Name: Izolacja i oczyszczanie neuronów obwodowych Drosophila za pomocą sortowania kulek magnetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Poznaj metodę izolacji i oczyszczania neuronów obwodowych Drosophila za pomocą sortowania kulkami magnetycznymi. Technika ta umożliwia badanie układu nerwowego w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Yuh-Nung Janowi oraz dr. Wesowi Grueberowi za udostępnienie szczepów much wykorzystanych w niniejszym badaniu. Autorzy dziękują Thomas F. and Kate Miller Jeffress Memorial Trust za wsparcie tych badań (D.N.C.) oraz Biuru Prorektora George Mason University (E.P.R.I.).

Uwagi ogólne dotyczące sortowania magnetycznego neuronów obwodowych Drosophila (całkowity czas wykonania protokołu: 2,5-3 godziny)
Należy przez cały czas przestrzegać standardowych procedur laboratoryjnych mających na celu utrzymanie czystego środowiska wolnego od RNaz, aby zapobiec degradacji RNA.
Kiedy kutykula larwy Drosophila zostaje poddana sekcji i umieszczona w buforze do dysocjacji komórek, neurony obwodowe są jednymi z ostatnich komórek odrywających się od kutykuli. Wykorzystaliśmy tę właściwość i opracowaliśmy niniejszy protokół, aby usunąć większość nieswoistych komórek z kutykuli, takich jak tkanka mięśniowa i tłuszczowa, przed izolacją neuronów da.
Dzięki praktyce cały protokół można pomyślnie zrealizować w ciągu około 2,5 godziny. Przygotowanie kulek pokrytych przeciwciałami musi zostać zakończone przed rozpoczęciem eksperymentu.
1. Przygotowanie kulek magnetycznych do wiązania komórek:
Ten krok należy wykonać przed rozpoczęciem eksperymentu. Przygotowane koraliki można przechowywać w temperaturze 4°C do momentu ich użycia.
<ol>
 <li>Przemyć 100 μl kulek Dynabeads M-280 pokrytych streptawidyną trzykrotnie w PBS, resuspendując je w 500 μl świeżego PBS i każdorazowo pelletując w silnym polu magnetycznym.</li>
 <li>Na koniec resuspendować kulki bezpośrednio w 100 μl nierozcieńczonego biotynilowanego przeciwciała szczurzego anty-mysiego CD8a (stężenie przeciwciała wynosi 100 μg/ml).</li>
 <li>Inkubować mieszaninę przez 1 godzinę na lodzie, sporadycznie delikatnie mieszając w wortexie, aby zapobiec sedymentacji. [1 μl Dynabeads M-280 może związać 0,05-0,10 μg biotynilowanego przeciwciała].</li>
 <li>Przemyć mieszaninę kulek z przeciwciałami trzykrotnie zgodnie z opisem w kroku 1.1, aby usunąć nadmiar przeciwciał. Kulki magnetyczne są teraz pokryte przeciwciałami i gotowe do użycia. Przechowywać mieszaninę kulek z przeciwciałami w 100 μl 1X PBS w temperaturze 4°C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Wybór i płukanie larw: (10-15 minut)
 <ol>
 <li>Odbierz 30-50 larw trzeciego stadium o zbliżonym wieku i umieść je w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,6 ml zawierającej 1-1,2 ml 1X soli fizjologicznej fosforanowej (PBS). (3-5 minut)</li>
 <li>Zamknij probówkę i wymieszaj ją na wortexie z maksymalną prędkością trzy razy przez 1 sekundę za każdym razem.</li>
 <li>Za pomocą wypalanej pipety Pasteura całkowicie odlej nadsącz. Powtórz etapy płukania (2.1) i mieszania na wortexie (2.2) 3-4 razy, aż nadsącz będzie wyraźnie wolny od cząstek pokarmu i zanieczyszczeń.</li>
 <li>Krótko powtórz płukanie przy użyciu 1 ml 70% etanolu, a następnie odlej nadsącz.</li>
 <li>Przepłucz larwy dwukrotnie 1 ml ddH2O i odlej nadsącz.</li>
 <li>Krótko powtórz płukanie jeszcze raz przy użyciu 1 ml RNase-AWAY, a następnie odlej nadsącz.</li>
 <li>Przepłucz larwy trzy razy w 1 ml ddH2O, aby zapewnić całkowite usunięcie RNase-AWAY.</li>
</ol>
3. Disekcja: (10-12 minut)
<ol>
 <li>Umieść 10-12 larw w centrum 35-milimetrowej płytki Petri powlekanej Sylgardem. Rozmieść je w niewielkich odstępach od siebie. [Krok krytyczny: Odrzuć wszystkie larwy, które wydają się nie być na odpowiednim etapie rozwoju]</li>
 <li>U wszystkich larw przetnij przedni koniec ciała za pomocą cienkich nożyczek do sekcji.</li>
 <li>Używając tępych pincet Dumont nr 5, wywiń larwy na drugą stronę. Wsuń jedną pincetę do wnętrza kutykuli larwy aż do końca tylnego odcinka ciała. Zaciśnij końcówki pincety, aby uchwycić tylny koniec kutykuli (Rysunek 1a) (można spróbować docisnąć kutykulę do powierzchni Sylgardu, aby ułatwić ten proces). Drugą pincetą wypchnij kutykulę larwy na zewnątrz. [Krok krytyczny: Przed przystąpieniem do eksperymentu z izolacją komórek warto kilkakrotnie przećwiczyć tę metodę. Należy dążyć do całkowitego wywinięcia larw, aby upewnić się, że wszystkie miękkie tkanki są wystawione na działanie roztworu w celu łatwej dysocjacji.]</li>
