Name: Sekcja zarodków myszy o gęstości 6,5 dpc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę izolacji zarodków myszy w stadium primitivnej smugi (~6,5 dpc) do badań nad ekspresją genów i decyzjami komórkowymi. Technika ta umożliwia precyzyjne badania biologii rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Disekcja organów rozrodczych samicy myszy
<ol>
<li>Zabieg eutanazji ciężarnych zwierząt przeprowadza się poprzez uduszenie CO2 przy użyciu gazu sprężonego. </li>
<li>Zwierzę ułożyć na plecach na podkładce chłonnej i nasączyć 70% etanolem, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia preparatu sierścią myszy. </li>
<li>Ucisnąć skórę i wykonać regularnymi nożyczkami chirurgicznymi niewielkie nacięcie poprzeczne wzdłuż linii środkowej. Mocno chwycić skórę powyżej i poniżej nacięcia, a następnie rozsunąć ją w stronę głowy i ogona, aby odsłonić jamę brzuszną. </li>
<li>Chwycić otrzewną pęsetą i rozciąć ją, aby odsłonić jamę brzuszną. </li>
<li>Zlokalizować narządy rozrodcze w grzbietowej części jamy ciała: dwa rogi macicy, jajowody oraz jajniki. </li>
</ol>
Disekcja na etapie prążka pierwotnego (6,5 dpc)
<ol>
<li>Usunąć róg macicy, chwytając macicę poniżej jajowodu i wycinając ją wzdłuż krezki macicy. Wypreparowaną macicę umieścić w lodowatym PBS. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_7_8_2/160_figure-1.jpg" alt="Morfologia kolonii na płytce agarowej, eksperyment mikrobiologiczny, obserwacja wzrostu bakterii." width="263" height="132" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1 </li>
<li>Oddzielić poszczególne embriony, przecinając róg macicy pomiędzy miejscami implantacji. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_7_8_3/160._figure-2.jpg" alt="Schemat eksperymentu z kulturą tkanek roślinnych przedstawiający proces tworzenia i podziału kalusa." width="575" height="171" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2 </li>
<li>Chwycić mięśniową wyściółkę macicy, wsuwając pęsetę zegarmistrzowską pomiędzy otaczającą warstwę mięśniową a otaczającą tkankę decydualną. Odchylić warstwę mięśniową, odsłaniając decyduę. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_4/160_Figure-3.png" alt="Proces dyssekcji embrionu; obrazy mikroskopowe; badanie biologii rozwoju." width="593" height="166" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3 </li>
<li>Odciąć fragment odsłoniętej decyduy w okolicy wierzchołka (około 1/5 tkanki decydualnej), co odsłoni środkową część brzuszna lub dystalny koniec zamkniętego w niej embrionu. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_5/160_Figure-4.png" alt="Dyssekcja kultury tkankowej przy użyciu pęsety, obraz mikroskopowy do badań analizy mikroskopowej." width="589" height="212" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4 </li>
<li>Embrion można wydobyć za pomocą końcówek pęsety. Przebić decyduę pęsetą wokół embrionu, a następnie rozchylić pęsetę, aby rozerwać decyduę. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_6/160_Figure-5.png" alt="Proces mikroiniekcji komórek, układ eksperymentalny, obraz mikroskopowy, wprowadzanie materiału genetycznego." width="249" height="200" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5 </li>
<li>Po usunięciu embrionu może być nadal przytwierdzona błona Reicharta, a także stożek ektoplacentalny (trofoblast). Można przeprowadzić dalszą dyssekcję embrionu poprzez ostrożne preparowanie. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_7/160_Figure-6.png" alt="Obraz mikroskopowy regeneracji planarii, podkreślający zdolności regeneracyjne płazińców." width="356" height="222" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 6"> Rysunek 6 </li>
</ol>

<ol><li>Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).</li>
</ol>

Implantacja u myszy następuje między 4,5 dpc a narodzinami. Opisaną metodę sekcji można zastosować w sposób niemal identyczny do izolacji embrionów w wcześniejszych lub późniejszych stadiach rozwoju, między 5,5 a 8,5 dpc.

<table><tbody><tr><td>Mikropinceta do sekcji, ząbkowana, prosta</td><td>Narzędzie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5130</td><td>2 pary</td></tr><tr><td>Mikropinceta do sekcji wzór #55 INOX</td><td>Narzędzie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td>2 pary</td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny Dulbecco&amp;rsquo;s (1x)</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna szalka Petri z polistyrenu Fisherbrand</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd w PBS</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proste nożyczki do sekcji z ostrymi końcami</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Ciężarne myszy</td><td>Zwierzę</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

disekcja embrionów myszy w 6,5 dniu po zapłodnieniu (dpc)

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analiza wzorców ekspresji genów podczas wczesnych etapów rozwoju embrionalnego ssaków może dostarczyć istotnych wskazówek dotyczących funkcji genów, oddziaływań międzykomórkowych oraz mechanizmów sygnalizacyjnych, które kierują formowaniem się wzorców embrionalnych. Jednak wypreparowanie zarodka myszy z błony desidualnej krótko po implantacji może być procedurą trudną, a brakuje szczegółowej dokumentacji tego procesu krok po kroku.

