Name: Elektroprzędzenie rusztowań z polimerów włóknistych dla inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj elektroprzędzenie polimerów dla inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych. Ta metoda umożliwia tworzenie rusztowań włóknistych naśladujących macierz zewnątrzkomórkową oraz zaawansowane przetwarzanie przez fotopatterning.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez stypendium przeddoktoranckie American Heart Association przyznane JLI oraz grant National Institutes of Health R01AR056624.

A. Elektroprzędzenie pojedynczego polimeru
<ol>
 <li>Przed przygotowaniem roztworu do elektroprzędzenia, należy sporządzić 0,5% wag. roztwór fotoinicjatora Irgacure 2959 (I2959) w wodzie dejonizowanej, rozpuszczając go w temperaturze 37°C przez kilka dni. Krok ten nie jest konieczny, jeśli nie jest używany polimer fotoreaktywny.</li>
 <li>Połączyć zmetyloakrylowany kwas hialuronowy (MeHA, synteza opisana w Burdick et al.), poli(tlenek etylenu) (PEO, 900 kDa) oraz I2959 w wodzie dejonizowanej w celu przygotowania roztworu o końcowym stężeniu 2% wag. MeHA, 3% wag. PEO oraz 0,05% wag. I2959. Użyć wirówki typu vortex do mieszania roztworu, aż stanie się on klarowny. Rodzaj i stężenie polimeru, a także użyty rozpuszczalnik mogą zostać zmodyfikowane na tym etapie w zależności od pożądanych właściwości rusztowania.</li>
 <li>Przenieść roztwór do strzykawki i przymocować do niej igłę tępą o rozmiarze 18 G i długości 6 cali.</li>
 <li>Zaprogramować pompę strzykawkową na szybkość wypływu 1,2 mL/hr. Włożyć strzykawkę z igłą do urządzenia.</li>
 <li>Przymocować uziemiony przewód wysokiego napięcia do aparatu zbierającego. W celu zebrania włókien rozłożonych losowo należy użyć płaskiej metalowej płyty, a w celu zebrania włókien uporządkowanych – trzpienia obracającego się z prędkością ~10 m/s. Przewód naładowany dodatnio przymocować do igły. Schemat aparatury do elektroprzędzenia przedstawiono na Rysunku 1.</li>
 <li>Ustawić igłę lub urządzenie zbierające w taki sposób, aby odległość między nimi wynosiła 15 cm.</li>
 <li>Uruchomić przepływ w pompie strzykawkowej. Gdy ciecz pojawi się na końcówce igły, włączyć źródło zasilania i ustawić napięcie na 22 kV.</li>
 <li>Po zakończeniu procesu zbierania (od kilku minut w przypadku cienkich filmów, do 24 godzin dla grubszych mat), zdjąć rusztowanie z aparatury zbierającej i przechowywać je w próżni przez noc, aby zapewnić całkowite usunięcie rozpuszczalnika.</li>
 <li>Ocenić morfologię włókien za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM); reprezentatywne rusztowania dla struktur uporządkowanych i nieuporządkowanych pokazano na Rysunku 1.</li>
</ol>
Uwaga: Szybkość przepływu próbki, odległość do urządzenia zbierającego oraz napięcie zależą od kombinacji polimeru i rozpuszczalnika i muszą zostać zoptymalizowane dla każdego układu, zazwyczaj poprzez obserwację morfologii rusztowania za pomocą SEM.
B. Fotousieciowanie i fotowzorowanie
<ol>
 <li>Wytnij próbki o wymiarach 5mm X 5mm z matrycy rusztowania.</li>
 <li>Przygotuj zestaw do sieciowania, umieszczając każde rusztowanie na szklanym slajdzie pokrytym folią, kładąc fotomaskę bezpośrednio na rusztowaniu, przykrywając całość czystym szklanym slajdem i spinając oba końce żabkami biurowymi. Uwaga: jednocześnie można przygotować cztery próbki; jeśli pożądany nie jest konkretny wzór, do sieciowania można użyć przezroczystej folii bez wzoru.</li>
 <li>Przepłucz zestaw z rusztowaniami w komorze azotowej. Ważne jest, aby konstrukcja pozostała wolna od tlenu, który może hamować proces sieciowania.</li>
 <li>Umieść zestaw z rusztowaniami w komorze azotowej pod światłem o długości fali 365 nm i natężeniu ~10 mW/cm2, stosując adapter kolimujący, przez 5 minut. Patrz schemat na Rysunku 2.</li>
