li&gt;1,5 ml Triton X-100 (jest to gęsta ciecz przechowywana na półkach z odczynnikami suchymi) &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">4% LMP Agaroza&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;2 g proszku LMP agarozy &lt;/li&gt; &lt;li&gt;50 ml PBS &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Wstrząsać do wymieszania, podgrzewać w mikrofalówce do rozpuszczenia proszku. &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">GG-NPG (glicerol żelatyna z n-propylogalanianem)&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;Umieścić butelkę glicerolożelatyny w kąpieli wodnej o temperaturze 50°C w celu stopienia&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Dodać 0,06 g propylogalanianu (znajdującego się na półce Terri), dobrze wstrząsnąć&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Przechowywać w kąpieli wodnej, okresowo wstrząsając do czasu rozpuszczenia.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Rozdzielić do probówek 1 ml (brązowe probówki)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">4% paraformaldehyd&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;4 g proszku paraformaldehydu (znajdującego się na półkach z odczynnikami suchymi) &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Wlać około 10 ml PBS-H do cylindra miarowego, dodać proszek paraformaldehydu &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Dolewać wodę, aż objętość osiągnie około 70 ml &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Dodać jedną kroplę NaOH. &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Mieszać do rozpuszczenia (zwykle około 20-30 minut) &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Dodać HCl, aż pH osiągnie wartość między 7 a 8. &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Dopełnić objętość wodą do 100 ml. &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Mocznik 0,01 M&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;0,3 g mocznika (znajdującego się na półkach z odczynnikami suchymi)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;500 ml wody&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów t cd8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Uważa się, że liczebność i rozmieszczenie wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ w stosunku do liczby i lokalizacji zainfekowanych komórek docelowych mają krytyczne znaczenie dla rozstrzygnięcia przebiegu infekcji, od całkowitego wyeliminowania patogenu po przewlekłe zakażenia utrwalone. Opisujemy tutaj metodę oceny przestrzennych i ilościowych zależności między efektorowymi (E) wirusowo-specyficznymi limfocytami T CD8+ a zainfekowanymi celami (T), która łączy barwienie tetramerami in situ (IST) w celu wykrycia wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ z hybrydyzacją in situ (ISH) w celu wykrycia komórek z obecnością viral-RNA+ w tkankach, w których toczy się walka między mechanizmami obronnymi odporności a infekcją. Połączenie barwienia IST i ISH, skrótowo określane jako ISTH, umożliwia wizualizację i mapowanie lokalizacji efektorowych komórek odpornościowych oraz celów, a także łatwe wyznaczenie stosunku E:T. Parametry te mogą następnie posłużyć do określenia zależności między bliskością przestrzenną a czasem i skalą odpowiedzi immunologicznej, co pozwala na prognozowanie wyników wczesnej fazy infekcji.

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Uważa się, że liczba i rozmieszczenie swoistych dla wirusa limfocytów T CD8+ w stosunku do liczby i rozmieszczenia zakażonych komórek docelowych mają krytyczne znaczenie dla rozstrzygnięć, które wahają się od całkowitego wyeliminowania patogenu do przewlekłych zakażeń utrwalonych. Opisujemy tutaj metodę oceny relacji przestrzennych i ilościowych między swoistymi dla wirusa efektorowymi (E) limfocytami T CD8+ a zakażonymi celami (T), która łączy barwienie tetramerem in situ (IST) w celu wykrycia swoistych dla wirusa limfocytów T CD8+ oraz hybrydyzację in situ (ISH) w celu wykrycia komórek RNA+ wirusa w tkankach, w których toczy się walka między mechanizmami obronnymi układu odpornościowego a infekcją. Połączenie barwienia IST i ISH, skrótowo określane jako ISTH, umożliwia wizualizację i mapowanie lokalizacji efektorowych komórek odpornościowych oraz celów, a także łatwe wyznaczanie stosunków E:T. Parametry te mogą następnie służyć do określenia zależności między bliskością przestrzenną a czasem i skalą odpowiedzi immunologicznej, co pozwala przewidzieć przebieg wczesnej fazy zakażenia.

