Ekstrakcja genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z gleb i osadów
10 listopada 2009
Opisano metodologię izolowania genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej i wysokiej jakości z mikroorganizmów glebowych.
Cześć, jestem San Lee i pracuję w laboratorium Stephena Harlema na Wydziale Mikrobiologii i Immunologii Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę genomowej ekstrakcji DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z lasu do gleby, która ma również zastosowanie do szerokiej gamy typów gleb i osadów. Używamy genomu o wysokiej masie cząsteczkowej, DNA do budowy biblioteki mierników leśnych zbiorowisk mikroorganizmów glebowych.
Mając te biblioteki w ręku, możemy badać różnorodność i potencjał metaboliczny zbiorowisk mikroorganizmów dzielących się między różnymi poziomami glebowymi. Więc zacznijmy. Ten protokół rozpoczyna się od lizy komórek.
Pierwszym krokiem jest uzupełnienie buforu denaturującego poprzez dodanie etanolu betta mer capto do stężenia 0,5%Aby uzyskać najlepsze wyniki, roztwór denaturujący należy za każdym razem świeżości. Alternatywnie należy użyć buforu sprzed tygodnia i temperatury poniżej czterech stopni Celsjusza. Do następnego kroku potrzebny będzie dozownik ciekłego azotu oraz autoklaw oraz wstępnie schłodzony tłuczek moździerzowy i szpatułka.
Umieścić dwugramową zamrożoną próbkę gleby we wstępnie schłodzonej zaprawie. Dodaj jeden mililitr roztworu denaturującego. Następnie dodaj ciekły azot, aby całkowicie pokryć glebę.
Użyj wstępnie schłodzonego tłuczka, aby zmielić próbkę, aż cząstki gleby staną się sproszkowane i jednorodne, a próbka zacznie się topić. Następnie dodaj więcej ciekłego azotu i powtórz etap mielenia. Na tym kończy się etap lizy komórek za pomocą wstępnie schłodzonej szpatułki.
Przenieś zmieloną próbkę do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Próbkę należy przechowywać na lodzie, aby natychmiast przejść do etapu ekstrakcji DNA lub przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Do litrowego stosowania, tuż przed rozpoczęciem ekstrakcji DNA, uzupełnij bufor ekstrakcyjny, dodając bromek trimetyloamoniowy hexa deco lub CTAB i SDS. Pierwszy.
Sprawdź, czy CTAB jest skrystalizowany, a jeśli tak, rozpuść go w temperaturze 60 stopni Celsjusza przed kontynuowaniem. Następnie dodaj go do roztworu, aby uzyskać całkowite stężenie 1%Następnie dodaj 20%roztwór SDS do końcowego stężenia 2%Mleczna zawiesina. To normalne.
Po dodaniu SDS należy utrzymać jednorodny bufor ekstrakcyjny, przechowując go w temperaturze 60 stopni Celsjusza po 10 do 15 minutach. Gdy bufor ekstrakcyjny jest dobrze rozpuszczony i jednorodny, dodaj dziewięć mililitrów buforu ekstrakcyjnego do próbki gleby i krótko wiruj z małą prędkością, aby wymieszać. Inkubować próbkę z buforem ekstrakcyjnym w piecu do hybrydyzacji o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 40 minut.
Podczas inkubacji delikatnie odwracaj probówki co 10 minut lub w sposób ciągły obracaj probówki z najniższą prędkością wirnika. Podczas inkubacji roztwór może wydawać się lekko lepki po inkubacji. Następnym krokiem jest użycie chloroformowego alkoholu izoamylowego do oczyszczenia DNA z materiału organicznego w mieszaninie do lizy.
Rozpocznij od odwirowania próbki przez 10 minut w temperaturze 1800 G w temperaturze około 10 do 14 stopni Celsjusza w kapturze, zbierz DNA zawierające supernatant, ostrożnie przesuwając końcówkę pipety wzdłuż boku probówki, unikając beżowej warstwy na górze i warstwy organicznej na dole. Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej 50-mililitrowej probówki zawierającej 20 mililitrów chloroformu ISL alkoholu lub a a następnym powtórzyć proces ekstrakcji jeszcze dwa razy na tej samej próbce. W międzyczasie trzymaj ekstrakt DNA i chloroform i a a na lodzie w kapturze.
