Name: Nowatorski reporter zapytania ofertowego pomagający w wizualizacji dysku wyobrażeniowego oka u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Poznaj metodę preparowania dysków wyobrażeniowych oka u Drosophila z wykorzystaniem reportera RFP. Technika ta umożliwia identyfikację i wizualizację określonych typów komórek w rozwijającym się oku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez King’s College London oraz Royal Society.

<ol>
 <li>Najpierw nanieś kroplę PBS na szalkę Sylgard pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
 <li>Następnie za pomocą szpatułki wyjmij z fiolki lub butelki kilka wędrujących larw trzeciego stadium i umieść je w PBS.</li>
 <li>Aby rozpocząć sekcję, użyj pęsety w lewej ręce (jeśli jesteś praworęczny), aby chwycić larwę w dwóch trzecich długości w kierunku tylnym, a następnie użyj drugiej pęsety, aby przytrzymać ciemne haczyki gębowe na końcu przednim.</li>
 <li>Teraz delikatnie rozdziel larwę, odsuwając obie pęsety od siebie. Aparat gębowy powinien oddzielić się od reszty ciała wraz z kompleksem oko/mózg.</li>
 <li>Aby zabarwić krążki oka do immunofluorescencji, utrwal krążki na tym etapie, umieszczając je w 4% roztworze paraformaldehydu/PBS na 30-45 minut w lodzie. Następnie przemyj krążki czterokrotnie w PBST i zabarw je odpowiednimi przeciwciałami.</li>
 <li>Najłatwiej jest przeprowadzić sekcję krążków oka bezpośrednio na szkiełku. Nanieś kroplę PBS na szkiełko i przenieś krążki do kropli PBS, trzymając za aparat gębowy.</li>
 <li>Tkanki imaginalne są półprzezroczyste, dlatego początkowo krążki oka są trudne do zidentyfikowania. Aby ułatwić ich identyfikację, użyj mikroskopu stereoskopowego z możliwością fluorescencji. Przy użyciu linii reporterowej eye-RFP krążki oka są wyraźnie widoczne jako czerwona fluorescencyjna tkanka nakładająca się na sferyczne płaty optyczne (Rycina 1).</li>
 <li>Jeśli używasz światłowodowego zimnego źródła światła, skieruj światło pod kątem skośnym do szkiełka, co zapewni krążkom większy kontrast. Krążki oka/antenalne są przyłączone do płatów optycznych za pomocą szypułek optycznych z tyłu oraz do aparatu gębowego za pomocą szypułki wychodzącej z krążka antenalnego z przodu.</li>
 <li>Aby wypreparować krążki oka, przytrzymaj aparat gębowy jedną pęsetą i użyj drugiej pęsety, aby oddzielić krążki oka od mózgu larwy. Następnie oddziel krążki oka od aparatu gębowego. Na koniec usuń aparat gębowy ze szkiełka, ponieważ może on uniemożliwić płaskie położenie szkiełka nakrywkowego.</li>
 <li>Po wypreparowaniu wszystkich krążków oka delikatnie przechyl szkiełko i osusz nadmiar PBS. Następnie dodaj kroplę Vectashield i delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe.</li>
 <li>Krążki są teraz gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej (Rycina 2).</li>
 </ol>
Reprezentatywne wyniki
Po prawidłowej sekcji tarczka oka/anteny powinna płasko spoczywać na szkiełku, bez żadnych tkanek obcych, takich jak mózg. Biegun grzbietowy i brzuszny tarczki oka są zakrzywione, przez co mają tendencję do zwijania się, ale można tego uniknąć, wykonując serię obrazów Z (Z-series) na mikroskopie konfokalnym i pomijając te sekcje w projekcji. Chociaż tarczka jest nabłonkiem jednowarstwowym, zmienne położenie jąder komórkowych wymaga wykonania projekcji serii Z w celu uzyskania ogólnego obrazu tarczki. Projekcja typowej tarczki oka/anteny eye-RFP wykonana na mikroskopie konfokalnym przedstawiona jest na rysunku 2. Zazwyczaj wykonujemy sekcje o grubości 1 μm przez tarczkę, używając obiektywu 20x lub 40x. Reporter eye-RFP lokalizuje się w jądrach, zatem wzór widoczny na rysunku 2 reprezentuje jądra komórek wykazujących ekspresję RFP.
<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig1.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej płatów węchowych; zaznaczona tkanka nerwowa z czerwoną fluorescencją." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="rycina 1"> Rycina 1. Wstępna dysekcja kompleksu oko/mózg z larwy Drosophila trzeciego stadium z markerem eye-RFP. Tarcza imaginalna oka/czułka (obrysowana) jest przytwierdzona do części gębowych (MP) i nakłada się na płat wzrokowy (OL) mózgu. Obraz wykonano przy użyciu stereomikroskopu fluorescencyjnego, aby ukazać ekspresję RFP w tarczy oka. Strona przednia znajduje się po lewej. Pasek skali: 300 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna tarczek oka Drosophila; faloidyna znakuje aktynę (zielony), RFP znakuje białka (czerwony)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="rycina 2"> Rycina 2. Ekspresja reportera eye-RFP w tarczce imaginalnej oka. Tarczka oka (ED)/czułkowa (AD) trzeciego stadium larwalnego wypreparowana z larwy eye-RFP, wykazująca ekspresję RFP (czerwony). Tarczkę barwiono faloidyną (zielony), która barwi apikalne powierzchnie komórek i uwidacznia bruzdę morfogenetyczną (grot strzałki). RFP wykazuje ekspresję w komórkach prekursorowych wokół bruzdy morfogenetycznej, w fotoreceptorach 1, 6, 7 oraz w komórkach stożkowych. Strona przednia znajduje się po lewej stronie. Pasek skali: 25 μm.

