Name: Mikroiniekcja wewnątrzjądrowa DNA do zdysocjowanych neuronów dorosłych ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-10T17:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Poznaj mikroiniekcję wewnątrzjądrową cDNA do zdysocjowanych neuronów dorosłych ssaków. Ta metoda umożliwia skuteczną transfekcję komórek postmitotycznych i wysoką ekspresję białek w badaniach neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania prowadzone w naszym laboratorium są wspierane przez Intramural Research Program NIH, National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism.

I. Przygotowanie do iniekcji
W tej sekcji opisano kroki przygotowawcze, które należy podjąć przed wstrzyknięciem cDNA do jądra neuronów. Procedura izolacji neuronów wykracza poza zakres niniejszego artykułu, jednak istotne jest, aby neurony zostały dysocjowane do pojedynczych komórek i dobrze przylegały do dolnej powierzchni naczyń hodowlanych o średnicy 35 mm (przydatne wskazówki w tym zakresie znajdują się w sekcji Discussion). Choć potencjalnie można wykorzystać różne rodzaje neuronów, do wysekowania preferowane są zwoje obwodowe, takie jak górny zwoj szyjny (SCG) lub zwoje korzeni grzbietowych, ponieważ są one łatwo dostępne i pozwalają na uzyskanie dużej liczby neuronów. Dodatkowymi zaletami stosowania neuronów SCG jest to, że stanowią one stosunkowo homogeniczną populację komórek i są dobrze scharakteryzowane1,2,3,4.
A. Przygotowanie plazmidowego cDNA do iniekcji
<ol>
 <li>Aby zapobiec kontaminacji lub degradacji DNA, podczas przygotowania należy nosić rękawiczki.</li>
 <li>DNA kodujące białko zainteresowania jest subclonowane do odpowiedniego wektora ekspresyjnego dla ssaków, takiego jak pCI (Promega, Madison, WI), pod kontrolą silnego i konstytutywnie aktywnego promotora cytomegalowirusa (CMV). Jeśli białko nie jest znakowane, w celu potwierdzenia prawidłowego wstrzyknięcia i ekspresji współwstrzykuje się plazmid reporterowy, kodujący na przykład EGFP (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). DNA izoluje się przy użyciu wysokiej jakości kolumny separacyjnej (np. zestaw QIAfilter Midi-prep kit, Qiagen, Chatsworth, CA), a następnie dodatkowo oczyszcza za pomocą jednostki filtra odwirującego z filtrem PVDF (0.1 μm, Millipore, Bedford, MA), aby usunąć cząstki stałe z preparatu plazmidowego, które mogłyby zablokować pipety do mikroiniekcji podczas procesu wstrzykiwania. Plazmidy przechowuje się w temperaturze -20°C w stężeniu około 1 μg/μl w odpowiednim buforze do przechowywania DNA (np. bufor TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0).</li>
 <li>Bezpośrednio przed mikroiniekcją cDNA plazmidowe rozcieńcza się i miesza do pożądanego stężenia końcowego w buforze TE lub H2O. Zazwyczaj 5-10 ng/μl genu reporterowego jest wystarczające do znakowania wstrzykniętych komórek, a całkowite stężenie wstrzykiwanego cDNA nie powinno przekraczać 200 ng/μl, ponieważ DNA przy wysokich stężeniach jest lepkie i może zapchać pipety do mikroiniekcji. Małą objętość cDNA do iniekcji (5-10 μl) przygotowuje się poprzez mieszanie kropel roztworu na czystej powierzchni niewielkiego kawałka Parafilmu (stroną znajdującą się pod papierowym podkładem). Krople roztworu miesza się, wielokrotnie pobierając i wypuszczając ciecz pipetorem, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas mieszania.</li>
 <li>Używając końcówki do mikroloadera (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), przenieś roztwór cDNA do specjalnie przygotowanej rurki hematokrytowej (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Instrukcje dotyczące przygotowania rurek hematokrytowych znajdują się w sekcji materiałów (Tabela Materiałów). Rurkę hematokrytową zawierającą roztwór cDNA do iniekcji umieść w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 ml.</li>
 <li>Wiruj probówkę przez 15-30 min przy 10 000 g w mikrocentryfudze wyposażonej w rotor z kątem stałym lub z koszyczkami odchylanymi (Eppendorf), w temperaturze pokojowej (20-24°C), aby osadzić cząstki w roztworze cDNA, które mogłyby zablokować pipetę do mikroiniekcji. Roztwór cDNA do iniekcji można przechowywać w temperaturze pokojowej podczas sesji wstrzykiwania.</li>
</ol>
B. Wykonanie pipet do iniekcji
<ol>
 <li>Jednorazowe szklane pipety do mikroiniekcji są dostępne w sprzedaży (np. Femtotips, Eppendorf), co jest wygodne, lecz kosztowne (10 $ za jedną pipetę). Pipety do iniekcji można wytwarzać w laboratorium, korzystając z programowalnego wyciągacza pipet P-97 Flaming Brown (Sutter Instrument Company, Novato, CA) oraz cienkościennych kapilar z borokrkaianu (World Precision Instruments, Sarasota, FL). Ta opcja jest bardziej ekonomiczna i pozwala na kontrolę kształtu oraz rozmiaru pipety do mikroiniekcji.</li>