W niniejszym materiale demonstrujemy sposób izolacji embrionów po implantacji (6,5 dpc), polegający najpierw na wycięciu macicy u ciężarnej myszy (wykrycie czopa pochwowego uznano za dzień 0,5 post coitum), a następnie na wyseparowaniu embrionu z decidua macierzystej. Opisano również dyssekcję błony Reicherta oraz usunięcie stożka ektoplacentalnego.

Izolacja embrionów w stadium poimplantacyjnym umożliwia badanie wzorców ekspresji genów oraz analizę procesów podejmowania decyzji dotyczących linii komórkowych podczas rozwoju embrionalnego, jednak prawidłowa dysekcja wczesnego embrionu może być trudna. Niniejszy protokół opisuje metodę izolacji wczesnych embrionów w stadium prążka pierwotnego (~6,5 days post coitum [dpc]).

Disekcja embrionów myszy w 6,5 dniu po zapłodnieniu (dpc)

Analiza wzorców ekspresji genów we wczesnych etapach rozwoju embrionalnego ssaków może dostarczyć istotnych wskazówek na temat funkcji genów oraz oddziaływań międzykomórkowych...

Nazywam się Kelly Shea, jestem kierownikiem laboratorium oraz technikiem badawczym w laboratorium Neilsena. Jest to bardzo trudne zadanie, ponieważ wiele osób nie wie, jak rozróżnić poszczególne warstwy tkanek. W związku z tym należy w zasadzie odsunąć wszystkie warstwy tkanek, aby odsłonić znajdujący się pod nimi embrion, który na tym etapie nie jest jeszcze silnie unaczyniony. Jest on zatem bardzo przezroczysty i trudno go rozróżnić.Należy użyć tępych pęset i nożyczek. W pierwszej kolejności należy ucisnąć tkanki zwierzęcia wzdłuż linii pośrodkowej i wykonać pierwsze nacięcie. Następnie od tego miejsca można rozsunąć skórę, odsłaniając jamę brzuszną zwierzęcia.Za pomocą pęsety należy unieść cienką warstwę otrzewnej, a następnie rozciąć ją nożyczkami i odchylić na bok. Należy wykonać cięcie wzdłuż linii brzusznej zwierzęcia i rozdzielić oba rogi macicy, które są połączone w środku. Można przeciąć je bezpośrednio u nasady.Prawdopodobnie wraz z tym pobierzecie Państwo dużo tkanki tłuszczowej. Należy pobrać cały róg macicy zwierzęcia i umieścić go bezpośrednio w PBS.Oto widok wewnątrz rogu. Są to miejsca implantacji: 1, 2, 3, 4, 5. Należy je po prostu od siebie oddzielić.Można w zasadzie naciąć tkankę pomiędzy miejscami implantacji dokładnie tutaj. Można po prostu chwycić embrion z boku i go rozdzielić. Na tym etapie odsłania się decidua, która jest bardziej gąbczastą tkanką znajdującą się poniżej.Zatem zarodek powinien znajdować się dokładnie pośrodku, w tym miejscu. Jest to wierzchołek liścienia. Należy go zorientować tak, aby wierzchołek był skierowany do góry.Należy odciąć wierzchołek w odległości około jednej piątej jego długości. Zarodek powinien znajdować się dokładnie w tym miejscu, w samym środku. Orientuję go poziomo, chwytam jedną parą pincet, przytrzymuję drugą, odcinam końcówkę, a następnie rozdzielam części.Po zdjęciu zakrętki ustaw zarodek krawędzią do góry. Jak widać, w miejscu usunięcia zakrętki znajduje się otwór. Należy wsunąć tam pęsetę. Tak.W tym momencie embrion znajduje się bardzo luźno wewnątrz blastodermy. Po rozwarciu blastodermy można go w zasadzie dość łatwo wysunąć, pod warunkiem, że podłoży się narzędzie pod jego podstawę. Jest on bardzo mały.Do zarodka wciąż przylegają również niektóre tkanki. Znajduje się tutaj stożek pozapłodowy, zlokalizowany bezpośrednio na szczycie zarodka. Pozostałe tkanki są również wciąż przytwierdzone.Następnie pobieram go za pomocą pipety. Na tym etapie należy utrwalić embriony, dlatego przygotowałem naczynie z PFA.Chcieliśmy zbadać geny kandydackie. W zasadzie wykorzystujemy techniki hybrydyzacji in situ w preparatach całych (whole mount RNA in situ), aby zwizualizować produkcję kwasów nukleinowych in situ w embrionie. Te konkretne geny, które nas interesują, kodują domniemane markery prekursorów komórek linii płciowej; przewiduje się również, że są one ekspresowane w embrionie myszy w konkretnym punkcie czasowym, co wspomaga rozwój i dojrzewanie komórek linii płciowej z domniemanych prekursorów komórek linii płciowej w dojrzałe komórki linii płciowej.Jednym z czynników, które nas szczególnie interesują i nad którym jako pierwszym przeprowadziliśmy analizę whole mount in situ na tych embrionach w 6,5 dniu rozwoju, było białko morfogenetyczne kości 4, BMP four. Jest ono członkiem superrodziny TGF-beta. Jest to czynnik bardzo ważny i absolutnie niezbędny w procesie dojrzewania komórek linii zarodkowej.Konieczne jest również, aby komórki zarodkowe przemieściły się w obrębie zarodka i zlokalizowały się w pobliżu prążka pierwotnego zarodka. BMP4 odgrywa kluczową rolę zarówno w sygnalizacji, jak i w procesie dojrzewania, przez który muszą przejść komórki zarodkowe, aby osiąść w prążku pierwotnym. Dlatego należy po pierwsze upewnić się, że wiadomo, czego się szuka, jak mały jest dany obiekt i w jakiej skali się pracuje, a także usiąść i bardzo starannie zaplanować pracę.Technika ta, a w szczególności rodzaj używanego mikroskopu stereoskopowego, ma kluczowe znaczenie. Jedną z trudności technicznych jest fakt, że procedura ta wymaga wielu manipulacji i bardzo precyzyjnych, stabilnych ruchów rąk, aby nie uszkodzić embrionu. Należy zatem korzystać z mikroskopu stereoskopowego zapewniającego dużą przestrzeń roboczą oraz upewnić się, że wszystkie niezbędne do eksperymentu elementy są przygotowane, aby ograniczyć liczbę manipulacji podczas sekcji do niezbędnego minimum.Poza tym uważam, że należy robić to bardzo powoli i bardzo ostrożnie oddzielać poszczególne warstwy tkanek, aby dokładnie wiedzieć, z czym się pracuje. Należy również upewnić się, gdzie znajduje się embrion.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sekcja zarodków myszy o gęstości 6,5 dpc