Dzięki połączeniu hybrydyzacji in situ i barwienia tetramerami w technice znanej jako ISTH, można określić względną liczbę oraz relacje przestrzenne między efektorowymi komórkami odpornościowymi swoistymi dla antygenu wirusowego a komórkami i tkankami zainfekowanymi wirusem. Procedura ISTH rozpoczyna się od zatopienia świeżej tkanki zainfekowanej SIV w agarozie. Tkankę tnie się na sekcje o grubości 200 µm przy użyciu wibrotomu, a następnie barwi na obecność antygenu wirusowego.Specyficzne komórki CD8+ przy użyciu tetramerów MHC znakowanych FITC. Po zamrożeniu, barwione skrawki są dalej cięte na sekcje o grubości 8 µm za pomocą kriostatu, a następnie przeprowadza się hybrydyzację in situ w celu lokalizacji komórek zainfekowanych wirusem. Mikroskopia konfokalna jest wykorzystywana do obrazowania podwójnie barwionych sekcji i ostatecznej rekonstrukcji oryginalnych grubych skrawków, aby ujawnić relację między efektorowymi komórkami układu odpornościowego a komórkami docelowymi.Zastosowanie tej procedury do badania wczesnej infekcji SIV okazało się dobrym prognostykiem w określaniu ciężkości rozwijającej się choroby. Cześć, jestem Chinen Lee z zespołu badawczego Ashley HA w Katedrze Mikrobiologii na Uniwersytecie Minnesoty. Jestem Pam Skinner, adiunkt w Katedrze Biomedycznych Nauk Weterynaryjnych na Uniwersytecie Minnesoty.Dzisiaj przedstawimy procedurę hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem tetramerami in situ, w skrócie ISTH. Oprócz stosowania barwienia tetramerami in situ w połączeniu z hybrydyzacją in situ, co demonstrujemy dzisiaj, rutynowo wykorzystujemy również barwienie tetramerami in situ w połączeniu z immunohistochemią, aby określić lokalizację, liczebność i profil ekspresji białek swoistych dla antygenu limfocytów T CD8 in situ. W barwieniu tetramerami in situ na grubych skrawkach pomogą nam dr Heon Kim i Terry Matala, a w przygotowaniu cienkich skrawków i hybrydyzacji in situ pomoże nam So. Zacznijmy zatem.Aby rozpocząć tę procedurę, schłodź kąpiel Vibram zawierającą sterylną PBSH do 2 °C. Ustaw kąt ostrza wibratora na 27 stopni. W miarę możliwości utrzymuj świeże tkanki schłodzone na lodzie i rozpocznij procedurę w ciągu 24 godzin od pobrania tkanek.Aby zminimalizować degradację podczas chłodzenia, należy również ułatwić wycięcie świeżej tkanki, usunąć tkankę łączną, a następnie za pomocą skalpela pociąć próbkę na małe fragmenty, umieścić je w naczyniu typu whey boat i pokryć 4% niskotopnym agarosem w PBS, roztopionym w temperaturze około 40°C. Należy upewnić się, że tkanka styka się z dnem naczynia i docisnąć fragmenty tkanki, jeśli wypływają na powierzchnię, a następnie pozostawić do zestalenia na lodzie przez trzy do pięciu minut.W tym przypadku wykorzystana została tkanka śledziony, lecz przy użyciu skalpela można równie dobrze użyć węzłów chłonnych, pochwy, szyjki macicy, macicy lub innych świeżych tkanek. Wytnij agros wokół tkanki i za pomocą pęsety ostrożnie przenieś tkankę zatopioną w agros do bloku tkankowego. Następnie pokryj blok tkankowy Vibram klejem Loctite.Nie przesuwać fragmentu tkanki po umieszczeniu go na bloku tkankowym. Pozostawić do wyschnięcia na lodzie przez około 10 minut. Następnie zamocować blok tkankowy w wibrotomie i wykrawać sekcje o grubości 200 µm, stosując bardzo małą prędkość posuwu do przodu i stosunkowo wysoką amplitudę.Używając pędzla, przenieś wycięte skrawki do specjalnej komory tkankowej umieszczonej w dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, uprzednio napełnionej jednym mililitrem schłodzonego PBSH. Umieść do czterech skrawków tkanki w każdej komorze tkankowej. Opisz próbki i zabezpiecz pokrywkę płytki gumką recepturką, aby przeprowadzić barwienie skrawków tkanki w celu wykrycia limfocytów T swoistych dla wirusa.Tetramery sprzężone z ZI są najpierw rozcieńczane w buforze blokującym do stężenia 0,5 µg/mL. Roztwór jest pipetowany do płytki 24-dołkowej w ilości 1 mL na dołek. Świeżo wycięta tkanka jest przenoszona do komór tkankowych na płytce i pozostawiona do inkubacji na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C.Należy pozostawić pustą studzienkę między komorami tkankowymi zawierającymi różne próbki, aby zapobiec krzyżowemu zanieczyszczeniu roztworów w kolejnych krokach. Na tym etapie można dodać przeciwciała skierowane przeciwko białkom zewnątrzkomórkowym lub białkom powierzchniowym komórek. Do płukania, po inkubacji pierwotnej, należy przygotować 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą schłodzony PBSH.Przemyj dwukrotnie, przenosząc komory z tkanką do wypełnionej wcześniej płytki na 20 minut każdego razu; przed przeniesieniem upewnij się, że większość cieczy została odlana z komór z tkanką. Ponadto, podczas przenoszenia komór z tkanką uważaj, aby zawartość jednej próbki nie ściekła do drugiej, i monitoruj skrawki w komorach, aby upewnić się, że nie przywarły do ścianek. Po utrwalaniu utrwal skrawki świeżym 4%paraldehydem w PBS przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Przemyto dwukrotnie zimnym PBSH przez pięć minut każdego razem, aby wzmocnić sygnał z tetramerów. Inkubować przekroje z króliczymi przeciwciałami anty-fitzy w stosunku 1:10 000 w buforze blokującym przez jeden do trzech dni. Na tym etapie można dodać przeciwciała przeciwko epitopom wewnątrzkomórkowym.Należy upewnić się, że komórki zostały uprzednio permeabilizowane, a miejsca niespecyficzne zablokowane przed dodaniem przeciwciała. Może być również wymagane odzyskiwanie antygenu po drugiej długiej inkubacji mającej na celu wzmocnienie sygnału. Przećć przekroje w PBSH trzykrotnie, za każdym razem przez co najmniej 20 minut, a nawet do kilku godzin.Przeprowadź końcową inkubację z odpowiednimi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Na przykład można zastosować przeciwciała kozie anty-królicze SI three, aby związać przeciwciała królicze anty-fitzy, co spowoduje czerwoną fluorescencję komórek barwionych tetramerem. Jeśli do przeciwbarwienia białek zainteresowania, takich jak CD eight w celu wizualizacji komórek T cytotoksycznych, użyto przeciwciał mysich, można zastosować przeciwciała kozie anty-mysie Alexa 488, aby związały się z przeciwciałami mysimi i spowodowały zieloną fluorescencję komórek barwionych przeciwciałami; rozcieńczenia każdego przeciwciała należy określić empirycznie.Inkubować od jednego do trzech dni, chroniąc skrawki przed światłem poprzez owinięcie płytek folią aluminiową podczas inkubacji oraz w dalszej kolejności, ponieważ światło powoduje wygaszanie fluorescencji. Na koniec ponownie utrwalić skrawki, aby unieruchomić tetramery i przeciwciała. Przemyć i zamontować na szkiełku mikroskopowym w żelatynie glicerolowej zawierającej 4 mg/mL NP-40 i galianu dla przechowywania w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania cienkich skrawków do hybrydyzacji in situ.Przetworzone preparaty z barwieniem tetramerem in situ można teraz analizować za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby określić lokalizację, liczebność oraz wzorzec ekspresji białek swoistych dla antygenu limfocytów T CD8+ w obrazie. Przedstawione przekroje tkanki śledziony od zainfekowanego SIV macaki rezesus zostały zabarwione tetramerami gag w celu oznaczenia swoistych dla SIV limfocytów T CD8+, przeciwciałami CD20 oraz przeciwciałami CD3. Ponieważ przeciwbarwienie przeciwciałami zostanie utracone w kolejnym kroku, ważne jest przeprowadzenie analizy tetramerów in situ przed przejściem do dalszych etapów.Procedurę cienkiego krojenia należy rozpocząć od podgrzania sekcji o grubości 200 µm w temperaturze 70 °C przez pięć minut na bloku grzejnym, aby oddzielić grube sekcje od szkiełka. Po oddzieleniu sekcji należy je zatopić w OCT na suchym lodzie, najpierw wypełniając dno plastikowej formy OCT. Następnie należy umieścić tkankę na wierzchu OCT i przykryć ją OCT.Użyj kriotomu do wycięcia przekrojów o grubości ośmiu mikronów z sekcji zatopionych w OCT, a następnie przymocuj te przekroje o grubości ośmiu mikronów do zasilikonizowanych szkiełek. Szkiełka można następnie przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w szczelnym pudełku do późniejszej hybrydyzacji in situ. Standardowa hybrydyzacja in situ jest stosowana do wykrywania komórek zainfekowanych wirusem za pomocą specyficznych dla wirusa sond rybowych znakowanych S 35.Procedura obejmuje również pokrywanie skrawków emulsją śladów jądrowych oraz montowanie preparatów. W medium paramount kompatybilnym z fluorescencją obrazy konfokalne są pozyskiwane przy użyciu mikroskopu konfokalnego BioRad MRC 1000, który jest wyposażony w urządzenie do odbicia niebieskiego światła epi tube. Barwienie tetramerem in situ jest wizualizowane przy użyciu EPI one 605 dla czerwonego fluorochromu tetrameru oraz EPI 2 522 DF 32 dla zielonego fluorochromu CD8 w przypadku hybrydyzacji in situ.Do obrazowania ziaren srebra powstałych w wyniku sygnału hybrydyzacji in situ w wywołanych autoradiogramach należy użyć oświetlenia EPI two blue reflection. Aby rozpocząć akwizycję obrazów, należy pobierać obrazy z każdego przekroju od lewej do prawej i od góry do