 <li>Wyjmij każde rusztowanie i umieść je w płytce 12-dołkowej.</li>
 <li>Do każdego dołka wlej 2 mL wody dejonizowanej, zabezpiecz płytkę folią Parafilm, aby zapobiec odparowywaniu wody, i inkubuj w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Wymień wodę trzy razy.</li>
 <li>Zweryfikuj powstanie porów pod mikroskopem świetlnym (patrz przykład na Rysunku 2). Rusztowania są teraz gotowe do użycia.</li>
</ol>
Uwaga: Fotousieciowanie nie jest konieczne dla wielu rodzajów polimerów, jednak fotolitograficzne wzorowanie można stosować wyłącznie w przypadku polimerów fotoreaktywnych.
C. Podwójne elektroprzędzenie polimerów z wizualizacją włókien za pomocą fluorescencji
<ol>
 <li>Przygotować 5% wagowy roztwór PEO (200 kDa) w 90% etanolu. Mieszać przy 700 obr./min w 50°C przez co najmniej 2 godziny przed elektroprząśnięciem.</li>
 <li>Przenieś roztwór PEO do strzykawki i dodaj DAPI, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/ml w roztworze do elektroprządu. Owiń strzykawkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. </li>
 <li>Przygotować ten sam roztwór, który opisano w kroku A2, z tym że należy dodać również rhodaminę B z grupą metakryloyloxyethyl thiocarbamoyl (MeRho, 683,24 g/mol) do uzyskania stężenia końcowego wynoszącego 25 μM w roztworze do elektroprzędzenia. Owiń strzykawkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. </li>
 <li>Ostrożnie użyj taśmy klejącej, aby przymocować zmetykrylowane szkiełka nakrywki (patrz Khademhosseini i wsp.) do powierzchni trzpienia. Uwaga: włókna zostaną przytwierdzone do metakrylowanych szkiełek nakrywkowych. </li>
 <li>Przymocuj jeden koniec 5-milimetrowego odcinka rurki silikonowej z złączami luer-lock do jednej z strzykawek, a drugi koniec do igły. Włóż strzykawkę do pompy strzykawkowej i wprowadź igłę przez otwór w rozdzielaczu. Powtórz czynność z drugą strzykawką i rozdzielaczem po przeciwnej stronie trzpienia. Rozdzielacze przesuwają się wzdłuż długości trzpienia i służą do zapewnienia równomiernego rozkładu obu polimerów w powstałym rusztowaniu. Patrz schemat w Rysunek 3.</li>
 <li>Należy odpowiednio dostosować parametry opisane w sekcji A zgodnie z Tabela 1Upewnij się, że końcówki igieł są wycentrowane na trzpieniu. 
 Tabela 1. Parametry podwójnego elektroprzędzenia polimerów 
 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody> 
<tr>
<td>Strzykawka </td>
<td>Odległość od Fannera do końcówki igły (cm)</td>
<td>Odległość od końcówki igły do trzpienia (cm)</td>
<td>Szybkość przepływu (ml/h)</td>
<td>Napięcie przyłożone (kV)</td>
 </tr>
 <tr>
<td>MeHA</td>
<td>6</td>
<td>15</td>
<td>1.2</td>
<td>+22</td>
 </tr>
 <tr>
<td>PEO</td>
<td>6</td>
<td>10</td>
<td>1.2</td>
<td>+15</td>
 </tr>
</tbody>
 </table> 
</li>
 <li>Po prawidłowym ustawieniu wszystkich elementów należy wyłączyć światło, a następnie uruchomić mandrel oraz pompy strzykawkowe. Należy usunąć folię aluminiową ze strzykawek. Gdy ciecz pojawi się na końcach obu igieł, należy jednocześnie włączyć zasilacze i podłączyć wentylatory. </li>
 <li>Po zakończeniu zbierania wyłączyć zasilacze oraz trzpień i odłączyć wentylatory. Ostrożnie usunąć szkiełka nakrywki i taśmę za pomocą żyletki. </li>
 <li>Wizualizuj włókna za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla rhodaminy i DAPI. Zobacz przykład w Rysunek 3Uwaga: Włókna fluorescencyjne są najlepiej widoczne, gdy proces elektroprzędzenia trwa krótko (&lt;3 minuty), jednakże proces ten można przedłużyć w nieskończoność w celu utworzenia grubszych konstruktów, szczególnie bez użycia szkiełek podstawowych. </li>
</ol>
D. Wysiewanie komórek na rusztowania
<ol>
 <li>Umieść każde szkiełko podstawowe z naniesionym polimerem z elektroprzędzenia w oddzielnej studzience płytki wielodołkowej o odpowiednim rozmiarze. Uwaga: oddziaływania komórek z włóknami są łatwo widoczne przy elektroprzędzeniu na metakrylowanych szkiełkach szklanych. Do wizualizacji włókien można ponownie zastosować MeRho.</li>
