Sekcja na żywo zarodków Drosophila: uproszczone metody badań przesiewowych kolekcji mutantów za pomocą barwienia przeciwciałami
December 29th, 2009
Opisujemy uproszczony protokół generowania preparatów "filetowych" z zarodków Drosophila o określonych genotypach. Protokół ten pozwala na efektywne wykonywanie różnych badań genetycznych. Pozwala również na doskonałą wizualizację struktur w późnym zarodku.
Tutaj widzimy procedurę pobierania zarodków. Przenieść muchy z fiolek do probówek pięciocylindrowej komory zbiorczej. Następnie połóż talerz winogronowy na wierzchu komory i pozwól muchom złożyć jaja przez kilka godzin.
Gdy zarodki są na odpowiednim etapie, przenieś je z winogron aate na podwójną taśmę klejącą za pomocą pędzla. Teraz wytocz zarodki z ich koni i ułóż je na bloku agaru brzusznymi bokami. Na środku widzimy szkiełko z prostokątem wosku i kawałkiem podwójnej taśmy klejącej Na jednym końcu odwróć podwójną taśmę samoprzylepną nad blokiem z ułożonymi w linii zarodkami i dotknij nią zarodków, aby przenieść je na szkiełko.
Będą teraz natychmiast zwrócone grzbietową stroną do góry. Dodać PBS do obszaru szkiełka otoczonego prostokątem woskowym, tak aby przykryć zarodki. Na górze widać widok slajdu z boku, a na dole – widok z góry.
Wytnij szczelinę wzdłuż błony wielkowej za pomocą szklanej igły do preparowania. Szturchnij zarodki w okolicy mózgu, podnieś je i przesuń do rzędów na szkle. Następnie wypreparuj każdy zarodek, aby zrobić filet.
Na końcu zabiegu pojawi się szkiełko z rzędami zarodków fileta. Jest teraz gotowy do naprawy. Cześć, nazywam się Peter Lee i jestem na plakacie w laboratorium Kaizens na wydziale biologii w Caltech.
Cześć, nazywam się Ashley Wright i jestem absolwentką Caltech w Kaizens Lab. Nazywam się Kaizen, jestem profesorem w Caltech, a moja grupa badawcza pracuje nad rozwojem układu nerwowego u muszek owocowych. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę preparowania żywych zarodków opalu.
Wykorzystaliśmy te metody do poszukiwania ligandów receptorów sierocych. Robimy to, przeprowadzając badania przesiewowe zbiorów linii nad białkami powierzchniowymi komórek poprzez barwienie na żywo zarodków białkami fuzji receptorów. Stosujemy tę procedurę również w laboratorium do badania fenotypów embrionalnych i przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych.
Przeprowadziłem badanie przesiewowe niedoborów pod kątem aktów motorycznych na fenotypy przewodnie. Więc zacznijmy. Piotr pokaże ci, jak to się robi.
Na początek za pomocą szpatułki umieść plamę pasty drożdżowej na talerzu do zbierania jaj winogronowych agri, odpowiadającym każdej z beczek komory do pobierania zarodków. Następnie wstrzyknij gazowy dwutlenek węgla do fiolek muchowych, aby uśpić muchy. Przenieś kilkaset much bezpośrednio do komory zbiorczej.
Następnie przykryj komorę płytką do zbierania jaj i dociśnij: Za pomocą 20-calowego paska taśmy do etykietowania przymocuj komorę i płytkę razem, zaczynając od środka płytki agarowej. Taśma zachodzi na talerz do zbierania jaj. Po przebudzeniu much inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez dwie lub trzy godziny w pozycji poziomej po inkubacji, postukaj muchy w dół i załóż płytkę zbiorczą.
Jeśli w każdym sektorze usuniętej płytki znajduje się mniej niż 100 zarodków. Kontynuuj wykonywanie dwugodzinnych zbiorów, aż zostanie zebrana wystarczająca liczba zarodków. Pobrane zarodki mogą zostać połączone zgodnie ze specyfikacją zawartą w dołączonym pisemnym protokole.
Aby postarzać zarodki, umieść mokry kawałek bibuły filtracyjnej o średnicy 90 milimetrów w pokrywie szalki Petriego i umieść na niej płytkę zbiorczą z zarodkami do góry nogami. Inkubować płytkę przez żądany czas i w żądanej temperaturze, przygotować szkiełko do oceny stopnia zarodka i sortowania, umieszczając dwustronną taśmę klejącą na szkiełku. Następnie umieść prostokątną płytę agaru winogronowego na szkiełku S.
