Obrazowanie komórek na chipie bez użycia soczewek stanowi nowe narzędzie dla wysokoprzepustowej biologii komórki i diagnostyki medycznej

W tym filmie zaprezentowano dowód koncepcji obrazowania na chipie z wykorzystaniem listy soczewek, nazwanego Lucas. Nazwa Lucas oznacza platformę do monitorowania komórek w szerokim polu widzenia opartą na liście soczewek i obrazowaniu cieniowym. W przeciwieństwie do konwencjonalnych układów obrazowania, platforma Lucas nie wymaga zastosowania obiektywów mikroskopowych ani innych masywnych komponentów optycznych.

W przypadku systemu Lucas badany preparat umieszcza się na szkiełku przedmiotowym i delikatnie przykrywa identycznym szkiełkiem nakrywkowym. Przy użyciu pióra próżniowego próbkę przenosi się na obszar aktywny matrycy czujników optoelektronicznych. Platforma obrazująca rejestruje następnie cienie lub cyfrowe hologramy typu lenslet dla każdej badanej komórki znajdującej się w polu widzenia.

Zautomatyzowane cyfrowe przetwarzanie tych cieni komórkowych pozwala na określenie typu, liczby oraz względnego położenia komórek w roztworze. Pole widzenia może obejmować obszar do 18 cm² przy głębokości ostrości wynoszącej około pięciu milimetrów. Uzyskane obrazy dyfrakcyjne są następnie przetwarzane cyfrowo przez opracowany na zamówienie algorytm decyzyjny, co umożliwia zarówno charakterystykę, jak i identyfikację docelowych komórek lub cząstek.

Lucas oferuje zminiaturyzowaną platformę, która obniża koszty i znacząco zwiększa wydajność eksperymentów opartych na obrazowaniu, dzięki czemu jest ona kompatybilna z zaawansowanymi, najnowocześniejszymi technologiami w dziedzinie mikroprzepływów i badań biologicznych. Cześć, reprezentuję Laboratorium Bio i Nano ROM w Katedrze Inżynierii Elektrycznej Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles, a ja jestem Anthony Erlinger, również z Laboratorium Nanofotoniki i Biofotoniki. Dzisiaj przedstawimy procedurę wysokoprzepustowego obrazowania za pomocą soczewek dla heterogenicznych roztworów SA, takich jak próbka krwi pełnej.

Niniejsza procedura w naszym laboratorium wykorzystuje nowatorską technikę obrazowania, którą nazywamy platformą monitorowania macierzy komórkowych w ultra szerokim polu z listą soczewek opartą na obrazowaniu cieniowym, w skrócie Lucas. Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć proces, należy pobrać 3 mL krwi pełnej oraz polistyrenowe mikrokulki o różnych średnicach, takich jak 5, 10 i 20 µm, i pozostawić je w temperaturze pokojowej na 30 minut.

Używając pipety serologicznej, dodaj dwa mililitry klasycznej pożywki płynnej RPMI 1640 jako rozcieńczalnika do sterylnej probówki polipropylenowej o pojemności pięciu mililitrów. Po 30-minutowym okresie sedymentacji pobierz 10 µl próbki erytrocytów z dna probówki z pobraną krwią pełną i przenieś ją do roztworu RPMI. Dodaj całkowitą objętość 20 µl polistyrenowych mikrokulek do rozcieńczenia erytrocytów w RPMI i wymieszaj zawiesinę komórkową, delikatnie pipetując. Przenieś od pięciu do 15 µl heterogenicznej mieszaniny na szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety.

Na roztwór nałóż drugie, identyczne szkiełko nakrywkowe. Próbka powinna zostać równomiernie zamknięta pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywowymi. Następnie, używając pisaka próżniowego, przenieś próbkę na obszar aktywny matrycy czujników w celu przeprowadzenia obrazowania.

Następnie przygotuj wodny odczyn barwiący, łącząc 0,1% buforowany roztwór SNY oraz rozcieńczony roztwór błękitu nowego (NMB) w stosunku objętości 2:1; szczegółowe informacje na temat przygotowania roztworów SNY i błękitu nowego znajdują się w dołączonym protokole pisemnym. Następnie w zlewce z polipropylenu połącz odczyn barwiący ACOA z próbką krwi pełnej w stosunku objętości 1:1, mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego przez dwie minuty. Po tym czasie inkubuj przez dodatkowe 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj 1,99 ml klasycznego roztworu RPMI 1640 do probówki z polipropylenu o pojemności pięciu mililitrów.

Następnie przenieś 10 µL zabarwionego roztworu krwi do medium RPMI, aby uzyskać stosunek objętości 1:200. Po tym wymieszaj roztwór w wirówce typu vortex przez 30 s, a następnie nanieś od 10 do 100 µL roztworu zabarwionych komórek pomiędzy szkiełka podstawowe lub do zbiornika mikroprzepływowego. Następnie, używając pióra próżniowego, umieść próbkę na obszarze aktywnym macierzy czujników.