 <li>Do wyciągania wąskich końcówek pipet do mikroiniekcji stosuje się program dwuetapowy. Ponieważ otwór pipety do mikroiniekcji jest zbyt wąski, aby można go było zbadać pod mikroskopem świetlnym, jakość pipet należy oceniać bezpośrednio, przeprowadzając iniekcję w kilku komórkach przed ostatecznym zatwierdzeniem ustawień programu. Poniżej znajdują się przybliżone ustawienia temperatury (heat), siły wyciągania (pull), prędkości (velocity) i czasu (time): (wyciąganie 1) 600, 115, 15, 250; (wyciąganie 2) 640, 130, 65, 200. Ustawienia te różnią się w zależności od partii szkła oraz stanu włókna grzejnego w wyciągaczu i powinny być dostosowywane w razie potrzeby. Więcej szczegółów znajduje się w pozycji5.</li>
 <li>Należy wyciągnąć kilka (2-5) pipet do iniekcji na każdą płytkę z neuronami do iniekcji, na wypadek uszkodzeń lub problemów podczas sesji. Pipety do iniekcji należy przechowywać w przykrytym pojemniku, aby zapobiec przedostaniu się kurzu do końcówki pipety do mikroiniekcji.</li>
</ol>
II. Mikroiniekcja do jądra komórkowego
W tej sekcji szczegółowo opisano proces wstrzykiwania cDNA do jądra neuronów. Podstawowy zestaw do mikroiniekcji obejmuje odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowy (np. Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) do wizualizacji procesu, mikromanipulator (np. Eppendorf 5171) do sterowania ruchem pipety iniekcyjnej oraz iniekcyjny system ciśnieniowy (np. Eppendorf FemtoJet Express) do wypychania roztworu cDNA z pipety. Połączenie systemu ciśnieniowego z mikromanipulatorem pozwala na synchronizację tych dwóch procesów podczas iniekcji. Inne opcjonalne, lecz wysoce zalecane komponenty to zamontowany system monitorowania wideo (kamera CCD, Cohu Inc., San Diego, CA; czarno-biały monitor wideo, Sony Corporation, Tokyo, Japan). System ten nie jest bezwzględnie wymagany do przeprowadzania iniekcji, jednak monitor czarno-biały zapewnia wysoki kontrast, co usprawnia wizualizację jądra komórkowego i zwiększa komfort obserwacji podczas długich sesji iniekcyjnych. Dodatkowo można wykorzystać laptop z oprogramowaniem obsługującym kontroler ręczny w celu półautomatyzacji procesu iniekcji (szczegóły znajdują się w sekcji Dyskusja).
Idealny czas na wstrzyknięcie neuronów SCG przypada na okres od 3 do 6 godzin po dysocjacji. Na tym etapie komórki są sferyczne, ściśle przylegają do dna naczynia, a jądro jest wyraźnie widoczne w mikroskopie fazokontrastowym jako centralna, okrągła organella z ciemną błoną, zawierająca jeden lub więcej jąderek (Rysunek 1A).
<ol>
 <li>Umieść naczynie z dysocjowanymi neuronami na środku stolika mikroskopu. Dostrój ostrość i zoptymalizuj optykę kontrastową fazową mikroskopu tak, aby jądra neuronów były wyraźnie widoczne. </li>
 <li>Naboruj 2 μl przygotowanego roztworu cDNA do mikropipety do mikroiniekcji, używając końcówki mikroloadera. Unikaj pobierania roztworu z dna probówki do hematokrytu, ponieważ może to spowodować wzbudzenie cząstek stałych, które osadziły się podczas wirowania. Włókno w mikropipetach do mikroiniekcji powinno wspomagać pobieranie roztworu do końcówki, ale jeśli utrzymują się małe pęcherzyki powietrza, delikatnie stuknij w ściankę szklaną, aby je usunąć. </li>
 <li>Włóż mikropipetę do mikroiniekcji do uchwytu kapilarnego wtryskiwacza ciśnieniowego, a następnie przymocuj uchwyt do mikromanipulatora. Uchwyt jest ustawiony pod kątem 45°. </li>
 <li>Opuść mikropipetę do mikroiniekcji do naczynia. W momencie wprowadzenia pipety do pożywki hodowlanej tworzy się menisk, który wpływa na refrakcję światła i obniża jakość obrazu neuronów. Aby rozwiązać ten problem, można lekko przesunąć wieżyczkę pierścienia fazowego, aż jądra neuronów znów staną się wyraźnie widoczne. </li>
 <li>Niektóre systemy wtrysku ciśnieniowego posiadają funkcję „czyszczenia” (clean), która przez krótki czas przykłada maksymalne ciśnienie powietrza do końcówki mikropipety. Używaj tej funkcji do oczyszczania pipety z zanieczyszczeń przed rozpoczęciem oraz w trakcie iniekcji, jeśli końcówka wydaje się zapchana. Jeśli podczas korzystania z tej funkcji na ekranie nie widać wypychanego płynu, wymień pipetę na nową. </li>
 <li>Wycentruj mikropipetę do mikroiniekcji w monitorze podglądu i ustaw końcówkę obok neuronu, w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co jąderko. Ustaw tę pozycję jako dolną granicę osi z w mikromanipulatorze. Jest to głębokość, do której mikropipeta do mikroiniekcji zostanie przesunięta podczas wtrysku. Następnie ustaw końcówkę około 30 μm powyżej tego punktu, aby mikropipeta znajdowała się nad neuronami. </li>
 <li>Tryb „iniekcji” (inject) w mikromanipulatorze Eppendorf 5171 można zdefiniować za pomocą następujących ustawień w celu przeprowadzenia iniekcji dojądrowych. Funkcja inject jest włączona, podczas gdy funkcja impale pozostaje wyłączona. Przekątna ścieżka iniekcji (wzdłuż osi x i z) powoduje najmniejsze uszkodzenia komórki, dlatego do iniekcji należy używać trybu axial. Prędkość iniekcji 300 μm/s jest wystarczająca; zsynchronizuj narastanie ciśnienia w momencie, gdy mikropipeta osiągnie ustawiony limit osi z. </li>