dołu, dbając o to, aby każdy obraz nakładał się na obrazy sąsiednie w około 20%. Aby uniknąć luk w zrekonstruowanym obrazie montażowym, należy nazwać każdy obraz zgodnie z jego wierszem i kolumną w pliku Excel.Po zakończeniu zbierania danych z preparatów, należy użyć oprogramowania confocal assistant do rzutowania seryjnych obrazów Z dla każdego kanału w jeden obraz, stosując procedurę akcji z programu Photoshop 7 dostępną od autorów, a następnie automatycznie połączyć rzutowany obraz z trzech kanałów w jeden obraz RGB. Następnie należy zszyć połączone obrazy w warstwach, aby wygenerować obraz montażowy całego przekroju. Pojedyncze ziarna srebra oraz barwienie tetramerem należy przypisać do komórek na montażu za pomocą programu Metamorph lub Photoshop.Przypisz współrzędne XY środków lub identyfikatory OID komórek dodatnich pod kątem RNA wirusa oraz komórek dodatnich pod kątem tetrameru. Eksportuj dane OID do plików Excel jako wartości numeryczne dla każdej komórki i wykorzystaj dane zebrane w plikach Excel do określenia stosunku efektorów immunologicznych (komórek E) do celów wirusowych (komórek T), bazując na całkowitej liczbie komórek dodatnich pod kątem tetrameru i dodatnich pod kątem RNA wirusa w przekroju, aby uchwycić relacje przestrzenne między tymi populacjami komórek. Skopiuj i wklej odpowiednie wykresy z plików Excel do dokumentu w programie Photoshop.Zmniejsz krycie warstwy, aby wyrównać i przeskalować siatki tak, by pokrywały się kolorami, zaznacz je, a następnie skopiuj i wklej do nowej warstwy. Pozycje niebieskich komórek RNA-dodatnich pozwalają usunąć warstwę służącą do wyrównywania siatek, dzięki czemu na spłaszczonym obrazie zostaną ujawnione pozycje komórek tetramer-dodatnich oraz viral RNA-dodatnich. Stosując przedstawioną tutaj metodę ISTH, jesteśmy w stanie śledzić odpowiedź immunologiczną na zakażenie SIV po inokulacji dopochwowej w tym miejscu wniknięcia oraz w tkankach limfatycznych, do których rozprzestrzenia się infekcja.W tych miejscach tkankowych w 10. dniu po infekcji występuje duża liczba zakażonych komórek, jednak nawet trzy dni później obserwuje się komórki dodatnie pod kątem barwienia CD8 na zielono, ale nie ma jeszcze czerwonych komórek dodatnich pod kątem tetrameru specyficznego dla SIV. Odpowiedź immunologiczna jest zatem zbyt późna, aby wyeliminować infekcję.Jednakże w trzecim tygodniu po zakażeniu wyraźnie widoczny jest spadek liczby zakażonych komórek, zwłaszcza w miejscu wniknięcia patogenu. Wykorzystaliśmy metodę ISTH, aby wykazać, że stopień tej redukcji był skorelowany z bliskością przestrzenną oraz względną liczbą efektorowych komórek odpornościowych dodatnich pod względem tetrameru w stosunku do komórek docelowych dodatnich pod względem N-S-I-V-R-N-A; określamy to mianem stosunku E do T in vivo.Relacje przestrzenne są łatwo wizualizowane za pomocą tej metody, gdzie komórki efektorowe są zaznaczone na czerwono, a cele wirusowe na niebiesko w tym zainfekowanym węźle chłonnym. Wiele komórek efektorowych i docelowych znajduje się w bliskim sąsiedztwie i istnieją obszary, w których wiele komórek efektorowych otacza pojedynczą komórkę pozytywną pod kątem S-I-V-R-N-A, podczas gdy w innych obszarach komórka pozytywna pod kątem S-I-V-R-N-A występuje pojedynczo. Stosunek E:T jest obliczany w prosty sposób, gdy pozycje komórek zostaną określone i zapisane w pliku Excel w formie liczby każdej z nich.Najskuteczniejsza kontrola infekcji wirusowej koreluje z dużą nadwyżką czerwonych efektorów nad zielonymi celami w stosunku 43 do jednego. W tym przypadku, w szyjce macicy i pochwie, gdzie rozpoczęła się infekcja, stosunki ETT w węzłach chłonnych były niższe. Dodatnia korelacja między wysokimi stosunkami ETT a redukcją ładunku wirusowego od wartości szczytowej wskazuje, że silniejsza odpowiedź immunologiczna w miejscu wniknięcia przekłada się na lepszą kontrolę infekcji.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób jednoczesnego wykrywania wysoce specyficznych komórek CDAT oraz komórek zainfekowanych wirusem in situ. Technika ta pozwala na jednoczesną wizualizację antygenowo swoistych limfocytów T oraz komórek zainfekowanych wirusem w tkankach. Metodę tę można zastosować do oceny szczepionek opartych na limfocytach T CD8+ oraz innych interakcji między patogenem a gospodarzem, które nie są związane z wakcynacją, podczas przeprowadzania tej procedury.Ważne jest, aby wszystkie odczynniki pozostały wolne od RNaz przed przeprowadzeniem hybrydyzacji in situ. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.

