Ekstrakcja wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleb i osadów

Witajcie, jestem San Lee z laboratorium Stephena Harlema w Katedrze Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę ekstrakcji wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleby leśnej, która ma zastosowanie również do szerokiej gamy typów gleb i osadów. Wykorzystujemy wysokocząsteczkowe genomowe DNA do tworzenia bibliotek metagenomicznych leśnych społeczności mikrobiologicznych gleby.

Posiadając te biblioteki, możemy badać różnorodność i potencjał metaboliczny społeczności mikrobowych rozdzielonych pomiędzy różne poziomy glebowe. Zacznijmy zatem. Niniejszy protokół rozpoczyna się od lizy komórek.

Pierwszym krokiem jest uzupełnienie buforu denaturującego poprzez dodanie beta-merkaptoetanolu do stężenia 0,5%. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy przygotowywać roztwór denaturujący na świeżo przed każdym użyciem. Alternatywnie można zastosować bufor starszy niż jeden tydzień, który był przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsius. Do następnego kroku będą potrzebne: naczynie z ciekłym azotem, autoklaw oraz schłodzony wcześniej moździerz z tłuczkiem i szpatułka.

Umieść dwugramową zamrożoną próbkę gleby w schłodzonym wcześniej moździerzu. Dodaj jeden mililitr roztworu denaturującego. Następnie dodaj ciekły azot, aby całkowicie przykryć glebę.

Użyj schłodzonego wcześniej tłuczka, aby rozetrzeć próbkę, aż cząsteczki gleby staną się sypkie i jednorodne, a próbka zacznie topnieć. Następnie dodaj więcej ciekłego azotu i powtórz etap rozcierania. Tym samym kończy się etap lizy komórek z wykorzystaniem schłodzonej wcześniej szpatułki.

Przenieś zmieloną próbkę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Próbkę należy przechowywać w lodzie w celu niezwłocznego przejścia do etapu ekstrakcji DNA lub przechowywać w temperaturze -80 °C. W przypadku późniejszego użycia, bezpośrednio przed rozpoczęciem ekstrakcji DNA, uzupełnij bufor ekstrakcyjny, dodając bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB) oraz SDS.

Sprawdzić, czy CTAB uległ krystalizacji, a jeśli tak, rozpuścić go w temperaturze 60°C przed kontynuacją. Następnie dodać go do roztworu do uzyskania całkowitego stężenia 1%. Następnie dodać 20% roztwór SDS do uzyskania stężenia końcowego 2%. Powstanie mętnej zawiesiny jest zjawiskiem normalnym.

Po dodaniu SDS, aby bufor do ekstrakcji pozostał homogenny, należy go przechowywać w temperaturze 60 °C przez 10 do 15 minut. Gdy bufor do ekstrakcji zostanie całkowicie rozpuszczony i stanie się homogenny, należy dodać dziewięć mililitrów buforu do próbki gleby i krótko wymieszać na wirówce typu vortex przy niskich obrotach. Próbkę z buforem do ekstrakcji należy inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 65 °C przez 40 minut.

Podczas inkubacji należy delikatnie odwracać probówki co 10 minut lub stale obracać je przy najniższej prędkości rotora. Po zakończeniu inkubacji roztwór może wydawać się lekko lepki. Kolejnym krokiem jest zastosowanie chloroformoizoamylalkoholu w celu oczyszczenia DNA z materiałów organicznych znajdujących się w mieszaninie lizującej.

Rozpocznij od wirowania próbki przez 10 minut przy 1800 Gs w temperaturze około 10 do 14 °C w dygestorium; zbierz nadsącz zawierający DNA, ostrożnie przesuwając końcówkę pipety wzdłuż ścianki probówki, unikając beżowej warstwy na górze oraz warstwy organicznej na dnie. Przenieś nadsącz do schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml chloroformo-izoamylalkoholu (CIAA). Następnie powtórz proces ekstrakcji jeszcze dwa razy na tej samej próbce. W międzyczasie przechowuj ekstrakt DNA oraz CIAA na lodzie w dygestorium.

W celu przeprowadzenia drugiej ekstrakcji DNA, należy powrócić do probówki zawierającej osad glebowy z pozostałością buforu ekstrakcyjnego i dodać kolejne pięć mililitrów buforu ekstrakcyjnego. Delikatnie wymieszać zawartość za pomocą końcówki o pojemności jednego mililitra, a następnie krótko wortexować, aby ponownie zawiesić osad, analogicznie jak poprzednio. Tym razem inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut.

Następnie wiruj z prędkością 1800 Gs przez 10 minut. W dygestorium, w temperaturze około 10 do 14 °C, przenieś nadsącz do probówki zawierającej chloroform i alkohol izoamylowy (chloroform i a a) oraz nadsącz z poprzedniej ekstrakcji. Powtórz cały proces ekstrakcji jeszcze raz, aby wyizolować jak największą ilość DNA z próbki gleby.

