Izolacja i oczyszczanie neuronów obwodowych Drosophila za pomocą sortowania magnetycznego z użyciem kulek

Do izolacji neuronów dopaminergicznych (DA) wykorzystuje się larwy Drosophila posiadające transgen reporterowy fuzji CD8-GFP specyficzny dla neuronów. Larwy poddawane są sekcji poprzez wywinięcie kutykuli na drugą stronę, co odsłania obwodowy układ nerwowy. Wywinięte larwy poddawane są dysocjacji enzymatycznej, a następnie dysocjacji mechanicznej poprzez wstrząsanie w wirówce (vortexing), pipetowanie i rozdrabnianie.

Następnie komórki są filtrowane w celu uzyskania jednokomórkowej zawiesiny zawierającej głównie nabłonek, mięśnie i neurony. Do zawiesiny komórkowej dodaje się magnetyczne kulki pokryte przeciwciałami, które wiążą neurony wykazujące ekspresję białka fuzyjnego GFP z tagiem CD8. Na koniec neurony pokryte magnetycznymi kulkami są izolowane poprzez umieszczenie roztworu w silnym polu magnetycznym, co pozwala na uzyskanie wysoko oczyszczonych populacji neuronów.

Witam, nazywam się Dan Cox i reprezentuję Katedrę Molekularną i Mikrobiologii w Instytucie Badań Zaawansowanych Krasno na George Mason University. Witam, nazywam się Ish AER z laboratorium dr. Dana Coxa. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji i oczyszczania obwodowych neuronów DLO za pomocą sortowania magnetycznego.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania mechanizmów molekularnych regulujących morfogenezę specyficzną dla klasy oraz prawostronną. Zatem zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wybrać od 30 do 50 larw w stadium trzeciej gwiazdy o tym samym wieku i umieścić je w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1.6 ml zawierającej od 1 do 1.2 ml 1x PBS.

Zamknąć probówkę i wymieszać ją na wirówce typu vortex z maksymalnym ustawieniem trzy razy przez jedną sekundę za każdym razem. Używając pipety z końcówką wypaloną w ogniu, całkowicie usunąć nadsącz. Dodać 1 mL PBS i powtórzyć etapy płukania oraz mieszania w vortexie trzy razy, aż nadsącz będzie wyraźnie pozbawiony cząstek pokarmu i zanieczyszczeń.

Krótko powtórzyć płukanie za pomocą 1 mL 70% etanolu. Następnie dwa razy wypłukać larwy w 1 mL wody dwukrotnie destylowanej. Na koniec ponownie powtórzyć płukanie w 1 mL roztworu RNase AWAY oraz trzy razy w 1 mL wody dwukrotnie destylowanej, aby całkowicie usunąć RNase AWAY. Larwy są teraz gotowe do sekcji.

Umieść od 10 do 12 larw w centrum szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów z powłoką sill guard. Rozmieść je w niewielkich odstępach od siebie i odrzuć wszystkie larwy, które nie wydają się być na odpowiednim etapie rozwoju. Następnie, używając precyzyjnych nożyczek sekcyjnych oraz pęsety Dumont o tępym czubku, rozetnij przedni koniec larw.

Numer pięć, pęseta. Wywiń larwy na drugą stronę. Zacznij od wsunięcia jednej pęsety do wnętrza kutykuli larwy, aż do jej końca tylnego.

Zaciśnij końcówki pęsety, aby chwycić tylny koniec kutykuli. Dociskanie kutykuli do powierzchni sylgardu ułatwia ten proces. Za pomocą drugiej pęsety wywiń kutykulę larwy na drugą stronę.

Należy upewnić się, że larwy są całkowicie odwrócone, tak aby wszystkie miękkie tkanki były wystawione na działanie roztworu w celu łatwej dysocjacji. Przećwicz tę czynność kilka razy przed przystąpieniem do dysocjacji komórek. Po wypreparowaniu trzech do czterech larw należy je natychmiast przenieść do świeżego, lodowatego PBS w probówce do wirówki.

Powtarzaj czynność, aż do momentu zebrania wymaganej liczby od 30 do 40 larw, a następnie przystąp do usuwania niespecyficznych komórek. Należy pamiętać, że po przeprowadzeniu sekcji wszystkich larw spodziewane są straty na poziomie 10 do 20% podczas preparowania i asocjacji. Usuń luźno przylegające tkanki niespecyficzne, takie jak ciała tłuszczowe i komórki ośrodkowego układu nerwowego.