 <li>Wtryskiwacz ciśnieniowy kontroluje ilość roztworu cDNA wstrzykiwanego do jądra. W trybie iniekcji „automatycznej” podawanie DNA jest sterowane czasowo i inicjowane przez podłączony mikromanipulator. Ciśnienie iniekcji (Pi) powinno być ustawione w zakresie od 100 do 200 hektopaskali (hPa; 1 hPa $\approx$ 0,015 psi); wyższe ciśnienia nie poprawiają skuteczności ani jakości iniekcji i mogą wskazywać na inne problemy z rozmiarem końcówki mikropipety lub czystością DNA. Należy zastosować czas trwania iniekcji (ti) wynoszący 0,3 s oraz ciśnienie kompensacyjne (Pc) wynoszące 30 hPa, które zapewnia stałe nadciśnienie, aby zapobiec przedostawaniu się zatykających cząstek z pożywki do końcówki pipety. </li>
 <li>Używając sterowania osiami xy stolika mikroskopu, ustaw neuron do iniekcji pod końcówką mikropipety. Wyrównaj końcówkę pipety nad centrum jądra, zmieniając ostrość między końcówką a jąderkami. </li>
 <li>Wykonaj iniekcję do jądra, naciskając przycisk iniekcji (w mikromanipulatorze). Podczas etapu iniekcji ruch mikropipety oraz uwalnianie roztworu cDNA są kontrolowane przez mikromanipulator. Trudno jest potwierdzić sukces iniekcji dojądrowej gołym okiem, jednak wtrysk roztworu cDNA o stosunkowo niskiej lepkości (w porównaniu do lepkości środowiska jądrowego) często objawia się jako biała smużka w optyce kontrastowej fazowej i może służyć jako wskaźnik wniknięcia do jądra. Czasami mikropipeta nie przebija błony jądrowej, a jedynie przesuwa jądro. Druga próba iniekcji w tym samym miejscu może doprowadzić do udanego wstrzyknięcia DNA do jądra. Opuchlizna komórki zazwyczaj wskazuje na niezamierzoną iniekcję cytoplazmatyczną. Ponadto znaczne obrzmienie jądra jest źle tolerowane przez neurony i zazwyczaj prowadzi do szybkiej śmierci komórki; dlatego ciśnienie i czas trwania iniekcji nie powinny przekraczać sugerowanych wartości. </li>
<li>Kontynuuj iniekcję neuronów, przesuwając stolik mikroskopu tak, aby kolejny neuron znalazł się pod mikropipetą. Systematycznie przemieszczaj się po naczyniu, aby zainiekować około 50-100 jąder, a następnie przenieś naczynie z neuronami do inkubatora na nocną inkubację. Pomyślnie zainiekowane neurony można zidentyfikować następnego dnia po ekspresji genu reporterowego.</li>
</ol>
III. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="Mikroskopia neuronów SCG; obrazowanie w kontraście fazowym i fluorescencyjne po dysocjacji/mikroiniekcji." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Neurony z górnego zwoju szyjnego (SCG). Obraz w kontraście fazowym neuronów SCG 3 godziny po dysocjacji (A). Na tym etapie jądro komórkowe jest wyraźnie widoczne, co ułatwia ustawienie końcówki pipety do mikroiniekcji. Jądro znajduje się w centrum neuronów i zawiera pojedyncze (lewo) lub wiele (prawo) ciemnych jąderek. Neurony SCG 16 godzin po iniekcji cDNA EGFP do jądra (B). Po lewej neurony SCG obserwowane w kontraście fazowym. Po prawej obraz epifluorescencyjny tych samych neuronów, wykazujący prawidłową iniekcję i wynikową ekspresję EGFP w jednym neuronie. Biały pasek skali ma długość 20 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="Voltage clamp technique diagram, showing voltage-current relationship in non-injected vs. microinjected cells." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> Rysunek 2: Rejestracje prądów z całej komórki przepływających przez heterologicznie ekspresowane potasowe kanały prostujące do wewnątrz sprzężone z białkiem G+ kanały (GIRK) z neuronów SCG. prądy GIRK (IGIRK) wywołano za pomocą 200-msowego rampy napięcia od -140 do +40 mV z potencjału holdingowego -60 mV (wstawka na rys. A) po aktywacji endogennych α2-adrenoreceptory przez norepinefrynę (NE, 10 μM). Nałożone ślady są zapisami z tego samego neuronu i wskazują stan przed (czarny) oraz po aplikacji samego NE (niebieski) lub NE z dodatkiem 10 mM Ba2+ (czerwony). Linie przerywane wskazują poziom prądu równego zero. Do rejestracji IGIRKroztwór zewnętrzny zawierał (w mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES i 10 CaCl22, 0,8 MgCl22, 15 glukozy, 15 sacharozy i 0,0003 TTX, z pH skorygowanym do 7,4 za pomocą NaOH. Wewnętrzny roztwór rejestrujący zawierał (w mM) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl22, 2 MgCl22, 10 HEPES, 4 MgATP oraz 0,3 Na2GTP, z pH dostosowanym do 7,2 za pomocą KOH. Brak prądu wywołanego rampą napięcia w obecności NE w nieinjektowanych neuronach SCG (A) dowodzi, że neurony SCG nie wykazują endogennej ekspresji kanałów GIRK. Pomyślna injekcja plazmidowego cDNA kodującego funkcjonalny kanał GIRK11 powoduje powstanie dużych prądów podczas rampy napięcia po ekspozycji na NE (B, lewo). Prądy te wykazują typowe charakterystyki prądów przez kanały GIRK: aktywację przez agonistę receptora sprzężonego z białkiem G (NE), prostowanie do wnętrza oraz blokowanie prądów przez domniemany bloker kanałów GIRK, $\text{Ba}^{2+}$.2+ (B, prawa czerwona krzywa). Otwarte i wypełnione kółka reprezentują IGIRK odpowiednio przy prądzie podtrzymującym i szczytowym. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg"> kliknij tutaj</a> aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 2.

