Name: Ekstrakcja genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z gleb i osadów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z gleb i osadów. Protokół umożliwia izolację wysokiej jakości DNA do badań różnorodności mikrobiomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Canadian Foundation for Innovation, British Columbia Knowledge Development Fund, Genome British Columbia oraz Ministerstwu Lasów i Pastwisk Kolumbii Brytyjskiej (British Columbia Ministry of Forests and Range) za wsparcie prowadzonych badań nad produktywnością gleb leśnych. S.L. otrzymał wsparcie w formie stypendium z Centrum Różnorodności i Ewolucji Mikrobowej (Centre for Microbial Diversity and Evolution), finansowanego przez fundację TULA.

Część I: Ekstrakcja DNA
Procedura
1. Przetwarzanie 6 próbek wymaga 8 godzin, z wyłączeniem kwantyfikacji DNA.
Przed rozpoczęciem ekstrakcji należy schłodzić moździerz, tłuczek i szpatułkę w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub przy użyciu ciekłego azotu. Należy również schłodzić na lodzie probówki 50 ml zawierające 20 ml chloroformu z alkoholem izoamylowym (24:1). Piec do hybrydyzacji należy ustawić na 65 °C w celu wstępnego podgrzania. Należy sprawdzić roztwór CTAB; jeśli uległ krystalizacji, należy go podgrzać do 60 °C, aby rozpuścić kryształy. Roztwór denaturujący oraz bufor do ekstrakcji należy przygotować, dodając ostatnie składniki bezpośrednio przed rozpoczęciem ekstrakcji (patrz przepis poniżej). Wszystkie procedury ekstrakcyjne należy przeprowadzać w dygestorium.
2. Przygotuj bufor denaturujący i bufor do ekstrakcji. Uwaga: Aby zmaksymalizować wydajność DNA, kluczowe jest precyzyjne przygotowanie buforów zgodnie z instrukcjami.
3. Umieść 2 g gleby w schłodzonym wcześniej moździerzu. Uwaga: Gleba pobrana w terenie powinna być zamrożona na suchym lodzie podczas transportu i przechowywana w temperaturze -80 °C. Przed ekstrakcją DNA glebę należy rozmrozić i przesiać przez sito o oczkach 2 mm. Można zwiększyć początkową ilość gleby do 10 g.
4. Dodaj 1 ml roztworu denaturującego do gleby.
5. Zamrozić i zmielić glebę w ciekłym N2 za pomocą moździerza z tłuczkiem, aż cząsteczki gleby staną się sypkie i homogenne. Powtórzyć proces mrożenia i mielenia dwukrotnie. Uwaga: Próbkę gleby należy utrzymywać w stanie zamrożenia podczas mielenia, stosując odpowiednią ilość ciekłego azotu, aby całkowicie przykryć próbkę. Lekkie roztopienie podczas mielenia jest dopuszczalne.
6. Przenieś zmieloną glebę do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, używając schłodzonej wcześniej szpatułki. Uwaga: Na tym etapie próbkę zmielonej gleby można przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli jest to konieczne.
7. Dodać 9 ml buforu do ekstrakcji. Aby wymieszać roztwór z glebą, krótko wierzbać przy niskiej prędkości. Uwaga: Aby zapewnić jednorodność buforu, należy go ogrzać do 60 °C przez 10-15 minut przed użyciem. Pozostałą część buforu należy utrzymywać w temperaturze 60 °C przez cały czas trwania ekstrakcji. Wierzbać z prędkością 8 (w skali, w której 10 jest wartością maksymalną). 
8. Inkubować przez 40 min w temperaturze 65°C w piecu do hybrydyzacji. Podczas inkubacji stale obracać probówki z najniższą prędkością lub delikatnie odwracać je co 10 min. Uwaga: Umieścić probówkę poziomo w piecu do hybrydyzacji, aby bufor miał kontakt z glebą na dużej powierzchni. Roztwór może wydawać się nieco lepki podczas inkubacji.
9. Wirować przy 1800 ×g przez 10 min w temperaturze 10 - 14 °C. Przenieść nadsącz do schłodzonej wcześniej stożkowatej probówki 50 ml zawierającej 20 ml chloroformu i alkoholu izoamylтельного (24:1), przechowywać na lodzie. Uwaga: Podczas przenoszenia nadsączu należy uważać, aby nie zakłócić warstwy organicznej (warstwy dolnej). W razie potrzeby pozostawić 1-2 ml nadsączu, aby zebrać wyłącznie czysty nadsącz. Na powierzchni nadsączu często widoczna jest beżowa warstwa (o grubości około 1-3 mm). Nie należy naruszać tej warstwy podczas zbierania nadsączu. Należy starać się prowadzić końcówkę pipety wzdłuż ścianki probówki, aby zapobiec przerwaniu tej beżowej warstwy. Jeśli nadsącz jest zbyt mętny, należy powtórzyć ekstrakcję chloroformem i alkoholem izoamyltelowym jeszcze raz na nadsączu. Podczas przenoszenia chloroformu nie należy używać jednorazowych pipet plastikowych, ponieważ chloroform topi plastik. Należy użyć pipety szklanej, szklanego cylindra miarowego lub wlać chloroform bezpośrednio do stożkowatych probówek 50 ml.
10. Wykonaj ekstrakcję osadu glebowego jeszcze 2 razy;
