Nowy reporter RFP wspomagający wizualizację tarczki wyobraźnej oka u Drosophila
15 grudnia 2009
Opisujemy nowy reporter w postaci czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), który jest specyficznie ekspresowany w oku Drosophila. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania tarczki wyobraźnej oka oraz sposób, w jaki reporter ten może pomóc w preparacji i identyfikacji konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku.
Nowa transgeniczna linia Drosophila z reporterem IRFP wykazuje ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP) w określonych komórkach tarczki wyobraźnięj oka. Linia transgeniczna ta może wspomóc identyfikację, wypreparowanie i znakowanie konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku. Aby wypreparować tarczkę wyobraźnią oka, larwy w stadium wędrującego trzeciego stadium są usuwane ze ścianek probówki za pomocą szpatułki.
Larwy umieszcza się następnie w kropli PBS na płytce z obrzeżem typu sill guard. Za pomocą pęsety oddziela się aparat gębowy z przymocowanymi krążkami ocznymi od reszty larwy, a następnie krążki oczne przenosi się na szkiełko przedmiotowe, gdzie oddziela się je od aparatu gębowego i mózgu. Witajcie, jestem Amna Cole z laboratorium Josepha Batemana w Wolfson Center for Age Related Diseases na King's College London.
Dzisiaj zaprezentujemy procedurę dyssekcji pryzmatycznych krążków oka u Drosophila. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania genów zaangażowanych w neurogenezę. Zacznijmy zatem.
Aby rozpocząć sekcję krążków wyobrażeniowych oka, nanieś kroplę PBS na szalkę Petriego powleczoną Sylgardem. Pod mikroskopem sekcyjnym powłoka Sylgard pomoże chronić pęsety przed uszkodzeniem podczas sekcji. Następnie, używając szpatułki, pobierz larwę trzeciego stadium i umieść ją w kropli PBS. Trzymając pęsety w obu dłoniach, chwyć larwę jedną z pęset w odległości dwóch trzecich w stronę końca tylnego. Teraz użyj drugiej pęsety, aby przytrzymać ciemne części gębowe na końcu przednim larwy.
Delikatnie rozsuń larwę, oddalając od siebie pęsety. Części gębowe powinny oddzielić się od reszty ciała wraz z kompleksem oko-mózg. Następnie nanieś kroplę PBS na szkiełko i przenieś krążki do kropli PBS, trzymając za części gębowe.
Teraz przełącz stereomikroskop w tryb fluorescencyjny; ponieważ RFP wykazują tylko tarczki imaginalne oka, można je łatwo zidentyfikować jako czerwona fluorescencyjna tkanka nakładająca się na sferyczne płaty optyczne, co zwiększa kontrast tarczek. Skieruj światłowodowe źródło zimnego światła pod kątem ukośnym do preparatu. Tarczki imaginalne oka są przytwierdzone do płatów optycznych za pomocą szypuły optycznej z tyłu oraz do części gębowych za pomocą szypuły pochodzącej z tarczki antenowej z przodu.
Aby wypreparować krążki wyobrażeniowe oka, przytrzymaj części jedną pęsetą, a drugą oddziel krążki wyobrażeniowe oka od mózgu larwy. Następnie oddziel krążki wyobrażeniowe oka od części gębowych. Po oddzieleniu części gębowych od krążków wyobrażeniowych oka, usuń je z okładki.
Przężerki oczne powinny teraz leżeć płasko na szkiełku i być wolne od jakichkolwiek zbędnych tkanek, w tym tkanki mózgowej. Kontynuuj preparowanie pozostałych przężerkach. Po wypreparowaniu wszystkich przężerkach ocznych delikatnie przechyl szkiełko i użyj małego kawałka ręcznika papierowego, aby osuszyć nadmiar PBS.
Teraz należy dodać kroplę medium montażowego vector shield i delikatnie położyć na wierzchu szkiełko nakrywkowe. Plasterki są teraz gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej. Jeśli obrazowanie ma odbyć się w późniejszym terminie, należy przechowywać preparat w temperaturze 4 °C.
RFP pozostanie widoczny przez co najmniej rok. Podczas obrazowania, obrazy serii Z powinny być pozyskiwane za pomocą mikroskopu konfokalnego lub Zeiss AxiOm z odstępem 1 µm, używając obiektywu 20x lub 40x; następnie, przy użyciu oprogramowania mikroskopu, można wygenerować obrazy projekcyjne. Krążki wyobraźnia much wykazujących ekspresję IRFP zostały wypreparowane i zabarwione Phalloidiną. Obrazowanie przeprowadzono następnie na mikroskopie Zeiss AxiOm z odstępem 1 µm, używając obiektywu 20x. Komórki krążka oka wykazujące ekspresję RFP są przedstawione na czerwono.
Bruzdę morfogenetyczną wizualizowano za pomocą barwienia foid, przedstawiono ją w kolorze zielonym. Bieguny grzbietowy i brzuszny tarczy oka są zakrzywione i wykazują tendencję do zwijania się. Sekcje te mogą zostać usunięte z końcowego obrazu projekcyjnego.
Chociaż tarcza jest nabłonkiem jednowarstwowym, zmienne położenie jąder komórkowych wymaga wykonania projekcji serii Z, aby uzyskać pełny obraz tarczy. Ponieważ reporter IRFP lokalizuje się w jądrze, widoczny tutaj wzór reprezentuje ekspresję RFP w jądrach. Właśnie zaprezentowaliśmy procedurę wycinania tarcz oka z larw drosophila.