 <li>Po zsekcjonowaniu 3-4 larw natychmiast przenieś je do świeżego, lodowatego PBS (umieść probówkę na lodzie) w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,6 ml.</li>
 <li>Powtarzaj kroki 3.1 do 3.4, aż do momentu zebrania wszystkich wymaganych larw (w tym protokole od 30 do 40 larw). [Krok krytyczny: Należy przewidzieć stratę na poziomie 10-20% podczas sekcji i dysocjacji i odpowiednio zaplanować liczbę próbek.]</li>
 </ol>
4. Usuwanie słabo przylegających komórek nieswoistych: (2-3 minuty)
 [Ten krok ułatwia usunięcie słabo przylegających tkanek nieswoistych, takich jak ciała tłuszczowe i OUN.]
<ol>
<li>Wziąć probówkę do wirówki o pojemności 1,6 ml zawierającą odwrócone kutykule larwalne i zastąpić supernatant około 700-800 μl świeżego, lodowatego PBS.</li>
<li>Wymieszać zawartość probówki w wstrząsającym wirówce (vortex) w trybie pulsacyjnym 5 razy (3 sekundy na puls) przy pełnej prędkości.</li>
<li>Odlać supernatant i zastąpić go około 700-800 μl świeżego, lodowatego PBS.</li>
<li>Powtórzyć kroki 4.2 i 4.3 trzy razy.</li>
<li>Resuspender kutykule larwalne w 400 μl świeżego, lodowatego PBS.</li>
</ol>
5. Dysocjacja tkanki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek: (18-20 minut)
[Krok krytyczny: Nadmierna dysocjacja może spowodować utratę markerów powierzchniowych komórek, co prowadzi do niskiej wydajności i słabej żywotności komórek. Tkankę larwalną można dysocjować za pomocą dysocjacji mechanicznej (sonikacja, dounce), enzymatycznej (trypsyna, kolagenaza itp.) lub kombinacji obu tych metod. Ponieważ tkanki larwalne są trudne do dysocjacji, ustaliliśmy, że połączenie dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej daje najlepsze rezultaty.]
<ol>
 <li>Dodaj 1,5 μl 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch units/vial) do kutykuli larwalnej zawieszonej w 400 μl PBS.</li>
 <li>Wymieszaj roztwór w vortexerze 2-3 razy po 1 sekundzie na maksymalnym ustawieniu (powinno to usunąć słabo przylegające komórki z kutykuli do roztworu).</li>
 <li>Inkubuj roztwór w temperaturze pokojowej (22-25°C) przez 5 minut. [Kluczowy krok: Czas inkubacji ma ogromny wpływ na końcową wydajność sortowania komórek. Zalecany czas inkubacji powinien być wystarczający do rozluźnienia tkanki. Nie przekraczaj 15 minut.]</li>
 <li>Wymieszaj probówkę w vortexerze pulsacyjnie 20-30 razy na maksymalnych ustawieniach, przez 2 sekundy na każdy puls przy pełnej prędkości. Powinno to uwolnić mięśnie i inne tkanki do roztworu. Na każdym etapie badaj małą próbkę roztworu pod fluorescencyjnym stereomikroskopem. (Z doświadczeniem powinno być możliwe określenie stopnia dysocjacji poprzez bezpośrednią obserwację probówki do mikrocentryfugi pod stereomikroskopem z funkcją fluorescencji).</li>
 <li>Przemyj kutykule larwalne 2-3 razy świeżym, schłodzonym do temperatury lodu PBS, a następnie zawieś je w 500 μl świeżego, schłodzonego do temperatury lodu PBS zawierającego 1% BSA.</li>
 <li>Aby zapobiec przywieraniu kutykuli larwalnej do szklanej powierzchni 2 ml homogenizatora tkanek Kontes i szerokiego tłuczka, pokryj uprzednio homogenizator i tłuczek roztworem 1% BSA w PBS, a po krótkim płukaniu wylej roztwór BSA. Następnie, używając wypalanej pipety Pasteura, przenieś kutykule z kroku 5.5 do pokrytego BSA homogenizatora. [Kluczowy krok: Wychłodź homogenizator i tłuczek, umieszczając je na lodzie przez kilka minut, aby zapobiec uszkodzeniu lub lizie komórek].</li>
 <li>Homogenizuj tkankę wolnymi i jednostajnymi ruchami, unikając pienienia (około 20-30 ruchów). [Kluczowy krok: Homogenizuj powoli i jednostajnie, w przeciwnym razie komórki mogą ulec lizie.]</li>
 <li>Aby ocenić stopień dysocjacji komórek, przetrzyj zewnętrzną ściankę homogenizatora czystą chusteczką Kimwipe i obejrzyj ją pod fluorescencyjnym stereomikroskopem. Neurony powinny oddzielić się od kutykuli i być widoczne w roztworze. Jeśli jest to trudne, można alternatywnie pobrać pipetą małą próbkę roztworu i zbadać ją pod fluorescencyjnym stereomikroskopem. Dobrym wskaźnikiem dysocjacji komórek jest brak neuronów w kutykuli larwalnej. Jeśli jednak nadal obserwuje się neurony przytwierdzone do kutykuli lub niedysocjowane całkowicie komórki, kontynuuj homogenizację do momentu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
 <li>Wykonaj triturację roztworu 5 razy wypalaną pipetą Pasteura, której końcówka została zwężona do około 50% standardnej średnicy, a następnie 10 razy pipetą Pasteura zwężoną do około 25% standardnej średnicy. [Kluczowy krok: Zbyt gwałtowna trituracja może uszkodzić komórki. Monitoruj stan komórek pomiędzy etapami i odpowiednio dostosuj procedurę].</li>