 <li>Inkubuj rusztowania w PBS przez noc, aby zapewnić całkowite usunięcie rozpuszczalnika i wszelkich możliwych wymywalnych produktów ubocznych.</li>
 <li>Usuń PBS ze studzienek.</li>
 <li>W celu sterylizacji rusztowań umieść je pod lampą bakteriobójczą w komorze z laminarnym przepływem powietrza na 30 minut. W przypadku zasiewania całego rusztowania, obróć je i umieść pod lampą bakteriobójczą na kolejne 30 minut.</li>
 <li>Przeprowadź standardową hodowlę komórkową i przygotuj skoncentrowaną zawiesinę komórek o pożądanej gęstości (np. 6,000 cells cm-2). Przykładowo, użyj 100 mL zawiesiny komórek dla szkiełka o wymiarach 22 mm X 22 mm. Umieść w inkubatorze na 1 godzinę.</li>
 <li>Dodaj odpowiednią ilość pożywki do hodowli komórkowej do każdej studzienki. Umieść rusztowania z powrotem w inkubatorze.</li>
 <li>Przebarw komórki przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu Live/Dead. Uwaga: w celu wizualizacji komórek można zastosować inne rodzaje barwienia, takie jak DAPI (jądra komórkowe) i znakowana fluorescencyjnie faloidyna (aktynowe włókna stresu).</li>
<li>Wizualizuj komórki i włókna za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla TRITC i FITC. Zobacz przykład na Rysunku 4.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure1tmb.jpg" border="0" alt="Metoda elektroprzędzenia, przygotowanie roztworu polimeru; schemat rusztowania z nanowłóknami nieukładanymi i układanymi." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Schemat przedstawiający konfigurację urządzenia do tworzenia rusztowań nieukładanych (góra) oraz rusztowań układanych (dół). Pokazano przykładowe obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla każdego typu rusztowania. Pasek skali = 5μm. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.
<img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure2tmb.jpg" border="0" alt="Proces litografii UV rusztowania elektroprzędzionego, aplikacja fotomaski, schemat formowania wzorowanego żelu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Schemat metody wzorowania. Wzory są formowane poprzez umieszczenie fotomaski między źródłem światła a rusztowaniem podczas fotousieciowania, a następnie wypłukanie niezwiązanego polimeru. Fotomaska oraz obraz SEM rusztowań po formowaniu porów i liofilizacji. Pasek skali = 100 μm. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure2.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 2.
<img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure3tmb.jpg" alt="Schemat układu do elektroprzędzenia z prędkościami przepływu polimeru; obraz mikroskopowy formowania się włókien." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Schemat układu do wielopolimerowego elektroprzędzenia i niezbędnych parametrów procesowych, a także reprezentatywny obraz fluorescencyjny mieszaniny dwóch populacji włókien (przykład: czerwone MeHA i niebieskie PEO), które zostały jednoczesnie elektroprzędzione w celu utworzenia wielopolimerowego rusztowania. Pasek skali = 100 μm. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure3.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 3.
<img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure4tmb.jpg" border="0" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek, podkreślający ekspresję białek za pomocą zielonych markerów fluorescencyjnych." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Przykład obrazu z barwieniem Live/Dead ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych oraz ich oddziaływań z włóknami otrzymanymi metodą elektroprzędzenia. Pasek skali = 100 μm. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure4.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 4.