<ol><li>Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).</li>
<li>Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).</li>
</ol>

Disekcja krążka wyobraźniczego oka Drosophila jest prosta, ale jej opanowanie może wymagać czasu. Kluczowe etapy to identyfikacja krążka oka oraz jego oddzielenie od larwalnego mózgu. Identyfikacja krążka oka jest ułatwiona dzięki zastosowaniu linii eye-RFP opisanej w niniejszym materiale. Możliwe modyfikacje obejmują usunięcie krążka czuciwego lub błony peripodialnej, bądź pozostawienie przyłączonego płata optycznego w celu wizualizacji aksonów PR wchodzących do mózgu.
Linia eye-RFP...

nowy reporter rfp wspomagający wizualizację tarczki wyobraźnej oka u drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

TheDrosophilaoko jest potężnym systemem modelowym do badania takich obszarów jak neurogeneza, transdukcja sygnału i neurodegeneracja. Wiele odkryć dokonanych przy użyciu tego systemu wykorzystywało spatiotemporalny charakter różnicowania się fotoreceptorów w rozwijającym się dysku wyobrażeniowym oka. Aby korzystać z tego systemu, badacz musi najpierw nauczyć się identyfikować i wypreparowywać dysk oka. Opisujemy nowy reporter RFP, który pomaga w identyfikacji dysku oka oraz wizualizacji specyficznych typów komórek w rozwijającym się oku. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania dysku wyobrażeniowego oka z larw trzeciego instaru i opisujemy, w jaki sposób reporter eye-RFP może wspomóc ten proces. Reporter eye-RFP jest wyrażany wyłącznie w oku i może być wizualizowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zarówno w żywej tkance, jak i po utrwaleniu, bez konieczności amplifikacji sygnału. Pokazujemy również, jak ten reporter może być wykorzystany do identyfikacji specyficznych typów komórek w obrębie dysku oka. Niniejszy protokół oraz zastosowanie reportera eye-RFP pomogą badaczom wykorzystującym tenDrosophilaoko, aby odpowiedzieć na fundamentalnie ważne pytania biologiczne.

Opisujemy nowy reporter w postaci czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), który jest specyficznie ekspresowany w oku Drosophila. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania tarczki wyobraźnej oka oraz sposób, w jaki reporter ten może pomóc w preparacji i identyfikacji konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku.

Nowy reporter RFP wspomagający wizualizację tarczki wyobraźnej oka u Drosophila

Oko muszki owocówki *Drosophila* stanowi potężny system modelowy do badania takich obszarów jak neurogeneza, transdukcja sygnału i neurodegeneracja. Wiele odkryć...