W przypadku drugiej ekstrakcji DNA wróć do probówki zawierającej osad glebowy z resztkowym buforem ekstrakcyjnym i dodaj pięć kolejnych mililitrów buforu ekstrakcyjnego. Delikatnie wymieszaj jednomililitrową końcówką, aby wymieszać i krótko zmieszać, aby ponownie zawiesić granulkę jak poprzednio. Inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza, tym razem przez 10 minut.
Następnie odwirować w temperaturze 1800 g przez 10 minut. W temperaturze około 10 do 14 stopni Celsjusza w kapturze przenieść supernatant do probówki zawierającej chloroform, alkohol izoamylowy lub chloroform i a a oraz supernatant z poprzedniej ekstrakcji. Powtórz cały proces ekstrakcji jeszcze raz, aby wydobyć jak najwięcej DNA z próbki gleby.
Po wykonaniu łącznie trzech ekstrakcji próbki gleby, bardzo delikatnie potrząsaj probówką zawierającą zebrany składnik nadnatantu i chloroform i a a na obracającej się płytce o temperaturze 1,25 RRP m przez 10 minut Po tym etapie mieszania odwirować probówkę o sile 1800 g przez 20 minut w temperaturze około 10 do 14 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie przenieś fazę wodną do nowej ultra probówki wirówkowej, pozostawiając od jednego do dwóch mililitrów SNAT, aby uniknąć zakłócenia granicy faz między fazą wodną i organiczną. Teraz, aby wytrącić DNA, dodaj 0,6 mililitra alkoholu izopropylowego.
Na każdy mililitr zebranego supernatantu delikatnie odwróć probówki kilka razy, aby wymieszać. W tym momencie możesz być w stanie zobaczyć, jak DNA wytrąca się w długie nitki. Następnie inkubować DNA z izopropanolem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po inkubacji nadszedł czas, aby osadzać DNA przez wirowanie, zaznaczając jeden róg probówki, umieszczając ją w wirówce, aby wiedzieć, gdzie spodziewać się granulki DNA Wirować w temperaturze 16 000 GS przez 20 minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza po odwirowaniu, usunąć alkohol izopropylowy przez dekantację i/lub odsysanie próżniowe. Uważaj, aby nie zgubić granulki DNA, której wielkość waha się od ledwo widocznej do dziewięciu milimetrów szerokości, w zależności od wydajności ekstrakcji i biomasy w próbkach gleby, susz granulkę DNA w temperaturze pokojowej przez pięć do 20 minut. Uważaj, aby nie przesuszyć, gdy granulka jest sucha.
Ponownie zawiesić DNA w 200 do 400 mikrolitrach te. Wymieszaj go delikatnie stukając. Przenieś roztwór DNA do probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Utrzymuj DNA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. W celu pełnego rozpuszczenia DNA po wyekstrahowaniu DNA z próbki gleby, pozostałe etapy sprawdzania stężenia i integralności DNA próbki to standardowe procedury, które są szczegółowo opisane w innym protokole JoVE z laboratorium Hallam. Określ stężenie DNA wybraną przez siebie metodą.
Sprawdź również integralność DNA o dużej masie cząsteczkowej, pobierając od 10 do 20 mikrolitrów próbki DNA za pomocą elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym lub PFGE. Mediana wielkości DNA powinna wynosić 36 kilozasad lub więcej, w zależności od dalszej aplikacji. Przejdź do następnego etapu wirówki gradientowej chlorku cezu, alternatywnie, DNA można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub minus 80 stopni Celsjusza przed ultrawirowaniem.
Następnym krokiem jest zastosowanie wirowania gradientowego chlorku cezu w celu dalszego oczyszczenia DNA poprzez usunięcie zanieczyszczeń, po stężeniu wirowania gradientowego chlorku cezu i dalsze oczyszczanie DNA za pomocą urządzeń filtrujących odśrodkowych AmCon i MicroCon. Wirowanie gradientowe chlorku cezu jest kluczem do uzyskania wysokiej jakości DNA i zostało szczegółowo opisane w innym protokole JoVE z laboratorium Hallam. Po wykonaniu etapów wirowania i zatężania gradientu chlorku cezu sprawdź stężenie DNA wybraną metodą.