<ol><li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li>
<li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+%CE%B2%CE%B3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein βγ subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li>
<li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li>
<li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li>
<li>Dean, D. A. Chapter 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDean%2C+DA+%22Live+Cell+Imaging%3A+a+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: a Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 51-66 (2005).</li>
<li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li>
<li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li>
<li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RGS-insensitive+G%CE%B1+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons.%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of RGS-insensitive Gα subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons.</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li>
<li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+gene+transfer+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li>
<li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li>
<li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4%2C+the+two+subunits+of+the+KACh+channel%2C+using+functional+homomeric+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li>
</ol>

Typowe problemy i sugestie:
Jak wspomniano wcześniej, sukces iniekcji do jąder komórkowych zależy od przylegania komórek do płytek hodowlanych. Odroczenie rozpoczęcia iniekcji o kilka godzin po procedurze dysocjacji komórek pozwala neuronom przylgnąć do dna naczyń. Ponadto powlekanie naczyń 0,1 mg/ml wysokocząsteczkowej poli-L-lizyny (Sigma, St. Louis, MO) wspomaga adhezję neuronów do dolnej powierzchni naczyń.
Zapychanie się pipet do mikroiniekcji, szczególnie przy próbach wstrzykiwania wysokich stężeń DNA, może być częstym problemem. Stosowanie wysokiej jakości kolumn separacyjnych do izolacji i oczyszczania plazmidowego DNA oraz przeprowadzanie wspomnianych dodatkowych etapów oczyszczania (filtry wirowkowe, wirowanie w rurkach do hematokrytu) może pomóc w usunięciu cząsteczek stałych przed wstrzykiwaniem. Podczas iniekcji można skorzystać z funkcji „clean” w injektorze ciśnieniowym (wystarczy 0,2 s); jeśli jednak nie rozwiązuje to problemu, należy użyć nowej pipety do iniekcji. Jeśli większość pipet do mikroiniekcji zapycha się podczas jednej sesji, należy rozważyć zmianę ustawień wyciągarki do pipet szklanych w celu uzyskania końcówek pipet do mikroiniekcji o większym otworze.
Kolejnym problemem pojawiającym się podczas mikroiniekcji jądrowych jest nierówność powierzchni dna naczyń do hodowli tkankowej. Zmienność ta bezpośrednio wpływa na dokładność celowania końcówką pipety iniekcyjnej w jądro, ponieważ głębokość, na jaką pipeta przemieszcza się podczas iniekcji, jest stała. W związku z tym limit osi z musi być korygowany w trakcie wykonywania iniekcji w obrębie tego samego naczynia. Konieczność dokonania korekty stanie się oczywista, gdy nie pojawi się oznaka iniekcji jądrowej (brak białej smugi w jądrze lub całkowite pominięcie komórki) lub gdy końcówka pipety iniekcyjnej zbliży się do dna naczynia (co spowoduje uciśnięcie komórki, a nawet uderzenie końcówki pipety o dno). Podczas wysiewania neuronów można zastosować szklane cylindry do klonowania (O.D. 10 mm, nr kat. 2090-01010, Bellco Glass, Vineland, NJ), aby ograniczyć je do mniejszego, bardziej zwartego obszaru, co minimalizuje dystans, jaki pipeta iniekcyjna musi pokonać między kolejnymi iniekcjami. Cylindry te usuwa się przed przystąpieniem do mikroiniekcji.
Wady techniki:
Mikroiniekcje dojądrowe są wymagające technicznie i wymagają od operatora cierpliwości oraz wysokiego stopnia sprawności manualnej. Biegłość w tej technice, podobnie jak w przypadku każdej innej umiejętności, przychodzi wraz z praktyką. Dlatego zaleca się przećwiczenie samych iniekcji jądrowych genu reporterowego przed przystąpieniem do właściwych eksperymentów. Aby dodatkowo wspomóc proces iniekcji, można zintegrować kroki sterowania mikromanipulatorem i injektorem ciśnieniowym w programie komputerowym. Programy takie jak Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) mogą być wykorzystywane do zapisywania ustawień mikroiniekcji i programowania kontrolerów wielofunkcyjnych (ShuttlePro, Contour Design, Windham, NH) w celu częściowej automatyzacji procesu iniekcji (szczegóły w 6,7,8). 
 Kolejną wadą techniki mikroiniekcji dojądrowych jest niski odsetek sukcesu. Około 10-20% próbowanych iniekcji jądrowych prowadzi do ekspresji białka. Choć taka wydajność może być wystarczająca w zastosowaniach, które nie wymagają dużej liczby komórek wykazujących ekspresję, na przykład w elektrofizjologii, w przypadku różnych testów biochemicznych może ona okazać się niewystarczająca.
Zastosowania techniki:
Pomimo swoich wad, mikroiniekcja DNA do jądra komórkowego jest niezwykle użyteczną techniką heterologicznej ekspresji białek w neuronach.
Wysoki poziom ekspresji białek uzyskuje się dzięki mikroiniekcjom jądrowym ze względu na dużą liczbę plazmidów uwalnianych do jądra podczas iniekcji, wysoką aktywność promotora CMV regulującego transkrypcję genów oraz długą stabilność plazmidów w jądrze. Nadekspresja białek jest szczególnie przydatna w eksperymentach z dominantnim ujemnym efektem, gdzie wymagane są wysokie poziomy białek heterologicznych w celu zdominowania białka endogennego. Inną zaletą iniekcji dojądrowych jest możliwość dostarczenia stałej proporcji konstruktów cDNA do jądra w przypadku wstrzykiwania wielu konstruktów. W przypadku innych metod transfekcji trudno jest w sposób powtarzalny wprowadzić taką samą proporcję każdego konstruktu DNA do różnych komórek w obrębie jednej szalki oraz pomiędzy poszczególnymi transfekcjami. Bezpośrednia iniekcja roztworu cDNA do jądra eliminuje to źródło zmienności i pozwala na efektywne miareczkowanie stosunku ekspresyjnych białek.
Tradycyjne metody transfekcji charakteryzują się ograniczoną skutecznością w komórkach postmitotycznych ze względu na niską inkorporację DNA do jądra9 oraz toksyczność chemiczną związaną z odczynnikami do transfekcji10. Mikroiniekcje jądrowe rozwiązują te problemy poprzez mechaniczne wprowadzanie materiału genetycznego do jądra. Choć technika ta jest bardziej złożona, możliwość badania wpływu białka w funkcjonalnym systemie biologicznym, z zachowaniem endogennych szlaków sygnalizacyjnych, z nawiązką rekompensuje pracochłonność tej metody.
Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania.

<table><tbody><tr><td>Jednostka filtrująca Ultrafree-MC</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td>Filtr PVDF Durapore; rozmiar porów 0.1 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Bufor TE</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>351-010-131</td><td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>Kapilary do mikrohematokrytu</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td>Przygotowanie nieheparynizowane:&lt;br/&gt;Namoczyć w 100% etanolu przez noc. Trzykrotnie dokładnie wypłukać wodą dejonizowaną i wysuszyć szkło w piekarniku (95&amp;#x00B0;C). Pociąć oczyszczone kapilary do hematokrytu na odcinki o długości 3-4 cm za pomocą skrybera z końcówką diamentową, a następnie jeden koniec zamknąć za pomocą płomienia, trzymając szkło pęsetą. Przechowywać w czystym zlewce szklanym pod przykryciem, aby zapobiec osadzaniu się kurzu.</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>Z rotorem kątowym lub koszykowym</td></tr><tr><td>Napiwniki do pipet Microloader 20 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Szkło kapilarne do mikroiniekcji</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW120F-4</td><td>Cienkościenne z włóknem, średnica zewnętrzna 1.2 mm, średnica wewnętrzna 0.9 mm, długość 100 mm</td></tr><tr><td>Wytwornica mikrokapilar Sutter Instrument (Puller)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Z platynowo-irydowym włóknem w ramce (część nr FB330B)</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Obiektywy kontrastowo-fazowe 20x i 40x, zamontowany na stole wibroizolacyjnym</td></tr><tr><td>Kamera CCD (Charge-coupled device)</td><td>Cohu Inc.</td><td>6410</td><td></td></tr><tr><td>Monitor wideo</td><td>Sony Corporation</td><td>PVM-122</td><td>Czarno-biały, ekran 9&amp;#8221;</td></tr><tr><td>System mikromanipulatorów</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka do mikroiniekcji</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik mikroiniekcji</td><td>Contour Design</td><td>S-PROV2</td><td>Programowalny sterownik multimedialny</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Version 4.05A</td><td>Program sterujący sterownikiem mikroiniekcji napisanym przez S. Ikedę</td></tr></tbody></table>

wewnątrzjądrowa mikroiniekcja dna do rozdzielonych neuronów dorosłych ssaków

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Pierwotne hodowle komórek neuronalnych są cennymi narzędziami do badania funkcji białek, ponieważ stanowią system bardziej istotny biologicznie w porównaniu z unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi. Jednak postmitotyczny charakter pierwotnych neuronów uniemożliwia efektywną heterologiczną ekspresję białek przy użyciu powszechnych procedur, takich jak elektroporacja czy transfekcja chemiczna. W związku z tym, w celu skutecznej ekspresji białek w tych niedzielących się komórkach, należy zastosować inne techniki.
W niniejszym artykule opisujemy kroki niezbędne do przeprowadzenia iniekcji wewnątrzjądrowych konstruktów cDNA do rozdzielonych neuronów współczulnych osobników dorosłych. Technika ta, zastosowana w odniesieniu do różnych typów neuronów, pozwala na skuteczną indukcję ekspresji białek heterologicznych. Wyposażenie niezbędne do procedury mikroiniekcji obejmuje mikroskop odwrócony do wizualizacji komórek, szklaną pipetę iniekcyjną wypełnioną roztworem cDNA podłączoną do systemu dostarczania pod ciśnieniem N2(g) oraz mikromanipulator. Mikromanipulator koordynuje ruch iniekcyjny pipety do mikroiniekcji z krótkim impulsem ciśnieniowego N2, aby wyrzucić roztwór cDNA z końcówki pipety.
Technika ta nie wykazuje toksyczności związanej z wieloma innymi metodami transfekcji i umożliwia ekspresję wielu konstruktów DNA w stałym stosunku. Niska liczba wstrzykniętych komórek sprawia, że procedura mikrowstrzykiwania jest dobrze dostosowana do badań pojedynczych komórek, takich jak rejestracje elektrofizjologiczne i obrazowanie optyczne, lecz może nie być idealna dla testów biochemicznych wymagających większej liczby komórek i wyższej wydajności transfekcji. Chociaż mikrowstrzykiwania do jądra komórkowego wymagają nakładów sprzętowych i czasowych, możliwość osiągnięcia wysokiego poziomu ekspresji białek heterologicznych w środowisku fizjologicznie istotnym sprawia, że technika ta jest bardzo użytecznym narzędziem do badania funkcji białek.