Nowa transgeniczna linia Drosophila z reporterem IRFP wykazuje ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP) w określonych komórkach tarczki wyobraźnięj oka. Linia transgeniczna ta może wspomóc identyfikację, wypreparowanie i znakowanie konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku. Aby wypreparować tarczkę wyobraźnią oka, larwy w stadium wędrującego trzeciego stadium są usuwane ze ścianek probówki za pomocą szpatułki.Larwy umieszcza się następnie w kropli PBS na płytce z obrzeżem typu sill guard. Za pomocą pęsety oddziela się aparat gębowy z przymocowanymi krążkami ocznymi od reszty larwy, a następnie krążki oczne przenosi się na szkiełko przedmiotowe, gdzie oddziela się je od aparatu gębowego i mózgu. Witajcie, jestem Amna Cole z laboratorium Josepha Batemana w Wolfson Center for Age Related Diseases na King's College London.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę dyssekcji pryzmatycznych krążków oka u Drosophila. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania genów zaangażowanych w neurogenezę. Zacznijmy zatem.Aby rozpocząć sekcję krążków wyobrażeniowych oka, nanieś kroplę PBS na szalkę Petriego powleczoną Sylgardem. Pod mikroskopem sekcyjnym powłoka Sylgard pomoże ch

a-novel-rfp-reporter-to-aid-visualization-eye-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nowy reporter RFP do pomocy w wizualizacji tarczy ocznej w Drosophila

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

W niniejszym materiale przedstawiono standardowe podejście do przygotowania oczu dorosłych osobników Drosophila do wykonywania półcienkich przekrojów oraz analizy pod mikroskopem świetlnym. Protokół ten może być stosowany do ogólnej analizy morfologicznej wad oka lub, po wprowadzeniu wskazanych modyfikacji, do określania wymagań genetycznych genów w konkretnych typach komórek oka (np. analiza klonalna fotoreceptorów) bądź do analizy pod mikroskopem elektronowym.

Przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Źródło: Hellerman, M. B., et al. Obrazowanie na żywo Drosophila Oko poczwarki. J. Vis. exp. (2015){{TAG_ 28}}Film demonstruje technikę obrazowania na żywo do badania wzorców oczu u poczwarki Drosophila melanogaster. Markery znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) umożliwiają wizualizację organizacji i różnicowania komórek podczas tworzenia rozwijającej się struktury oka.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Metoda Tomato/GFP-FLP/FRT polega na wizualizacji mozaikowych komórek fotoreceptorowych u żywych Drosophila. Może być używany do śledzenia losów poszczególnych komórek fotoreceptorowych w siatkówce przez kilka dni lub tygodni. Metoda ta idealnie nadaje się do badań nad zwyrodnieniami siatkówki i chorobami neurodegeneracyjnymi czy rozwojem komórek fotoreceptorowych.

Metoda pomidorów/GFP-FLP/FRT do obrazowania na żywo mozaikowych dorosłych komórek fotoreceptorowych Drosophila

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Celem tej techniki jest umożliwienie naukowcom przeprowadzenia sekcji, barwienia immunologicznego i montażu krążków z oczami poczwarek Drosophila melanogaster w każdym wieku.

Wypreparowanie i montaż krążków ocznych poczwarki Drosophila

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Ten protokół opisuje szczegółową metodę długoterminowej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo wyobrażonego dysku Drosophila. Pokazuje różnicowanie fotoreceptorów i rotację ommatidialną w ciągu 10 godzin obrazowania na żywo tarczy oka. Protokół jest prosty i nie wymaga kosztownej konfiguracji.

Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila

Czas ekspozycji na ligandy może mieć wpływ na ich konsekwencje rozwojowe. Tutaj pokazujemy, jak obrazować uwalnianie białka morfogenetycznego kości Drosophila (BMP) o nazwie Dpp z komórek dysku skrzydła.

Obrazowanie uwalniania DPP z dysku skrzydła Drosophila

Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Poznaj metodę preparowania dysków wyobrażeniowych oka u Drosophila z wykorzystaniem reportera RFP. Technika ta umożliwia identyfikację i wizualizację określonych typów komórek w rozwijającym się oku.

Nowy reporter RFP wspomagający wizualizację tarczki wyobraźnej oka u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów