Żywa dyssekcja zarodków Drosophila: Usprawnione metody przesiewania kolekcji mutantów za pomocą barwienia przeciwciałami

Poniżej przedstawiono procedurę zbierania embrionów. Przenieś muchy z fiolek do probówek pięcioogniwowej komory zbierającej. Następnie na górze komory umieść płytkę agri z winogronami i pozostaw muchy na kilka godzin w celu zniesienia jaj.

Gdy embriony osiągną odpowiedni stopień rozwoju, przenieś je z płytki do przenoszenia na dwustronną taśmę klejącą za pomocą pędzelka. Następnie wyroluj embriony z ich kokonów i ustaw je w rzędzie na bloku agaru stroną brzuszną do dołu. W centralnej części widzimy slajd z prostokątem z wosku i kawałkiem dwustronnej taśmy klejącej. Jednym z końców odwróć dwustronną taśmę nad blokiem z ustawionymi w rzędzie embrionami i dotknij nią embrionów, aby przenieść je na slajd.

Zaraz znajdą się one stroną grzbietową do góry. Do obszaru szkiełka ograniczonego woskowym prostokątem należy dodać PBS tak, aby przykryć embriony. Górna część obrazu przedstawia widok z boku, a dolna widok z góry.

Nacinamy błonę żółtkową wzdłuż, używając szklanej igły sekcyjnej. Przebijamy embriony w obszarze mózgu, podnosimy je i układamy w rzędach na szkle. Następnie preparujemy każdy embrion, wykonując filet.

Po zakończeniu procedury na szkiełku powinny znajdować się rzędy embrionów filet. Są one teraz gotowe do utrwalenia. Cześć, jestem Peter Lee, doktorant w laboratorium Kaizens na wydziale biologii w Caltech.

Witajcie, jestem Ashley Wright, doktorantka z laboratorium Kaizena na Caltech. Jestem Kaizen, profesor na Caltech, a moja grupa badawcza zajmuje się rozwojem układu nerwowego u muszek owocówek. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wypreparowania żywych embrionów opal.

Metody te wykorzystaliśmy do poszukiwania ligandów receptorów sierocych. Robimy to poprzez przesiewanie kolekcji linii komórkowych z nadekspresją białek powierzchniowych komórek za pomocą barwienia żywych zarodków białkami fuzyjnymi receptora. Procedury tej używamy w laboratorium również do badania fenotypów zarodkowych oraz przeprowadzania przesiewów genetycznych.

Przeprowadziłem badanie przesiewowe pod kątem niedoborów aktów motorycznych w fenotypach prowadzenia. Zatem zacznijmy. Peter pokaże wam, jak to się robi.

Na początek za pomocą szpatułki nanieś kropkę pasty drożdżowej na płytkę do zbierania jajek grape agri w miejscu odpowiadającym każdemu z koszyczków komory zbierania embrionów. Następnie wprowadź dwutlenek węgla do fiolek z muchami, aby je uśpić. Przenieś kilkaset much bezpośrednio do komory zbierania.

Następnie przykryj komorę płytką do zbierania jaj i dociśnij ją. Używając 20-calowego odcinka taśmy etykietującej, przymocuj komorę do płytki, zaczynając od środka płytki z agarem. Taśma powinna nachodzić na płytkę do zbierania jaj. Po wybudzeniu się much inkubuj je w pozycji poziomej w ciemności w temperaturze pokojowej przez dwie lub trzy godziny. Po inkubacji opukaj ścianki, aby muchy opadły na dno, a następnie wymień płytkę do zbierania.

Jeśli w każdym sektorze usuniętej płytki znajduje się mniej niż 100 embrionów, należy kontynuować dwugodzinne zbiory do momentu zgromadzenia odpowiedniej liczby embrionów. Zebrane embriony można łączyć zgodnie ze specyfikacją zawartą w towarzyszącym protokole pisemnym.

Aby przeprowadzić starzenie embrionów, umieść wilgotny fragment okrągłego papieru filtracyjnego o średnicy 90 mm w pokrywie szalki Petriego, a następnie połóż na nim odwróconą płytkę zbiorczą z embrionami. Inkubuj płytkę przez wymagany czas i w pożądanej temperaturze. Przygotuj preparat do wyznaczania stadium rozwoju i sortowania embrionów, naklejając na szkiełko przedmiotowe dwustronną taśmę klejącą. Następnie umieść na szkiełku prostokątny fragment agaru winogronowego.