Bezpośrednia injekcja cDNA do jądra komórkowego jest skuteczną techniką transfekcji komórek pomitotycznych. Metoda ta zapewnia wysoki poziom ekspresji białek heterologicznych z pojedynczych lub wielu konstruktów cDNA i umożliwia badanie funkcji białek w fizjologicznie istotnym środowisku z wykorzystaniem różnych testów na pojedynczych komórkach.

Wewnątrzjądrowa mikroiniekcja DNA do rozdzielonych neuronów dorosłych ssaków

Pierwotne hodowle komórek neuronalnych są cennymi narzędziami do badania funkcji białek, ponieważ stanowią system bardziej relewantny biologicznie w porównaniu z...

W pierwszym kroku tej procedury iniekcji roztwór DNA o stężeniu roboczym jest wirowany w celu osadzenia cząstek. Następnie pipety do iniekcji materii cząsteczkowej, wykonane z kapilar szklanych borokrzemowych, są napełniane roztworem DNA. Komórki umieszcza się na stoliku mikroskopu i optymalizuje wizualizację jądra komórkowego.Pipetę ustawia się w osi jądra i dokonuje iniekcji komórki. Następnego dnia w każdej szalce iniekcję przeprowadza się w wielu komórkach. Prawidłowo zainiekowane komórki identyfikuje się na podstawie ekspresji genu reporterowego.Witajcie, nazywam się Van Mu i pochodzę z laboratorium dr. Stephena Akedy w Narodowym Instytucie Nadużywania Alkoholu i Alkoholizmu w ramach Narodowych Instytutów Zdrowia. Jestem Damien Williams, również z laboratorium Akedy. A ja jestem Eugene run z laboratorium AKEDA.W dzisiejszym materiale przedstawimy procedurę mikroiniekcji konstruktów cDNA do rozdzielonych neuronów przy użyciu systemu INTERCLEAR. Jest to skuteczna metoda heterologicznej ekspresji wybranych białek w komórkach pomitotycznych, które tradycyjnie są trudne do transfekcji. W naszym laboratorium stosujemy tę technikę do badania mechanizmów leżących u podstaw modulacji kanałów N przez białka G.Przejdźmy zatem do barwienia zębów. Rozpocznij od wysiania dysocjowanych neuronów dorosłych ssaków na naczynia hodowlane pokryte 0,1 mg/ml wysokocząsteczkowej poli-L-lizyny. Ułatwia to adhezję neuronów do dolnej powierzchni naczyń.Szklane cylindry do klonowania można wykorzystać do zagęszczenia wysianych neuronów na mniejszym, bardziej ograniczonym obszarze, aby zminimalizować odległość między neuronami przeznaczonymi do iniekcji. Przed wykonaniem mikroiniekcji dojądrowych należy umieścić szalki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na trzy do sześciu godzin, aby zapewnić komórkom wystarczająco dużo czasu na przywieranie do dna szalek.Podczas inkubacji neuronów przygotowywane są pipety do mikroiniekcji przy użyciu wyciągarki Sutter P 97 oraz cienkościennych rurek kapilarnych z borokrzemianu. Stosujemy dwuetapowy program wyciągania z następującymi ustawieniami dla pierwszego i drugiego etapu. Ponieważ wymagane parametry różnią się w zależności od partii szkła oraz stanu włókna grzejnego w wyciągarce, należy je dostosować w razie potrzeby.Na każdą szalkę z neuronami należy dociągnąć co najmniej pięć pipet do iniekcji na wypadek ich uszkodzenia lub wystąpienia problemów podczas sesji wstrzykiwania. Dociągnięte pipety do iniekcji powinny być przechowywane w przykrytym pojemniku, aby zapobiec dostawaniu się kurzu do końcówki pipety do mikroiniekcji bezpośrednio przed iniekcją, gdy cDNA plazmidy są rozcieńczane do stężenia roboczego. Na powierzchni roboczej należy umieścić mały kawałek paraformy i zdjąć papierowe podłoże.Dodaj roztwór zapasowy CD NA oraz bufor TE do param. W celu rozcieńczenia CD NA zaleca się zastosowanie końcowego stężenia CDNA poniżej 200 ng/µL oraz całkowitej objętości od 2 do 10 µL. Jeśli białko kodowane przez CD NA nie posiada znacznika, wraz z eksperymentalnym CD NA można współwstrzyknąć plazmid reporterowy kodujący np. EGFP. Aby potwierdzić pomyślne wstrzyknięcie i ekspresję, wymieszaj roztwory CD NNA, pipetując je kilka razy w górę i w dół na perfil.Należy zachować ostrożność, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza, w celu osadzenia wszelkich cząstek w roztworze cDNA, które mogłyby później zablokować pipetę do mikroiniekcji. Za pomocą końcówki do mikroładownika należy przenieść roztwór do przygotowanej rurki do hematokrytu, która została oczyszczona, przycięta i zamknięta ogniowo z jednego końca. Następnie rurkę do hematokrytu należy umieścić w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez 15 do 30 minut.10 000 g w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wirowania odstaw probówkę zawierającą roztwór do iniekcji cDNA. Roztwór może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin podczas sesji iniekcyjnej.Po wysianiu komórek należy usunąć szklane cylindry do klonowania. Następnie wysiane komórki należy umieścić z powrotem w inkubatorze na pozostałą część okresu inkubacji przed sesją iniekcji. Aby rozpocząć iniekcje, należy najpierw wyjąć z inkubatora szalkę z wysianymi neuronami i umieścić ją na stole mikroskopu w układzie do iniekcji.Układ składa się z odwróconego mikroskopu fazowo-kontrastowego, injektora ciśnieniowego połączonego z mikromanipulatorem oraz systemu monitoringu wideo. W kontraście fazowym neurony widoczne są jako komórki sferyczne z wyraźnie zaznaczonym jądrem w postaci centralnej okrągłej organelli z ciemną błoną, które może zawierać jedno lub więcej jąderek. Za pomocą końcówki pipety do napełniania mikroelektrod pobrać 2 µL przygotowanego CD NA z rurki do hematokrytu.Należy uważać, aby nie pobierać roztworu z dna probówki, gdzie mogły osiąść cząsteczki. Przenieść roztwór do pipety do mikroiniekcji. Filament w pipecie do mikroiniekcji powinien ułatwić zaciągnięcie roztworu do końcówki.Jeśli jednak pozostaną małe pęcherzyki