Pomiar współczynników dyfuzji poprzez odzysk fluorescencji dwufotonowej po fotowybielaniu
26 lutego 2010
W tym artykule opiszemy procedurę pomiaru współczynników dyfuzji za pomocą odzyskiwania fluorescencji wielofotonowej po fotowybielaniu. Zaczniemy od wyrównania lasera wzdłuż ścieżki optycznej do próbki i określenia odpowiednich parametrów eksperymentalnych, a następnie będziemy kontynuować generowanie i ostateczne dopasowanie krzywych odzysku fluorescencji.
Fluorescencja wielofotonowa. Rekonwalescencję po zabiegu fotowybielania można łatwo wykazać za pomocą swobodnie dyfuzującej próbki fluorescencyjnych cząsteczek barwnika. Po pierwsze, wiązka lasera o niskiej intensywności jest wysyłana do próbki w celu wygenerowania referencyjnego poziomu fluorescencji z cząsteczek D w objętości ogniskowej lasera.
Następnie wysyłany jest krótki błysk lasera o wysokiej intensywności, który fotowybiela część cząsteczek barwnika w objętości ogniskowej. Na koniec wiązka laserowa jest tłumiona do poprzedniego niskiego poziomu intensywności, a fluorescencja jest monitorowana, gdy cząsteczki wybielone foto dyfundują na zewnątrz i są zastępowane przez nadal fluorescencyjne cząsteczki spoza objętości ogniskowej. Uzyskana fluorescencja w funkcji krzywej czasu jest analizowana w celu uzyskania współczynnika dyfuzji.
Cześć, nazywam się Kelly Sullivan i pracuję w Laboratorium Edwarda Browna na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu w Rochester. Dzisiaj pokażemy Ci, jak przeprowadzić regenerację fluorescencji wielofotonowej po fotowybielaniu. Używamy tej techniki w naszym laboratorium do badania dyfuzji zarówno w systemach biologicznych in vitro, jak i in vivo.
Więc zacznijmy. Aby rozpocząć, ustaw żądaną długość fali lasera i włóż odpowiedni filtr przed rurką powielacza zdjęć lub PMT. Następnie, aby uniknąć uszkodzenia ogniwa pcal, dostosuj moc lasera do 200 miliwatów lub mniej.
Istnieją dwa lustra zorientowane na rysunku czwartym przed komórką pcal. Lustra te są niezbędne i wystarczające do wyrównania wiązki laserowej przez komórkę pcal. Ustaw przesunięcie napięcia na kontrolerze polaryzacji ogniwa pcal na zero, wyreguluj ścieżkę lasera przez komórkę pcal tak, aby laser był wyśrodkowany w przednich i tylnych oknach.
Użyj lusterka w górę strumienia na rysunku czwartym, aby wyśrodkować wiązkę w przedniej szybie i lusterka w dół na rysunku czwartym, aby wyśrodkować belkę w tylnej szybie. Teraz ustaw napięcie na krysztale ogniwa pcal na maksymalną wartość. Odpowiednia wartość zależy od długości fal i można ją znaleźć w instrukcji obsługi ogniwa pcal.
Wyreguluj lustra na rysunku czwartym przed ogniwem pcal, aż moc wyjściowa z ogniwa pcal zostanie zmaksymalizowana. Teraz przełącz napięcie na kwarcu na zero i dostosuj przesunięcie napięcia na kontrolerze polaryzacji, aby zminimalizować moc wyjściową z ogniwa pcal. Przywróć moc lasera padającą na komórkę pcal do wartości wymaganej w eksperymencie.
Teraz przejdź do mikroskopu, aby uzyskać dobrą ostrość wizualną na znormalizowanej próbce fluorescencyjnej. Tutaj używamy utrwalonych fluorescencyjnych ziaren pyłku. Po ustawieniu ostrości uszczelnij mikroskop, dostosuj moc lasera do odpowiedniego poziomu do obrazowania próbki poprzez zmianę napięcia na krysztale komórki pcal.
Na koniec wyłącz światła i włącz PMT. Rozpocznij powtórne skanowanie obrazu znormalizowanej próbki i wyreguluj lustra za komórką pcal, aż do uzyskania ostrego obrazu próbki. Przyjrzyjmy się teraz określeniu bezpiecznych mocy monitora, na których skupiają się ludzie w próbce.
Na potrzeby tego filmu użyjemy próbki wodnego barwnika umieszczonej w zagłębieniu w szkiełku podstawowym i przykrytej szkiełkiem nakrywkowym. Osłabij laser do niskiej, ale rozsądnej mocy, aby wytworzyć fluorescencję w próbce. Zamknij mikroskop, przekieruj sygnał wyjściowy z PMT do licznika fotonów.
