Name: Zakażenie bakteryjne Wolbachia u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj protokół izolacji i iniekcji Wolbachii u Drosophila. Metoda wykorzystuje filtr do wyodrębnienia bakterii z około stu much, umożliwiając badanie dynamiki infekcji w modelu owadzim.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

zakażenie bakterią wolbachia u drosophila

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

Zakażenie bakterią Wolbachia u Drosophila

Nazywam się Voia Friedman. Jestem adiunktem na Uniwersytecie Princeton. Dzisiaj opowiem Państwu o kilku protokołach, które opracowałam w celu transfekcji, a konkretnie w celu początkowej izolacji hemolimfy z zainfekowanych much oraz późniejszego wstrzyknięcia tej hemolimfy niezakazionym osobnikom.Podstawowo jest to bardzo prosty protokół izolacji hemolimfy do celów podstawowych. Należy użyć urządzenia firmy Mepo, które zawiera filtr nakładany na probówkę typu E. Zaczynamy od około 100 much. Po znieczuleniu much należy umieścić je w urządzeniu z filtrem, wykorzystując do tego lejek, co ułatwia ich wprowadzenie do urządzenia, a następnie przemyć je 70% etanolem.Należy usunąć etanol, a po trzecim ostatnim płukaniu przeprowadzić proces z użyciem wody molekularnej, aby uniknąć obecności bakterii z pozostałościami etanolu. Następnie należy przenieść zawartość do nowej probówki i wirować w mikrocentryfudze przez dwie minuty. Później można to wstrzyknąć; należy karmić wyłącznie muchy niepodatne.Zatem należy wziąć dwustronną taśmę klejącą; zazwyczaj takie taśmy mają dwie strony, z czego jedna jest bardziej lepka od drugiej. Pozostaw stronę z mocniejszym klejem skierowaną do góry, ponieważ to na niej zostaną przyklejone muchy. W zasadzie, jeśli w aparaturze gazowej na górze znajduje się takie szkiełko, przepływ gazu zostanie zatrzymany, a muchy obudzą się, jeśli znajdą się na powierzchni szkiełka.Można po prostu skierować przepływ, tworząc niewielki osłonowy obszar, małą komorę za pomocą taśmy. Następnie kieruje się gaz nad muchy. W ten sposób mocuje się to światło tutaj za pomocą taśmy i ma się swoje muchy.Przyklej muchy do górnej części taśmy, wszystkie w tej samej orientacji, kierując ich głowy w stronę, z której będziesz wprowadzać igłę. Dzięki temu będziesz mógł łatwiej ominąć skrzydło; musisz mieć pewność, że nie odlecą, ponieważ są to muchy. Gdyby obudziły się w trakcie procedury, nie chcesz, aby odleciały.Należy zatem pamiętać, aby lekko nacisnąć końcówką igły skrzydła muchy w okolicy odwłoka. Nie stanowi problemem, jeśli skrzydła zostaną uszkodzone. Ponieważ podczas wyjmowania much po wstrzyknięciu i tak najprawdopodobniej stracą one skrzydła, przeżyją one ten zabieg.Może to być przydatne, ponieważ dzięki temu nie stracimy much. Następnie nakłada się olej mineralny na mikrometr z tyłu igły, a potem wprowadza się igłę do iniekcji i można dostosować ciśnienie tak, aby materiał dotarł do końcówki igły. Iniekcję przeprowadzałem w objętości od 10 do 15 nanolitrów, jednak kluczowe jest zachowanie powtarzalności. Ważnym szczegółem w tym eksperymencie jest to, że po