 <li>Przefiltruj roztwór przez filtr komórkowy 30 μm i zbierz filtrat komórkowy do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,6 ml. Otrzymany roztwór powinien stanowić zawiesinę pojedynczych komórek i jest teraz gotowy do magnetycznego sortowania komórek.</li>
 </ol>
6. Sortowanie komórek za pomocą kulek magnetycznych: (45 – 75 minut, w zależności od czasu inkubacji z przeciwciałem)
<ol>
<li>Dodaj 15 μl kulek magnetycznych powlekanych przeciwciałami do 500 μl zawiesiny komórkowej (krok 5.10). Pozostałe kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami można przechowywać do czasu kolejnych izolacji komórek.</li>
 <li>Inkubuj komórki z kulkami magnetycznymi powlekanymi przeciwciałami przez 30-60 minut na lodzie, sporadycznie mieszając ręcznie. [Krok krytyczny: Inkubacja w wyższej temperaturze lub przez dłuższy czas może prowadzić do niespecyficznego wiązania przeciwciał.] </li>
 <li>Umieść probówkę do mikrowirówki w silnym polu magnetycznym na 2 minuty. Wszystkie komórki wyselekcjonowane pozytywnie wraz z niewiązanymi kulkami oddzielą się przy ściance probówki. </li>
 <li>Powoli odpipetuj nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. </li>
 <li>Przemyj komórki 3-4 razy świeżym, schłodzonym do temperatury lodowej PBS, aby usunąć pozostałe niespecyficzne komórki. </li>
 <li>Resuspenduj komórki w 30 μl świeżego, schłodzonego do temperatury lodowej PBS.</li>
 <li>Aby oszacować czystość i wydajność uzyskania komórek, nanieś 5 μl zawiesiny komórkowej na wypolerowaną powierzchnię komory licznikowej (hemocytometru) i policz wszystkie widoczne fluorescencyjne komórki pod fluorescencyjnym stereomikroskopem. Sprawdź również liczbę komórek niefluorescencyjnych oraz wszelkie oznaki zanieczyszczeń. Zazwyczaj próbka będzie silnie wzbogacona w komórki fluorescencyjne. </li>
 </ol>
7. Izolacja RNA z komórek sortowanych za pomocą kulek magnetycznych: (60 – 75 minut)
<ol>
 <li>Po policzeniu komórek należy je sgranulować w polu magnetycznym, odrzucić nadsącz i dodać 20 μl buforu do ekstrakcji z zestawu PicoPure™ RNA Isolation Kit (Molecular Devices). W zależności od liczby komórek może być konieczne dodanie większej objętości buforu do ekstrakcji.</li>
 <li>Przemieszać zawartość probówki w wstrząsarze Vortex z maksymalną prędkością, aby umożliwić wymieszanie granulatu komórek z buforem do ekstrakcji.</li>
 <li>Inkubować probówkę w temperaturze 42°C przez 30 minut.</li>
 <li>Aby zapewnić usunięcie kulek magnetycznych przed oczyszczaniem RNA na kolumnie (patrz krok 7.5), probówkę należy krótko odwirować przy 2,000 (x) g przez 2 minuty w celu sgranulowania kulek magnetycznych. Następnie probówkę umieszcza się w silnym polu magnetycznym w celu zatrzymania granulatu, a nadsącz przenosi do nowej probówki do mikrocentryfugi.</li>
 <li>Wyekstrahować i oczyścić RNA na kolumnie zgodnie z instrukcją producenta zestawu PicoPure RNA extraction kit. Opracowanie DNaza jest opcjonalne i może zostać przeprowadzone na kolumnie podczas oczyszczania RNA, zależnie od wymagań analizy. Na koniec eluować związane całkowite RNA w małej objętości (11-30 μl) buforu do elucji i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia. W razie potrzeby można pobraćアリkot 1 μl do oceny jakości całkowitego RNA za pomocą urządzenia Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.).</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Do izolacji neuronów da Drosophila wykorzystano sortowanie za pomocą kulek magnetycznych (Rycina 1). RNA oczyszczone z tych izolowanych neuronów da (Rycina 2a) charakteryzowało się doskonałą jakością, co potwierdziła obecność ostrych pików rybosomalnego RNA 5.8S, 18S i 28S podczas analizy na Bioanalyzerze Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc.) (Rycina 2b). Rozpoczynając od 30-40 larw trzeciego stadium rozwojowego, byliśmy w stanie wyizolować średnio 300-500 neuronów da klasy IV przy użyciu drivera ppk-GAL4 oraz 1500-2000 neuronów da (klasy I, II, III i IV) przy użyciu pan-da neuron-specyficznego drivera GAL421-7. Aby ocenić specyficzne dla neuronów wzbogacenie wyizolowanych komórek, przeprowadziliśmy ilościową reakcję PCR z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) z użyciem dwóch markerów specyficznych dla genów neuronalnych (elav i futsch). Analizy te wykazały znaczący wzrost krotności wzbogacenia obu genów markerowych, co wskazuje na wysoką specyficzność wzbogacenia neuronów da w porównaniu z frakcją przepływową otrzymaną przy zastosowaniu naszego protokołu (Rycina 3). Ostatecznie wyizolowane RNA z neuronów pan-da oraz neuronów da klasy IV wykorzystano do profilowania ekspresji transkrypcyjnej na mikrotablicach oligo całego genomu Drosophila melanogaster firmy Agilent (4 x 44K) (Rycina 4). Analizy te zidentyfikowały liczne wcześniej opisane regulatory morfogenezy dendrytów neuronów da, a także szeroki wachlarz wcześniej nieopisanych cząsteczek i domniemanych szlaków transdukcji sygnału, które potencjalnie pełnią istotne role funkcjonalne w rozwoju neuronów da. Obecnie prowadzone są badania mające na celu ocenę potencjalnej roli tych nieopisanych wcześniej cząsteczek w pośredniczeniu rozwoju neuronów da, a w szczególności morfogenezy dendrytów.
