Name: Przygotowanie zarodków do mikroskopii elektronowej embrionalnej rurki serca Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-21T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę przygotowania zarodków Drosophila do mikroskopii elektronowej transmisyjnej. Technika umożliwia wizualizację światła serca i błony podstawnej w badaniach morfogenezy serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nasze prace nad formowaniem rurki serca były wspierane przez grant National Science Foundation (numer przyznania 0744165) przyznany S.G.K.

<ol>
<li>Przygotuj na świeżo 2ml roztworu utrwalającego zawierającego 12,5% glutaraldehydu w 50mM buforze kakodylanowym (pH7,4) w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. Dodaj 8ml n-heptanu i energicznie wstrząśnij. Pozostaw do rozdzielenia się dwóch faz. Usuń górną fazę zawierającą n-heptan nasycony glutaraldehydem, przelej ją do czystej fiolki scyntylacyjnej i odstaw. Będzie to roztwór utrwalający.</li>
<li>Zbierz embriony w wieku 0-20 godzin za pomocą komory do zbierania embrionów, która stanowi mały koszyczek z wyjmowanym wkładem siatkowym. Usuń zewnętrzną błonę chorionową, namaczając embriony w 50% roztworze wybielacza przez 2-3 minuty lub do momentu, aż embriony wypłyną na powierzchnię. Dokładnie wypłucz wodą ddH20 i osusz embriony na ręczniku papierowym.</li>
<li>Za pomocą pęsety chwyć wkład siatkowy pokryty zdechorionowanymi embrionami i umieść go w roztworze utrwalającym, pozwalając embrionom opaść z siatki. Pozostaw embriony do utrwalenia na 1,5 godziny w temperaturze 4°C, mieszając na nutatorze.</li>
<li>Przygotuj szalkę Petriego wyłożoną taśmą dwustronną. Usuń embriony z utrwalacza za pomocą pipety Pasteura i umieść je na klejącej powierzchni szalki Petriego. Przenieś embriony w minimalnej ilości roztworu utrwalającego, aby zapobiec rozpuszczeniu kleju taśmy przez heptan zawarty w utrwalaczu. Wstrząśnij szalką Petriego, aby utworzyć pojedynczą warstwę embrionów. Umieść szalkę Petriego w dygestorium do czasu odparowania heptanu. Dodaj odpowiednią ilość PBS + 0,1% Tween20, aby przykryć embriony. Przeprowadź ręczną dewitellinizację embrionów w późnej fazie 16 pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą tępej igły wolframowej. Zbierz embriony pipetą Pasteura do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml. Kroki 5-7 wykonuje się w tej probówce.</li>
<li>Wypłucz embriony w 0,1M buforze kakodylanowym o pH 7,4, a następnie przeprowadź postutrwalanie w roztworze zawierającym 1% czterotlenku osmu w 0,1M buforze kakodylanowym o pH 7,4 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wypłucz embriony 0,1M buforze kakodylanowym o pH 7,4.</li>
<li>Odwodnij embriony w stopniowanej serii etanolu i acetonu. Odwodnij embriony w 50% etanolu przez 10 minut, a następnie w 70% etanolu przez 10 minut. Następnie odwodnij w 90% acetonie przez 10 minut oraz w dwóch krokach w 100% acetonie po 10 minut każdy.</li>
<li>Usuń aceton, a następnie rozpocznij proces infiltracji, dodając do embrionów mieszaninę żywicy Epon-Spurr i acetonu w stosunku 1:1. Naświetlaj w mikrofalówce Pelco Biowave Pro przez trzy minuty, utrzymując próbkę pod ciśnieniem próżniowym. Stosuj ciśnienie próżniowe do próbki przez dodatkowe pięć minut po zakończeniu pracy mikrofalówki. Wymień mieszaninę żywicy i acetonu 1:1 na 100% żywicę Epon-Spurr i ponownie naświetlaj w mikrofalówce pod ciśnieniem próżniowym. Wymień 100% żywicę Epon-Spurr po raz ostatni i naświetlaj w mikrofalówce pod ciśnieniem próżniowym.</li>
<li>Za pomocą pipety Pasteura przenieś embriony z probówki mikrocentryfugowej do silikonowej formy do zatapiania. Ustaw embriony w rzędzie tak, aby koniec tylny embrionu był wyrównany z zwężonym brzegiem formy. Wygrzewaj w piecu w temperaturze 70°C przez noc.</li>
<li>Wyjmij próbkę i przygotuj ją do krojenia.</li>
<li>Rozpocznij wycinanie sekcji o grubości 1μm przy użyciu noża diamentowego Histo Knife i mikrotomu Richert Ultracut E. Odnotuj moment dotarcia do pierwszej sekcji embrionu. Od tego punktu wytnij 100μm w głąb próbki. Pobierz sekcję za pomocą pętli i umieść ją na szkiełku przedmiotowym. Krótko podgrzej sekcję na płytce grzejnej. Zabarw sekcję za pomocą kropli błękitu metylenowego. Pod mikroskopem świetlnym zidentyfikuj światło serca.</li>
<li>Wytnij sekcje o grubości 90nm przy użyciu noża diamentowego Ultra 45° i mikrotomu Richert Ultracut E. Pobierz wiele sekcji na siatkę miedzianą.</li>
<li>Siatki barwi się 3% octanem uranylu nasyconym w 50% etanolu przez dziesięć minut, a następnie płucze trzy razy w wodzie dwukrotnie destylowanej. Następnie siatki barwi się cytrynianem ołowiu (0,04g rozpuszczone w 10ml wody dwukrotnie destylowanej i 100ml 10M NaOH) przez 2,5 minuty w komorze zawierającej granulki NaOH w celu stworzenia środowiska wolnego od CO2. Siatki płucze się trzy razy w wodzie dwukrotnie destylowanej.</li>
<li>Sekcje są badane za pomocą mikroskopu elektronowego JEOL 1200EX przy 80Kv i fotografowane cyfrową kamerą AMT.</li>
</ol>

<ol><li>Tepass, U., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+Cellular+Junctions+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo.</a> Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , (2000).</li>
<li>Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsion+by+Slit+and+Roundabout+prevents+Shotgun%2FE-cadherin-mediated+cell+adhesion+during+Drosophila+heart+tube+lumen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation.</a> J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).</li>
</ol>

Morfogeneza embrionalnej rurki serca Drosophila stała się cennym systemem modelowym do badania adhezji komórek i zmian ich kształtu podczas rozwoju embrionalnego. Jednym z wyzwań w badaniu tej struktury jest trudność w wizualizacji światła rurki serca w całych embrionach. Technika zaprezentowana w tym filmie, zaadaptowana z wcześniej opisanych procedur 1-2, okazała się skuteczna w wydajnej i niezawodnej analizie znacznej liczby genotypów pod kątem formowania się rurki serca i jej światła3.

przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów drosophila

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

MorfogenezaDrosophilazarodkowa rurka serca stała się cennym modelem badawczym do studiowania migracji komórek, adhezji międzykomórkowej oraz zmian kształtu komórek podczas rozwoju zarodkowego. Jednym z wyzwań w badaniu tej struktury jest fakt, że światło rurki serca, jak również cechy błonowe kluczowe dla formowania się rurki serca, są trudne do wizualizacji w całych zarodkach ze względu na niewielki rozmiar rurki serca i przestrzeni wewnątrzświatłowej w stosunku do zarodka. Zastosowanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej umożliwia większe powiększenie tych struktur i daje możliwość badania zarodków w przekroju poprzecznym, co pozwala łatwo określić rozmiar i kształt światła. W tym filmie szczegółowo opisujemy proces niezawodnej fiksacji, zatapiania i krojenia późnych stadiówDrosophilazarodki w celu wizualizacji światła rurki serca, a także istotnych struktur komórkowych, w tym połączeń międzykomórkowych i błony podstawnej.

Opisujemy proces utrwalania, zatapiania, krojenia i obrazowania późnych stadiów embrionów Drosophila do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu badania embrionalnej rurki serca. Technika ta umożliwia wizualizację światła rurki serca, a także błony podstawnej wyścielającej światło serca.

Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Morfogeneza embrionalnej rurki serca Drosophila stała się cennym systemem modelowym do badania migracji komórek, adhezji międzykomórkowej oraz komórek...

W tym filmie wyjaśniono, jak przeprowadzić transmisyjną mikroskopię elektronową, znaną również jako TEM, w przypadku serca embrionalnego drozofilid. Serce stało się cennym systemem modelowym do badania migracji komórek, adhezji międzykomórkowej oraz zmian kształtu komórek. Technika ta umożliwia wizualizację kształtu światła serca, a także komponentów ultrastrukturalnych, takich jak błony komórkowe, połączenia międzykomórkowe i błona podstawna.Aby rozpocząć tę procedurę, przygotowuje się roztwór utrwalający odpowiedni do transmisyjnej mikroskopii elektronowej embrionów drozozili. Następnie embriony z powłokami, zebrane w przedziale czasowym od 0 do 20 godzin, umieszcza się w roztworze utrwalającym. Po zakończeniu procesu embriony wyjmuje się z roztworu utrwalającego i przekłada na taśmę dwustronną w celu ułatwienia dalszej manipulacji.W szalce Petri zawierającej bufor zdemineralizowany zarodki unoszą się w buforze i są odzyskiwane za pomocą pipety. Następnie zarodki są utrwalane i poddawane gradientowi odwodnienia. Po infiltracji żywicą są przenoszone do formy do odlewu, gdzie zostają ułożone.Otrzymany blok jest cięty nożem diamentowym. Przekroje są przenoszone na siatki miedziane, barwione i analizowane. Cześć, jestem Nadine Lop z laboratorium Sunity Kramer w Katedrze Patologii i Medycyny Laboratoryjnej na Uniwersytecie Medycyny i Stomatologii New Jersey w Robert Wood Johnson Medical School.Nazywam się Raj Patel. Jestem mikroskopistą elektronowym z jednostki patologii PON. Dzisiaj przedstawimy procedurę przygotowania i obrazowania embrionów oph do transmisyjnej mikroskopii elektronowej.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania morfogenezy serca Drosophila. Zatem zacznijmy.Przed przystąpieniem do pracy z zarodkami drosophila należy świeżo przygotować roztwór utrwalający do metody utrwalania zarodków z wykorzystaniem permeabilizacji heptanem. W dygestorium pipetować 2 mL świeżo przygotowanego roztworu zawierającego 12,5% glutaraldehydu w buforze Cate do szklanej fiolki scyntylacyjnej. Dodać 8 mL heptanu ADA i energicznie wstrząsnąć.Następnie odczekaj jedną minutę. Po rozdzieleniu się dwóch faz górna faza zawiera heptan ADA nasycony glutaraldehydem, który stanowi roztwór utrwalający. Przenieś górną fazę pipetą do czystej probówki i odstaw ją. Aby zebrać embriony w wieku od 0 do 20 godzin, użyj komory do zbierania embrionów, która stanowi niewielki koszyk z wyjmowanym wkładem z siatki.Zacznij od wyjęcia płytki z sokiem z winogron zawierającej embriony i usuń wszystkie martwe muchy. Następnie, używając wody i pędzelka, odklej embriony od płytki z sokiem z winogron i przenieś je do komory zbierania embrionów za pomocą butelki z rozpylaczem zawierającej wodę.Opłucz embriony, aby usunąć nadmiar drożdży z płytki z sokiem winogronowym. Usuń zewnętrzną błonę chorionową, namaczając embriony w 50% roztworze wybielacza przez dwie do trzech minut lub do momentu, aż embriony wypłyną na powierzchnię. Dokładnie opłucz je wodą destylowaną i osusz embriony na ręczniku papierowym.Za pomocą pęsety podnieś wkład siatkowy, który powinien być teraz pokryty powleczonymi embrionami. Umieść wkład w utrwalaczu, pozwalając embrionom opaść z siatki. Pozostaw embriony do utrwalenia przez półtorej godziny w temperaturze 4 °C, mieszając je na wytrząsarce orbitalnej.Po zakończeniu inkubacji przenieś embriony do szalki Petriego wyłożonej dwustronną