Następnie ponownie sprawdź integralność DNA o dużej masie cząsteczkowej, uruchamiając małą próbkę DNA za pomocą PFGE. Całkowita ilość genomowego DNA wyizolowanego z dwóch gramów wymuszonej gleby waha się od 10 do 180 mikrogramów, jak pokazano w przebiegu żelu przed i po ultrawirowaniu chlorku cezu. Zakres wielkości wyizolowanego DNA zwykle waha się od 40 do 60 kilozasad, pokazany tutaj jest chromatogram próbek genomowego DNA przed i po ultrawirowaniu chlorku cezu.
Ten krok poprawia czystość DNA, zwiększając stosunek dwóch 60 do dwóch 80 z 1,3 do 1,6 przed do 1,8 do 1,9 później. Co więcej, szczytowa absorbancja przy 230 nanometrach, co sugeruje zanieczyszczenie kwasem humusowym, została skutecznie zmniejszona po odwirowaniu. Właśnie pokazaliśmy, jak wyizolować wysokocząsteczkowe genomowe DNA ze zbiorowisk mikroorganizmów glebowych.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wykonaniu buforu do ekstrakcji i denaturacji dokładnie według instrukcji. I uważaj, aby nie dotrzeć do podniebienia DNA po wytrąceniu alkoholu izopropylowego. Kiedy odzyskasz prążek DNA po zacentrowaniu gradientu chlorków.
Nie należy zapominać o przepłukaniu strzykawki za pomocą TE, aby zmaksymalizować odzysk DNA. I wreszcie, aby sprawdzić ilość i jakość wyizolowanego DNA na wszystkich sugerowanych etapach. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodologię izolacji wysokocząsteczkowego genomowego DNA z mikrobialnych społeczności glebowych. Procedura ta ma zastosowanie do różnych typów gleb i osadów, umożliwiając badanie różnorodności mikrobialnej oraz potencjału metabolicznego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Genomika
- Nauki o środowisku
Wstęp
- Genomiczne DNA o wysokiej masie cząsteczkowej jest kluczowe dla badania społeczności mikrobiologicznych.
- Glebowe społeczności mikrobiologiczne odgrywają istotną rolę w funkcjonowaniu ekosystemów.
- Zrozumienie różnorodności mikrobiologicznej może być pomocne w praktykach zarządzania środowiskiem.
- Obecne metody mogą nie zapewniać skutecznej izolacji wysokiej jakości DNA z gleby.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu ekstrakcji genomicznego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej.
- Ułatwienie konstrukcji bibliotek do badania społeczności drobnoustrojów.
- Pogłębienie wiedzy na temat różnorodności drobnoustrojów w różnych poziomach glebowych.
Zastosowane metody
- Liza komórek w celu uwolnienia DNA z komórek drobnoustrojów.
- Izolacja wysokocząsteczkowego DNA genomowego.
- Zastosowanie metody do różnych typów gleb.
- Konstrukcja bibliotek metagenomicznych leśnych do analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna ekstrakcja wysokiej jakości genomowego DNA z próbek gleby.
- Przygotowane biblioteki dostarczają informacji na temat różnorodności mikrobiologicznej.
- Metoda ma zastosowanie do szerokiego zakresu rodzajów gleb i osadów.
- Umożliwia dalsze badania nad potencjałem metabolicznym mikroorganizmów.
Wnioski
- Opracowana metodologia jest skuteczna w izolacji DNA genomowego.
- Ekstrakcja DNA o wysokiej masie cząsteczkowej ma kluczowe znaczenie dla badań mikrobiologicznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zgłębienia ekologii drobnoustrojów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dostęp do genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z kompleksowych próbek środowiskowych umożliwia tworzenie metagenomicznych bibliotek z dużymi insertami do badań funkcjonalnych i odkrywania szlaków metabolicznych. Możliwość ta wspiera identyfikację celów i generowanie wiodących związków w procesie odkrywania leków z produktów naturalnych, zapewniając dostęp do potencjału metabolicznego nieukhodowanych mikroorganizmów. Metoda ta rozwiązuje kluczowy problem w genomice środowiskowej, ułatwiając weryfikację wczesnych hipotez terapeutycznych poprzez bezpośredni dostęp do genetycznie zróżnicowanych mikrobiomów glebowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez zapewnienie dostępu do genetycznie zróżnicowanych, niehodowlanych społeczności drobnoustrojów w celu poszukiwania nowych celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Pozwala na otrzymanie wysokocząsteczkowego DNA odpowiedniego do konstrukcji bibliotek z dużymi insertami, co redukuje błędy klonowania i zwiększa częstość wykrywania funkcjonalnych trafień.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie matryc DNA do funkcjonalnego przesiewania metagenomicznego szlaków biosyntetycznych pochodzenia glebowego powiązanych z aktywnością terapeutyczną.
- Wartość operacyjna: Umożliwia otrzymanie oczyszczonego DNA z ograniczonym zanieczyszczeniem kwasami huminowymi, co zwiększa wydajność późniejszych reakcji enzymatycznych oraz powtarzalność analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera identyfikację nowych funkcji enzymatycznych i związków bioaktywnych z mikrobiomów środowiskowych w celu walidacji przedklinicznej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia tworzenie bibliotek gotowych do sekwencjonowania w celu ekspresji heterologicznej i optymalizacji wiodących związków w procesie odkrywania leków przeciwdrobnoustrojowych lub przeciwnowotworowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w początkowy etap procesu odkrywania leków, umożliwiając tworzenie bibliotek do kampanii przesiewowych, które służą do identyfikacji związków wiodących oraz wyboru kandydatów do badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia bezhipotezyczną eksplorację potencjału metabolicznego mikroorganizmów glebowych w celu odkrywania nowych celów i szlaków.
- Screening: Dostarcza materiału DNA do funkcjonalnych testów przesiewowych zaprojektowanych do wykrywania bioaktywnych metabolitów lub aktywności enzymatycznej.
- Analityka: Pozwala na weryfikację wielkości i czystości za pomocą elektroforezy w żelu w polu pulsującym oraz wirowania w gradiencie chlorku cezu w celu zapewnienia jakości biblioteki.
- Badania translacyjne: Łączy odkrywanie genów środowiskowych z oceną przedkliniczną poprzez ekspresję sklonowanych szlaków w łatwo hodowalnych organizmach gospodarzach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia ustandaryzowany, skalowalny protokół ekstrakcji DNA, który można zastosować w różnych próbkach gleby i osadów podczas powtarzalnych kampanii przesiewowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez dostęp do genetycznie bogatych, niehodowlanych rezerwuarów mikrobiologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację izolacji DNA, ograniczając zmienność pomiędzy różnymi typami próbek środowiskowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go na wczesnym etapie odkrywania poprzez rozszerzenie dostępu do nowej przestrzeni chemicznej mikrobiomów glebowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowaną do ryzyka priorytetyzację związków wiodących pochodzących z bibliotek metagenomicznych o zwalidowanym potencjale funkcjonalnym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biologii molekularnej oraz doświadczenia w pracy z odczynnikami niebezpiecznymi, takimi jak beta-merkaptoetanol, chloroform i chlorek cezu.
- Zależne od dostępu do sprzętu do ultrawirowania w celu przeprowadzenia etapów gradientu chlorku cezu oraz systemów do elektroforezy w polu pulsującym do oceny integralności DNA.
- Wymaga stosowania ustandaryzowanych procedur operacyjnych we wszystkich zespołach, aby zapewnić powtarzalną wydajność i jakość DNA z różnorodnych matryc glebowych.
- Wymaga ostrożnego obchodzenia się z próbkami w celu uniknięcia fragmentacji DNA, w tym unikania intensywnego mieszania w wortexie oraz wielokrotnego pipetowania podczas etapów ekstrakcji i precypitacji.
- Ograniczone przez naturalną zmienność zawartości kwasów huminowych w glebie, co może wymagać optymalizacji etapów oczyszczania dla określonych typów próbek.