<img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" alt="Schemat procesu ekstrakcji DNA, ilustrujący metodę krok po kroku oraz wyniki izolacji zawartości komórkowej." data-altupdatedat="1787630408000"> Rycina 1: Schemat sortowania magnetycznego neuronów da Drosophila. (a) Larwy trzeciego stadium o tym samym wieku, niosące specyficzny dla neuronów da transgen reporterowy GAL4,UAS-mCD8-GFP, są preparowane poprzez wywinięcie kutykuli larwalnej na drugą stronę w celu odsłonięcia PNS na bufor dysocjujący i przechowywane w lodowatym PBS. (b) Dysocjacja enzymatyczna jest przeprowadzana poprzez dodanie Liberase Blendzyme 3 do roztworu zawierającego kutykulę larwalną. (c) Tkanki larwalne są dalej dysocjowane poprzez kombinację wortexowania, tryturacji i douncingu w celu usunięcia niespecyficznie znakowanych tkanek, takich jak ciała tłuszczowe, jelito i CNS. (d,e) Komórki są następnie filtrowane za pomocą filtra komórkowego 30 μm. Roztwór zawiera zawiesinę pojedynczych komórek różnych typów, w tym nabłonka, mięśni i neuronów. (f) Do zawiesiny komórkowej dodaje się Dynabeads M-280 pokryte przeciwciałem anty-mysim CD8a i inkubuje na lodzie przez 30-60 minut. (g) Kuleczki magnetyczne wiążą się z neuronami da, które wykazują ekspresję białka fuzyjnego GFP znakowanego mysim CD8. (h,i) Komórki pokryte kuleczkami magnetycznymi są oddzielane poprzez umieszczenie roztworu w silnym polu magnetycznym. Nadpłyn jest odrzucany, a komórki są przemywane trzy razy w celu usunięcia wszelkich pozostałych niespecyficznych komórek, co skutkuje (j) wysoko oczyszczonymi populacjami neuronów da. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć większą wersję ryciny 1.
<img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" alt="Schemat wzoru dyfrakcyjnego i wykres XRD przedstawiający analizę pików w celu charakterystyki materiału." data-altupdatedat="1787630408000"> Rysunek 2: (a) Reprezentatywny obraz pozytywnie wyselekcjonowanych, fluorescencyjnych GFP neuronów da klasy IV wyizolowanych poprzez dysocjację komórek i sortowanie za pomocą kulek magnetycznych. Ustalono, że otrzymana populacja neuronów jest silnie wzbogacona w neurony da klasy IV, z niewielką ilością lub brakiem zanieczyszczeń innymi komórkami. (b) Elektroferogram z analizatora Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) całkowitego RNA wyizolowanego z sortowanych kuleczkami magnetycznymi neuronów da, wykazujący doskonałą jakość całkowitego RNA, co potwierdza obecność rRNA 5.8S, 18S i 28S. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć większą wersję rysunku 2.
<img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" alt="Wykres słupkowy krotności wzbogacenia markerów neuronalnych, porównanie Elav i Futsch, analiza danych." data-altupdatedat="1787630408000"> Rycina 3: Analizę qRT–PCR ekspresji genów markerów neuronalnych w izolowanych neuronach da (GAL421-7,UAS-mCD8-GFP) oraz w frakcji przepływowej wykonano w trzech powtórzeniach. Poziomy ekspresji dwóch specyficznych markerów neuronalnych (elav i futsch) oceniono za pomocą qRT–PCR. Wartości uzyskane z tych analiz znormalizowano względem kontroli endogennej (rp49), a poziomy względne do tych zaobserwowanych w frakcji przepływowej obliczono metodą ΔΔCτ6. Zarówno elav, jak i futsch były znacznie wzbogacone w populacji izolowanych neuronów da w porównaniu z frakcją przepływową.
<img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" alt="Zielony wzór kodu macierzy, cyfrowy przepływ danych, analiza kryptograficzna, diagram wizualizacji danych." data-altupdatedat="1787630408000"> Rycina 4: Reprezentatywny plik obrazu z mikromacierzy z użyciem znacznika Cy3, specyficzny dla neuronów da klasy IV. Przedstawiono tutaj pełnogenomową mikromacierz oligo *Drosophila melanogaster* marki Agilent (4 x 44K) zhybrydyzowaną z całkowitym RNA znakowanym Cy3, wyizolowanym z neuronów da klasy IV oczyszczonych metodą sortowania za pomocą kulek magnetycznych. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 4.

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

Przedstawiony tutaj protokół został zoptymalizowany pod kątem izolacji i oczyszczania neuronów obwodowych, które ściśle przylegają do wewnętrznej powierzchni kutykuli larwy Drosophila w trzecim stadium rozwojowym, z wykorzystaniem strategii sortowania komórek za pomocą kulek magnetycznych. Choć w tym protokole wykorzystaliśmy go do specyficznej izolacji neuronów da Drosophila, można go zaadaptować do izolacji innych typów komórek przylegających do kutykuli w stadiach larwalnych lub poczwarkowych (np. nabłonka, mięśni, in...

<table><tbody><tr><td>10X roztwór soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS)</td><td>MP Biomedicals</td><td>PBS10X02</td><td>Rozcieńczone do 1X roztworu roboczego</td></tr><tr><td>10X Liberase Blendzyme 3</td><td>Grupa Roche</td><td>11814176001</td><td>Rozcieńczone do 1X roztworu roboczego (28 W&amp;#252;jednostek/fiolkę)</td></tr><tr><td>RNase-AWAY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowane przeciwciało szczurze anty-mysie CD8a</td><td>Invitrogen</td><td>MCD0815</td><td>100 &amp;#x03BC;stężenie roztworu zapasu w g/ml</td></tr><tr><td>BSA (albumina surowicy bydlęcej), frakcja V</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11018-017</td><td>Przygotować 1% roztwór BSA w PBS</td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>11205D</td><td>1 &amp;#x03BC;może wiązać 0,05–0,10 &amp;#x03BC;g biotynilowanego przeciwciała</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA PicoPure</td><td>Molecular Devices</td><td>KIT0204</td><td>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta&amp;rsquo;instrukcje</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;tytuł_jove&quot;&gt;Sprzęt&lt;/p&gt;&lt;ul&gt; &lt;li&gt;(10) Neodymowe magnesy blokowe (K &amp;amp; J Magnetics, Inc., kat. nr B444B), alternatywnie DynaMag&amp;#8482;Można zastosować -2 (Invitrogen, kat. nr 123-21D). &lt;/li&gt; &lt;li&gt;szkło do rozcierania tkanek Kontes, pojemność robocza 2 ml, z tłuczkiem o dużym prześwicie (Kat. nr 885300-0002)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Filtry do komórek, np. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, kat. nr 130-041-407)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;szalki Petri o średnicy 35 mm powlekane Sylgardem (Dow Corning Corporation, nr kat. 3097358-1004)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Narzędzia do sekcji: dwie pary pęset Dumont nr 5 (Fine Science Tools, kat. nr 11251-20)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Mikro-nożyczki do sekcji wiosenne Vannasa (Fine Science Tools, nr kat. 15000-08)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Pipety (P-1000, P-100, P-10) z jednorazowymi końcówkami&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Standardowy hemocytometr do liczenia komórek i oceny czystości preparatu&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Pipety Pasteura z końcówkami polerowanymi ogniowo o standardowej średnicy, zwężone do ok. 50% średnicy standardowej oraz zwężone do ok. 25% średnicy standardowej do tryturacji&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Mikrowirówka stołowa (1-16 000 (x) g)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Wymieszać w wstrząsarce (vortex)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Fluorescencyjny stereomikroskop (w niniejszym protokole zastosowano model Leica MZ16FA)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

izolacja i oczyszczanie neuronów obwodowych drosophila za pomocą sortowania magnetycznego z użyciem kulek

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

TheDrosophilaobwodowy układ nerwowy (PNS) stanowi potężny model do badania złożonych procesów rozwoju neuronów oraz morfogenezy dendrytów na poziomie funkcjonalnym i molekularnym. Aby wspomóc te analizy, opracowaliśmy strategię izolacji podklasy neuronów PNS zwanych neuronami arboryzacji dendrytycznej (da), które są szeroko wykorzystywane do badania morfogenezy dendrytów1,2Neurony te są bardzo trudne do wyizolowania jako czysta populacja, co wynika częściowo z ich niezwykle niskiej liczebności oraz trudno dostępnej lokalizacji pod twardą chitynową kutykulą larwy. Opracowana przez nas nowa metoda pozwala pokonać te trudności i opiera się na szybkim oraz specyficznym wzbogacaniu komórek przy użyciu magnetycznych kulek pokrytych przeciwciałami. W badaniach nad sortowaniem za pomocą kulek magnetycznych wykorzystaliśmy larwy w trzecim stadium rozwoju o tym samym wieku, wykazujące ekspresję białka fuzyjnego GFP z tagiem mysiego CD8 (UAS-mCD8-GFP)3pod kontrolą specyficznych dla neuronów dendrytycznych klasy IV (da)pickpocket (ppk)-GAL4sterownik4dla kontroli pan-da neuron-specyficznego GAL421-7sterownik5Choć niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem izolacji komórek PNS przytwierdzonych do wewnętrznej ściany kutykuli larwy, poprzez zmianę kilku parametrów ten sam protokół można wykorzystać do izolacji wielu różnych typów komórek przytwierdzonych do kutykuli w stadiach larwalnym lub pupalnym rozwoju (np. nabłonków, mięśni, oenocytów itp.) lub innych typów komórek z organów larwalnych, w zależności od wzorca ekspresji specyficznego drivera GAL4. RNA wyizolowane tą metodą charakteryzuje się wysoką jakością i może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach genomicznych, takich jak badania profilowania ekspresji genów metodą mikromacierzy. Podejście to stanowi potężne nowe narzędzie do przeprowadzania badań na wyizolowanychDrosophilaarboryzację dendrytyczną (da) neuronów, dostarczając tym samym nowych informacji na temat molekularnych mechanizmów leżących u podstaw morfogenezy dendrytów.

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji i oczyszczania neuronów obwodowych Drosophila z wykorzystaniem strategii szybkiego sortowania komórek wspomaganego magnetycznymi kulkami. RNA uzyskane z wyizolowanych komórek może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach, w tym w badaniach mikromacierzy.

Izolacja i oczyszczanie neuronów obwodowych Drosophila za pomocą sortowania magnetycznego z użyciem kulek

Obwodowy układ nerwowy (PNS) muchy *Drosophila* stanowi potężny model do badania złożonych procesów rozwoju neuronów oraz dendrytów...

Do izolacji neuronów dopaminergicznych (DA) wykorzystuje się larwy Drosophila posiadające transgen reporterowy fuzji CD8-GFP specyficzny dla neuronów. Larwy poddawane są sekcji poprzez wywinięcie kutykuli na drugą stronę, co odsłania obwodowy układ nerwowy. Wywinięte larwy poddawane są dysocjacji enzymatycznej, a następnie dysocjacji mechanicznej poprzez wstrząsanie w wirówce (vortexing), pipetowanie i rozdrabnianie.Następnie komórki są filtrowane w celu uzyskania jednokomórkowej zawiesiny zawierającej głównie nabłonek, mięśnie i neurony. Do zawiesiny komórkowej dodaje się magnetyczne kulki pokryte przeciwciałami, które wiążą neurony wykazujące ekspresję białka fuzyjnego GFP z tagiem CD8. Na koniec neurony pokryte magnetycznymi kulkami są izolowane poprzez umieszczenie roztworu w silnym polu magnetycznym, co pozwala na uzyskanie wysoko oczyszczonych populacji neuronów.Witam, nazywam się Dan Cox i reprezentuję Katedrę Molekularną i Mikrobiologii w Instytucie Badań Zaawansowanych Krasno na George Mason University. Witam, nazywam się Ish AER z laboratorium dr. Dana Coxa. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji i oczyszczania obwodowych neuronów DLO za pomocą sortowania magnetycznego.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania mechanizmów molekularnych regulujących morfogenezę specyficzną dla klasy oraz prawostronną. Zatem zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wybrać od 30 do 50 larw w stadium trzeciej gwiazdy o tym samym wieku i umieścić je w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1.6 ml zawierającej od 1 do 1.2 ml 1x PBS.Zamknąć probówkę i wymieszać ją na wirówce typu vortex z maksymalnym ustawieniem trzy razy przez jedną sekundę za każdym razem. Używając pipety z końcówką wypaloną w ogniu, całkowicie usunąć nadsącz. Dodać 1 mL PBS i powtórzyć etapy płukania oraz mieszania w vortexie trzy razy, aż nadsącz będzie wyraźnie pozbawiony cząstek pokarmu i zanieczyszczeń.Krótko powtórzyć płukanie za pomocą 1 mL 70% etanolu. Następnie dwa razy wypłukać larwy w 1 mL wody dwukrotnie destylowanej. Na koniec ponownie powtórzyć płukanie w 1 mL roztworu RNase AWAY oraz trzy razy w 1 mL wody dwukrotnie destylowanej, aby całkowicie usunąć RNase AWAY. Larwy są teraz gotowe do sekcji.Umieść od 10 do 12 larw w centrum szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów z powłoką sill guard. Rozmieść je w niewielkich odstępach od siebie i odrzuć wszystkie larwy, które nie wydają się być na odpowiednim etapie rozwoju. Następnie, używając precyzyjnych nożyczek sekcyjnych oraz pęsety Dumont o tępym czubku, rozetnij przedni koniec larw.Numer pięć, pęseta. Wywiń larwy na drugą stronę. Zacznij od wsunięcia jednej pęsety do wnętrza kutykuli larwy, aż do jej końca tylnego.Zaciśnij końcówki pęsety, aby chwycić tylny koniec kutykuli. Dociskanie kutykuli do powierzchni sylgardu ułatwia ten proces. Za pomocą drugiej pęsety wywiń kutykulę larwy na drugą stronę.Należy upewnić się, że larwy są całkowicie odwrócone, tak aby wszystkie miękkie tkanki były wystawione na działanie roztworu w celu łatwej dysocjacji. Przećwicz tę czynność kilka razy przed przystąpieniem do dysocjacji komórek. Po wypreparowaniu trzech do czterech larw należy je natychmiast przenieść do świeżego, lodowatego PBS w probówce do wirówki.Powtarzaj czynność, aż do momentu zebrania wymaganej liczby od 30 do 40 larw, a następnie przystąp do usuwania niespecyficznych komórek. Należy pamiętać, że po przeprowadzeniu sekcji wszystkich larw spodziewane są straty na poziomie 10 do 20% podczas preparowania i asocjacji. Usuń luźno przylegające tkanki niespecyficzne, takie jak ciała tłuszczowe i komórki ośrodkowego układu nerwowego.Należy zastąpić supernatant w probówce zawierającej odwrócone kutykule larwalne od 700 do 800 µL świeżego, lodowatego PBS. Na koniec należy zastosować pulsacyjne mieszanie. Probówkę do wirówki należy wymieszać w wirówce (vortex) pięć razy, stosując impulsy trwające trzy sekundy przy pełnej prędkości.Następnie odlej nadsącz i zastąp go około 700 do 800 µL świeżego, schłodzonego buforu PBS. Powtórz ten krok trzykrotnie, a na koniec resuspenduj kutykule larw w 400 µL świeżego, schłodzonego buforu PBS.Zastosuj zimny PBS przed przejściem do dysocjacji komórek w celu izolacji arboryzacji dendrytycznej lub neuronów larwalnych. Wykorzystaj kombinację dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej. Należy wystrzegać się nadmiernej dysocjacji, która może spowodować utratę markerów powierzchniowych komórek, prowadząc do niskiej wydajności i niskiej żywotności komórek.Rozpocznij dysocjację, dodając 1,5 µL enzymu liase zyme three o stężeniu 1x (28 jednostek na fiolkę) do kutykul larwalnych zawieszonych w 400 µL PBS. Wymieszaj roztwór w wirówce typu vortex dwa do trzech razy przez jedną sekundę przy maksymalnych ustawieniach, aby uwolnić słabo przylegające komórki z kutykul do roztworu.Następnie inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Ponieważ czas inkubacji ma istotny wpływ na końcową wydajność sortowania komórek, nie należy przekraczać 15 minut na koniec impulsu inkubacyjnego.Wymieszaj zawartość probówki w vorteksie od 20 do 30 razy z maksymalną prędkością, stosując impulsy trwające dwie sekundy. Powinno to spowodować uwolnienie mięśni oraz innych nieswoistych tkanek do roztworu. Okresowo sprawdzaj próbkę pod stereo mikroskopem z funkcją fluorescencji, aby ustalić, czy neurony obwodowe są nadal przytwierdzone do kutykuli.Należy sprawdzić niewielką próbkę roztworu, obserwując probówkę do mikrocentryfugi bezpośrednio pod stereomikroskopem z funkcją fluorescencji, aby określić stopień dysocjacji. Czynność tę należy powtarzać na każdym etapie dysocjacji, przerywając wstrząsanie w wirówce (vortexowanie) przed momentem, gdy neurony obwodowe zaczną dysocjować z kutykuli do roztworu. Następnie należy krótko przemyć kutykule larwalne, wymieniając dwa do trzech razy po 1 ml świeżego, lodowatego PBS.I na koniec resuspensja. Zawiesić je w 500 µL świeżego, lodowatego PBS zawierającego 1% BSA. Aby kontynuować mechaniczną dysocjację komórek, użyć dwumililitrowego homogenizatora tkankowego i tłuczka o dużym prześwicie z roztworem 1% BSA w PBS. Po krótkim płukaniu odrzucić roztwór BSA.Zapobiegnie to przywieraniu kutykul larwalnych do szklanych powierzchni. Następnie schłodzić homogenizator tkankowy wraz z tłuczkiem, umieszczając je na lodzie przez kilka minut, aby zapobiec uszkodzeniu lub lizie komórek. Następnie za pomocą wypalanej końcówki pipety przenieść kutykule do homogenizatora tkankowego.Następnie rozetrzyj tkankę powolnymi i jednostajnymi ruchami, unikając spienienia, wykonując około 20 do 30 pociągnięć. Pamiętaj, aby robić to powoli i miarowo. W przeciwnym razie komórki mogą ulec lizie.Aby ocenić stopień dysocjacji komórek, należy przetrzeć ściankę rozcieracza do tkanek czystą chusteczką Kimwipe i obejrzeć próbkę pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Neurony powinny oddzielić się od kutykuli i być widoczne w roztworze. Dobrym wskaźnikiem dysocjacji komórek jest brak neuronów w kutykuli larwy.Jeśli jednak nadal widoczne są neurony przytwierdzone do kutykuli lub w całkowicie dysocjowanych komórkach obserwuje się aglomeraty, należy kontynuować proces, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Kontynuuj dysocjację mechaniczną, używając pipety Pasteura wypalanej nad płomieniem. Zwęż do około 50% średnicy standardowej końcówki, aby przelać roztwór pięciokrotnie, a następnie dziesięciokrotnie za pomocą wypalanej pipety Pasteura.Zwęź końcówkę do około 25% standardowej średnicy. Należy pamiętać, że zbyt silna rotacja może uszkodzić komórki. Monitoruj stan komórek pomiędzy poszczególnymi krokami i odpowiednio dostosuj procedurę.Zakończ proces, filtrując roztwór przez filtr komórkowy 30 µm i zbierz filtrat komórkowy do probówki typu microfuge o pojemności 1,6 ml. Otrzymany roztwór powinien stanowić jednorodne zawiesiny komórek i jest teraz gotowy do magnetycznej separacji komórek. Kulki magnetyczne pokryte przeciwciałem anty-CD8.Przygotowano zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym, a neurony DA wykazują ekspresję białka fuzyjnego CD8-GFP, będącego celem przeciwciała. Sortowanie komórek rozpoczyna się od dodania 15 µL kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami do 500 µL zawiesiny komórkowej. Komórki inkubuje się z kulkami magnetycznymi pokrytymi przeciwciałami od 30 do 60 minut w temperaturze 0°C, sporadycznie mieszając ręcznie; inkubacja w wyższej temperaturze lub przez dłuższy czas może prowadzić do nieswoistego wiązania przeciwciał.Następnie umieść mikroprobówkę w silnym polu magnetycznym na dwie minuty. Wszystkie dodatnio wyselekcjonowane komórki wraz z niepowiązanymi kuleczkami przyłączą się do ścianki probówki; powoli odessać nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego, a następnie przemyć komórki trzy do czterech razy w świeżym, lodowatym PBS. Krok ten usuwa wszelkie pozostałe komórki nieswoiste.Na koniec resuspender komórki w 30 µL świeżego, lodowatego PBS, aby oszacować czystość i wydajność uzyskania komórek. Nanieść pipetą 5 µL zawiesiny komórkowej na wypolerowaną powierzchnię cytometru hematologicznego i policzyć wszystkie widoczne komórki fluorescencyjne pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Należy również ocenić liczbę komórek niewykazujących fluorescencji oraz sprawdzić obecność zanieczyszczeń.Zazwyczaj próbka będzie silnie wzbogacona w komórki fluorescencyjne. Na koniec należy użyć zestawu pico pure RNA isolation kit do izolacji RNA z komórek związanych z kuleczkami. Do posortowanych komórek należy dodać bufor ekstrakcyjny, a następnie usunąć kuleczki za pomocą magnesu przed etapem oczyszczania na kolumnie; jeden mikrolitr wyekstrahowanego RNA należy wykorzystać do oceny jakości całkowitego RNA na urządzeniu Agilent Bioanalyzer 2100.RNA oczyszczone z izolowanych neuronów DA jest doskonałej jakości, o czym świadczy obecność ostrych pików rybosomalnego RNA 5,8 s oraz 28 s podczas analizy w Bioanalizatorze Agilent 2100. Zaczynając od 30. do 43. godziny rozwoju larw, byliśmy w stanie wyizolować średnio od 300 do 500 neuronów DA klasy czwartej przy użyciu drivera PPK gal four oraz od 1500 do 2000 neuronów DA klas 1, 2, 3 i 4. Przy zastosowaniu specyficznego dla neuronów panda drivera gal four, ilościowe R-T-P-C-R z użyciem markerów specyficznych dla neuronów L 11 fch wykazało znaczną krotność wzbogacenia obu, co wskazuje na bardzo specyficzne wzbogacenie neuronów DA przy użyciu zaprezentowanego przez nas protokołu w porównaniu do frakcji przepływowej. W końcu izolowane RNA zarówno z neuronów panda, jak i z neuronów DA klasy czwartej zostało wykorzystane do profilowania ekspresji transkrypcyjnej na mikromacierzach oligo całego genomu Agilent Drosophila Melanogaster, co pozwoliło na zidentyfikowanie wielu czynników zaangażowanych w morfogenezę neuronów DA.Przedstawiliśmy sposób izolacji i oczyszczania obwodowych neuronów drosofil we wczesnym stadium trzeciego przyrzostu larwy za pomocą sortowania magnetycznego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zrównoważenie etapów dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej. Nadmierna dysocjacja enzymatyczna może prowadzić do degradacji markerów powierzchniowych CD8, co skutkuje nieefektywnym lub nieudanym sortowaniem komórek.Ważne jest również utrzymanie warunków wolnych od RNaz podczas całej procedury, aby zachować integralność oczyszczonego RNA z izolowanych neuronów. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.

isolation-purification-drosophila-peripheral-neurons-magnetic-bead

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i oczyszczanie Drosophila Neuronów obwodowych przez sortowanie magnesowymi perłami

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji aktywnej, pełnowymiarowej kinezyny z embrionów Drosophila do biofizycznych badań pojedynczych cząsteczek. Przedstawiamy sposób zbierania embrionów, przygotowania lizatu embrionalnego, a następnie polimeryzacji mikrotubul (MT). Kinezynę oczyszcza się poprzez jej unieruchomienie na mikrotubulach, odwirowanie kompleksów kinezyna-MT, a następnie uwolnienie kinezyny z mikrotubul poprzez dodanie ATP.

Izolacja i oczyszczanie kinezyny z embrionów Drosophila

Ten film demonstruje metodę izolowania pierwotnych komórek oligodendrocytów z zawiesiny komórek nerwowych uzyskanej od mysiego szczeniaka za pomocą separacji magnetycznej. Technika ta wykorzystuje kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami specyficznymi dla antygenów oligodendrocytów, co umożliwia selektywną izolację tych komórek.

Izolowanie mysich pierwotnych oligodendrocytów za pomocą kulek immunomagnetycznych

Ten film demonstruje protokół ekstrakcji komórek mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgach myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek. Protokół obejmuje preparację uszkodzonej tkanki mózgowej zawierającej komórki mikrogleju, potraktowanie tkanki określonymi enzymami w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki oraz wykorzystanie kulek magnetycznych specyficznych dla receptora mikrogleju do wyizolowania komórek mikrogleju.

Izolowanie mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgu myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Tkanki Drosophila często zawierają niejednorodną mieszaninę typów komórek. Aby zbadać ekspresję genów w określonych typach komórek z danej tkanki, jądra mogą być genetycznie znakowane, a następnie izolowane przy użyciu podejścia opartego na powinowactwie. Wyizolowane jądra mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak analiza ekspresji genów i immunoprecypitacja chromatyny.

Izolacja oznaczonych jąder z tkanek Drosophila w oparciu o powinowactwo do analizy ekspresji genów

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Neurony czuciowe specyficzne dla narządów są trudne do zidentyfikowania. Szybkie śledzenie niebieskie służy do identyfikacji neuronów bez dawki unerwiających drogi oddechowe w celu sortowania komórek. Posortowane neurony bez dawki są używane do ekstrakcji wysokiej jakości kwasu rybonukleinowego (RNA) do sekwencjonowania. Za pomocą tego protokołu określa się ekspresję genów neuronów specyficznych dla dróg oddechowych.

Metoda celowania i izolowania neuronów czuciowych unerwiających drogi oddechowe u myszy

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Tutaj prezentujemy protokół dysocjacji komórek do efektywnego izolowania komórek obecnych w niskiej obfitości w systemie wzrokowym Drosophila poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS).

Oczyszczanie komórek o niskiej liczebności w układzie wzrokowym Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

Opisujemy protokół izolowania komórek mikrogleju z podwzgórza myszy (lub równoważnych małych struktur mózgu) za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek (MACS), w stosunkowo krótkim czasie. Mikroglej podwzgórza sortowany przez MACS może być używany do analizy ex vivo i może być posiany w celu przeprowadzenia testów in vitro.

Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie

Poznaj metodę izolacji i oczyszczania neuronów obwodowych Drosophila za pomocą sortowania kulkami magnetycznymi. Technika ta umożliwia badanie układu nerwowego w neurobiologii.

Izolacja i oczyszczanie neuronów obwodowych Drosophila za pomocą sortowania magnetycznego z użyciem kulek

Przeglądaj więcej filmów