10.1. Do osadów glebowych dodać 5 ml buforu do ekstrakcji, delikatnie wymieszać za pomocą końcówki 1 ml, a następnie krótko wierzchołkować przy niskiej prędkości. Uwaga: Przed użyciem wstrząsnąć i wymieszać bufor.
10.2. Inkubować w 65°C przez 10 min w piecu do hybrydyzacji. Odwirywać przy 1800 xg przez 10 min w temperaturze 10 - 14 °C. Przenieść nadsącz do probówki z kroku 9. Przechowywać probówkę z zebranym nadsączem i chloroformem z alkoholem izoamylowym na lodzie podczas ekstrakcji. Uwaga: Należy upewnić się, że nadsącz jest dodawany do właściwej probówki, aby uniknąć krzyżowania próbek.
10.3. Powtórz kroki 9.1 i 9.2 jeszcze raz.
11. Używając rotatora, bardzo delikatnie kołysz probówkę zawierającą zebrany nadsącz (14-19 ml) i chloroform-alkohol izoamylowy z prędkością 1,25 rpm przez 10 min. Uwaga: Bardzo szczelnie zamknij zakrętkę, aby zapobiec wyciekowi. Przed umieszczeniem probówki na rotatorze połóż na nim ręcznik papierowy, aby można było łatwo wykryć ewentualne wycieki. 
12. Wirować przy 1800 xg przez 20 min w temperaturze 10 - 14 °C.
13. Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Uwaga: Podczas przenoszenia supernatantu nie naruszaj interfazy między fazą wodną (warstwa górna) a fazą organiczną (warstwa dolna). Pozostaw około 1,5- 2 ml supernatantu, aby zapewnić zebranie wyłącznie czystego supernatantu.
14. Odzyskaj DNA, używając alkoholu izopropylowego (krok 15.a - 21.a). Alternatywnie, jeśli spodziewasz się bardzo niskiej ilości biomasy w próbce, co w przypadku wytrącania alkoholem izopropylowym doprowadzi do powstania ledwo widocznego i trudnego do odzyskania osadu, zastosuj wirówki membranowe Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Devices (krok 15.b - 21.b).
15.a. Przenieś nadsącz do nowej probówki do ultrawirówki.
16.a. Do zebranego supernatantu dodać alkohol izopropylowy w stosunku objętości 0,6:1. Delikatnie odwrócić probówki kilka razy, aby wymieszać zawartość.
17.a Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
18.a. Odwiruj z prędkością 16000 ×g przez 20 min w temperaturze 20 - 25 °C. Przed etapem wirowania upewnij się, że masy wszystkich probówek są dobrze zrównoważone. Uwaga: Zaznacz na probówce kierunek siły odśrodkowej, aby łatwiej zlokalizować osad DNA w przypadku niskiej wydajności izolacji DNA.
19.a. Usuń alkohol izopropylowy poprzez odlanie lub odsysanie próżniowe. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu DNA. Uwaga: Usuń alkohol izopropylowy niezwłocznie po zakończeniu wirowania. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zgubić osadu DNA. Wielkość osadu DNA może się znacznie różnić w zależności od rodzaju gleby – od wyraźnie widocznego (średnica ~9 mm) do prawie niewidocznego. Zaleca się usuwanie pozostałości alkoholu izopropylowego poprzez ostrożne odsysanie wzdłuż ścianki probówki, aby nie odessać osadu DNA.
20.a. Suszyć osad DNA w temperaturze pokojowej przez 5 – 20 min. Uwaga: Nie należy nadmiernie wysuszać osadu DNA, w przeciwnym razie ponowne rozpuszczenie DNA będzie utrudnione.
21.a. Osad DNA resuspendować w 200 μl TE. Wymieszać delikatnie, opukując probówkę. Roztwór DNA przenieść do probówki 1,5 ml. Probówkę przechowywać w temperaturze 4°C przez noc, aby całkowicie rozpuścić DNA. Uwaga: W zależności od wielkości osadu można dostosować objętość dodawanego TE. Zazwyczaj odpowiednia objętość TE to 200 - 400 μl.
*Alternatywnie należy wykonać kroki 15.b – 21.b.
15.b. Wstępnie przemyć urządzenia do filtrowania odśrodkowej Amicon® Ultra-15; dodać do urządzenia 15 ml TE i wirować przy 3500 xg przez 10 min. Odrzucić filtrat.
16.b. Przenieś roztwór DNA z kroku 13 do uprzednio wypłukanego filtra Amicon. Wiruj przy 3500 xg do momentu, aż objętość DNA zostanie zredukowana do 200 - 500 μl. Odrzuć filtrat.
17.b. Przemyj DNA dwukrotnie buforem TE; dodaj 10 ml TE do urządzeń filtrujących Amicon. Wirowaj z prędkością 3500 xg do czasu, aż objętość DNA zostanie zredukowana do około 200 μl. Odrzuć filtrat. Powtórz czynność jeszcze raz.
18.b. Przenieś roztwór DNA z filtra do nowej probówki 1,5 ml. 
19.b. Do filtra Amicon dodać 40 μl TE. Obie strony membran filtru należy przemyć, pipetując roztwór w górę i w dół, aby odzyskać wszelkie pozostałości DNA z filtra. Ten roztwór płuczący należy dodać do probówki z kroku 18.b.
20.b. W razie potrzeby DNA można dodatkowo zagęścić za pomocą odwirującego urządzenia filtrującego Microcon® Ultracel YM-30; należy wstępnie przemyć filtr, dodając 200 μl TE i wirując przy 10000 xg przez 7 minut. Do filtra należy dodać roztwór DNA i wirować przy 5000 xg przez 1 min. Wirowanie należy powtarzać do momentu, aż objętość roztworu DNA na filtrze zmniejszy się do około 50 μl. Uwaga: Maksymalna początkowa objętość próbki dla filtra Microcon wynosi 500 μl. Nie wirować z prędkością przekraczającą 14000 x g. Należy unikać nadmiernego wirowania, które doprowadziłoby do całkowitego wyschnięcia membrany. Należy upewnić się, że po wirowaniu filtr jest wciąż przykryty niewielką ilością cieczy. W przypadku nadmiernego wirowania i wyschnięcia membrany należy dodać 15 μl TE, delikatnie mieszać przez 30 sekund i przejść do kroku 21.b.
21.b. Umieść jednostkę filtrującą do góry dnem w nowej probówce Microcon i wiruj przy 1000 x g przez 3 min, aby odzyskać DNA.
22. Ilościowo określ zawartość DNA za pomocą żelu TAE (0,8%, 0,5xTAE, 50 V przez 4 godziny) oraz za pomocą spektrofotometru Nanodrop lub testu Pico-green i czytnika płytek. Uwaga: Ilość DNA można oszacować, porównując prążek próbki z prążkiem markera o znanym stężeniu (marker DNA wysokocząsteczkowego lub λHindIII) na żelu. 
23. Sprawdzić integralność wysokocząsteczkowego DNA za pomocą elektroforezy w polu pulsacyjnym (PFGE) z użyciem żelu 1% 1xTAE (szczegóły znajdują się w Etapie II, część 2 pod adresem <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387</a>, doi: 10.3791/1387 opracowanym przez Taupp et al. 2009). Uwaga: Do kontroli jakości można użyć zwykłego żelu agarozowego zamiast agarozy niskotopliwej. W skrócie, warunki elektroforezy są następujące: 2-250 kb, 6 V, początkowy czas przełączenia: 5 s, końcowy czas przełączenia: 15 s, czas przebiegu: 12 h w temperaturze 14 °C. Barwienie SYBR Gold przez jedną godzinę w celu wizualizacji DNA na żelu. 
24. Jeśli masy cząsteczkowe wyekstrahowanego DNA są satysfakcjonujące, należy przejść do następnego etapu wirowania w gradiencie CsCl. Alternatywnie DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C przed wirowaniem w CsCl. Mediana wielkości DNA powinna być równa lub przekraczać 36 Kb, jeżeli celem jest stworzenie metagenomicznej biblioteki DNA z dużymi insertami. 
Część II. Oczyszczanie DNA przy użyciu ultrawirówki z gradientem chlorku cezu
Przygotowanie wirówki: 1,5 - 2 godziny Etap wirowania: 18 godzin Usuwanie bromku etydyny (EtBr) i zagęszczanie DNA po wirowaniu: 3 godziny
Procedura
Szczegóły znajdują się w publikacji Wright et al. 2009. <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a>, doi: 10.3791/1352
Reprezentatywne wyniki/rezultaty
Całkowita ilość genomowego DNA wyizolowanego z 2 g organicznego horyzontu leśnego (horyzont O) oraz horyzontów mineralnych (horyzonty Ae, AB i Bt) (pobranych z obszaru Long Term Soil Productivity (LTSP) położonego nad jeziorem Skulow, BC, Kanada, zarządzanego przez BC Ministry of Forests and Range) wynosiła od 10 mg do 180 mg. Mediana wielkości wyizolowanego DNA zazwyczaj mieściła się w zakresie 40 – 60 kb (Rysunek 1). Stosunek absorbancji przy 260 nm/280 nm wynosił od 1,3 do 1,6, a przy 230 nm zaobserwowano piki, co może wskazywać na zanieczyszczenie kwasami huminowymi często występujące w próbkach gleby. Centryfugacja w gradiencie CsCl drastycznie zredukowała to zanieczyszczenie i zwiększyła stosunek 260/280 do 1,8 – 1,9, jak pokazano na Rysunku 2a i 2b.
<img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="Wynik elektroforezy żelowej z rozdziałem DNA; schemat; prążki wskazujące rozmiar i ilość fragmentów DNA." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Zdjęcia PFGE wyekstrahowanego DNA genomicznego przed ultrawirowaniem w CsCl. ścieżka 1: marker 1 kb 100 ng, ścieżka 2: marker λHind III 100 ng, ścieżka 3: marker λHind III 250 ng, ścieżka 4: marker λHind III 500 ng, ścieżka 5: marker Fosmid 36 kb 100 ng, ścieżki 6 i 7: DNA genomiczny wyizolowany z mineralnego horyzontu glebowego Ae, ścieżki 8 i 9: DNA genomiczny wyizolowany z mineralnego horyzontu glebowego AB w punkcie LTSP położonym nad jeziorem Skulow, BC 
<img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="Wykresy spektroskopowe, widma absorpcyjne, UV-Vis, diagram, analiza długości fali, dane naukowe." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Chromatogramy DNA genomowego wykryte spektrofotometrem przed (A) i po ultrawirowaniu w gradiencie CsCl (B). Zwróć uwagę na obniżenie wartości absorbancji przy długości fali 230 nm po ultrawirowaniu w gradiencie CsCl, co wskazuje na poprawę jakości DNA genomowego. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć większą wersję rysunku 2.

<ol><li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22AEM%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li>
<li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+insert+environmental+genomic+library+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;*Roztwór denaturujący&lt;/strong&gt;: łącznie 10 ml</td></tr><tr><td>IzKtyj Nowak izKtyjan guanidyny (MW 118,16), 4,73 g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl (pH 7,0), 100 &amp;mu;l</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, 20 &amp;mu;L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dopełnić wodą do objętości całkowitej 9,95 ml.</td></tr><tr><td colspan="4">Autoklaw.</td></tr><tr><td colspan="4">Dodaj 50 &amp;#x03BC;l 2-merkapto&amp;#8211;etanol bezpośrednio przed użyciem. (5 &amp;#x03BC;l 2-merkaptotrietanolu&amp;#8211;etanol na 1 ml roztworu denaturującego)</td></tr><tr><td colspan="4">Uwaga: Roztwór denaturujący należy przechowywać w temperaturze 4°C. &amp;deg;C. Nie należy używać buforu starszego niż jeden tydzień. Jeśli to możliwe, należy przygotować świeży bufor do użytku.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;**Bufor do ekstrakcji**&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bufor fosforan sodu 1 M [pH 7,0]*, 100 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl [pH 7,0], 100 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA [pH 8,0], 200 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl, 300 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Autoklawować i przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td colspan="4">Tuż przed użyciem dodać 200 ml 5% bromku heksadecylotrimetylammonium (CTAB, autoklawowany) oraz 100 ml 20% SDS (autoklawowany). W przypadku wykrystalizowania CTAB, należy go rozpuścić w temperaturze 60°C. &amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">* Bufor fosforan sodu 1M: 57,7 ml, 1M fosforan sodu jednopodstawowy (NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) oraz 42,3 ml 1 M fosforanu sodu dwuzasadowego (NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;). Dostosować pH do wartości 7,0</td></tr><tr><td colspan="4">Uwaga: Nie należy stosować 20% SDS, jeśli wystąpiło jego wytrącenie. Po dodaniu SDS do roztworu normalnym zjawiskiem jest powstanie mlecznej zawiesiny. Po dodaniu SDS należy umieścić bufor do ekstrakcji w temperaturze 60 &amp;deg;Mieszaj, aby zapewnić pełne zawieszenie SDS.</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja wysokocząsteczkowego genomowego dna z gleb i osadów