wprowadzeniu igły do muchy, należy ją przesunąć tak daleko, jak to możliwe, przez górną część odwłoka.Ponieważ tutaj, w zasadzie w momencie przebicia igłą, istnieje większa przestrzeń do ruchu w górę i w dół. Zasadniczo, jeśli miejsce to znajduje się bliżej kutykuli, mniejsze jest prawdopodobieństwo przebicia organów żywotnych muchy. Jest bardzo mało prawdopodobne, aby przebić na przykład jelita, co spowodowałoby śmierć muchy, na której przeprowadza się operację.Nazywam się Voia Friedman. Jestem adiunktem na Uniwersytecie Princeton w laboratorium Erica Helsa. Dzisiaj chciałabym opowiedzieć Państwu o protokole, który przed chwilą zaprezentowano w demonstracji.Niniejszy protokół został opracowany w celu wykazania, że UBA jest zdolny do przenikania przez tkanki. UBA jest jednym z najskuteczniejszych wewnątrzkomórkowych pasożytów na świecie; infekuje od 20% do 70% owadów oraz wiele innych organizmów.Jest to również bardzo ważne w kontekście chorób ludzkich, ponieważ infekuje również nicienie przenoszące schorzenia takie jak ślepota rzeczna czy onchocerkoza. W tych organizmach CCA jest obligatoryjnym endosymbiontem. Istnieje zatem ogromne zainteresowanie wykorzystaniem CCA jako środka do walki z chorobami pasożytniczymi przenoszonymi przez komary i kleszcze, w tym przez komary, jak w przypadku malarii i dengi.Niniejszy protokół został opracowany, aby wykazać, że po wprowadzeniu CCA do jamy brzusznej muchy, mogą one przenikać przez tkanki i dotrzeć do linii zarodkowej. To, co tutaj widać, to morfologia jajnika Drosophila; gdy CCA znajdują się w hemolimfie, mogą one przekroczyć błonę otrzewną otaczającą jajnik.Następnie przekraczają one warstwę mięśniową. W rzeczywistości jednym z pierwszych miejsc, do których dostają się wewnątrz jajnika, jest obraz komórek macierzystych somatycznych. Następnie mogą one dotrzeć do linii zarodkowej.Ta bakteria jest przenoszona w ten sam sposób co mitochondria, czyli przez matkę, za pośrednictwem cytoplazmy obecnej w komórce jajowej. Z tego powodu muszą one być obecne w linii zarodkowej, co stało się podstawą opracowania niniejszego protokołu.Niniejszy protokół może być bardzo użyteczny, ponieważ tradycyjny sposób, w jaki próbowano przeprowadzić transfekcję wba, polegał zazwyczaj na pobraniu wba i wprowadzeniu nowego gatunku owada poprzez mikroiniekcje do embrionu. Są to jednak metody znacznie bardziej skomplikowane.W zasadzie wykorzystujemy tutaj biologię tych organizmów, ponieważ są one zdolne do przenikania przez tkanki i przedostawania się do tkanek macierzystych, z których mogą przejść dalej do linii zarodkowej. Dzięki temu łatwiejsze jest pobieranie UBA od niektórych gatunków zainfekowanych owadów, które mogą następnie przenosić je na gatunki niezainfekowane. Prawdopodobnie chodzi o samą iniekcję.W zasadzie należy zadbać o to, aby unieruchomić muchę tak dokładnie, jak to możliwe. Używamy dwustronnej taśmy klejącej; igłę należy wprowadzić możliwie najbliżej i równolegle do ciała muchy, aby nie wbić jej zbyt głęboko. Dzięki temu zmniejszy się ryzyko śmierci muchy po przeprowadzeniu zabiegu.