Należy zastąpić supernatant w probówce zawierającej odwrócone kutykule larwalne od 700 do 800 µL świeżego, lodowatego PBS. Na koniec należy zastosować pulsacyjne mieszanie. Probówkę do wirówki należy wymieszać w wirówce (vortex) pięć razy, stosując impulsy trwające trzy sekundy przy pełnej prędkości.

Następnie odlej nadsącz i zastąp go około 700 do 800 µL świeżego, schłodzonego buforu PBS. Powtórz ten krok trzykrotnie, a na koniec resuspenduj kutykule larw w 400 µL świeżego, schłodzonego buforu PBS.

Zastosuj zimny PBS przed przejściem do dysocjacji komórek w celu izolacji arboryzacji dendrytycznej lub neuronów larwalnych. Wykorzystaj kombinację dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej. Należy wystrzegać się nadmiernej dysocjacji, która może spowodować utratę markerów powierzchniowych komórek, prowadząc do niskiej wydajności i niskiej żywotności komórek.

Rozpocznij dysocjację, dodając 1,5 µL enzymu liase zyme three o stężeniu 1x (28 jednostek na fiolkę) do kutykul larwalnych zawieszonych w 400 µL PBS. Wymieszaj roztwór w wirówce typu vortex dwa do trzech razy przez jedną sekundę przy maksymalnych ustawieniach, aby uwolnić słabo przylegające komórki z kutykul do roztworu.

Następnie inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Ponieważ czas inkubacji ma istotny wpływ na końcową wydajność sortowania komórek, nie należy przekraczać 15 minut na koniec impulsu inkubacyjnego.

Wymieszaj zawartość probówki w vorteksie od 20 do 30 razy z maksymalną prędkością, stosując impulsy trwające dwie sekundy. Powinno to spowodować uwolnienie mięśni oraz innych nieswoistych tkanek do roztworu. Okresowo sprawdzaj próbkę pod stereo mikroskopem z funkcją fluorescencji, aby ustalić, czy neurony obwodowe są nadal przytwierdzone do kutykuli.

Należy sprawdzić niewielką próbkę roztworu, obserwując probówkę do mikrocentryfugi bezpośrednio pod stereomikroskopem z funkcją fluorescencji, aby określić stopień dysocjacji. Czynność tę należy powtarzać na każdym etapie dysocjacji, przerywając wstrząsanie w wirówce (vortexowanie) przed momentem, gdy neurony obwodowe zaczną dysocjować z kutykuli do roztworu. Następnie należy krótko przemyć kutykule larwalne, wymieniając dwa do trzech razy po 1 ml świeżego, lodowatego PBS.

I na koniec resuspensja. Zawiesić je w 500 µL świeżego, lodowatego PBS zawierającego 1% BSA. Aby kontynuować mechaniczną dysocjację komórek, użyć dwumililitrowego homogenizatora tkankowego i tłuczka o dużym prześwicie z roztworem 1% BSA w PBS. Po krótkim płukaniu odrzucić roztwór BSA.

Zapobiegnie to przywieraniu kutykul larwalnych do szklanych powierzchni. Następnie schłodzić homogenizator tkankowy wraz z tłuczkiem, umieszczając je na lodzie przez kilka minut, aby zapobiec uszkodzeniu lub lizie komórek. Następnie za pomocą wypalanej końcówki pipety przenieść kutykule do homogenizatora tkankowego.

Następnie rozetrzyj tkankę powolnymi i jednostajnymi ruchami, unikając spienienia, wykonując około 20 do 30 pociągnięć. Pamiętaj, aby robić to powoli i miarowo. W przeciwnym razie komórki mogą ulec lizie.

Aby ocenić stopień dysocjacji komórek, należy przetrzeć ściankę rozcieracza do tkanek czystą chusteczką Kimwipe i obejrzeć próbkę pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Neurony powinny oddzielić się od kutykuli i być widoczne w roztworze. Dobrym wskaźnikiem dysocjacji komórek jest brak neuronów w kutykuli larwy.

Jeśli jednak nadal widoczne są neurony przytwierdzone do kutykuli lub w całkowicie dysocjowanych komórkach obserwuje się aglomeraty, należy kontynuować proces, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Kontynuuj dysocjację mechaniczną, używając pipety Pasteura wypalanej nad płomieniem. Zwęż do około 50% średnicy standardowej końcówki, aby przelać roztwór pięciokrotnie, a następnie dziesięciokrotnie za pomocą wypalanej pipety Pasteura.