Jajko powinno być wystarczająco duże, aby pomieścić od pięciu do 10 rzędów po 10 do 15 zarodków. Gdy zarodki osiągną pożądany etap, wyjmij je z inkubatora. Przenieś dojrzałe zarodki z płytki pobranej na dwustronną taśmę klejącą.
Za pomocą mokrego pędzla rozprowadź zarodki równomiernie na taśmie. Pod mikroskopem preparacyjnym GFP zarodki SOAR pod kątem odpowiedniej ekspresji GFP, która wskazuje na genotyp. W tym eksperymencie genotypowanie przeprowadza się poprzez selekcję zarodków, które nie mają ekspresji kędzierzawego ramienia równoważącego, GFP.
Ponieważ genotypowanie zarodków będzie się różnić w zależności od użytego balansera, należy zapoznać się z dołączonym pisemnym protokołem, aby uzyskać więcej informacji na temat jego wykonywania. Krok. Następnie za pomocą igły preparacyjnej pokryj zarodki, delikatnie tocząc je po dwustronnej taśmie klejącej. Na etapie 16 jelito podzieliło się na trzy pasma.
Następnie jelito zaczyna rozwijać ukośne pasma w pobliżu ogona, a następnie zwija się, a zarodek staje się jaśniejszy. Następnie użyj igły preparującej, aby przetoczyć każdy zarodek na wierzch koriona lub innych zarodków. Unikając kontaktu z taśmą, podnieś zarodek i przenieś go na płytę agaru winogronowego.
Wyrównaj powlekane zarodki na tej matce tak, aby ich grzbietowe strony przylegały do płyty agarowej, a tylne końce były skierowane w dół. Następnie umieść szkiełko na szalce Petriego z mokrą bibułą filtracyjną i inkubuj zarodki w temperaturze pokojowej, aż osiągną pożądany wiek Do rozbioru przygotuj szkiełko do sekcji na żywo, wycinając mały prostokątny kawałek dwustronnej taśmy klejącej. Umieść taśmę w pobliżu jednego końca szkiełka super frost plus za pomocą pisaka woskowego.
Narysuj prostokąt o szerokości slajdu i długości od 30 do 40 milimetrów wokół taśmy. Między woskiem a taśmą powinno być około trzech milimetrów odstępu. Następnie przenieś zarodki z wielkiej płyty płytki na taśmę, odwracając szkiełko i delikatnie opuszczając je na ustawione w linii zarodki, tak aby taśma zetknęła się z nimi.
Zarodki powinny być zorientowane tylnymi końcami do dołu. Po transferze zarodki zostaną umieszczone grzbietem do góry na szkiełku natychmiast dodaj jeden XPBS nad zarodkami, aby wypełnić prostokąt woskowy za pomocą szklanej igły do preparacji, która jest wykonywana na ściągaczu igłowym, takim jak igła do wstrzykiwań. Przeciąć wzdłuż grzbietowej linii środkowej, zaczynając od tylnego końca zarodka.
Teraz szturchnij przedni koniec zarodka i podnieś go. Zaczynając od dołu, przenieś zarodek na prawo od paska taśmy, trzymając go w buforze. Kontynuuj preparację i przenoszenie zarodków, tworząc uporządkowany rząd zarodków na szkiełku, który pasuje do każdego rzędu na płycie rolniczej.
Za pomocą igły preparacyjnej delikatnie dociśnij klapki ścianki korpusu na szkiełko. Unikanie rozciągania lub usuwania materiału z ich powierzchni. Igła powinna stykać się tylko z przednim i tylnym rogiem na grzbietowych krawędziach ściany ciała.
Ponieważ aksony silnika nie rozciągają się tak daleko. Grzbietowo należy unikać dotykania igieł szkiełka, ponieważ pęknie ono po przeniesieniu wszystkich zarodków i przymocowaniu ich do szkiełka. Usuń jelito z każdego zarodka, odcinając cztery jelita od obszaru mózgu i odciągając całe jelito od zarodka.
Wysuń tylne jelito na szkiełko. Po zakończeniu wszystkich sekcji użyj dwóch poprzednich pipet, aby jednocześnie dostarczyć 5% formaldehydu o temperaturze pokojowej do jednego rogu wosku, prostokąta i usuń roztwór z przeciwległego rogu. Wymień roztwór utrwalający trzy razy, używając całkowitej objętości około sześciu mililitrów.
Inkubować zarodki w roztworze utrwalającym przez 45 minut. Bardzo ważne jest, aby łąkotka nie miała kontaktu z zarodkami, ponieważ spowoduje to ich zniszczenie. Użyj pipety, aby usunąć większość roztworu utrwalającego.
Przemyć PB S3 razy metodą pipet do dwóch pastwisk. Następnie przemyj zarodki trzykrotnie PBT, aby wykonać permację. Ten krok sprawia również, że zarodki są mniej wrażliwe na łąkotkę.
Po ostatnim umyciu ostrożnie usuń PBT, przechylając szkiełko i dotknij krótko chusteczki Kim w rogu obszaru otoczonego woskiem, aby usunąć nadmiar roztworu. Za pomocą wstępnie załadowanej pipety człowiek natychmiast dodaj 200 mikrolitrów bloku roztworu blokującego na 10 do 30 minut. W temperaturze pokojowej usuń roztwór blokujący za pomocą chusteczki Kim.
Następnie natychmiast dodaj 200 mikrolitrów pożądanego przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Umieść szkiełko na nawilżonej płytce i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W tym eksperymencie przeciwciało monoklonalne 1D four służy do znakowania aksonów ruchowych.
Następnego dnia wyjmij naczynia z czterech stopni Celsjusza i umyj zarodki trzy razy na bujanej platformie z PBT przez co najmniej 15 minut na mycie. Na wszystkich etapach mycia upewnij się, że jest wystarczający PBT, aby całkowicie zanurzyć zjeżdżalnię podczas kołysania. Po umyciu zarodków zablokuj szkiełko jak poprzednio.
Po zablokowaniu natychmiast dodaj 200 mikrolitrów przeciwciała wtórnego i roztworu blokującego i inkubuj dwie godziny w temperaturze pokojowej, tutaj Alexa 4 88 go anty-US. Wtórny jest używany w połączeniu z Rodine Phin do oznaczania włókien mięśniowych. Ponownie umyj trzy razy PBT na platformie bujanej przez co najmniej 15 minut na pranie.
Przenieś szkiełka do innej tacy, aby usunąć resztki detergentu. Następnie umyj dwa razy PBS przez pięć minut. Usuń szkiełko z powierzchni PBS, większość pozostałego PBS ze studni za pomocą chusteczki chemicznej i natychmiast dodaj 500 mikrolitrów 70% glicerolu.
Ponieważ glicerol ma taki sam współczynnik załamania światła jak zarodek, wykonanie tego kroku sprawi, że barwienie będzie bardziej widoczne, należy oczyszczać zarodki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń glicerol chusteczką kim chusteczką. Usunięcie prawie całego glicerolu spłaszczy zarodki, podczas gdy usunięcie mniejszej ilości glicerolu spowoduje bardziej trójwymiarową strukturę.
Po usunięciu glicerolu nałóż szkiełko nakrywkowe numer jeden. Zarodki są gotowe do obrazowania, wypreparowane i barwione zarodki można uwidocznić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. W tym przypadku wypreparowany zarodek został wybarwiony przeciwciałem znakującym akson ruchowy 1D cztery.
Obraz ten jest podobny w wyglądzie do częściej spotykanych obrazów, w których immunohistochemia HRP została wykorzystana do wizualizacji za pomocą immunofluorescencji. Możliwe jest uzyskanie obrazów o wyższej jakości, na których wyraźnie widać szczegóły gałęzi aksonów motorycznych. Barwienie za pomocą phin znakowanego rho dominem, który wiąże aktynę, pozwala na jednoczesną wizualizację mięśni.
Daje to wyraźniejszy obraz warstw i organizacji mięśni, a następnie można je uzyskać za pomocą barwienia HRP Tutaj cztery aksony 1D lub aksony motoryczne są pokazane na zielono Fein lub mięśnie są pokazane na czerwono. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić sekcję żywych zarodków Drosophila z kolekcji zmutowanych linii. Kiedy wykonujesz te procedury, ważne jest, aby zacząć od łatwych linii, takich jak lio, pancernik, GFP, zrównoważone zapasy, i po prostu robić kilka linii na raz.
Gdy staniesz się bardziej biegły i szybszy w sekcjach, możesz wykonać do 10 linii dziennie, co pozwoli ci przesiać kolekcję około 200 zmutowanych linii w ciągu około 20 dni. Jest to więc naprawdę bardzo skuteczna procedura, gdy staniesz się ekspertem w wykonywaniu wszystkich kroków. Więc to wszystko, dzięki za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia uproszczony protokół wytwarzania preparatów "filetowych" embrionów Drosophila o określonych genotypach. Protokół umożliwia wydajne przeprowadzanie różnych przesiewów genetycznych i zapewnia doskonałą wizualizacje struktur w późnych embrionach.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Genetyka
- Biologia rozwojowa
Tło
- Embriony Drosophila są szeroko stosowane w badaniach genetycznych.
- Preparaty filetowe pozwalają na szczegółowe badanie struktur embrionalnych.
- Skuteczne protokoły poprawiają zdolność przeprowadzania przesiewów genetycznych.
- Techniki wizualne są niezbędne do zrozumienia procesów rozwojowych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu wytwarzania preparatów filetowych embrionów Drosophila.
- Poprawa wydajności metod przesiewowych genetycznych.
- Ulepszenie wizualizacji struktur embrionalnych.
Zastosowanie metod
- Zbieranie embrionów za pomocą komory z pięcioma beczkami.
- Przenoszenie embrionów na dwustronną taśmę klejącą do wyrównania.
- Zastosowanie bloków agarowych do pozycjonowania embrionów.
- Odwrócenie taśmy w celu przeniesienia embrionów na szkiełka do obserwacji.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia łatwe zbieranie i przygotowywanie embrionów.
- Embriony mogą być wydajnie wyrównywane do wizualizacji.
- Można uzyskać wysokiej jakości obrazy struktur embrionalnych.
- Metoda obsługuje różne zastosowania przesiewowe genetyczne.
Wnioski
- Ten uproszczony protokół poprawia badania embriogenezy Drosophila.
- Stanowi on cenną narzędzie dla badaczy przeprowadzających przesiewy genetyczne.
- Ulepszone techniki wizualne przyczyniają się do lepszego zrozumienia biologii rozwoju.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput phenotypic screening of Drosophila mutant collections by combining live dissection with antibody staining, supporting target validation in neurodevelopmental pathways. It reduces time and labor compared to fixed dissection methods, allowing screening of up to 10 lines per day with quantitative scoring of 4-7 mutant embryos per line. The approach enhances predictive confidence in early discovery by facilitating detection of low-penetrance phenotypes across hundreds of balanced lines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through phenotypic screening of mutant collections for neurodevelopmental targets.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genotype to observable axon and muscle phenotypes in live embryos.
- Translational Value: Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct visualization of motor axon guidance and muscle organization phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fillet preparations suitable for antibody-based readouts of neuronal and muscular structures.
- Quantitative Output: Enables scoring of up to 70 hemisegments per line at high magnification with 40X water-immersion lens for robust phenotypic quantification.
- Scalability: Streamlined workflow accommodates screening of hundreds of balanced mutant lines in genetic screens for orphan receptor ligands.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a disease-relevant system for studying neurodevelopmental phenotypes with conservation to human axon guidance pathways.
- Preclinical Continuity: Supports translational biomarker alignment by enabling consistent phenotyping from discovery through validation stages.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows identification of subtle, low-penetrance mutations that may inform target selection and de-risking decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in neurodevelopmental biology and enabling scalable screening prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through direct observation of motor axon and muscle phenotypes in genetically defined embryos.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible fillet preparations with quantitative immunofluorescence readouts for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates quantitative phenotypic data (e.g., axon branching patterns, muscle layering) that enable comparative analysis across genetic conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conservation of axon guidance mechanisms and muscle development pathways relevant to human neurodevelopmental disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable screening platform for neurodevelopmental target validation across multiple projects and mutant collections.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives through high-content phenotypic screening.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of embryonic dissections across users and experimental batches.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling screening of large mutant collections in compressed timelines (e.g., 200 lines in ~20 days).
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying phenotypes with variable penetrance that might be missed in lower-throughput assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila embryo handling, genotyping via GFP balancer screening, and microsurgical dissection techniques.
- Dependent on instrumentation including compound microscopes with 40X water-immersion lenses, wax-coated slides, and humidified chambers for antibody incubation.
- Necessitates standardization of embryo staging (stages 14-17), dissection timing, and antibody staining protocols across users.
- Involves adaptation considerations for different balancer systems (e.g., GFP, Curly) affecting genotyping strategies.
- Practical limitations include the need for trained personnel to achieve optimal throughput (10 lines/day) and sensitivity to embryo health and staging accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:21
Introduction
2:14
Collection of Embryos From Fly Crosses
4:15
Staging Embryos and Sorting for GFP Expression
6:34
Drosophila Embryo Live Dissection
8:31
Embryo Fixation and Antibody Staining
12:11
Immunofluoresent Imaging of Dissected Drosophila Embryos
12:58
Conclusion