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe podczas wczesnych etapów rozwoju stanowi idealny model do zweryfikowania naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad w embrionach myszy w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (post coitum).

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

Stereotypowe projekcje aferentów sensorycznych do rdzenia kręgowego gryzoni stanowią łatwo dostępny system eksperymentalny do badania rozgałęzień aksonalnych poprzez śledzenie pojedynczych aksonów.

Znakowanie neuronów ziewnięcia grzbietowego (DRG) barwnikiem DiI w celu badania rozgałęzień aksonalnych w preparacie całego rdzenia kręgowego zarodka myszy

Opisano protokół separacji ektodermy twarzy i mezenchymy zarodka. Używamy Dispase II do leczenia najpierw całych zarodków, następnie wycinamy całe wypukłości twarzy, a następnie oddzielamy ektodermę twarzy i mezenchymę.

Oddzielenie embrionalnej ektodermy twarzy myszy i mezenchymy

Pierwotne odłączone embrionalne kultury neuronów hipokampa są przydatne do badania mechanizmów sygnalizacyjnych związanych ze śmiercią neuronów. Określenie płci zarodków przed izolacją i dysocjacją hipokampa pozwala na przygotowanie oddzielnych kultur męskich i żeńskich, co umożliwia badaczowi zidentyfikowanie i zbadanie sygnalizacji komórkowej specyficznej dla płci.

Stratyfikowane kultura neuronów według płci w celu zbadania szlaków śmierci komórek niedokrwiennych

Węzeł i płytka struny grzbietowej są przejściowymi organizatorami sygnalizacji w rozwoju mysich embrionów, które można wizualizować za pomocą kilku technik. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wykonać dwie techniki badania ich struktury i morfogenezy: 1) skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM); i 2) immunofluorescencja całej góry (WMIF).

Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Klasycznie, wsierdzie zarodka zarodka zastawki myszy zostało przeanalizowane za pomocą przekrojów poprzecznych, czołowych lub strzałkowych. Nasze nowatorskie podejście do dwuwymiarowego obrazowania wsierdzia en face w regionach walwugennych umożliwia analizę polaryzacji planarnej i rearanżacji komórek wsierdzia podczas rozwoju zastawki.

En Face Przygotowanie poduszki wsierdzia do planarnej analizy morfogenezy u zarodków myszy

Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli i obrazowania embrionów myszy, który umożliwia obrazowanie 3D + czasowe komórek progenitorowych serca. Ten zestaw narzędzi wideo omawia kluczowe umiejętności wymagane do skutecznego obrazowania na żywo, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia z publikacji tekstowych.

Obrazowanie na żywo wczesnych progenitorów serca w zarodku myszy

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Poznaj metodę izolacji zarodków myszy w stadium primitivnej smugi (~6,5 dpc) do badań nad ekspresją genów i decyzjami komórkowymi. Technika ta umożliwia precyzyjne badania biologii rozwojowej.

Disekcja embrionów myszy w 6,5 dniu po zapłodnieniu (dpc)

Przeglądaj więcej filmów