Kasetka powinna być wystarczająco duża, aby pomieścić od pięciu do 10 rzędów po 10 do 15 embrionów. Gdy embriony osiągną pożądany stopień rozwoju, należy wyjąć je z inkubatora. Następnie przenieś embriony w odpowiednim wieku z płytki zbiorczej na dwustronną taśmę klejącą.

Za pomocą mokrego pędzla równomiernie rozmieść embriony na taśmie. Pod mikroskopem stereoskopowym z filtrem GFP przejrzyj embriony SOAR pod kątem odpowiedniej ekspresji GFP, która wskazuje na genotyp. W tym doświadczeniu genotypowanie polega na wyborze embrionów, które nie wykazują ekspresji balancera curly arm, GFP.

Ponieważ genotypowanie embrionów różni się w zależności od użytego balancera, prosimy o zapoznanie się z towarzyszącym protokołem pisemnym w celu uzyskania dalszych informacji na temat wykonania tego kroku. Następnie, za pomocą stępionej igły sekcyjnej, należy zebrać embriony, delikatnie przetaczając je po dwustronnej taśmie klejącej. W stadium 16 jelito podzieliło się na trzy pasma.

Następnie w jelicie, w pobliżu ogona, zaczynają rozwijać się pasma ukośne, po czym następuje jego zwijanie, a zarys embrionu staje się wyraźniejszy. Następnie, używając igły sekcyjnej, należy przetoczyć każdy embrion na wierzch chorionu lub innych embrionów. Unikając kontaktu z taśmą, należy podnieść embrion i przenieść go na płytkę z agarem winogronowym.

Ustaw powlekone embriony na tej płytce tak, aby ich strony grzbietowe przylegały do płytki z agarem, a końce tylne były skierowane w dół. Następnie umieść szkiełko w szalce Petriego z mokrym papierem filtrowanym i inkubuj embriony w temperaturze pokojowej, aż osiągną pożądany wiek. W celu przeprowadzenia sekcji przygotuj szkiełko do sekcji na żywo, wycinając mały prostokątny kawałek dwustronnej taśmy klejącej. Przyklej taśmę w pobliżu jednego z końców szkiełka typu super frost plus, używając woskowej kredki.

Narysuj wokół taśmy prostokąt o szerokości szkiełka i długości od 30 do 40 mm. Między woskiem a taśmą powinna pozostać odstęp wynoszący około trzech mm. Następnie przenieś embriony z płyty wielkiej na taśmę, odwracając szkiełko i delikatnie opuszczając je na ustawione w rzędzie embriony, tak aby taśma stykała się z nimi.

Zarodki należy zorientować końcami tylnymi do dołu. Po przeniesieniu zarodki znajdą się na szkiełku stroną grzbietową do góry; należy wówczas natychmiast dodać jeden XPBS nad zarodki, aby wypełnić prostokąt z wosku, używając szklanej igły sekcyjnej wykonanej za pomocą wyciągacza do igieł, podobnie jak igła do iniekcji. Należy wykonać cięcie wzdłuż linii środkowej grzbietu, zaczynając od tylnego końca zarodka.

Teraz delikatnie dotknij przedniego końca zarodka i unieś go. Zaczynając od dołu, przenieś zarodek na prawą stronę paska taśmy, utrzymując go w buforze. Kontynuuj sekcję i przenoszenie zarodków, tworząc na szkiełku uporządkowany rząd zarodków odpowiadający każdemu rzędowi na płytce agri slab.

Za pomocą igły sekcyjnej delikatnie dociśnij płaty ściany ciała do szkiełka przedmiotowego, unikając rozciągania lub usuwania materiału z ich powierzchni. Igła powinna stykać się jedynie z przednimi i tylnymi narożnikami na grzbietnych krawędziach ściany ciała.

Ponieważ aksony motoryczne nie sięgają tak daleko. W kierunku grzbietowym należy unikać dotykania krawędzi szkiełka, ponieważ pęknie ono po przeniesieniu i przymocowaniu wszystkich embrionów. Usuń jelita z każdego embrionu, przecinając je w obszarze mózgu i wyciągając cały układ pokarmowy z embrionu.

Wysuń jelito tylne na szkiełko. Po zakończeniu wszystkich sekcji użyj dwóch pipet Paspala, aby jednocześnie wprowadzić 5% formaldehyd w temperaturze pokojowej do jednego rogu woskowego prostokąta i usunąć roztwór z przeciwległego rogu. Wymień roztwór utrwalający trzy razy, używając łącznej objętości około sześciu mililitrów.