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Mikrobiom gleby stanowi ogromny i stosunkowo słabo zbadany rezerwuar różnorodności genomicznej i innowacji metabolicznych, który jest ściśle powiązany z przepływem składników odżywczych i energii w ekosystemach lądowych. Podejścia genomiczne środowiskowe niezależne od hodowli, znane również jako metagenomiczne, obiecują bezprecedensowy dostęp do tych informacji genetycznych w zakresie rekonstrukcji szlaków oraz przesiewu funkcjonalnego w poszukiwaniu wysokowartościowych procesów terapeutycznych i konwersji biomasy. Niemniej jednak, mikrobiom gleby wciąż stanowi wyzwanie, głównie ze względu na trudności w pozyskiwaniu wysokocząsteczkowego DNA o jakości wystarczającej do produkcji bibliotek z dużymi insertami. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół ekstrakcji wysokocząsteczkowego DNA genomicznego społeczności drobnoustrojów z gleb i osadów. Jakość wyizolowanego DNA genomicznego jest optymalna do konstruowania środowiskowych bibliotek genomicznych z dużymi insertami, przeznaczonych do późniejszego sekwencjonowania i analiz przesiewowych.
Procedura rozpoczyna się od lizy komórek. Ściany komórkowe i błony mikroorganizmów są lizowane zarówno za pomocą sił mechanicznych (rozcieranie), jak i chemicznych (β-merkaptoetanol). Następnie DNA genomowe jest izolowane przy użyciu buforu ekstrakcyjnego, chloroformu z alkoholem izoamylowym oraz alkoholu izopropylowego. Bufory stosowane w etapach lizy i ekstrakcji zawierają izotiocyjanian guanidyny oraz bromek cetylotrimetylammonium (CTAB), aby zachować integralność wysokocząsteczkowego DNA genomowego. W zależności od planowanych dalszych analiz, wyizolowane DNA genomowe może zostać dodatkowo oczyszczone metodą ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu (CsCl), co pozwala na usunięcie zanieczyszczeń, w tym kwasów huminowych. Pierwsza procedura, czyli ekstrakcja, trwa około 8 godzin, z wyłączeniem etapu kwantyfikacji DNA. Ultrawirowanie w gradiencie CsCl jest procesem dwudniowym. Przez cały czas trwania procedury z DNA genomowym należy obchodzić się delikatnie, aby zapobiec jego fragmentacji; należy unikać intensywnego mieszania w wirówce (vortexowania) oraz wielokrotnego, gwałtownego pipetowania.