powietrza, należy delikatnie stuknąć w bok szkła, aby je usunąć, oraz upewnić się, że uchwyt kapilary wtryskiwacza ciśnieniowego jest zamocowany pod kątem 45 stopni. Następnie należy włożyć pipetę do mikroiniekcji do uchwytu kapilary i przymocować uchwyt do mikromanipulatora. W kolejnym kroku należy opuścić pipetę do mikroiniekcji do naczynia za pomocą mikromanipulatora; w momencie wprowadzenia pipety do pożywki hodowlanej tworzy się menisk, który zmienia drogę przejścia światła przez preparat, co obniża jakość obrazu neuronów.Aby rozwiązać ten problem, należy dostosować pierścień fazowy, aż jądra neuronów staną się wyraźnie widoczne. Przed rozpoczęciem wstrzykiwania należy użyć funkcji czyszczenia systemu do mikroiniekcji ciśnieniowej, aby usunąć z pipety zanieczyszczenia i sprawdzić jakość pipet do mikroiniekcji.Wytrysk roztworu powinien być widoczny na ekranie. Po uruchomieniu tej funkcji ciecz z odpowiednio dobranego rozmiaru końcówki pipety jest wydmuchiwana w postaci cienkiego strumienia. Jeśli pipeta do mikroiniekcji jest zapchana lub zbyt wąska, ciecz nie zostanie wydmuchnięta podczas korzystania z funkcji czyszczenia.Jeśli końcówka jest zbyt szeroka lub została uszkodzona, ciecz będzie wypływać z niej w postaci szerokiego strumienia. Jeśli podczas iniekcji końcówka wydaje się nieodpowiednia, należy wymienić pipetę iniekcyjną, a następnie wycentrować pipetę do mikroiniekcji w monitorze podglądu. Utrzymując jądro w ostrości, należy opuszczać końcówkę pipety, aż znajdzie się ona w ostrości w bezpośrednim sąsiedztwie neuronu.Ustaw tę pozycję jako dolny limit osi Z w mikromanipulatorze. Pozycja ta stanowi głębokość, do której pipeta do mikroiniekcji będzie wysuwać się podczas iniekcji. Następnie ustaw końcówkę pipety w odległości około 30 µm powyżej tego punktu.W ten sposób pipeta do mikroiniekcji znajduje się powyżej neuronów. Teraz należy zaprogramować ustawienia mikromanipulatora do mikroiniekcji. Ustaw tryb iniekcji (inject mode) mikromanipulatora na „on”, a funkcję przebijania (impale function) na „off”, aby zminimalizować uszkodzenia komórek.Podczas mikroiniekcji wyznacz diagonalną ścieżkę iniekcji, wybierając tryb osiowy. Ustaw prędkość iniekcji na 300 µm/s i zsynchronizuj narastanie ciśnienia przy wartości granicznej. Następnie zaprogramuj kolejny krok.W ustawieniach injektora ciśnieniowego ustawiono ciśnienie wtrysku (PI) w zakresie od 100 do 200 hektopaskali (hPa), czas wtrysku (ti) na 0,3 sekundy oraz ciśnienie kompensacyjne (PC) na 30 hPa. Po dostrojeniu ustawień manipulatora można przystąpić do iniekcji dojądrowych. Korzystając z kontroli pozycji stolika w osiach XY mikroskopu, należy ustawić neuron pod końcówką pipety do mikroiniekcji.Ustaw końcówkę pipety nad środkiem jądra komórkowego, ustawiając ostrość naprzemiennie na końcówce i na jądrze. Wykonaj iniekcję do jądra, naciskając przycisk iniekcji w mikromanipulatorze. Iniekcja substancji o stosunkowo niskiej lepkości.Roztwór cDNA często przejawia się jako biała smuga w jądrze komórkowym podczas obserwacji w optyce kontrastowej. Kontynuuj mikroiniekcje do neuronów, przesuwając stolik mikroskopu tak, aby kolejny neuron znalazł się pod pipetą do mikroiniekcji.Systematycznie przesuwaj się po całej szalce. Kontynuuj wstrzykiwanie jąder. Co 10 do 15 iniekcji stosuj opisaną wcześniej funkcję czyszczenia, aby sprawdzić jakość pipety do mikroiniekcji.Jeśli pipeta jest zapchana lub uszkodzona, należy zastąpić ją nową do iniekcji. Nierówności dna szalek do hodowli tkankowej mogą spowodować, że pipeta do iniekcji ominie komórkę lub uniemożliwić widoczność białej smugi w jądrze. W takich przypadkach należy po prostu dostosować końcówkę pipety do mikroiniekcji do tej samej płaszczyzny ostrości co jądro i ustawić to jako nowy limit osi x.Następnie kontynuuj wstrzykiwanie do neuronów. Czasami pipeta do mikroiniekcji nie przebija błony jądrowej i jedynie przesuwa jądro. W takim przypadku druga próba wstrzyknięcia w to samo miejsce może doprowadzić do pomyślnego wprowadzenia DNA do jądra.Opuchlizna komórki zazwyczaj wskazuje na niezamierzoną iniekcję cytoplazmatyczną. Po wstrzyknięciu od 50 do 100 jąder, należy przenieść szalkę z neuronami z powrotem do inkubatora w celu inkubacji przez noc. Po 16 godzinach pomyślnie zainfekowane neurony można zidentyfikować na podstawie ekspresji genu reporterowego.W tym polu wstrzyknięto jeden neuron z górnego zwoju szyjnego (SCG), który można zidentyfikować dzięki ekspresji EGFP. Neurony SCG, do których nie wstrzyknięto plazmidu i które nie posiadają endogennych białek grk (kanałów potasowych wewnątrzstymulowanych sprzężonych z białkiem G), nie generują mierzalnych prądów podczas rampy napięciowej. W porównaniu z nimi, pomyślne wstrzyknięcie plazmidu cDNA kodującego funkcjonalny kanał grk sprawia, że po wystawieniu na działanie norepinefryny, agonisty receptora sprzężonego z białkiem G, podczas rampy napięciowej powstają duże prądy.Prądy mierzone w tym przypadku są typowe dla kanałów Kirka i charakteryzują się aktywacją przez norepinefrynę, prostowaniem do wewnątrz oraz inhibicją przez domniemanego blokera kanałów grk. Barium, właśnie pokazaliśmy Państwu, jak wstrzyknąć CD NA do jądra neuronów. Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby pamiętać o czterech kwestiach.Po pierwsze, aby odwirować DNA przed iniekcją. Po drugie, aby upewnić się, że jądro komórkowe jest wyraźnie widoczne. Po trzecie, aby ponownie dostosować limit osi Z podczas nawigacji po szalce.Po czwarte, należy regularnie sprawdzać jakość pep tipu pomiędzy kolejnymi wtryskami. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.