wolbachia-bacterial-infection-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Infekcja bakteryjna Wolbachia u Drosophila

Osy pasożytnicze stanowią główną grupę naturalnych wrogów wielu owadów, w tym Drosophila melanogaster. Przedstawimy techniki rozmnażania tych pasożytów w gatunkach Drosophila spp. oraz zademonstrujemy sposób analizy ich wpływu na tkanki odpornościowe larw Drosophila.

Wprowadzenie do os w pasożytach Drosophila i odpowiedzi immunologicznej przeciwpasożytniczej

Źródło: Siva-Jothy, J. A. i inni. Infekcja bakteryjna jamy ustnej i wypadanie u Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2018)Film pokazuje infekcję jamy ustnej Drosophila melanogaster bakteriami patogennymi. Obejmuje przygotowanie fiolek z infekcją oraz przenoszenie głodnych much w celu umożliwienia spożycia bakterii. Procedura obejmuje kolonizację jelit, następnie sterylizację powierzchniową i homogenizację much. Na koniec pokazuje ilościowe określenie wewnętrznego obciążenia bakteryjnego...

Zakażenie jamy ustnej Drosophila melanogaster bakteriami patogennymi

Źródło: Hiroyasu, A., D i in., Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do zakażeń drobnoustrojowych i analiza. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje procedurę wywoływania infekcji bakteryjnej u larw Drosophila poprzez umieszczenie ich w kropli bakteryjnej i nakłucie igłą wolframową. Larwy są następnie wysiadane na rowkowatej, bogatej w składniki odżywcze płytce agarowej w celu badania interakcji żywiciel-patogen.

Ustanowienie infekcji bakteryjnej u larw Drosophila

Drosophila melanogaster to wybitny organizm modelowy do badania wrodzonego układu odpornościowego oraz fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dostarczyć D. melanogaster solidne i ilościowo powtarzalne infekcje bakteryjne, a następnie jak zmierzyć nasilenie infekcji i określić ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

Przedstawiono metodę hodowli Drosophila melanogaster w warunkach aksonicznych i gnotobiotycznych. Zarodki much są dechorionowane w podchlorynie sodu, przenoszone aseptycznie do jałowej diety i hodowane w zamkniętych pojemnikach. Zaszczepianie diety i zarodków bakteriami prowadzi do asocjacji gnotobiotycznych, a obecność bakterii potwierdza się poprzez posiew homogenatów Drosophila na całe ciało.

Hodowla muszki owocowej Drosophila melanogaster w warunkach aksenicznych i gnotobiotycznych

Komary Aedes aegypti zakażone Wolbachią są uwalniane do naturalnych populacji w celu zahamowania transmisji arbowirusów. Opisujemy metody hodowli Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia w laboratorium do eksperymentów i uwolnienia w terenie, podejmując środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji i selekcji laboratoryjnej.

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

Ten protokół opisuje metody doustnego wystawiania i zarażania muszki owocowej Drosophila melanogaster patogenami bakteryjnymi, a także mierzenia liczby zakaźnych bakterii wydalanych po infekcji jelitowej. Dalej opisujemy wpływ mutantów immunologicznych na przeżywalność much po zakażeniu bakteryjnym jamy ustnej.

Zakażenie bakteryjne jamy ustnej i wydalanie u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje, jak ustalić infekcję wirusową in vivo u Drosophila melanogaster przy użyciu metody nanoiniekcji i podstawowych technik analizy interakcji wirus-gospodarz.

Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster

Dorosłe muchy Drosophila melanogaster były szeroko wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza i strategii infekcji mikrobiologicznej. Aby promować stadium larwy D. melanogaster jako dodatkowy lub alternatywny system modelowy, opisano technikę iniekcji larw.

Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Protokół wstrzyknięcia larw

Do wykrywania wewnątrzkomórkowej Wolbachii użyto czterech metod, które wzajemnie się uzupełniały i poprawiały dokładność wykrywania infekcji Wolbachia Aa23 pochodzącej z Aedes albopictus i Aa23-T wyleczonej z rodzimej infekcji Wolbachia za pomocą antybiotyków.

Wykrywanie szczepu Wolbachia wAlbB w liniach komórkowych Aedes albopictus

Linie komórkowe są przydatne w badaniach nad organizmami wewnątrzkomórkowymi, które nie mogą być hodowane poza komórkami gospodarza. Chociaż linie zakażone Wolbachią umożliwiły wiele odkryć, niejednorodność w obrębie tych linii może prowadzić do zmiennych wyników eksperymentalnych. Przedstawiamy protokół generowania klonów jednokomórkowych i ciągłych hodowli z komórek JW18 zakażonych Wolbachią.

Generacja kultur monoklonalnych z linii komórkowej Drosophila melanogaster JW18 zakażonej Wolbachią

Poznaj protokół izolacji i iniekcji Wolbachii u Drosophila. Metoda wykorzystuje filtr do wyodrębnienia bakterii z około stu much, umożliwiając badanie dynamiki infekcji w modelu owadzim.

Zakażenie bakterią Wolbachia u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów