Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

W tym filmie wyjaśniono, jak przeprowadzić transmisyjną mikroskopię elektronową, znaną również jako TEM, w przypadku serca embrionalnego drozofilid. Serce stało się cennym systemem modelowym do badania migracji komórek, adhezji międzykomórkowej oraz zmian kształtu komórek. Technika ta umożliwia wizualizację kształtu światła serca, a także komponentów ultrastrukturalnych, takich jak błony komórkowe, połączenia międzykomórkowe i błona podstawna.

Aby rozpocząć tę procedurę, przygotowuje się roztwór utrwalający odpowiedni do transmisyjnej mikroskopii elektronowej embrionów drozozili. Następnie embriony z powłokami, zebrane w przedziale czasowym od 0 do 20 godzin, umieszcza się w roztworze utrwalającym. Po zakończeniu procesu embriony wyjmuje się z roztworu utrwalającego i przekłada na taśmę dwustronną w celu ułatwienia dalszej manipulacji.

W szalce Petri zawierającej bufor zdemineralizowany zarodki unoszą się w buforze i są odzyskiwane za pomocą pipety. Następnie zarodki są utrwalane i poddawane gradientowi odwodnienia. Po infiltracji żywicą są przenoszone do formy do odlewu, gdzie zostają ułożone.

Otrzymany blok jest cięty nożem diamentowym. Przekroje są przenoszone na siatki miedziane, barwione i analizowane. Cześć, jestem Nadine Lop z laboratorium Sunity Kramer w Katedrze Patologii i Medycyny Laboratoryjnej na Uniwersytecie Medycyny i Stomatologii New Jersey w Robert Wood Johnson Medical School.

Nazywam się Raj Patel. Jestem mikroskopistą elektronowym z jednostki patologii PON. Dzisiaj przedstawimy procedurę przygotowania i obrazowania embrionów oph do transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania morfogenezy serca Drosophila. Zatem zacznijmy.

Przed przystąpieniem do pracy z zarodkami drosophila należy świeżo przygotować roztwór utrwalający do metody utrwalania zarodków z wykorzystaniem permeabilizacji heptanem. W dygestorium pipetować 2 mL świeżo przygotowanego roztworu zawierającego 12,5% glutaraldehydu w buforze Cate do szklanej fiolki scyntylacyjnej. Dodać 8 mL heptanu ADA i energicznie wstrząsnąć.

Następnie odczekaj jedną minutę. Po rozdzieleniu się dwóch faz górna faza zawiera heptan ADA nasycony glutaraldehydem, który stanowi roztwór utrwalający. Przenieś górną fazę pipetą do czystej probówki i odstaw ją. Aby zebrać embriony w wieku od 0 do 20 godzin, użyj komory do zbierania embrionów, która stanowi niewielki koszyk z wyjmowanym wkładem z siatki.

Zacznij od wyjęcia płytki z sokiem z winogron zawierającej embriony i usuń wszystkie martwe muchy. Następnie, używając wody i pędzelka, odklej embriony od płytki z sokiem z winogron i przenieś je do komory zbierania embrionów za pomocą butelki z rozpylaczem zawierającej wodę.

Opłucz embriony, aby usunąć nadmiar drożdży z płytki z sokiem winogronowym. Usuń zewnętrzną błonę chorionową, namaczając embriony w 50% roztworze wybielacza przez dwie do trzech minut lub do momentu, aż embriony wypłyną na powierzchnię. Dokładnie opłucz je wodą destylowaną i osusz embriony na ręczniku papierowym.

Za pomocą pęsety podnieś wkład siatkowy, który powinien być teraz pokryty powleczonymi embrionami. Umieść wkład w utrwalaczu, pozwalając embrionom opaść z siatki. Pozostaw embriony do utrwalenia przez półtorej godziny w temperaturze 4 °C, mieszając je na wytrząsarce orbitalnej.

Po zakończeniu inkubacji przenieś embriony do szalki Petriego wyłożonej dwustronną taśmą, zabierając jak najmniej utrwalacza. Potrząśnij szalką, aby rozłożyć embriony w jednej warstwie, a następnie umieść ją w dygestorium chemicznym, aby heptan mógł odparować. Po wyschnięciu embrionów przykryj je buforem zawierającym 0,1% tween hand de vize.

Zarodki w późnym stadium 16 pod mikroskopem stereoskopowym z użyciem tępej igły wolframowej. Zarodki, które zostały poddane procesowi, unoszą się i mogą być odzyskane za pomocą pipety Pasteura; przenieś zarodki do probówki mikroodśrodkowej o pojemności 1,5 mililitra. Przepłucz zarodki w 0,1 molarnym buforze CASTE, a następnie przeprowadź postfiksację w 1% cztetlenku osmu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji przemyj zarodki buforem Cate. Ponownie odwodnij zarodki w serii roztworów etanolu i acetonu o rosnącym stężeniu. Rozpocznij od 50% etanolu przez 10 minut, następnie 70% etanolu przez 10 minut, potem odwodnij w 90% acetonie przez 10 minut i na koniec w 100% acetonie w krokach po 10 minut każdy.

Usuń aceton. Rozpocznij proces infiltracji, dodając mieszaninę żywicy w sprayu i acetonu w stosunku jeden do jednego. Upewnij się, że próbka znajduje się pod ciśnieniem próżniowym, a następnie naświetlaj w mikrofalach przez trzy minuty.

Utrzymaj ciśnienie próżniowe przez dodatkowe pięć minut. Wymień mieszaninę żywicy i acetonu na 100% żywicy, a następnie ponownie poddaj działaniu mikrofal pod ciśnieniem próżniowym. Wymień żywicę i poddaj działaniu mikrofal pod ciśnieniem.

Powtórz czynność ostatni raz, aby uzyskać łącznie trzy etapy infiltracji. Przenieś embriony z probówki do mikrocentryfugi do silikonowej formy do zatapiania. Ułóż embriony w rzędzie w taki sposób, aby ich koniec tylny znajdował się przy zwężonej krawędzi formy.

Boczek pozostawiono w temperaturze 70 °C w piekarniku przez noc. Następnie wyjęto powstały blok w celu wykonania skrawków. Używając mikrotomu, wykonano skrawki o grubości 1 µm z embrionów.

Po przecięciu bloku i dotarciu do zarodka, użyj pętli, aby przenieść pojedynczy przekrój na szkiełko przedmiotowe, by przed przystąpieniem do wizualizacji sprawdzić, czy osiągnięto właściwą głębokość pozwalającą na uwidocznienie serca. Krótko podgrzej przekrój na płytce grzejnej i zabarw go błękitem metylowym, dodając najpierw kroplę barwnika na szkiełko, a następnie ponownie krótko podgrzewając.

Ponownie wypłucz oddejonizowaną wodą i obejrzyj przekrój pod mikroskopem na pożądanej głębokości cięcia. Światło serca powinno być rozpoznawalne pod mikroskopem świetlnym, aby spełnić wymogi dotyczące przestrzeni. Ponownie przytnij blok tak, aby w przekroju poprzecznym znajdowało się maksymalnie pięć embrionów z widocznym sercem embrionalnym.

Wyciąć przekroje o grubości 90 nanometrów za pomocą mikrotomu. Przenieść kilka przekrojów na siatkę miedzianą. Zbarwić siatkę 3% octanem al przez 10 minut, a następnie przepłukać trzykrotnie wodą destylowaną.

Następnie zabarw siatkę cytrynianem ołowiu przez dwie i pół minuty w komorze zawierającej granulki wodorotlenku sodu, aby stworzyć środowisko wolne od dwutlenku węgla. Po inkubacji wypłucz trzy razy wodą destylowaną. Przebadaj preparaty za pomocą mikroskopu elektronowego przy napięciu 80 kV i wykonaj zdjęcia za pomocą kamery CCD.

Aby ustalić, czy głębokość cięcia i etapowanie zostały przeprowadzone prawidłowo, powinno być widoczne, że między dwoma kardioblastami linii środkowej grzbietowej utworzyło się dojrzałe światło serca. Aby ocenić, czy błony komórkowe są nienaruszone, należy zbadać światło serca pod kątem obecności macierzy pozakomórkowej oraz poszukać obecności grzebieni i mitochondriów. W ten sposób zaprezentowaliśmy metodę określania ultrastruktury zarodkowego serca Drosophila. Podczas wykonywania tej procedury.

Ważne jest, aby pamiętać o prawidłowym określeniu stadium rozwoju embrionów drosophila oraz o dokładnym odmierzeniu składników żywicy i ich starannym wymieszaniu. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.