Inkubować embriony w roztworze utrwalającym przez 45 minut. Bardzo ważne jest, aby menisk nie stykał się z embrionami, ponieważ mogłoby to doprowadzić do ich zniszczenia. Użyć pipety Pasteura, aby usunąć większość roztworu utrwalającego.

Przemyj 3 razy używając PBS metodą dwóch pipet Pasteura. Następnie przemyj trzy razy PBT, aby przeprowadzić permeabilizację embrionów. Ten krok sprawia również, że embriony stają się mniej wrażliwe na działanie menisku.

Po ostatnim płukaniu ostrożnie usuń PBT, przechylając szkiełko, i krótko dotknij chusteczką Kim narożnika obszaru ograniczonego woskiem, aby usunąć nadmiar roztworu. Za pomocą przygotowanej pipety natychmiast dodaj 200 µL roztworu blokującego i inkubuj przez 10 do 30 minut. W temperaturze pokojowej usuń roztwór blokujący za pomocą chusteczki Kim.

Następnie należy bezzwłocznie dodać 200 µL odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Preparat należy umieścić w wilgotnej komorze i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. W tym doświadczeniu do znakowania aksonów ruchowych wykorzystano przeciwciało monoklonalne 1D4.

Następnego dnia wyjąć naczynia z temperatury 4°C i przemyć zarodki trzykrotnie w roztworze PBT na platformie kołyszącej, poświęcając co najmniej 15 minut na każde przemywanie. Podczas wszystkich etapów płukania należy upewnić się, że ilość PBT jest wystarczająca, aby szkiełko było całkowicie zanurzone podczas kołysania. Po przemyciu zarodków zablokować szkiełko w sposób opisany wcześniej.

Po blokowaniu należy niezwłocznie dodać 200 µL przeciwciała wtórnego i roztworu blokującego, a następnie inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej; w tym przypadku zastosowano przeciwciało wtórne Alexa 488 goat anti-US. Przeciwciało wtórne jest używane w połączeniu z Rodine Phin do znakowania włókien mięśniowych. Następnie trzy razy przemyć PBT na platformie kołyszącej, przez co najmniej 15 minut podczas każdego mycia.

Przenieś preparaty do innej kuwety, aby usunąć pozostałości detergentu. Następnie przemyj je dwukrotnie PBS przez pięć minut. Wyjmij preparat z PBS, usuń za pomocą chusteczki bezpyłowej większość pozostałego PBS z dołka i niezwłocznie dodaj 500 µL 70% glicerolu.

Ponieważ glicerol ma taki sam współczynnik załamania światła jak embrion, wykonanie tego kroku sprawi, że barwienie będzie bardziej widoczne; należy oczyścić embriony przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie należy usunąć glicerol za pomocą chusteczki typu Kimwipe. Usunięcie niemal całego glicerolu spowoduje spłaszczenie embrionów, podczas gdy usunięcie go w mniejszym stopniu pozwoli na zachowanie bardziej trójwymiarowej struktury.

Po usunięciu glicerolu nałóż szkiełko nakrywkowe nr 1. Zarodki są gotowe do obrazowania; zdysekowane i barwione zarodki można wizualizować za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Tutaj zdysekowany zarodek został zabarwiony przeciwciałem 1D4 znakującym aksony ruchowe.

Obraz ten jest podobny do częściej spotykanych obrazów, w których do wizualizacji immunofluorescencyjnej wykorzystano immunohistochemię z użyciem HRP. Możliwe jest uzyskanie obrazów o wyższej jakości, na których detale rozgałęzień aksonów ruchowych są widoczne wyraźniej. Barwienie współistniejące z użyciem phalloidyny znakowanej rodominą, która wiąże aktynę, pozwala na jednoczesną wizualizację mięśni.

Daje to wyraźniejszy obraz warstwowości i organizacji mięśni, niż można uzyskać przy barwieniu HRP. Tutaj aksony ruchowe 1D są pokazane na zielono, a mięśnie w kolorze czerwonym. Właśnie zademonstrowaliśmy, jak wypreparowywać żywe embriony drosophila z kolekcji linii mutantów. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest, aby zacząć od łatwych linii, takich jak zbalansowane stada armadillo GFP, i opracowywać tylko kilka linii naraz.

W miarę nabywania wprawy i zwiększania szybkości przeprowadzania sekcji, można analizować do 10 linii dziennie, co pozwoli na przesiewanie kolekcji około 200 linii mutantów w okresie około 20 dni. Jest to zatem bardzo wydajna procedura, gdy opanuje się już wszystkie etapy jej wykonania. To wszystko, dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.