<ol><li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li>
<li>Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li>
<li>Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolding+of+photocrosslinkable+hyaluronic+acid+for+cell+encapsulation+and+entrapment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment.</a> J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).</li>
<li>Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+on+the+Straight+and+Narrow%3A+The+Mechanics+of+Nanofibrous+Assemblies+for+Fiber-Reinforced+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+B%22%5BJournal%5D)">Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration.</a> Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).</li>
<li>Sill, T. J., Von Recum, H. avon <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning%3A+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multi-scale+and+photopatterned+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity.</a> , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

Do przygotowania włóknistych rusztowań polimerowych wykorzystano metodę elektroprzędzenia. Jako przykład ilustrujący zastosowano rusztowania fotousieciowalne oparte na kwasie hialuronowym, w których do przeprowadzenia sieciowania wymagana jest ekspozycja na światło. Dzięki zastosowaniu reaktywnych makromerów, takich jak MeHA, w rusztowaniach utworzono kanały (które wcześniej wykazały zdolność do poprawy dystrybucji komórek) poprzez użycie maski podczas fotousieciowania, co pozwoliło na uzyskanie struktur makroporowatych ...

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>I2959</td><td>Odczynnik</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEO 200 kDa</td><td></td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17503</td><td></td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Metakryloksyetylotiokarbamoilorodamina B</td><td>Odczynnik</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>Przygotować roztwór zapasowy w DMSO</td></tr><tr><td>Zestaw barwiący Live/Dead</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Zawiera kalceinę (barwi żywe komórki na zielono) i jodek etydinium (barwi martwe komórki na czerwono)</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Urządzenie</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td>Dwie pompy są niezbędne do przędzenia podwójnego polimeru</td></tr><tr><td>Źródło zasilania</td><td>Urządzenie</td><td>Gamma High Voltage</td><td>ES30P-5W</td><td>Dwa urządzenia są niezbędne do przędzenia podwójnego polimeru</td></tr><tr><td>Silnik</td><td>Urządzenie</td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>Musi być przymocowany do specjalnie wykonanego trzpienia</td></tr><tr><td>Tachometr</td><td>Urządzenie</td><td>Network Tool Warehouse</td><td>ESI-330</td><td>Służy do monitorowania prędkości trzpienia</td></tr><tr><td>System utwardzania punktowego UV Omnicure z adapterem kolimującym</td><td>Urządzenie</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>Przewód silikonowy</td><td>Urządzenie</td><td>McMaster-Carr</td><td>51135K151</td><td></td></tr><tr><td>Adapter żeński Luer Lock</td><td>Urządzenie</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K293</td><td></td></tr><tr><td>Adapter męski Luer Lock</td><td>Urządzenie</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K143</td><td></td></tr><tr><td>Igły</td><td>Urządzenie</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>Łaseczki</td><td>Urządzenie</td><td>Corning</td><td>2875-22</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroprzędzenie włóknistych rusztowań polimerowych do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Wraz z rozwojem inżynierii tkankowej rośnie ogromne zapotrzebowanie na opracowanie bardziej odpowiednich materiałów i technik przetwarzania, aby sprostać wymaganiom (np. mechanicznym i dotyczącym unaczynienia) bardziej złożonych organów i tkanek. Elektroprzędzenie jest popularną techniką tworzenia włóknistych rusztowań, które naśladują architekturę i skalę rozmiarów naturalnej macierzy pozakomórkowej. Takie włókniste rusztowania są również użyteczne jako podłoża do hodowli komórek, ponieważ włókna mogą być wykorzystane do kierowania zachowaniem komórek, w tym różnicowaniem komórek macierzystych (patrz obszerne przeglądy Maucket al.and Sillet al.(po więcej informacji). W niniejszym artykule opisujemy ogólny proces elektroprzędzenia polimerów, a jako przykład przedstawiamy elektroprzędzenie reaktywnego kwasu hialuronowego zdolnego do sieciowania pod wpływem ekspozycji na światło (patrz Ifkovitset al.(do przeglądu literatury na temat materiałów fotousieciowalnych). Przedstawiamy również dodatkowe możliwości przetwarzania, takie jak fotolitografia oraz formowanie rusztowań wielopolimerowych. Fotolitografię można wykorzystać do tworzenia rusztowań z kanałami i porowatością wieloskalową w celu zwiększenia infiltracji komórkowej i dystrybucji tkanki. Rusztowania wielopolimerowe są przydatne do lepszego dostrojenia właściwości (mechanicznych i degradacji) rusztowania, w tym precyzyjnego doboru porowatości dla infiltracji komórek. Co więcej, techniki te można rozszerzyć o szeroki wachlarz polimerów i reaktywnych makromerów, aby tworzyć złożone rusztowania dostarczające sygnałów niezbędnych do rozwoju skutecznych konstruktów inżynierii tkankowej.

W niniejszym artykule omówiono proces elektroprzędzenia polimerów do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych. W szczególności opisano elektroprzędzenie makromerów fotoreaktywnych z dodatkowymi możliwościami przetwarzania w postaci fotopatronowania oraz elektroprzędzenia wielopolimerowego.

Elektroprzędzenie włóknistych rusztowań polimerowych do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych

Wraz z rozwojem inżynierii tkankowej rośnie zapotrzebowanie na opracowanie bardziej odpowiednich materiałów i technik przetwarzania, aby móc rozwiązać...

Niniejszy film prezentuje elektroprzędzenie polimerów, popularną technikę stosowaną w inżynierii tkankowej i hodowlach komórkowych w celu tworzenia rusztowań włóknistych naśladujących architekturę i skalę rozmiarów natywnej macierzy pozakomórkowej. W tym materiale przeprowadzamy elektroprzędzenie fotoreaktywnego kwasu hialuronowego zdolnego do sieciowania pod wpływem światła oraz przedstawiamy kolejne zastosowania przetwórcze, takie jak fotopatterning – proces tworzący kanały, rusztowania oraz porowatość wielkoskalową, co zwiększa infiltrację komórkową i dystrybucję tkanki. Dodatkowo wykorzystujemy tworzenie rusztowań z wielu polimerów, co umożliwia elektroprzędzenie dwóch różnych polimerów w jedną matę, pozwalając na dostrojenie właściwości mechanicznych i degradacji rusztowania oraz dopasowanie porowatości pod kątem infiltracji komórkowej.Witajcie, jestem Jamie Kovi z laboratorium Jasona Burdicka w Katedrze Bioinżynierii na Uniwersytecie Pensylwanii. Cześć, jestem Harini Swin, również z laboratorium Burdicka. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę elektroprzędzenia rusztowań włóknistych do inżynierii tkankowej.Przedstawimy również dodatkowe możliwości przetwarzania w zakresie fotolitografii oraz tworzenia rusztowań z wielu polimerów. Procedury te stosujemy w naszym laboratorium do badania interakcji i infiltracji komórek HMSE w rusztowaniach z kwasu hialuronowego. Techniki te wykorzystujemy również z różnymi innymi polimerami w celu badania tkanek wzmacnianych włóknami, takich jak łąkotka i mięsień sercowy.Zacznijmy zatem. Przygotuj 0,5% wagowy roztwór inicjatora fotopolimeryzacji. I 2 9 5 9 lub I 2 9 5 9 rozpuszczam w wodzie dejonizowanej w temperaturze 37 °C przez kilka dni.I cure stosuje się w przypadku, gdy do elektroprzędzenia wymagany jest polimer fotoreaktywny. Aby przygotować roztwór do elektroprzędzenia, należy połączyć w wodzie dejonizowanej do końcowych stężeń: 2%wag metylowanego kwasu hialuronowego (MEHA), 3%wag tlenku polietylenu (PEO) oraz 0,05%wag roztworu I 2 9 5 9, wymieszać w wirówce typu vortex przez pięć minut i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. W celu homogenizacji roztworu, należy przenieść go do strzykawki i przymocować do niej tępą igłę o rozmiarze 18 G i długości sześciu cali.Następnie należy użyć pompy strzykawkowej i ustawić prędkość tłoczenia na 1,2 milliliters per hour. Wprowadzić igłę układu wtryskowego do pompy strzykawkowej. Podłączyć przewód uziemiający wysokiego napięcia do aparatu zbierającego.W tej procedurze wykorzystamy trzpień obracający się z prędkością około 10 metrów na sekundę. Aby zebrać uporządkowane włókna, podłącz przewód dodatni do igły, a następnie ustaw igłę lub urządzenie zbierające w taki sposób, aby odległość między nimi wynosiła 15 centymetrów. Uruchom przepływ z pompy strzykawkowej i gdy na końcówce igły pojawi się ciecz, włącz zasilacz i ustaw napięcie na 22 kilowolty.Gromadzić włókna na rusztowaniu aż do osiągnięcia pożądanej grubości. Czas gromadzenia zależy od wymaganej grubości oraz objętości użytego roztworu do elektroprzędzenia. W przypadku fotowzorowania stosujemy maty elektroprzędzone przez 16 godzin.Po zakończeniu procesu zbierania należy wyjąć rusztowanie z aparatury zbierającej i przechowywać je pod próżnią przez noc w celu całkowitego usunięcia rozpuszczalnika. Za pomocą nożyczek wyciąć z maty rusztowania próbki o wymiarach 5 mm na 5 mm. Każdą próbkę rusztowania umieścić na szkiełku przedmiotowym pokrytym folią w celu przygotowania do sieciowania, a następnie nałożyć maskę światłoczułą bezpośrednio na rusztowanie, przykryć ją czystym szkiełkiem przedmiotowym i zacisnąć oba końce szkiełka za pomocą klipsów biurowych.Używając komory azotowej, przepłucz rusztowanie, aby zapobiec ograniczeniu sieciowania spowodowanemu ekspozycją na tlen. Umieść zestaw z rusztowaniem w komorze azotowej pod światłem o długości fali 365 nanometrów i mocy około 10 milliwattów na centymetr kwadratowy, stosując adapter kolimujący przez pięć minut. Wyjmij każde rusztowanie i umieść je w 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.Do każdej studzienki należy dodać 2 mL wody dejonizowanej. Płytkę należy wypełnić profilowo, aby zapobiec aberracji EVA wody, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Wodę należy wymieniać co osiem godzin, używając pipety próżniowej do aspiracji wody dejonizowanej ze studzienek pomiędzy kolejnymi etapami przemywania.Przygotować 5% wagowy roztwór PEO w 90% etanolu na płycie grzejnej. Mieszać przy 700 RPM w temperaturze 50 °C przez co najmniej dwie godziny przed przystąpieniem do procedury. Po mieszaniu dodać DPI do uzyskania stężenia końcowego 10 µg/mL.Przenieś roztwór PEO i DPI do strzykawki o pojemności trzech mililitrów i owiń ją folią aluminiową, aby chronić przed światłem. Następnie przygotuj roztwór do elektroprzędzenia opisany w drugiej sekcji i za pomocą mikropipety dodaj methoxy ethyl biocarbon mole rod domine B do stężenia końcowego 25 micromolar do strzykawki o pojemności trzech mililitrów. Następnie owiń ją folią aluminiową, aby chronić przed światłem.Używając taśmy klejącej, ostrożnie przymocuj krawędzie szkiełek podstawkowych z matowego szkła o wymiarach 22 mm na 22 mm do powierzchni trzpienia w taki sposób, aby szkiełka opasły jego obwód. Używając kawałka rurki silikonowej o długości 5 mm, przymocuj jeden jej koniec do jednej z strzykawek z przyłączem Luer-Lock. Drugi koniec przymocuj do igły, włóż strzykawkę do pompy strzykawkowej, a igłę wprowadź przez otwór w wentylatorze.Rozpylacze przesuwają się wzdłuż osi trzpienia i służą do zapewnienia równomiernego rozkładu obu polimerów w powstałym rusztowaniu. Należy upewnić się, że końcówki igieł dla strzykawki zawierającej MEHA są wyśrodkowane względem trzpienia. Ustaw końcówkę igły w odległości 15 cm od trzpienia, a rozpylacz w odległości 6 cm od końcówki igły.Zaprogramuj pompę strzykawkową na przepływ 1,2 milliliters