a-technique-to-simultaneously-visualize-virus-specific-cd8-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Technika jednoczesnego wizualizowania wirusowo-specyficznych komórek CD8+ T i komórek zakażonych wirusem in situ

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania fluorescencyjnych limfocytów T wprowadzonych do przekrojów węzła chłonnego. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T w czasie rzeczywistym przy użyciu tradycyjnych mikroskopów fluorescencyjnych w szerokim polu lub mikroskopów konfokalnych.

Obrazowanie ex vivo limfocytów T w przekrojach węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej

Ten film opisuje obrazowanie rezydentów infiltrujących nowotwór limfocytów T CD8 znakowanych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w ludzkich wycinkach guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Analiza w czasie rzeczywistym migracji rezydentnych limfocytów T w różnych regionach guza przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Ten film demonstruje technikę wielospektralnej fluorescencji in-situ do analizy różnych subpopulacji infiltrujących limfocytów T w tkance nowotworowej. Kriosekcja tkankowa raka nerkowokomórkowego jest traktowana przeciwciałami znakującymi limfocyty T CD8 +, które wyrażają specyficzne receptory hamujące i wykazują fenotyp oporny na immunoterapię. Oznaczony odcinek jest wizualizowany za pomocą mikroskopu wielospektralnego w celu identyfikacji odrębnych subpopulacji limfocytów T CD8 +.

Multipleksowane obrazowanie immunofluorescencyjne w celu analizy subpopulacji limfocytów T opornych na immunoterapię

Ten film demonstruje metodę monitorowania zakażonego białka komórkowego 0, ICP0 w zakażeniu wirusem opryszczki pospolitej-1. Po syntezie de novo ICP0 przemieszcza się do jądra, a następnie przemieszcza się do cytoplazmy podczas progresji infekcji. Mikroskopia immunofluorescencyjna ujawnia i analizuje subkomórkową lokalizację białka, oferując wgląd w jego transport w różnych fazach infekcji.

Technika immunofluorescencji lokalizacji białek wirusowych w zakażonych komórkach

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Tutaj opisujemy metodę, która łączy barwienie in situ MHC-tetrameru z immunohistochemią w celu określenia lokalizacji, fenotypu i ilości limfocytów T specyficznych dla antygenu w tkankach. Protokół ten służy do określania charakterystyki przestrzennej i fenotypowej limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w stosunku do innych typów komórek i struktur w tkankach.

In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach

Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).

Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Poznaj technikę ISTH do wizualizacji przestrzennych relacji między limfocytami T CD8+ a zakażonymi komórkami w tkankach. Metoda ta umożliwia badanie dynamiki odpowiedzi immunologicznej in situ.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Przeglądaj więcej filmów