Podczas wykonywania tej procedury najlepiej użyć precyzyjnej pęsety, a także warto w tym czasie zrezygnować z picia kawy. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we wszystkich eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie wprowadza nowatorski reporter w postaci czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), który jest specyficznie ekspresowany w oku Drosophila. Szczegółowo opisano metodologię wycinania tarczki wyobrażeniowej oka, demonstrując, w jaki sposób reporter ten pomaga w identyfikacji konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Genetyka
- Biologia komórki
Wstęp
- Czerwone białka fluorescencyjne są cennymi narzędziami do wizualizacji procesów komórkowych.
- Muszka owocowa (Drosophila) służy jako organizm modelowy do badania rozwoju oka.
- Zrozumienie typów komórek w oku jest kluczowe dla biologii rozwoju.
- Linie transgeniczne mogą usprawnić badanie specyficznych funkcji komórkowych.
Cel badania
- Opracowanie transgenicznej linii Drosophila wykazującej ekspresję RFP w oku.
- Przedstawienie metodologii wypreparowywania krążka wyobraźnego oka.
- Ułatwienie identyfikacji specyficznych typów komórek podczas rozwoju oka.
Zastosowane metody
- Utworzenie transgenicznej linii Drosophila z ekspresją RFP.
- Disekcja tarcz wyobraźnych oka z wędrujących larw trzeciego stadium.
- Zastosowanie PBS w celu utrzymania żywotności tkanek podczas disekcji.
- Identyfikacja i znakowanie specyficznych typów komórek w oku.
Główne wyniki
- Linia reporterowa IRFP Drosophila z sukcesem wykazuje ekspresję RFP w komórkach oka.
- Techniki sekcji umożliwiają wyraźną wizualizację struktur oka.
- Konkretne typy komórek mogą zostać zidentyfikowane i oznakowane przy użyciu reportera RFP.
- Niniejsza metodologia pogłębia zrozumienie rozwoju oka u Drosophila.
Wnioski
- Nowoczesny reporter RFP jest cennym narzędziem do badania rozwoju oka Drosophila.
- Opisane metody sekcji można zastosować w różnorodnych badaniach rozwojowych.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać to podejście w celu uzyskania głębszego wglądu w funkcje poszczególnych typów komórek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wizualizacja specyficznych typów komórek w tarczy wyobraźnej oka Drosophila przy użyciu reportera RFP zlokalizowanego w jądrze umożliwia precyzyjną identyfikację i wycięcie tkanek, co wspomaga badania nad wczesnym etapem neurogenezy i transdukcją sygnałów. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną w procesach walidacji celów i analizach genomiki funkcjonalnej, dostarczając przejrzystych i powtarzalnych wyników. Podejście to ma bezpośrednie zastosowanie w punktach zwrotnych etapu odkryć, gdzie biologiczna redukcja ryzyka oraz klarowność mechanistyczna są kluczowe dla rozwoju portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmanaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia jednoznaczny proces identyfikacji tkanki tarczki wyobraźnej oka w badaniach opartych na hipotezach.
- Pozwala na funkcjonalną walidację wzorców ekspresji genów w procesach neurogenezy i determinacji losu komórek.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez umożliwienie bezpośredniej wizualizacji ekspresji reportera w tkance żywej lub utrwalonej.
- Zwiększa pewność prognostyczną w analizie szlaków sygnałowych i wyborze celów terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zstandaryzowany odczyt oparty na fluorescencji do opracowywania testów w modelach oczu Drosophila.
- Umożliwia powtarzalne przygotowanie zwalidowanych próbek biologicznych do późniejszego obrazowania i analizy.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy poprzez eliminację konieczności stosowania etapów wzmocnienia sygnału.
- Zwiększa gotowość do przesiewania w celu oceny związków lub modyfikatorów genetycznych w szlakach neurorozwojowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami neurodegeneracji i transdukcji sygnału u Drosophila, które są istotne w kontekście badanych chorób.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez wspieranie rzetelnej charakterystyki fenotypowej.
- Przynosi wartość translacyjną, ułatwiając wizualizację biomarkerów w systemach podatnych na manipulacje genetyczne.
- Zmniejsza ryzyko w procesie wdrażania kandydatów posiadających zwalidowane podstawy mechanistyczne.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten system reporterowy RFP integruje się z wczesnym etapem procesu od odkrycia do identyfikacji kandydata na lek, wspierając testowanie hipotez, mapowanie szlaków oraz genomikę funkcjonalną w modelach Drosophila.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia bezpośrednią wizualizację ekspresji genów i architektury tkanek w badaniach opartych na hipotezach.
- Screening: Zapewnia solidny, ilościowy odczyt fluorescencji w celu standaryzacji i powtarzalności testów.
- Analityka: Wspiera obrazowanie o wysokiej rozdzielczości i statystyczne porównywanie wzorców ekspresji specyficznych dla danego typu komórek.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając screening fenotypowy istotny dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje możliwość ponownego wykorzystania genetycznie kodowanego systemu reporterowego w różnorodnych badaniach nad neurogenezą i transdukcją sygnału.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje procesy identyfikacji tkanek, obrazowania oraz pozyskiwania danych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywną alokację zasobów kapitałowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów w fazie odkrywania i badań przedklinicznych z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu genetyki Drosophila oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Niezbędny jest dostęp do platform obrazowania konfokalnego lub epifluorescencyjnego w celu przeprowadzenia analizy ilościowej.
- Wymagane są ustandaryzowane protokoły sekcji i obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności wyników między zespołami.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania w innych genetycznie modyfikowalnych systemach modelowych z odpowiednimi konstruktami reporterowymi.
- Procedura zależy od utrzymania linii transgenicznych oraz infrastruktury obrazowania.