taśmą, zabierając jak najmniej utrwalacza. Potrząśnij szalką, aby rozłożyć embriony w jednej warstwie, a następnie umieść ją w dygestorium chemicznym, aby heptan mógł odparować. Po wyschnięciu embrionów przykryj je buforem zawierającym 0,1% tween hand de vize.Zarodki w późnym stadium 16 pod mikroskopem stereoskopowym z użyciem tępej igły wolframowej. Zarodki, które zostały poddane procesowi, unoszą się i mogą być odzyskane za pomocą pipety Pasteura; przenieś zarodki do probówki mikroodśrodkowej o pojemności 1,5 mililitra. Przepłucz zarodki w 0,1 molarnym buforze CASTE, a następnie przeprowadź postfiksację w 1% cztetlenku osmu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Po inkubacji przemyj zarodki buforem Cate. Ponownie odwodnij zarodki w serii roztworów etanolu i acetonu o rosnącym stężeniu. Rozpocznij od 50% etanolu przez 10 minut, następnie 70% etanolu przez 10 minut, potem odwodnij w 90% acetonie przez 10 minut i na koniec w 100% acetonie w krokach po 10 minut każdy.Usuń aceton. Rozpocznij proces infiltracji, dodając mieszaninę żywicy w sprayu i acetonu w stosunku jeden do jednego. Upewnij się, że próbka znajduje się pod ciśnieniem próżniowym, a następnie naświetlaj w mikrofalach przez trzy minuty.Utrzymaj ciśnienie próżniowe przez dodatkowe pięć minut. Wymień mieszaninę żywicy i acetonu na 100% żywicy, a następnie ponownie poddaj działaniu mikrofal pod ciśnieniem próżniowym. Wymień żywicę i poddaj działaniu mikrofal pod ciśnieniem.Powtórz czynność ostatni raz, aby uzyskać łącznie trzy etapy infiltracji. Przenieś embriony z probówki do mikrocentryfugi do silikonowej formy do zatapiania. Ułóż embriony w rzędzie w taki sposób, aby ich koniec tylny znajdował się przy zwężonej krawędzi formy.Boczek pozostawiono w temperaturze 70 °C w piekarniku przez noc. Następnie wyjęto powstały blok w celu wykonania skrawków. Używając mikrotomu, wykonano skrawki o grubości 1 µm z embrionów.Po przecięciu bloku i dotarciu do zarodka, użyj pętli, aby przenieść pojedynczy przekrój na szkiełko przedmiotowe, by przed przystąpieniem do wizualizacji sprawdzić, czy osiągnięto właściwą głębokość pozwalającą na uwidocznienie serca. Krótko podgrzej przekrój na płytce grzejnej i zabarw go błękitem metylowym, dodając najpierw kroplę barwnika na szkiełko, a następnie ponownie krótko podgrzewając.Ponownie wypłucz oddejonizowaną wodą i obejrzyj przekrój pod mikroskopem na pożądanej głębokości cięcia. Światło serca powinno być rozpoznawalne pod mikroskopem świetlnym, aby spełnić wymogi dotyczące przestrzeni. Ponownie przytnij blok tak, aby w przekroju poprzecznym znajdowało się maksymalnie pięć embrionów z widocznym sercem embrionalnym.Wyciąć przekroje o grubości 90 nanometrów za pomocą mikrotomu. Przenieść kilka przekrojów na siatkę miedzianą. Zbarwić siatkę 3% octanem al przez 10 minut, a następnie przepłukać trzykrotnie wodą destylowaną.Następnie zabarw siatkę cytrynianem ołowiu przez dwie i pół minuty w komorze zawierającej granulki wodorotlenku sodu, aby stworzyć środowisko wolne od dwutlenku węgla. Po inkubacji wypłucz trzy razy wodą destylowaną. Przebadaj preparaty za pomocą mikroskopu elektronowego przy napięciu 80 kV i wykonaj zdjęcia za pomocą kamery CCD.Aby ustalić, czy głębokość cięcia i etapowanie zostały przeprowadzone prawidłowo, powinno być widoczne, że między dwoma kardioblastami linii środkowej grzbietowej utworzyło się dojrzałe światło serca. Aby ocenić, czy błony komórkowe są nienaruszone, należy zbadać światło serca pod kątem obecności macierzy pozakomórkowej oraz poszukać obecności grzebieni i mitochondriów. W ten sposób zaprezentowaliśmy metodę określania ultrastruktury zarodkowego serca Drosophila. Podczas wykonywania tej procedury.Ważne jest, aby pamiętać o prawidłowym określeniu stadium rozwoju embrionów drosophila oraz o dokładnym odmierzeniu składników żywicy i ich starannym wymieszaniu. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