Po przeprowadzeniu łącznie trzech ekstrakcji z próbki gleby, bardzo delikatnie wymieszaj probówkę zawierającą zebrany nadsącz i chloroform na rotatorze z prędkością 1,25 rpm przez 10 minut. Po tym etapie mieszania odwiruj probówkę z prędkością 1800 Gs przez 20 minut w temperaturze od około 10 do 14 °C. Po wirowaniu ostrożnie przenieś fazę wodną do nowej probówki do ultrawirowania, pozostawiając jeden do dwóch mililitrów nadsączu, aby uniknąć naruszenia granicy między fazą wodną a organiczną. Następnie, w celu wytrącenia DNA, dodaj 0,6 ml izopropanolu.

Do każdego mililitra zebranego supernatantu dodaj izopropanol, a następnie kilka razy delikatnie odwróć probówki, aby wymieszać zawartość. Na tym etapie można zauważyć wytrącanie się DNA w postaci długich nici. Następnie inkubuj DNA z izopropanolem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji należy serylować DNA poprzez wirowanie. Oznacz jeden róg probówki przed umieszczeniem jej w wirówce, aby wiedzieć, gdzie spodziewać się osadu DNA. Wirować z prędkością 16 000 g przez 20 minut w temperaturze od 20 do 25 °C. Po wirowaniu usunąć alkohol izopropylowy poprzez zlanie go lub odsysanie próżniowe. Należy uważać, aby nie zgubić osadu DNA, którego wielkość waha się od niemal niewidocznego do 9 mm szerokości, w zależności od wydajności ekstrakcji i biomasy w próbkach gleby. Osad DNA suszyć w temperaturze pokojowej przez 5 do 20 minut. Należy uważać, aby nie przesuszyć go, gdy osad będzie już suchy.

Resuspend DNA w 200 do 400 µL buforu TE. Wymieszaj roztwór, delikatnie opukując probówkę. Przenieś roztwór DNA do probówki o pojemności 1,5 mL.

Przechowywać DNA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Aby w pełni rozpuścić DNA po jego ekstrakcji z próbki gleby, należy przeprowadzić pozostałe etapy sprawdzania stężenia i integralności DNA próbki zgodnie ze standardowymi procedurami, które zostały szczegółowo opisane w innym protokole JoVE z laboratorium Hallama. Oznaczyć stężenie DNA wybraną przez siebie metodą.

Należy również sprawdzić integralność wysokocząsteczkowego DNA, przeprowadzając elektroforezę w polu impulsowym (PFGE) 10 do 20 µL próbki DNA. Mediana wielkości DNA powinna wynosić 36 kb lub więcej, w zależności od planowanych dalszych zastosowań. Przejdź do następnego etapu wirowania w gradiencie chlorku cezu; alternatywnie DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C przed ultrawirowaniem.

Kolejnym krokiem jest zastosowanie wirowania w gradiencie chlorku cezu w celu dalszego oczyszczenia DNA poprzez usunięcie zanieczyszczeń, a następnie skoncentrowanie i dalsze oczyszczenie DNA przy użyciu odwirku filtracyjnego AmCon i MicroCon. Wirowanie w gradiencie chlorku cezu jest kluczowe dla uzyskania wysokiej jakości DNA i zostało szczegółowo opisane w innym protokole JoVE z laboratorium Hallama. Po przeprowadzeniu etapów wirowania w gradiencie chlorku cezu oraz koncentracji należy sprawdzić stężenie DNA wybraną przez siebie metodą.

Następnie należy ponownie sprawdzić integralność wysokocząsteczkowego DNA, przeprowadzając PFGE niewielkiej próbki DNA. Całkowita ilość genomowego DNA wyizolowanego z dwóch gramów gleby wymuszonej mieści się w przedziale od 10 do 180 µg, co pokazano na żelu przed i po ultrazentryfugacji w chlorku cezu. Zakres wielkości wyizolowanego DNA zazwyczaj mieści się w granicach od 40 do 60 kb; przedstawiono tutaj chromatogram próbek genomowego DNA przed i po ultrazentryfugacji w chlorku cezu.

Ten etap poprawia czystość DNA, zwiększając stosunek 260/280 z poziomu 1,3–1,6 przed procesem do 1,8–1,9 po jego zakończeniu. Ponadto po wirowaniu udało się skutecznie zredukować szczyt absorbancji przy 230 nanometrach, który wskazywał na zanieczyszczenie kwasami huminowymi. Przedstawiliśmy właśnie sposób izolacji wysokocząsteczkowego genomowego DNA z glebowych społeczności mikrobiologicznych.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przygotować bufor do ekstrakcji i denaturacji ściśle według instrukcji. Należy również uważać, aby nie dotknąć osadu DNA po precypitacji alkoholem izopropylowym. Następnie należy odzyskać prążek DNA po wirowaniu w gradiencie chlorkowym.

Nie zapomnij przemyć strzykawki buforem TE, aby zmaksymalizować odzysk DNA. Na koniec należy sprawdzić ilość i jakość wyizolowanego DNA na wszystkich sugerowanych etapach. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.