na godzinę i ustaw źródło zasilania na 22 kilovolts. Przygotuj strzykawkę z PEO w dokładnie ten sam sposób, ale umieść końcówkę igły w odległości 10 centimeters od trzpienia i ustaw źródło zasilania na 15 kilovolts. Następnie zgaś światło i uruchom trzpień oraz pompy strzykawkowe.Zdejmij folię aluminiową ze strzykawek, gdy płyn pojawi się na końcówkach obu igieł. Jednocześnie włącz zasilacze i podłącz wentylatory, gdy proces zbierania zostanie zakończony. Wyłącz zasilacze oraz trzpień i ostrożnie odłącz wentylatory.Usuń szkiełka nakrywkowe i taśmę za pomocą żyletki. Włókna można zwizualizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla rumine i dpi. Umieść każde szkiełko nakrywkowe z przytwierdzonym polimerem electro spon w oddzielnej studzience płytki sześciodołkowej.Płytka wielodołkowa Inkubować rusztowania w dwóch mililitrach PBS przez noc, aby zapewnić całkowite usunięcie rozpuszczalnika i zanieczyszczeń. Po 24 godzinach odessać PBS z dołków za pomocą próżni, a następnie umieścić rusztowania pod bakteriobójczą lampą UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza na 30 minut. W celu sterylizacji przeprowadzić standardową hodowlę komórkową i przygotować stężoną zawiesinę komórek o pożądanej gęstości komórek.Na przykład należy użyć 100 mililitrów zawiesiny komórek dla szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry. Umieścić w inkubatorze na jedną godzinę. Do każdego z nich dodać odpowiednią ilość pożywki do hodowli komórek.Następnie umieść rusztowania z powrotem w inkubatorze. Przebarw komórki, używając dostępnego komercyjnie zestawu do barwienia żywych i martwych komórek firmy Invitrogen, aby zwizualizować komórki i włókna za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla TRITC i FITC. Zgodnie z oczekiwaniami, rusztowania zebrane na uziemionej płaskiej płycie wykazują włókna rozmieszczone losowo, podczas gdy rusztowania zebrane na obrotowym trzpieniu posiadają włókna uporządkowane.W celu wytworzenia wyrównanych włókien widocznych w skaningowej mikroskopii elektronowej podczas fotousieciowania rusztowania, umieszczamy maskę światłoczułą pomiędzy rusztowaniem a źródłem światła po zanurzeniu rusztowania w odjonizowanej wodzie i nieaktywnym ha. Obszary zablokowane przed światłem są oczyszczone z PEO, co prowadzi do powstania makroporów, co potwierdzają wyniki barwienia barwnikiem fluorescencyjnym. Jednoczesne elektroprzędzenie strumieni MEHA i PEO skutkuje otrzymaniem rusztowania kompozytowego zawierającego odrębne populacje włókien złożone z poszczególnych polimerów.Komórki HMC wydają się wchodzić w pozytywne interakcje z włóknami. Nie tylko zachowują żywotność, co potwierdza zielone barwienie, ale także wykazują tendencję do orientowania się wzdłuż czerwonych włókien. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób elektroprzędzenia rusztowań włóknistych do inżynierii tkankowej.Wprowadziliśmy również dodatkowe możliwości, takie jak fotolitografia wzorca oraz elektroprzędzenie wielopolimerowe. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zoptymalizować parametry elektroprzędzenia dla każdego polimeru w celu uzyskania jednorodnych włókien przed przystąpieniem do dalszych eksperymentów. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

