Elektroprzędzenie włóknistych rusztowań polimerowych do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych

Niniejszy film prezentuje elektroprzędzenie polimerów, popularną technikę stosowaną w inżynierii tkankowej i hodowlach komórkowych w celu tworzenia rusztowań włóknistych naśladujących architekturę i skalę rozmiarów natywnej macierzy pozakomórkowej. W tym materiale przeprowadzamy elektroprzędzenie fotoreaktywnego kwasu hialuronowego zdolnego do sieciowania pod wpływem światła oraz przedstawiamy kolejne zastosowania przetwórcze, takie jak fotopatterning – proces tworzący kanały, rusztowania oraz porowatość wielkoskalową, co zwiększa infiltrację komórkową i dystrybucję tkanki. Dodatkowo wykorzystujemy tworzenie rusztowań z wielu polimerów, co umożliwia elektroprzędzenie dwóch różnych polimerów w jedną matę, pozwalając na dostrojenie właściwości mechanicznych i degradacji rusztowania oraz dopasowanie porowatości pod kątem infiltracji komórkowej.

Witajcie, jestem Jamie Kovi z laboratorium Jasona Burdicka w Katedrze Bioinżynierii na Uniwersytecie Pensylwanii. Cześć, jestem Harini Swin, również z laboratorium Burdicka. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę elektroprzędzenia rusztowań włóknistych do inżynierii tkankowej.

Przedstawimy również dodatkowe możliwości przetwarzania w zakresie fotolitografii oraz tworzenia rusztowań z wielu polimerów. Procedury te stosujemy w naszym laboratorium do badania interakcji i infiltracji komórek HMSE w rusztowaniach z kwasu hialuronowego. Techniki te wykorzystujemy również z różnymi innymi polimerami w celu badania tkanek wzmacnianych włóknami, takich jak łąkotka i mięsień sercowy.

Zacznijmy zatem. Przygotuj 0,5% wagowy roztwór inicjatora fotopolimeryzacji. I 2 9 5 9 lub I 2 9 5 9 rozpuszczam w wodzie dejonizowanej w temperaturze 37 °C przez kilka dni.

I cure stosuje się w przypadku, gdy do elektroprzędzenia wymagany jest polimer fotoreaktywny. Aby przygotować roztwór do elektroprzędzenia, należy połączyć w wodzie dejonizowanej do końcowych stężeń: 2%wag metylowanego kwasu hialuronowego (MEHA), 3%wag tlenku polietylenu (PEO) oraz 0,05%wag roztworu I 2 9 5 9, wymieszać w wirówce typu vortex przez pięć minut i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. W celu homogenizacji roztworu, należy przenieść go do strzykawki i przymocować do niej tępą igłę o rozmiarze 18 G i długości sześciu cali.

Następnie należy użyć pompy strzykawkowej i ustawić prędkość tłoczenia na 1,2 milliliters per hour. Wprowadzić igłę układu wtryskowego do pompy strzykawkowej. Podłączyć przewód uziemiający wysokiego napięcia do aparatu zbierającego.

W tej procedurze wykorzystamy trzpień obracający się z prędkością około 10 metrów na sekundę. Aby zebrać uporządkowane włókna, podłącz przewód dodatni do igły, a następnie ustaw igłę lub urządzenie zbierające w taki sposób, aby odległość między nimi wynosiła 15 centymetrów. Uruchom przepływ z pompy strzykawkowej i gdy na końcówce igły pojawi się ciecz, włącz zasilacz i ustaw napięcie na 22 kilowolty.

Gromadzić włókna na rusztowaniu aż do osiągnięcia pożądanej grubości. Czas gromadzenia zależy od wymaganej grubości oraz objętości użytego roztworu do elektroprzędzenia. W przypadku fotowzorowania stosujemy maty elektroprzędzone przez 16 godzin.

Po zakończeniu procesu zbierania należy wyjąć rusztowanie z aparatury zbierającej i przechowywać je pod próżnią przez noc w celu całkowitego usunięcia rozpuszczalnika. Za pomocą nożyczek wyciąć z maty rusztowania próbki o wymiarach 5 mm na 5 mm. Każdą próbkę rusztowania umieścić na szkiełku przedmiotowym pokrytym folią w celu przygotowania do sieciowania, a następnie nałożyć maskę światłoczułą bezpośrednio na rusztowanie, przykryć ją czystym szkiełkiem przedmiotowym i zacisnąć oba końce szkiełka za pomocą klipsów biurowych.

Używając komory azotowej, przepłucz rusztowanie, aby zapobiec ograniczeniu sieciowania spowodowanemu ekspozycją na tlen. Umieść zestaw z rusztowaniem w komorze azotowej pod światłem o długości fali 365 nanometrów i mocy około 10 milliwattów na centymetr kwadratowy, stosując adapter kolimujący przez pięć minut. Wyjmij każde rusztowanie i umieść je w 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.

Do każdej studzienki należy dodać 2 mL wody dejonizowanej. Płytkę należy wypełnić profilowo, aby zapobiec aberracji EVA wody, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Wodę należy wymieniać co osiem godzin, używając pipety próżniowej do aspiracji wody dejonizowanej ze studzienek pomiędzy kolejnymi etapami przemywania.