preparation-embryos-for-electron-microscopy-drosophila-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie zarodków do mikroskopii elektronowej Drosophila zarodka rury sercowej

Technika ta umożliwia odsłonięcie układu nerwowo-mięśniowego embrionów Drosophila do przeprowadzenia immunohistochemii lub rejestracji elektrofizjologicznej. Jest ona przydatna do badania wczesnych etapów rozwoju nerwowo-mięśniowego lub wykonywania badań elektrofizjologicznych u mutantów, które nie są w stanie wykluć się z jaj.

Zbieranie i przygotowywanie embrionów Drosophila do rejestracji elektrofizjologicznej i innych procedur

Przedstawiono technikę niezbędną do wizualizacji bijącego serca w larwalnym i dorosłym stadium rozwoju Drosophila. Każdy etap cyklu życiowego wymaga zastosowania odmiennej metodologii.

Wizualizacja bijącego serca u Drosophila

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Ten film opisuje dorosłe serce muchy, inaczej zwane naczyniem grzbietowym Drosophila. Przedstawiony protokół przedstawia procedurę preparacji preparatów z żywym sercem.

Przygotowanie serca Drosophila: technika badania fizjologii serca u dorosłej muchy

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Klasycznie, wsierdzie zarodka zarodka zastawki myszy zostało przeanalizowane za pomocą przekrojów poprzecznych, czołowych lub strzałkowych. Nasze nowatorskie podejście do dwuwymiarowego obrazowania wsierdzia en face w regionach walwugennych umożliwia analizę polaryzacji planarnej i rearanżacji komórek wsierdzia podczas rozwoju zastawki.

En Face Przygotowanie poduszki wsierdzia do planarnej analizy morfogenezy u zarodków myszy

Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli i obrazowania embrionów myszy, który umożliwia obrazowanie 3D + czasowe komórek progenitorowych serca. Ten zestaw narzędzi wideo omawia kluczowe umiejętności wymagane do skutecznego obrazowania na żywo, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia z publikacji tekstowych.

Obrazowanie na żywo wczesnych progenitorów serca w zarodku myszy

Poznaj metodę przygotowania zarodków Drosophila do mikroskopii elektronowej transmisyjnej. Technika umożliwia wizualizację światła serca i błony podstawnej w badaniach morfogenezy serca.

Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Przeglądaj więcej filmów