electrospinning-fibrous-polymer-scaffolds-for-tissue-engineering-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nanowłóknienie śródfibrylowe dla inżynierii tkankowej i hodowli komórek

Uporządkowane włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia kierują wzrostem neuronów in vitro i stanowią potencjalny komponent rusztowań do regeneracji nerwów. Opisujemy procedurę przygotowania podłoży z włókien elektroprzędzionych oraz bezsurowiczą hodowlę pierwotnych neuronów sensorycznych (DRG) i ruchowych szczura w stadium E15. Uwzględniono również wizualizację neuronów za pomocą immunocytochemii.

Hodowla pierwotnych neuronów ruchowych i sensorycznych w zdefiniowanych mediach na rusztowaniach z nanowłókien z poli-L-laktydu otrzymanych metodą elektroprzędzenia

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Ten protokół łączy elektroprzędzenie i mikrosfery w celu opracowania rusztowań inżynierii tkankowej do kierowania neuronami. Czynnik wzrostu nerwów zamknięto w mikrosferach PLGA i elektroprzędzono w rusztowania włókniste z kwasem hialuronowym (HA).  Bioaktywność białka badano poprzez wysiewanie rusztowań pierwotnymi zwojami korzenia grzbietowego piskląt i hodowlę przez 4-6 dni.

Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

Zgłoszono syntezę i wytwarzanie długich włókien elektroprzędzionych obejmujących większy obszar złoża za pomocą nowo zaprojektowanego kolektora z nowego biodegradowalnego polimeru o nazwie poli(dodekanian glicerolu) (PGD). Włókna były w stanie wspierać wzrost komórek pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy.

Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania elektroprzędzonych rusztowań z nanowłókien o stopniowanej organizacji włókien i badamy ich zastosowania w regulacji morfologii/orientacji komórek. Gradienty w odniesieniu do właściwości fizycznych i chemicznych rusztowań z nanowłókien oferują szeroką gamę zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Postępy w technologiach biomateriałów umożliwiają rozwój trójwymiarowych konstruktów wielokomórkowych. Opracowaliśmy protokoły elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech pojedynczych rusztowań do hodowli głównych komórek strukturalnych dróg oddechowych, aby zapewnić model 3D in vitro ściany oskrzelików dróg oddechowych.

Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

Ten protokół służy jako kompleksowa wytyczna do wytwarzania rusztowań za pomocą elektroprzędzenia z polimerami stopionymi w trybie bezpośredniego zapisu. Systematycznie nakreślamy proces i definiujemy odpowiednie ustawienia parametrów w celu osiągnięcia docelowych architektur rusztowań.

Zapis elektroprzędzenia ze stopu trójwymiarowych rusztowań poli(ε-kaprolaktonu) z kontrolowanymi morfologiami do zastosowań w inżynierii tkankowej

Ten artykuł demonstruje technikę rozbudowy tradycyjnej, dwuwymiarowej (2D) elektroprzędzonej maty z nanowłókien w trójwymiarowe (3D) rusztowanie poprzez rozhermetyzowanie podkrytycznego płynu CO2. Te rozszerzone rusztowania są 3D, ściśle naśladują komórkowe wskazówki nanotopograficzne i zachowują funkcje cząsteczek biologicznych zamkniętych w nanowłóknach.

Ekspansja dwuwymiarowych mat z nanowłókien elektroprzędzonych do rusztowań trójwymiarowych

Metody eksperymentalne w inżynierii tkankowej

Poznaj elektroprzędzenie polimerów dla inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych. Ta metoda umożliwia tworzenie rusztowań włóknistych naśladujących macierz zewnątrzkomórkową oraz zaawansowane przetwarzanie przez fotopatterning.

Elektroprzędzenie włóknistych rusztowań polimerowych do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych

Przeglądaj więcej filmów