Name: Pomiar współczynników dyfuzji poprzez odzysk fluorescencji dwufotonowej po fotowybielaniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-26T16:45:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj metodę pomiaru współczynników dyfuzji za pomocą dwufotonowej fluorescencji po fotowybielaniu. Technika ta pozwala badać dynamikę molekularną w układach biologicznych in vitro i in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana z grantu Department of Defense Era of Hope Scholar Award (nr W81XWH-05-0396) oraz stypendium Pew Scholar in the Biomedical Sciences przyznanego Edwardowi B. Brownowi III.

1. Ustaw optykę.
Kluczowy sprzęt do eksperymentu MP-FRAP obejmuje: laser z blokadą modów, ogniwo Pockelsa (do modulacji wiązki), generator impulsów, lustro dichroiczne, obiektyw, filtr emisji fluorescencji, bramkowaną lampę fotopowielaczową oraz system rejestracji danych (licznik fotonów i skaler wielokanałowy).
2. Wyznaczenie bezpiecznych mocy monitorowania.
<ol>
<li>Zredukuj moc lasera do niskiego, ale odpowiedniego poziomu, pozwalającego na generowanie fluorescencji w próbce.</li>
<li>Ustaw ostrość wewnątrz próbki.</li>
<li>Ustaw licznik fotonów tak, aby całkowanie odbywało się w skali czasowej znacznie dłuższej niż przewidywany czas powrotu fluorescencji. Przy nieruchomej objętości ogniskowania wewnątrz próbki (w oprogramowaniu naszego mikroskopu osiąga się to za pomocą skanowania punktowego), zarejestruj odpowiednią liczbę danych z zliczeń fotonów.</li>
<li>Zwiększ moc i pobierz kolejną serię danych z zliczeń fotonów. Powtarzaj tę czynność, aż przyrost liczby zliczonych fotonów zacznie znacząco maleć w stosunku do wzrostu mocy.</li>
<li>Wykreśl log(liczba zliczeń fotonów) jako funkcję log(moc). Odchylenie od nachylenia równego dwa wskazuje na występowanie fotowyblakania podczas monitorowania. Jako moc monitorowania wybierz taką wartość, która znajduje się poniżej tego punktu odcięcia, ale zapewnia odpowiedni stosunek sygnału do szumu.</li>
</ol>
3. Określenie parametrów wejściowych dla generatora impulsów i skalera wielokanałowego.
<ol>
<li>Wyznacz szacunkowe wartości współczynnika dyfuzji oraz czasu regeneracji w oparciu o literaturę i/lub równanie Stokesa-Einsteina oraz równanie dyfuzji.</li>
<li>Ustaw niezbędne wartości parametrów w generatorze impulsów i skalerze.
<ol class="lalpha">
<li>W generatorze impulsów ustaw czasy wstępnego wybielania (pre-bleach) i wybielania (bleach). Dobrą zasadą jest, aby czas wstępnego wybielania był 1-2 krotnie dłuższy niż przewidywany połowiczny czas regeneracji, a czas wybielania stanowił jedną dziesiątą przewidywanego połowicznego czasu regeneracji.</li> 
<li>W skalerze ustaw szerokość kosza (bin width) na około połowę czasu trwania wybielania oraz ustaw liczbę koszy na zapis (bins per record) w taki sposób, aby iloczyn wybranej szerokości kosza i liczby koszy na zapis był większy lub w przybliżeniu równy przewidywanemu całkowitemu czasowi regeneracji powiększonemu o czasy wstępnego wybielania i wybielania.</li> 
<li>Wróć do generatora impulsów i ustaw częstotliwość sekwencji wstępne wybielanie/wybielanie/monitorowanie na wartość nieco mniejszą od odwrotności iloczynu szerokości kosza i liczby koszy na zapis. *</li> 
<li>Na koniec ustaw w skalerze liczbę zapisów/skanów (records/scan) w zależności od natężenia sygnału przy wybranej mocy monitorowania. 
*Bardzo ważne jest, aby czas pełnej sekwencji wstępne wybielanie/wybielanie/monitorowanie (1/częstotliwość) ustawiony w generatorze impulsów był większy niż czas zbierania danych (szerokość kosza x liczba koszy/zapis) ustawiony w skalerze. Jeśli to kryterium nie zostanie spełnione, w jednym zapisie w skalerze mogą pojawić się wielokrotne wyzwalacze wybielania.</li>
</ol>
</li>
<li>Ustaw moc monitorowania na wcześniej określonym, akceptowalnym poziomie. Ustaw moc wybielania na około 200 mW powyżej progu wybielania określonego podczas testu wybielania monitorującego. Obie te moce ustawia się jako różne napięcia przyłożone do kryształu PC.</li>
<li>Uszczelnij mikroskop, wyłącz światła, włącz PMT, rozpocznij skanowanie punktowe w oprogramowaniu mikroskopu, a następnie uruchom generator impulsów i skaler.</li>
<li>Przeanalizuj otrzymaną krzywą regeneracji, wykreślając ją i zaznaczając trzy istotne punkty: 1) fluorescencję przed wybielaniem, 2) fluorescencję bezpośrednio po wybielaniu oraz 3) fluorescencję na końcu zestawu danych. Wykorzystaj wartości fluorescencji przed i bezpośrednio po wybielaniu, aby dokładniej oszacować połowiczny czas regeneracji.</li>
<li>Mając tę szacunkową wartość połowicznego czasu regeneracji, zastosuj opisane wcześniej zasady, aby wyznaczyć nowe wartości dla czasów wstępnego wybielania, wybielania i szerokości kosza. Ponadto wykorzystaj fluorescencję przed wybielaniem oraz fluorescencję na końcu zestawu danych, aby dokładniej oszacować czas potrzebny do osiągnięcia pełnej regeneracji. Przyjmuje się, że dane powinny być zbierane przez okres czasu pozwalający na odnotowanie pełnej regeneracji w drugiej połowie zestawu danych.</li>
<li>Skoryguj parametry w generatorze impulsów i skalerze, wykonaj nowy pomiar krzywej i kontynuuj optymalizację parametrów, dopóki krzywa nie wykaże wyraźnego wybielenia i płynnej regeneracji. Należy pamiętać, że czas trwania wybielania można i należy skrócić poniżej wartości zalecanej przez ogólną zasadę, jeśli jest to możliwe. Można również dostosować moc wybielania, jeśli uzyskane wybielenie jest zbyt płytkie lub zbyt głębokie.</li>
</ol>
4. Test nasycenia wzbudzenia.
<ol>
<li>Wykorzystując odpowiednią moc monitorowania i wybielania, określoną we wcześniejszym etapie, zarejestruj serię krzywych MP-FRAP. Przeanalizuj każdy proces powrotu, znormalizowany do fluorescencji sprzed wybielania, stosując odpowiednią formę matematyczną oraz algorytm dopasowania nieliniowego najmniejszych kwadratów (patrz „Analiza danych” poniżej). Zapisz dopasowaną wartość parametru głębokości wybielania.</li>
<li>Kontynuuj rejestrowanie i analizowanie kolejnych serii krzywych MP-FRAP przy zwiększających się wartościach mocy wybielania.</li>
<li>Wykreśl log(parametr głębokości wybielania) jako funkcję log(mocy). Wszelkie odchylenie od nachylenia wynoszącego dwa wskazuje na nasycenie wzbudzenia. Wybierz taką moc wybielania, która zapewni silne wybielenie, ale nie spowoduje nasycenia.</li>
</ol>
5. Kontynuuj pomiary krzywych MP-FRAP.
<ol>
<li>Kontynuuj rejestrację krzywych, zgodnie z powyższym, przy prawidłowo ustawionych wszystkich parametrach.</li>
</ol>
6. Analiza danych.
<ol>
<li>Usuń dane sprzed wybielania oraz dane z momentu wybielania ze zbioru danych fluorescencji i dostosuj dane czasowe tak, aby t = 0 odpowiadało wartości fluorescencji bezpośrednio po wybielaniu.</li>
<li>Znormalizuj wynikową rekuperację fluorescencji względem średniej fluorescencji sprzed wybielania.</li>
<li>Dopasuj znormalizowaną krzywą, korzystając z odpowiedniego modelu matematycznego i nieliniowego algorytmu dopasowania metodą najmniejszych kwadratów, takiego jak funkcja lsqcurvefit w programie MATLAB. Model przedstawiony tutaj uwzględnia rekuperację fluorescencji pod wpływem dyfuzji i przepływu konwekcyjnego: <img src="/files/ftp_upload/1636/1636eq.jpg" alt="Wzór na równowagę statyczną, schemat przedstawiający złożone sumowanie dla analizy systemów dynamicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie"> gdzie Fo to średnia fluorescencja sprzed wybielania, β to parametr głębokości wybielania, τD to charakterystyczny czas rekuperacji dyfuzyjnej, R to stosunek kwadratu szerokości osiowej (wz) do radialnej (wr) objętości ogniskowej dwufotonowej, τvx = wr/vx, τvy = wr/vy, τvz = wz/vz, a v2 = vx2 + vy2 + vz2 to prędkość przepływu konwekcyjnego.
W przypadku przepływu ograniczonego do płaszczyzny obrazowania, τvz → ∞, a wyrażenie 1/ τvx + 1/ τvy można zastąpić przez 1/ τvr. W przypadku braku przepływu konwekcyjnego obie funkcje wykładnicze w liczniku dążą do 1, a wyrażenie zostaje znacznie uproszczone do zaledwie dwóch parametrów dopasowania: β oraz τD.
Współczynnik dyfuzji można łatwo obliczyć według wzoru D = wr2/8τD.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki.
<img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig1.jpg" alt="Wykres liczby fotonów w funkcji czasu; analiza emisji fotonów; wyniki pomiarów spektralnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Reprezentatywna krzywa wybielania i regeneracji dla FITC-BSA. Dobra krzywa regeneracji wykazuje silne wybielanie i łagodne odzyskiwanie sygnału, przy czym fluorescencję przy pełnej regeneracji określa się na podstawie drugiej połowy danych.
<img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig2.jpg" alt="Wykres znormalizowanej fluorescencji w funkcji czasu przedstawiający dopasowanie wykładnicze, stosowany w analizie czasu życia fluorescencji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Znormalizowana krzywa powrotu dla FITC-BSA (czerwona) oraz powiązane dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów (czarna). Dopasowanie to daje współczynnik dyfuzji wynoszący 52.9 um2/s, co jest zgodne z literaturą.