Zwęź końcówkę do około 25% standardowej średnicy. Należy pamiętać, że zbyt silna rotacja może uszkodzić komórki. Monitoruj stan komórek pomiędzy poszczególnymi krokami i odpowiednio dostosuj procedurę.

Zakończ proces, filtrując roztwór przez filtr komórkowy 30 µm i zbierz filtrat komórkowy do probówki typu microfuge o pojemności 1,6 ml. Otrzymany roztwór powinien stanowić jednorodne zawiesiny komórek i jest teraz gotowy do magnetycznej separacji komórek. Kulki magnetyczne pokryte przeciwciałem anty-CD8.

Przygotowano zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym, a neurony DA wykazują ekspresję białka fuzyjnego CD8-GFP, będącego celem przeciwciała. Sortowanie komórek rozpoczyna się od dodania 15 µL kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami do 500 µL zawiesiny komórkowej. Komórki inkubuje się z kulkami magnetycznymi pokrytymi przeciwciałami od 30 do 60 minut w temperaturze 0°C, sporadycznie mieszając ręcznie; inkubacja w wyższej temperaturze lub przez dłuższy czas może prowadzić do nieswoistego wiązania przeciwciał.

Następnie umieść mikroprobówkę w silnym polu magnetycznym na dwie minuty. Wszystkie dodatnio wyselekcjonowane komórki wraz z niepowiązanymi kuleczkami przyłączą się do ścianki probówki; powoli odessać nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego, a następnie przemyć komórki trzy do czterech razy w świeżym, lodowatym PBS. Krok ten usuwa wszelkie pozostałe komórki nieswoiste.

Na koniec resuspender komórki w 30 µL świeżego, lodowatego PBS, aby oszacować czystość i wydajność uzyskania komórek. Nanieść pipetą 5 µL zawiesiny komórkowej na wypolerowaną powierzchnię cytometru hematologicznego i policzyć wszystkie widoczne komórki fluorescencyjne pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Należy również ocenić liczbę komórek niewykazujących fluorescencji oraz sprawdzić obecność zanieczyszczeń.

Zazwyczaj próbka będzie silnie wzbogacona w komórki fluorescencyjne. Na koniec należy użyć zestawu pico pure RNA isolation kit do izolacji RNA z komórek związanych z kuleczkami. Do posortowanych komórek należy dodać bufor ekstrakcyjny, a następnie usunąć kuleczki za pomocą magnesu przed etapem oczyszczania na kolumnie; jeden mikrolitr wyekstrahowanego RNA należy wykorzystać do oceny jakości całkowitego RNA na urządzeniu Agilent Bioanalyzer 2100.

RNA oczyszczone z izolowanych neuronów DA jest doskonałej jakości, o czym świadczy obecność ostrych pików rybosomalnego RNA 5,8 s oraz 28 s podczas analizy w Bioanalizatorze Agilent 2100. Zaczynając od 30. do 43. godziny rozwoju larw, byliśmy w stanie wyizolować średnio od 300 do 500 neuronów DA klasy czwartej przy użyciu drivera PPK gal four oraz od 1500 do 2000 neuronów DA klas 1, 2, 3 i 4. Przy zastosowaniu specyficznego dla neuronów panda drivera gal four, ilościowe R-T-P-C-R z użyciem markerów specyficznych dla neuronów L 11 fch wykazało znaczną krotność wzbogacenia obu, co wskazuje na bardzo specyficzne wzbogacenie neuronów DA przy użyciu zaprezentowanego przez nas protokołu w porównaniu do frakcji przepływowej. W końcu izolowane RNA zarówno z neuronów panda, jak i z neuronów DA klasy czwartej zostało wykorzystane do profilowania ekspresji transkrypcyjnej na mikromacierzach oligo całego genomu Agilent Drosophila Melanogaster, co pozwoliło na zidentyfikowanie wielu czynników zaangażowanych w morfogenezę neuronów DA.

Przedstawiliśmy sposób izolacji i oczyszczania obwodowych neuronów drosofil we wczesnym stadium trzeciego przyrzostu larwy za pomocą sortowania magnetycznego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zrównoważenie etapów dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej. Nadmierna dysocjacja enzymatyczna może prowadzić do degradacji markerów powierzchniowych CD8, co skutkuje nieefektywnym lub nieudanym sortowaniem komórek.

Ważne jest również utrzymanie warunków wolnych od RNaz podczas całej procedury, aby zachować integralność oczyszczonego RNA z izolowanych neuronów. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.