Disekcja embrionów myszy w 6,5 dniu po zapłodnieniu (dpc)

Nazywam się Kelly Shea, jestem kierownikiem laboratorium oraz technikiem badawczym w laboratorium Neilsena. Jest to bardzo trudne zadanie, ponieważ wiele osób nie wie, jak rozróżnić poszczególne warstwy tkanek. W związku z tym należy w zasadzie odsunąć wszystkie warstwy tkanek, aby odsłonić znajdujący się pod nimi embrion, który na tym etapie nie jest jeszcze silnie unaczyniony. Jest on zatem bardzo przezroczysty i trudno go rozróżnić.

Należy użyć tępych pęset i nożyczek. W pierwszej kolejności należy ucisnąć tkanki zwierzęcia wzdłuż linii pośrodkowej i wykonać pierwsze nacięcie. Następnie od tego miejsca można rozsunąć skórę, odsłaniając jamę brzuszną zwierzęcia.

Za pomocą pęsety należy unieść cienką warstwę otrzewnej, a następnie rozciąć ją nożyczkami i odchylić na bok. Należy wykonać cięcie wzdłuż linii brzusznej zwierzęcia i rozdzielić oba rogi macicy, które są połączone w środku. Można przeciąć je bezpośrednio u nasady.

Prawdopodobnie wraz z tym pobierzecie Państwo dużo tkanki tłuszczowej. Należy pobrać cały róg macicy zwierzęcia i umieścić go bezpośrednio w PBS.

Oto widok wewnątrz rogu. Są to miejsca implantacji: 1, 2, 3, 4, 5. Należy je po prostu od siebie oddzielić.

Można w zasadzie naciąć tkankę pomiędzy miejscami implantacji dokładnie tutaj. Można po prostu chwycić embrion z boku i go rozdzielić. Na tym etapie odsłania się decidua, która jest bardziej gąbczastą tkanką znajdującą się poniżej.

Zatem zarodek powinien znajdować się dokładnie pośrodku, w tym miejscu. Jest to wierzchołek liścienia. Należy go zorientować tak, aby wierzchołek był skierowany do góry.

Należy odciąć wierzchołek w odległości około jednej piątej jego długości. Zarodek powinien znajdować się dokładnie w tym miejscu, w samym środku. Orientuję go poziomo, chwytam jedną parą pincet, przytrzymuję drugą, odcinam końcówkę, a następnie rozdzielam części.

Po zdjęciu zakrętki ustaw zarodek krawędzią do góry. Jak widać, w miejscu usunięcia zakrętki znajduje się otwór. Należy wsunąć tam pęsetę. Tak.

W tym momencie embrion znajduje się bardzo luźno wewnątrz blastodermy. Po rozwarciu blastodermy można go w zasadzie dość łatwo wysunąć, pod warunkiem, że podłoży się narzędzie pod jego podstawę. Jest on bardzo mały.

Do zarodka wciąż przylegają również niektóre tkanki. Znajduje się tutaj stożek pozapłodowy, zlokalizowany bezpośrednio na szczycie zarodka. Pozostałe tkanki są również wciąż przytwierdzone.

Następnie pobieram go za pomocą pipety. Na tym etapie należy utrwalić embriony, dlatego przygotowałem naczynie z PFA.

Chcieliśmy zbadać geny kandydackie. W zasadzie wykorzystujemy techniki hybrydyzacji in situ w preparatach całych (whole mount RNA in situ), aby zwizualizować produkcję kwasów nukleinowych in situ w embrionie. Te konkretne geny, które nas interesują, kodują domniemane markery prekursorów komórek linii płciowej; przewiduje się również, że są one ekspresowane w embrionie myszy w konkretnym punkcie czasowym, co wspomaga rozwój i dojrzewanie komórek linii płciowej z domniemanych prekursorów komórek linii płciowej w dojrzałe komórki linii płciowej.

Jednym z czynników, które nas szczególnie interesują i nad którym jako pierwszym przeprowadziliśmy analizę whole mount in situ na tych embrionach w 6,5 dniu rozwoju, było białko morfogenetyczne kości 4, BMP four. Jest ono członkiem superrodziny TGF-beta. Jest to czynnik bardzo ważny i absolutnie niezbędny w procesie dojrzewania komórek linii zarodkowej.

Konieczne jest również, aby komórki zarodkowe przemieściły się w obrębie zarodka i zlokalizowały się w pobliżu prążka pierwotnego zarodka. BMP4 odgrywa kluczową rolę zarówno w sygnalizacji, jak i w procesie dojrzewania, przez który muszą przejść komórki zarodkowe, aby osiąść w prążku pierwotnym. Dlatego należy po pierwsze upewnić się, że wiadomo, czego się szuka, jak mały jest dany obiekt i w jakiej skali się pracuje, a także usiąść i bardzo starannie zaplanować pracę.

Technika ta, a w szczególności rodzaj używanego mikroskopu stereoskopowego, ma kluczowe znaczenie. Jedną z trudności technicznych jest fakt, że procedura ta wymaga wielu manipulacji i bardzo precyzyjnych, stabilnych ruchów rąk, aby nie uszkodzić embrionu. Należy zatem korzystać z mikroskopu stereoskopowego zapewniającego dużą przestrzeń roboczą oraz upewnić się, że wszystkie niezbędne do eksperymentu elementy są przygotowane, aby ograniczyć liczbę manipulacji podczas sekcji do niezbędnego minimum.

Poza tym uważam, że należy robić to bardzo powoli i bardzo ostrożnie oddzielać poszczególne warstwy tkanek, aby dokładnie wiedzieć, z czym się pracuje. Należy również upewnić się, gdzie znajduje się embrion.