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 60, 73-76 (1990).</li>
<li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).</li>
<li>Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+model+of+fluorescence+recovery+expands+the+application+of+multiphoton+fluorescence+recover+after+photobleaching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo.</a> Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).</li>
</ol>

Potencjał wielofotonowej regeneracji fluorescencji po fotobleachingu (MP-FRAP) tkwi w możliwości badania grubych próbek z rozdzielczością 3D. Od czasu opracowania tej metody w latach 90. XX wieku, MP-FRAP jest wykorzystywana do wyznaczania współczynnika dyfuzji (lub analogicznych parametrów transportu) w ciałach komórkowych, grubych przekrojach tkanek ex vivo oraz w tkankach i przestrzeniach śródmiąższowych in vivo. W niniejszym artykule przedstawiliśmy sprzęt niezbędny do przeprowadzenia eksperymentu M...

<table><tbody><tr><td>Laser Ti:szafir</td><td>Newport Corp.</td><td>Mai Tai</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwo Pockelsa</td><td>Conoptics</td><td>350-80</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop laserowy</td><td>Olympus Corporation</td><td>Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>Dychroiczne lustro krótkoprzepustowe</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>670 DCSX-2P</td><td></td></tr><tr><td>Fotopowielacz</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>Licznik fotonów</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR 400</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowy skaler/uśredniacz</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR 430</td><td></td></tr><tr><td>Generator impulsów</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DG 535</td><td></td></tr><tr><td>FITC-BSA</td><td>Invitrogen</td><td>--</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar współczynników dyfuzji za pomocą dwufotonowej regeneracji fluorescencji po fotobieleniu

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Wielokrotna regeneracja fluorescencji po fotoblaknięciu (multi-fluorescence recovery after photobleaching) to technika mikroskopowa stosowana do pomiaru współczynnika dyfuzji (lub analogicznych parametrów transportu) makromolekuł, która może być zastosowana zarówno doin vitroiin vivosystemy biologiczne. Wielopunktowy pomiar powrotu fluorescencji po fotowybielaniu (multi-fluorescence recovery after photobleaching) przeprowadza się poprzez fotowybielanie obszaru zainteresowania w fluorescencyjnej próbce za pomocą intensywnego błysku lasera, a następnie osłabienie wiązki i monitorowanie fluorescencji w miarę gdy wciąż fluorescencyjne cząsteczki z obszarów spoza wybranego regionu dyfundują do niego, zastępując cząsteczki fotowybielone. Demonstrację rozpoczniemy od ustawienia wiązki lasera poprzez ogniwo Pockelsa (modulator laserowy) oraz wzdłuż drogi optycznej przez moduł skanowania laserowego i obiektyw do próbki. Dla uproszczenia zastosujemy próbkę wodnego barwnika fluorescencyjnego. Następnie określimy odpowiednie parametry eksperymentalne dla naszej próbki, w tym moc monitorowania i wybielania, czas wybielania, szerokość przedziałów (bin widths) dla zliczania fotonów oraz czas powrotu fluorescencji. W dalszej części opiszemy procedurę pozyskiwania krzywych powrotu, proces ten może zostać w znacznym stopniu zautomatyzowany za pomocą systemu LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) w celu zwiększenia przepustowości. Na koniec współczynnik dyfuzji zostanie wyznaczony poprzez dopasowanie danych o powrocie fluorescencji do odpowiedniego modelu matematycznego przy użyciu algorytmu dopasowania metodą najmniejszych kwadratów, który można łatwo zaprogramować w oprogramowaniu takim jak MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