Przygotować 5% wagowy roztwór PEO w 90% etanolu na płycie grzejnej. Mieszać przy 700 RPM w temperaturze 50 °C przez co najmniej dwie godziny przed przystąpieniem do procedury. Po mieszaniu dodać DPI do uzyskania stężenia końcowego 10 µg/mL.

Przenieś roztwór PEO i DPI do strzykawki o pojemności trzech mililitrów i owiń ją folią aluminiową, aby chronić przed światłem. Następnie przygotuj roztwór do elektroprzędzenia opisany w drugiej sekcji i za pomocą mikropipety dodaj methoxy ethyl biocarbon mole rod domine B do stężenia końcowego 25 micromolar do strzykawki o pojemności trzech mililitrów. Następnie owiń ją folią aluminiową, aby chronić przed światłem.

Używając taśmy klejącej, ostrożnie przymocuj krawędzie szkiełek podstawkowych z matowego szkła o wymiarach 22 mm na 22 mm do powierzchni trzpienia w taki sposób, aby szkiełka opasły jego obwód. Używając kawałka rurki silikonowej o długości 5 mm, przymocuj jeden jej koniec do jednej z strzykawek z przyłączem Luer-Lock. Drugi koniec przymocuj do igły, włóż strzykawkę do pompy strzykawkowej, a igłę wprowadź przez otwór w wentylatorze.

Rozpylacze przesuwają się wzdłuż osi trzpienia i służą do zapewnienia równomiernego rozkładu obu polimerów w powstałym rusztowaniu. Należy upewnić się, że końcówki igieł dla strzykawki zawierającej MEHA są wyśrodkowane względem trzpienia. Ustaw końcówkę igły w odległości 15 cm od trzpienia, a rozpylacz w odległości 6 cm od końcówki igły.

Zaprogramuj pompę strzykawkową na przepływ 1,2 milliliters na godzinę i ustaw źródło zasilania na 22 kilovolts. Przygotuj strzykawkę z PEO w dokładnie ten sam sposób, ale umieść końcówkę igły w odległości 10 centimeters od trzpienia i ustaw źródło zasilania na 15 kilovolts. Następnie zgaś światło i uruchom trzpień oraz pompy strzykawkowe.

Zdejmij folię aluminiową ze strzykawek, gdy płyn pojawi się na końcówkach obu igieł. Jednocześnie włącz zasilacze i podłącz wentylatory, gdy proces zbierania zostanie zakończony. Wyłącz zasilacze oraz trzpień i ostrożnie odłącz wentylatory.

Usuń szkiełka nakrywkowe i taśmę za pomocą żyletki. Włókna można zwizualizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla rumine i dpi. Umieść każde szkiełko nakrywkowe z przytwierdzonym polimerem electro spon w oddzielnej studzience płytki sześciodołkowej.

Płytka wielodołkowa Inkubować rusztowania w dwóch mililitrach PBS przez noc, aby zapewnić całkowite usunięcie rozpuszczalnika i zanieczyszczeń. Po 24 godzinach odessać PBS z dołków za pomocą próżni, a następnie umieścić rusztowania pod bakteriobójczą lampą UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza na 30 minut. W celu sterylizacji przeprowadzić standardową hodowlę komórkową i przygotować stężoną zawiesinę komórek o pożądanej gęstości komórek.

Na przykład należy użyć 100 mililitrów zawiesiny komórek dla szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry. Umieścić w inkubatorze na jedną godzinę. Do każdego z nich dodać odpowiednią ilość pożywki do hodowli komórek.

Następnie umieść rusztowania z powrotem w inkubatorze. Przebarw komórki, używając dostępnego komercyjnie zestawu do barwienia żywych i martwych komórek firmy Invitrogen, aby zwizualizować komórki i włókna za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla TRITC i FITC. Zgodnie z oczekiwaniami, rusztowania zebrane na uziemionej płaskiej płycie wykazują włókna rozmieszczone losowo, podczas gdy rusztowania zebrane na obrotowym trzpieniu posiadają włókna uporządkowane.

W celu wytworzenia wyrównanych włókien widocznych w skaningowej mikroskopii elektronowej podczas fotousieciowania rusztowania, umieszczamy maskę światłoczułą pomiędzy rusztowaniem a źródłem światła po zanurzeniu rusztowania w odjonizowanej wodzie i nieaktywnym ha. Obszary zablokowane przed światłem są oczyszczone z PEO, co prowadzi do powstania makroporów, co potwierdzają wyniki barwienia barwnikiem fluorescencyjnym. Jednoczesne elektroprzędzenie strumieni MEHA i PEO skutkuje otrzymaniem rusztowania kompozytowego zawierającego odrębne populacje włókien złożone z poszczególnych polimerów.

Komórki HMC wydają się wchodzić w pozytywne interakcje z włóknami. Nie tylko zachowują żywotność, co potwierdza zielone barwienie, ale także wykazują tendencję do orientowania się wzdłuż czerwonych włókien. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób elektroprzędzenia rusztowań włóknistych do inżynierii tkankowej.

Wprowadziliśmy również dodatkowe możliwości, takie jak fotolitografia wzorca oraz elektroprzędzenie wielopolimerowe. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zoptymalizować parametry elektroprzędzenia dla każdego polimeru w celu uzyskania jednorodnych włókien przed przystąpieniem do dalszych eksperymentów. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.