Wyłącz światła, włącz PMT i rozpocznij skanowanie punktowe w oprogramowaniu mikroskopu. Ustaw licznik fotonów tak, aby całkował w skali czasowej znacznie dłuższej niż oczekiwany czas odzyskiwania fluorescencji i rejestruj rozsądną liczbę punktów danych. Zwiększ moc i weź kolejną serię danych o liczbie fotonów.
Kontynuuj zwiększanie mocy, aż wzrost liczby fotonów wydaje się znacznie zmniejszać. W odniesieniu do wykresu wzrostu mocy, logarytm fotonu liczy się jako funkcja logarytmu mocy. Każde odchylenie od nachylenia dwóch wskazuje na bielenie.
Podczas monitorowania wybierz rozsądną moc monitora, która jest poniżej tego odcięcia. Ustalmy teraz parametry wejściowe do skalera wielokanałowego i generatora impulsów. Na generatorze impulsów.
Ustaw czas wstępnego uczenia tak, aby był od jednego do dwóch razy dłuższy niż oczekiwany czas połowy odzyskiwania, a czas wybielania wynosił jedną dziesiątą oczekiwanego czasu odzyskiwania połowy na wadze. Ustaw szerokość pojemnika na około połowę czasu trwania wybielania i ustaw liczbę pojemników na rekord, tak aby iloczyn wybranej szerokości pojemnika i pojemników na rekord był większy niż oczekiwany pełny czas odzyskiwania. Ponadto czasy wstępnego i wybielania wracają do generatora impulsów i ustawiają częstotliwość sekwencji wstępnego i wybielania na wartość nieco mniejszą niż odwrotność iloczynu szerokości pojemnika pomnożonego przez liczbę pojemników na rekord.
Na koniec ustaw liczbę rekordów na skan na skalerze w oparciu o intensywność sygnału przy wybranej mocy monitora. Teraz ustaw moc monitora na bezpieczny poziom i ustaw moc wybielacza na około 200 miliwatów powyżej wartości granicznej wybielania określonej podczas testu wybielania monitora. Obie te moce są ustawiane jako różne napięcia na uszczelce kryształu ogniwa aluminiowego, mikroskop wyłącza światła.
Włącz PMT. Rozpocznij skanowanie punktowe w oprogramowaniu do obrazowania. Następnie uruchom generator impulsów i skaler.
Aby przeanalizować wynikową krzywą odzyskiwania, zaznacz trzy ważne punkty. Fluorescencja wstępna, fluorescencja bezpośrednio po wybielaniu i fluorescencja na końcu zestawu danych. Użyj wartości fluorescencji przed i bezpośrednio po wybielaniu, aby lepiej oszacować czas połowy regeneracji.
Teraz użyj reguł opisanych we wcześniejszych krokach, aby zaktualizować wartości czasu trwania wybielacza wstępnego i szerokości. Weź nową krzywą i kontynuuj dostosowywanie parametrów, aż uzyskana krzywa wykaże silne wybielenie i płynną regenerację. Sprawdź nasycenie wzbudzenia, wykreślając logarytm parametru głębokości wybielacza w funkcji logarytmu mocy.
Każde odchylenie od nachylenia dwóch wskazuje na nasycenie wzbudzenia. Wybierz moc wybielacza, która daje silny wybielacz, ale nie powoduje nasycenia. Na koniec, po ustaleniu odpowiednich parametrów, kontynuuj odzyskiwanie fluorescencji wielofotonowej po fotowybielaniu lub krzywych MP FP interesującej Cię próbki.
Teraz pokażemy reprezentatywne wyniki zarówno surowych danych MP frap przy znormalizowanej krzywej owijania MP F, która została dopasowana do teel, współczynnika dyfuzji, surowych danych MP F frap, silnego wybielania i płynnego odzyskiwania. Pełne odzyskiwanie jest raportowane dla drugiej połowy danych, aby dopasować je do danych. Najpierw normalizujemy odzysk do średniej fluorescencji wstępnej, a następnie przeprowadzamy nieliniowe dopasowanie kwadratów dzierżawionych.
W odniesieniu do odpowiedniego modelu. Oba zestawy danych zostały pobrane w wodnym roztworze fluoresceiny i współczynnikach dyfuzji plonu. Zgodnie z literaturą, właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić odzysk fluorescencji wielofotonowej po eksperymencie z fotowybielaniem.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować ostrożność i ustawić parametry eksperymentalne, w szczególności czas trwania wybielania oraz uprawnienia do wybielania i monitorowania do bezpiecznych limitów określonych w protokole. Więc dzięki za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje procedurę pomiaru współczynników dyfuzji za pomocą wielofotonowej reaktywacji fluorescencji po fotobielaczeniu. Proces obejmuje wyrównanie lasera wzdłuż ścieżki optycznej do próbki i dopasowywanie krzywych reaktywacji fluorescencji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Pomiar dyfuzji
- Techniki fotobielaczenia
Tło
- Wielofotonowa reaktywacja fluorescencji po fotobielaczeniu to technika stosowana do badania dyfuzji molekularnej.
- Metoda zapewnia wgląd w dynamikę fluorescencyjnych cząsteczek w próbce.
- Zrozumienie współczynników dyfuzji jest niezbędne dla różnych zastosowań biologicznych.
- Procedura jest stosowana do próbek swobodnie dyfundujących cząsteczek barwników fluorescencyjnych.
Cel badania
- Aby pokazać procedurę pomiaru współczynników dyfuzji.
- Aby dostarczyć szczegółową metodologię dla badaczy w tej dziedzinie.
- Aby poprawić zrozumienie dynamiki molekularnej w systemach biologicznych.
Zastosowane metody
- Niskokolorowy wiązka laserowa generuje referencyjny poziom fluorescencji.
- Wysokoenergetyczny błysk laserowy fotobielacza część cząsteczek barwnika.
- Fluorescencja jest monitorowana podczas dyfuzji i zastępowania fotobielaczonych cząsteczek.
- Krzywe reaktywacji fluorescencji są analizowane, aby uzyskać współczynniki dyfuzji.
Główne wyniki
- Procedura skutecznie mierzy współczynniki dyfuzji cząsteczek fluorescencyjnych.
- Krzywe reaktywacji fluorescencji dostarczają ilościowych danych na temat dynamiki molekularnej.
- Metoda jest powtarzalna i może być stosowana do różnych próbek.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia interakcji molekularnych w kontekście biologicznym.
Wnioski
- Wielofotonowa reaktywacja fluorescencji po fotobielaczeniu to wartościowa technika do pomiaru współczynników dyfuzji.
- Opisana metodologia może być wykorzystywana przez badaczy do badania dynamiki molekularnej.
- Dalsze zastosowania tej techniki mogą poprawić nasze zrozumienie procesów biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Measuring diffusion coefficients via two-photon fluorescence recovery after photobleaching provides quantitative insights into molecular dynamics in biological systems, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The technique enables reproducible, label-free assessment of macromolecular transport, informing assay development and predictive confidence in lead identification workflows. Its applicability to both in vitro and in vivo systems enhances translational continuity and reduces biological uncertainty in preclinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying diffusion behavior of macromolecules in disease-relevant systems.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct measurement of molecular mobility in native or engineered environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing diffusion-based metrics that correlate with target engagement and binding kinetics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline diffusion parameters.
- Reproducibility: Delivers quantitative, fluorescence-based readouts that support assay standardization across runs and laboratories.
- Scalability: Integrates with automation platforms like LabVIEW for enhanced throughput in lead screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applies to in vivo biological systems, enabling assessment of diffusion in tissue-like environments.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing consistent biophysical readouts across model systems.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying molecular transport properties that influence drug distribution and target access.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, providing biophysical data that informs molecular design and optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how macromolecular diffusion changes under experimental conditions, clarifying pathway and target behavior.
- Screening: Enables assay readiness through standardized fluorescence recovery measurements that ensure consistent compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative diffusion coefficients via least-squares fitting of recovery curves, enabling objective comparison of molecular variants.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing diffusion measurements in both in vitro and in vivo systems, supporting extrapolation across scales.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable biophysical platform for assessing molecular dynamics across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around molecular mobility and interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined laser parameters, bleach protocols, and automated data acquisition.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets based on diffusion-derived biophysical profiles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets with favorable molecular transport characteristics for downstream development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy, photobleaching techniques, and fluorescence quantification.
- Depends on instrumentation including pulsed lasers, Pockels cells, photon counters, and compatible scanning systems.
- Necessitates standardization of laser power, bleach duration, and bin width settings across users and sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from aqueous dye models to complex biological samples like cells or tissue.
- Limited by the need for fluorescent labeling or intrinsic fluorescence, which may require optimization for low-abundance targets.