W niniejszym artykule opiszemy procedurę pomiaru współczynników dyfuzji z wykorzystaniem wielofotonowego odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu. Rozpoczniemy od ustawienia lasera wzdłuż drogi optycznej do próbki i określenia odpowiednich parametrów eksperymentalnych, a następnie przejdziemy do generowania i wreszcie dopasowywania krzywych odzyskiwania fluorescencji.

Pomiar współczynników dyfuzji za pomocą dwufotonowej regeneracji fluorescencji po fotobieleniu

Wielokrotna regeneracja fluorescencji po fotobleachingu (multi-fluorescence recovery after photobleaching) to technika mikroskopowa stosowana do pomiaru współczynnika dyfuzji (lub analogicznych parametrów transportu) ...

Procedurę wielofotonowej fluorescencji i powrotu po fotobleachingu można łatwo zademonstrować na próbce swobodnie dyfundujących cząsteczek barwnika fluorescencyjnego. Najpierw do próbki kierowana jest wiązka lasera o niskim natężeniu, aby wygenerować referencyjny poziom fluorescencji cząsteczek D w objętości ogniskowej lasera.Następnie wysyłany jest krótki, wysokointensywny błysk lasera w celu fotowybielenia części cząsteczek barwnika w objętości ogniskowej. Na koniec wiązkę lasera osłabia się do poprzedniego poziomu niskiej intensywności i monitoruje fluorescencję w miarę jak fotowybielone cząsteczki dyfundują na zewnątrz i są zastępowane przez wciąż fluorescencyjne cząsteczki spoza objętości ogniskowej. Powstała krzywa fluorescencji w funkcji czasu jest analizowana w celu wyznaczenia współczynnika dyfuzji.Witajcie, nazywam się Kelly Sullivan i reprezentuję laboratorium Edwarda Browna w Katedrze Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Rochester. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak przeprowadzić wielofotonową analizę powrotu fluorescencji po fotobleachingu. Technikę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania dyfuzji w biologicznych systemach in vitro oraz in vivo.Zacznijmy. Na pocz

measuring-diffusion-coefficients-via-two-photon-fluorescence-recovery

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar współczynników dyfuzji za pomocą dwufotonowego odzyskiwania fluorescencji po fotobielczeniu

Ten film demonstruje użycie spektroskopii fluktuacji fluorescencji do wykrywania interakcji między białkami na powierzchni komórki na styku komórka-komórka. Poprzez ekspresję transbłonowego receptora adhezyjnego będącego przedmiotem zainteresowania znakowanego białkiem fluorescencyjnym i mieszanie dwóch różnych populacji komórek zawierających dwie spektralnie oddzielone znaczniki fluorescencyjne, trans-interakcja między receptorami dwóch sąsiednich komórek o różnej fluorescencji jest oceniana...

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania interakcji białek w kontaktach komórkowych

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku po technice analizy fluktuacji k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) do pomiaru współczynników dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych białek błony plazmatycznej w żywych komórkach ssaków.

Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Prezentujemy nową technikę pomiaru bocznej dyfuzji gatunków powierzchniowo czynnych na granicy płyn-płyn poprzez połączenie monowarstwy kropelki z płaską monowarstwą.

Odzyskiwanie fluorescencji po połączeniu kropli w celu zmierzenia dwuwymiarowej dyfuzji monowarstwy fosfolipidowej

Opisano metodę pomiaru dyfuzji białek w błonach pierwotnych komórek odpornościowych za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS). W niniejszej pracy zilustrowano zastosowanie przeciwciał do znakowania fluorescencyjnego.

Dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Poznaj metodę pomiaru współczynników dyfuzji za pomocą dwufotonowej fluorescencji po fotowybielaniu. Technika ta pozwala badać dynamikę molekularną w układach biologicznych in vitro i in vivo.

Pomiar współczynników dyfuzji za pomocą dwufotonowej regeneracji fluorescencji po fotobieleniu

Przeglądaj więcej filmów