Opisano metodologię izolacji wysokiej jakości genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mikrobiologicznej społeczności glebowej.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleb i osadów

Mikrobiom glebowy to ogromny i stosunkowo słabo zbadany rezerwuar różnorodności genomicznej i innowacji metabolicznych, który jest ściśle powiązany z ...

Witajcie, jestem San Lee z laboratorium Stephena Harlema w Katedrze Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę ekstrakcji wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleby leśnej, która ma zastosowanie również do szerokiej gamy typów gleb i osadów. Wykorzystujemy wysokocząsteczkowe genomowe DNA do tworzenia bibliotek metagenomicznych leśnych społeczności mikrobiologicznych gleby.Posiadając te biblioteki, możemy badać różnorodność i potencjał metaboliczny społeczności mikrobowych rozdzielonych pomiędzy różne poziomy glebowe. Zacznijmy zatem. Niniejszy protokół rozpoczyna się od lizy komórek.Pierwszym krokiem jest uzupełnienie buforu denaturującego poprzez dodanie beta-merkaptoetanolu do stężenia 0,5%. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy przygotowywać roztwór denaturujący na świeżo przed każdym użyciem. Alternatywnie można zastosować bufor starszy niż jeden tydzień, który był przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsius. Do następnego kroku będą potrzebne: naczynie z ciekłym azotem, autoklaw oraz schłodzony wcześniej moździerz z tłuczkiem i szpatułka.Umieść dwugramową zamrożoną próbkę gleby w schłodzonym wcześniej moździerzu. Dodaj jeden mililitr roztworu denaturującego. Następnie dodaj ciekły azot, aby całkowicie przykryć glebę.Użyj schłodzonego wcześniej tłuczka, aby rozetrzeć próbkę, aż cząsteczki gleby staną się sypkie i jednorodne, a próbka zacznie topnieć. Następnie dodaj więcej ciekłego azotu i powtórz etap rozcierania. Tym samym kończy się etap lizy komórek z wykorzystaniem schłodzonej wcześniej szpatułki.Przenieś zmieloną próbkę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Próbkę należy przechowywać w lodzie w celu niezwłocznego przejścia do etapu ekstrakcji DNA lub przechowywać w temperaturze -80 °C. W przypadku późniejszego użycia, bezpośrednio przed rozpoczęciem ekstrakcji DNA, uzupełnij bufor ekstrakcyjny, dodając bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB) oraz SDS.Sprawdzić, czy CTAB uległ krystalizacji, a jeśli tak, rozpuścić go w temperaturze 60°C przed kontynuacją. Następnie dodać go do roztworu do uzyskania całkowitego stężenia 1%. Następnie dodać 20% roztwór SDS do uzyskania stężenia końcowego 2%. Powstanie mętnej zawiesiny jest zjawiskiem normalnym.Po dodaniu SDS, aby bufor do ekstrakcji pozostał homogenny, należy go przechowywać w temperaturze 60 °C przez 10 do 15 minut. Gdy bufor do ekstrakcji zostanie całkowicie rozpuszczony i stanie się homogenny, należy dodać dziewięć mililitrów buforu do próbki gleby i krótko wymieszać na wirówce typu vortex przy niskich obrotach. Próbkę z buforem do ekstrakcji należy inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 65 °C przez 40 minut.Podczas inkubacji należy delikatnie odwracać probówki co 10 minut lub stale obracać je przy najniższej prędkości rotora. Po zakończeniu inkubacji roztwór może wydawać się lekko lepki. Kolejnym krokiem jest zastosowanie chloroformoizoamylalkoholu w celu oczyszczenia DNA z materiałów organicznych znajdujących się w mieszaninie lizującej.Rozpocznij od wirowania próbki przez 10 minut przy 1800 Gs w temperaturze około 10 do 14 °C w dygestorium; zbierz nadsącz zawierający DNA, ostrożnie przesuwając końcówkę pipety wzdłuż ścianki probówki, unikając beżowej warstwy na górze oraz warstwy organicznej na dnie. Przenieś nadsącz do schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml chloroformo-izoamylalkoholu (CIAA). Następnie powtórz proces ekstrakcji jeszcze dwa razy na tej samej próbce. W międzyczasie przechowuj ekstrakt DNA oraz CIAA na lodzie w dygestorium.W celu przeprowadzenia drugiej ekstrakcji DNA, należy powrócić do probówki zawierającej osad glebowy z pozostałością buforu ekstrakcyjnego i dodać kolejne pięć mililitrów buforu ekstrakcyjnego. Delikatnie wymieszać zawartość za pomocą końcówki o pojemności jednego mililitra, a następnie krótko wortexować, aby ponownie zawiesić osad, analogicznie jak poprzednio. Tym razem inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut.Następnie wiruj z prędkością 1800 Gs przez 10 minut. W dygestorium, w temperaturze około 10 do 14 °C, przenieś nadsącz do probówki zawierającej