Platforma Lucas wykorzystuje optoelektroniczną macierz czujników do cyfrowego rejestrowania hologramów komórek beznożnych. W tym celu stosuje się urządzenia ładunkowo sprzężone, czyli CCD, aby umożliwić oświetlenie o regulowanej długości fali; można użyć monochromatora z lampą ksenonową oraz standardowego światłowodu z topionego krzemionki, który składa się z wiązki włókien i otworu o średnicy około 100 µm znajdującego się około 5 do 10 cm powyżej powierzchni czujnika. Oświetlenie o regulowanej długości fali zapewnia elastyczną platformę, na której można precyzyjnie dostroić sygnatury holograficzne komórek oraz syntetyzować hybrydowe sygnatury cyfrowe poprzez łączenie więcej niż jednej długości fali w celu poprawy stosunku sygnału do szumu i kontrastu obrazu Lucas.

Aby uzyskać lepszą charakterystykę, próbki dokładności umieszczone pomiędzy dwiema szkiełkami nakrywkowymi są nanoszone na obszar aktywny macierzy czujników, równomiernie oświetlony źródłem światła. Hologramy dyfrakcyjne każdej komórki lub mikroobiektu w roztworze heterogennym padają na macierz czujników, tworząc obraz Lucasa. Pozyskane dyfrakcyjne obrazy Lucasa są przetwarzane przez specjalnie opracowany algorytm decyzyjny, który wykorzystuje statystyczną bibliotekę obrazów dyfrakcyjnych do zautomatyzowanej charakterystyki i identyfikacji docelowych komórek lub mikroobiektów.

Rysunek ten przedstawia konwencjonalny obraz wykonany obiektywem 40x, ukazujący heterogeniczny roztwór mikrokulek polistyrenowych o rozmiarach 5, 10 i 20 mikrometrów oraz erytrocytów. Morfologia 3D, współczynnik refrakcji i złożoność międzykomponentowa tych cząstek różnią się od siebie nawzajem.

Niektóre z tych cech można rozróżnić pod zwykłym mikroskopem, jednak w bardzo ograniczonym polu widzenia wynoszącym mniej niż 0,5 mm² na platformie Lucas. Wszystkie te mikrocząstki wykazują unikalne, odmienne wzory holograficzne, podobne do odcisków palców. Dzięki temu mogą one zostać jednoznacznie scharakteryzowane na podstawie ich tekstur 2D.

System Lucas umożliwia monitorowanie ultra szerokiego pola widzenia, które może osiągać rozmiar od 10 do 20 centymetrów kwadratowych. Jest to wartość o rzędy wielkości większa niż w przypadku standardowych mikroskopów z obiektywami soczewkowymi. Poniżej przedstawiono obraz próbki krwi pełnej po barwieniu, wykonany przy użyciu obiektywu 40x na platformie Lucas.

Wewnętrzne cechy zabarwionych białych krwinek różnią się w sposób efektywny dzięki modyfikacji współczynnika załamania światła oraz właściwości rozpraszania jąder komórkowych. Charakterystyczne wzory dyfrakcyjne każdej pojedynczej komórki są rejestrowane przez macierz sensorów. Wykazuje to kolejną zaletę platformy Lucas jako potężnego narzędzia do cytometrii w punkcie opieki (point-of-care) oraz do celów diagnostycznych.

Jako w pełni zautomatyzowana platforma do szybkiej charakterystyki wybranych komórek, obrazy dyfrakcyjne Lucasa są przetwarzane cyfrowo przy użyciu specjalistycznego oprogramowania decyzyjnego. Na tym rysunku interfejs przetwarza heterogeniczną mieszaninę erytrocytów i mikrokulek. Algorytm skutecznie wykrywa obszary o wysokiej gęstości, jak również cząstki o niskim stosunku sygnału do szumu, takie jak kulki o średnicy 3 µm.

Tutaj przedstawiono przetworzony obraz w niestandardowym interfejsie Lucas. Oprogramowanie umożliwia wprowadzenie różnych specyfikacji, takich jak rozmiar piksela sensora lub długość fali oświetlenia. Ponadto możliwe jest zaznaczanie fragmentów obrazu oraz definiowanie wzorców komórkowych.

Próbka jest przeliczana na podstawie tych danych, a użytkownikowi wyświetlany jest obraz z zaznaczeniami. Przedstawiliśmy właśnie sposób obrazowania i charakteryzacji komórek przy użyciu platformy wysokoprzepustowej Lucas. Przeprowadzając tę procedurę, należy pamiętać, że zaprezentowane eksperymenty można zastosować do szerokiej gamy komórek i mikrocząsteczek.

Umożliwia ono również ultra szerokopolową i wysokoprzepustową charakterystykę komórek w roztworze heterogennym. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.