intranuclear-microinjection-dna-into-dissociated-adult-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wstrzyknięcie wewnątrzjądrowe DNA do rozdzielonych dorosłych neuronów ssaków

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

W niniejszej pracy opisujemy test wykorzystujący mikroiniekcję w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu dokładnego pomiaru kinetyki eksportu mRNA z jądra w somatycznych komórkach ssaków.

Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

Źródło: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineerical Interneuron Pregenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę wstrzykiwania wektora plazmidowego przenoszącego interesujący nas gen do progenitorów interneuronów w embrionalnym wycinku mózgu, a następnie elektroporacji w celu wejścia plazmidu i ekspresji genu. Te zmodyfikowane komórki progenitorowe mogą być później wykorzystane do leczenia zaburzeń mózgu.

Transfer genów wspomagany elektroporacją osadzony w agarozie w progenitorach interneuronów kory myszy

Migracja neuroblastów jest kluczowym krokiem w neurogenezie poporodowej. Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do zbadania roli kandydatów na regulatory migracji neuroblastów poprzez zastosowanie nukleofekcji DNA/małego RNA spinki do włosów (shRNA) oraz testu migracji 3D z neuroblastami wyizolowanymi z pourodzeniowego strumienia migracyjnego rostralnego gryzoni.

Nukleofekcja neuroblastów gryzoni do badania migracji neuroblastów in vitro

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Ten protokół ma na celu generowanie bezpośrednio przeprogramowanych interneuronów in vivo, przy użyciu systemu wirusowego opartego na AAV w mózgu i reportera GFP sterowanego przez synapsynę FLEX, który pozwala na identyfikację komórek i dalszą analizę in vivo.

Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych

Tutaj prezentujemy protokół, zaprojektowany do wykorzystania narzędzi chemogenetycznych do manipulowania aktywnością komórek progenitorowych interneuronów korowych przeszczepionych do kory mózgowej myszy po urodzeniu.

Przeszczepienie chemogenetycznie zmodyfikowanych progenitorów interneuronów korowych do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Ten protokół demonstruje użycie platformy robotycznej do mikroiniekcji do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych i neuronów w wycinkach mózgu. Technika ta jest wszechstronna i oferuje metodę śledzenia komórek w tkance z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Manipulacja pojedynczymi neuronalnymi komórkami macierzystymi i neuronami w wycinkach mózgu za pomocą mikroiniekcji robotycznej

Obecny protokół przedstawia instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania iniekcji dokanałowych u noworodków myszy w celu edycji genów i dostarczania leków.

Wstrzyknięcie dooponowe nowonarodzonej myszy w celu edycji genomu i dostarczania leków

Opisano nową technikę powszechnego dostarczania wirusa związanego z adenowirusem, która wykorzystuje infuzję wirusa podpajęczynówkowego. Metoda ta nie tylko zapewnia szeroką transdukcję mysich neuronów kory nowej w warstwach powierzchownych, ale także powoduje selektywną ekspresję transgenu w neuronach piramidowych warstwy piątej, nawet przy użyciu nieselektywnego promotora.

Rozległa transdukcja mysich neuronów kory nowej przez wstrzyknięcie subbaraczynoidu AAV2

Poznaj mikroiniekcję wewnątrzjądrową cDNA do zdysocjowanych neuronów dorosłych ssaków. Ta metoda umożliwia skuteczną transfekcję komórek postmitotycznych i wysoką ekspresję białek w badaniach neurobiologii.

Wewnątrzjądrowa mikroiniekcja DNA do rozdzielonych neuronów dorosłych ssaków

Przeglądaj więcej filmów