chloroform i alkohol izoamylowy (chloroform i a a) oraz nadsącz z poprzedniej ekstrakcji. Powtórz cały proces ekstrakcji jeszcze raz, aby wyizolować jak największą ilość DNA z próbki gleby.Po przeprowadzeniu łącznie trzech ekstrakcji z próbki gleby, bardzo delikatnie wymieszaj probówkę zawierającą zebrany nadsącz i chloroform na rotatorze z prędkością 1,25 rpm przez 10 minut. Po tym etapie mieszania odwiruj probówkę z prędkością 1800 Gs przez 20 minut w temperaturze od około 10 do 14 °C. Po wirowaniu ostrożnie przenieś fazę wodną do nowej probówki do ultrawirowania, pozostawiając jeden do dwóch mililitrów nadsączu, aby uniknąć naruszenia granicy między fazą wodną a organiczną. Następnie, w celu wytrącenia DNA, dodaj 0,6 ml izopropanolu.Do każdego mililitra zebranego supernatantu dodaj izopropanol, a następnie kilka razy delikatnie odwróć probówki, aby wymieszać zawartość. Na tym etapie można zauważyć wytrącanie się DNA w postaci długich nici. Następnie inkubuj DNA z izopropanolem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji należy serylować DNA poprzez wirowanie. Oznacz jeden róg probówki przed umieszczeniem jej w wirówce, aby wiedzieć, gdzie spodziewać się osadu DNA. Wirować z prędkością 16 000 g przez 20 minut w temperaturze od 20 do 25 °C. Po wirowaniu usunąć alkohol izopropylowy poprzez zlanie go lub odsysanie próżniowe. Należy uważać, aby nie zgubić osadu DNA, którego wielkość waha się od niemal niewidocznego do 9 mm szerokości, w zależności od wydajności ekstrakcji i biomasy w próbkach gleby. Osad DNA suszyć w temperaturze pokojowej przez 5 do 20 minut. Należy uważać, aby nie przesuszyć go, gdy osad będzie już suchy.Resuspend DNA w 200 do 400 µL buforu TE. Wymieszaj roztwór, delikatnie opukując probówkę. Przenieś roztwór DNA do probówki o pojemności 1,5 mL.Przechowywać DNA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Aby w pełni rozpuścić DNA po jego ekstrakcji z próbki gleby, należy przeprowadzić pozostałe etapy sprawdzania stężenia i integralności DNA próbki zgodnie ze standardowymi procedurami, które zostały szczegółowo opisane w innym protokole JoVE z laboratorium Hallama. Oznaczyć stężenie DNA wybraną przez siebie metodą.Należy również sprawdzić integralność wysokocząsteczkowego DNA, przeprowadzając elektroforezę w polu impulsowym (PFGE) 10 do 20 µL próbki DNA. Mediana wielkości DNA powinna wynosić 36 kb lub więcej, w zależności od planowanych dalszych zastosowań. Przejdź do następnego etapu wirowania w gradiencie chlorku cezu; alternatywnie DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C przed ultrawirowaniem.Kolejnym krokiem jest zastosowanie wirowania w gradiencie chlorku cezu w celu dalszego oczyszczenia DNA poprzez usunięcie zanieczyszczeń, a następnie skoncentrowanie i dalsze oczyszczenie DNA przy użyciu odwirku filtracyjnego AmCon i MicroCon. Wirowanie w gradiencie chlorku cezu jest kluczowe dla uzyskania wysokiej jakości DNA i zostało szczegółowo opisane w innym protokole JoVE z laboratorium Hallama. Po przeprowadzeniu etapów wirowania w gradiencie chlorku cezu oraz koncentracji należy sprawdzić stężenie DNA wybraną przez siebie metodą.Następnie należy ponownie sprawdzić integralność wysokocząsteczkowego DNA, przeprowadzając PFGE niewielkiej próbki DNA. Całkowita ilość genomowego DNA wyizolowanego z dwóch gramów gleby wymuszonej mieści się w przedziale od 10 do 180 µg, co pokazano na żelu przed i po ultrazentryfugacji w chlorku cezu. Zakres wielkości wyizolowanego DNA zazwyczaj mieści się w granicach od 40 do 60 kb; przedstawiono tutaj chromatogram próbek genomowego DNA przed i po ultrazentryfugacji w chlorku cezu.Ten etap poprawia czystość DNA, zwiększając stosunek 260/280 z poziomu 1,3–1,6 przed procesem do 1,8–1,9 po jego zakończeniu. Ponadto po wirowaniu udało się skutecznie zredukować szczyt absorbancji przy 230 nanometrach, który wskazywał na zanieczyszczenie kwasami huminowymi. Przedstawiliśmy właśnie sposób izolacji wysokocząsteczkowego genomowego DNA z glebowych społeczności mikrobiologicznych.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przygotować bufor do ekstrakcji i denaturacji ściśle według instrukcji. Należy również uważać, aby nie dotknąć osadu DNA po precypitacji alkoholem izopropylowym. Następnie należy odzyskać prążek DNA po wirowaniu w gradiencie chlorkowym.Nie zapomnij przemyć strzykawki buforem TE, aby zmaksymalizować odzysk DNA. Na koniec należy sprawdzić ilość i jakość wyizolowanego DNA na wszystkich sugerowanych etapach. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

extraction-high-molecular-weight-genomic-dna-from-soils

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wyodrębnianie genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z gleb i osadów

Opisujemy metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0.22 μm, a następnie oczyszczania go za pomocą wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu.

Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 $\mu$M oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół ekstrakcji DNA z materiału utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie. Jest to procedura wielodniowa, w ramach której skrawki tkanek są deparafinowane ksylenem, rehydratowane etanolem i traktowane proteinazą K w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA do późniejszej analizy genowo-specyficznej lub całego genomu.

Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

Przedstawiamy ulepszony protokół izolacji wysokocząsteczkowego DNA z hipersalinitycznych mat mikrobjalnych. Przed ekstrakcją i puryfikacją DNA komórki mikrobjalne są oddzielane od macierzy maty. Pozwala to na zwiększenie stężenia, poprawę jakości oraz zwiększenie rozmiaru DNA. Protokół ten może być stosowany również w przypadku innych próbek trudnych do obróbki.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego DNA z mat mikrobowych

Ekstrakcja DNA ze śliny może stanowić łatwo dostępne źródło DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, z niewielką lub żadną degradacją/fragmentacją.  Protokół ten zapewnia zoptymalizowane parametry pobierania/przechowywania śliny i ekstrakcji DNA, aby były wystarczającej jakości i ilości dla dalszych testów DNA o wysokich wymaganiach jakościowych.

Pobieranie i ekstrakcja DNA śliny do sekwencjonowania nowej generacji

Kriosfera oferuje dostęp do zachowanych organizmów, które przetrwały w poprzednich warunkach środowiskowych. Przedstawiono protokół zbierania i odkażania rdzeni wiecznej zmarzliny gleb i lodu. Brak egzogennych kolonii i DNA sugeruje, że wykryte mikroorganizmy reprezentują materiał, a nie zanieczyszczenie pochodzące z wiercenia lub przetwarzania.

Usuwanie materiałów egzogenicznych z zewnętrznej części zamrożonych rdzeni w celu zbadania starożytnych zbiorowisk biologicznych znajdujących się w środku

Opisana tutaj jest metoda ekstrakcji, oczyszczania i kontroli jakości genomowego DNA z obligatoryjnego biotroficznego patogenu grzybowego, mączniaka prawdziwego, do użycia w długotrwałym sekwencjonowaniu genomu.

Oczyszczanie genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Tutaj prezentujemy prostą technikę oceny środowiskowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) poprzez zwiększenie proporcji niskocząsteczkowego DNA zewnątrzkomórkowego. Wcześniejsze leczenie 20%-30% PEG i 1,2 M NaCl pozwala na wykrycie zarówno genomowych, jak i przenoszonych horyzontalnie genów AMR. Protokół nadaje się do procesu bez zestawów z dodatkową optymalizacją.

Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Protokół ten opisuje metodę CTAB polegającą na wydobyciu wysokiej jakości DNA z mykobakterii, pokonując wyzwania związane z ich twardymi, bogatymi w kwas grzybniczy ściany komórkowe. Proces obejmuje trawienie enzymatyczne, lizę komórek za pomocą CTAB oraz oczyszczanie DNA poprzez ekstrakcję organiczną i wytrącanie etanolem. Ta metoda wytwarza DNA odpowiednie do badań molekularnych i jest wiarygodna w badaniach mykobakterialnych.

Ekstrakcja deoksyrybonukleinowym w całym genomie z gatunków Mycobacterium za pomocą techniki bromku cetylotrymetylamoniowego

Izolacja genomowego DNA z ogonów myszy

Poznaj metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z gleb i osadów. Protokół umożliwia izolację wysokiej jakości DNA do badań różnorodności mikrobiomu.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleb i osadów

Przeglądaj więcej filmów