Zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi w celu wzbogacenia frakcji krążących komórek jądrzastych

W celu wzbogacenia frakcji krążących komórek jądrzastych z krwi. Urządzenie mikrofluidyczne jest najpierw przygotowywane za pomocą jednego roztworu XPBS w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie przed załadowaniem próbki krwi przez urządzenie, przy użyciu pomp strzykawkowych, przepuszczana jest woda dejonizowana oraz 2%paraldehyd w dwóch roztworach XPBS. Krew jest następnie przetwarzana w urządzeniu mikrofluidycznym i zbierana; etapy po przetworzeniu próbki obejmują wirowanie i usunięcie nadsączu.

Na koniec próbkę analizuje się za pomocą cytometrii przepływowej w celu przygotowania wykresów fax. Witajcie, jestem William White z laboratorium Biotechnologii w Mikroskali na Wydziale Bioinżynierii na Uniwersytecie Wool. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wzbogacania krążących komórek jądrowych poprzez lizę krwi pełnej z wykorzystaniem mikroprzepływów.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania stanu zapalnego w różnych procesach chorobowych, aby zapewnić wzbogacenie w leukocyty i inne krążące komórki jądrzaste bez ich utraty lub aktywacji. Zatem zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dopasować przewody doprowadzające o nieco większej średnicy niż otwory dostępu kanału w otworach wlotowym i wylotowym.

Następnie, aby zapewnić interfejs między skalą makro a mikro, należy przymocować igłę strzykawki o rozmiarze 30 G do rurek każdego z wlotów. Następnie należy napełnić strzykawkę o pojemności 1 mL roztworem one XPBS, dbając o usunięcie pęcherzyków powietrza. Podłącz strzykawkę do wlotu one i delikatnie naciskaj tłok ręcznie, aż z wlotu two wypłynie roztwór one XPBS.

Następnie natychmiast zacisnąć wlot dwa za pomocą biurowego żabki do papieru. Kontynuować naciskanie tłoka strzykawki, aż roztwór 1x PBS dotrze do portu wylotowego urządzenia mikroprzepływowego. Gdy roztwór wypłynie przez wylot, zacisnąć rurkę wylotową drugą żabką.

Kontynuuj wyciskanie strzykawki o objętości jednego mililitra, aż XPBS wypłynie z wlotu trzy, a następnie zaciśnij port wlotu trzy trzecim żabkowym zaciskiem do papieru. Urządzenie mikroprzepływowe jest teraz w pełni przygotowane. Rozpocznij kalibrację pomp strzykawkowych za pomocą dużej pompy strzykawkowej Harvard, ustawiając konfigurację średnicy na 22.5 milimetrów oraz szybkość przepływu na 600 microliters per minute.

W przypadku małej pompy strzykawkowej Harvard. Ustaw konfigurację średnicy na 4,61 milimetrów, a szybkość przepływu na 20 µL na minutę. Następnie napełnij jedną strzykawkę 30 mililitrów wodą dejonizowaną, pobierając roztwór bezpośrednio z 50 mililitrowej probówki stożkowej.

Pamiętaj o oznakowaniu strzykawki, a następnie napełnij kolejną strzykawkę o pojemności 30 ml roztworem XPBS 2% paraformaldehydu. Ponownie pobierz płyn bezpośrednio z probówki stożkowej i oznakuj strzykawkę. Teraz podłącz strzykawkę z wodą do wlotu dwa, a strzykawkę z 2% paraformaldehydem w XPBS do wlotu trzy, upewniając się, że w przewodach lub w urządzeniu mikroprzepływowym nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza.

Następnie zdejmij zaciski z wlotu drugiego, wlotu trzeciego oraz rurki wylotowej, przy podłączonych trzech strzykawkach. Umieść dwie duże strzykawki w dużej pompie strzykawkowej Harvard, a strzykawkę o objętości 1 mL w małej pompie strzykawkowej Harvard. Umieść rurkę wylotową w stożkowatej probówce odpadowej o pojemności 50 mL.

Następnie włącz dużą pompę strzykawkową Harvard zawierającą strzykawki o pojemności 30 ml i pozwól jej pracować przez jedną minutę. Sprawdź, czy w urządzeniu lub w przewodach nie ma pęcherzyków powietrza ani wycieków. Następnie włącz małą pompę strzykawkową Harvard i pozwól jej również pracować przez dodatkową minutę.

Sprawdzenie obecności pęcherzyków powietrza i wycieków. Zatrzymaj pompy po dwóch minutach. Ponieważ urządzenie mikroprzepływowe jest już gotowe do użycia z próbkami krwi, próbki krwi przeznaczone do analizy zostały pobrane zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym i są wykorzystywane w ciągu jednej godziny od momentu pobrania.

Pierwszą pobraną probówkę krwi utylizuje się, aby wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie. Wyjąć strzykawkę 1 ml z małej pompy strzykawkowej Harvard, a następnie wstrzyknąć 1 XPBS ze strzykawki 1 ml, wypełniając igłę strzykawki. Aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, napełnić strzykawkę 1 ml ilością 50 µl 1 XPBS, dbając, by nie uwięzić żadnych pęcherzyków.

Następnie należy napełnić strzykawkę 0.5 ml krwi. Podczas napełniania należy trzymać strzykawkę pionowo, aby uniknąć zmieszania PBS z krwią. Następnie strzykawkę zawierającą krew należy ponownie podłączyć do wlotu pierwszego.

Wytrzeć nadmiar płynu i zamocować strzykawkę pionowo w małej pompie strzykawkowej Harvard. Należy uważać, aby nie przepchnąć krwi przez cewkę do urządzenia. Wyjąć cewkę wylotową z rurki odpływowej i umieścić ją w czystej probówce wirówkowej o pojemności 50 milliliter znajdującej się w pojemniku z lodem.

Rozpocznij teraz proces, włączając najpierw dużą pompę strzykawkową Harvard i pozostawiając ją włączoną przez jedną minutę. Następnie włącz małą pompę strzykawkową Harvard. Próbka zacznie spływać z rurki wylotowej do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.

Pozostaw próbkę krwi w strzykawce o pojemności 1 ml, aby przeszła całkowicie przez urządzenie, co zajmuje około 20 minut. Następnie zatrzymaj obie pompy. Po zakończeniu procesu odwiruj zebraną próbkę przez pięć minut przy 350 ×g w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamowaniem.

Usunąć nadosad, umieszczając końcówkę pipety po przeciwnej stronie białego osadu. Usunąć jak najwięcej nadosadu, w szczególności szczątki czerwonych krwinek, uważając, aby nie poruszyć białego osadu. Resuspendować próbkę w jednym mililitrze buforu przepływowego zawierającego 1%BSA i 2%paraformaldehydu w 1XPBS poprzez pipetowanie.

Przenieś próbkę do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i wiruj przez pięć minut przy 4×g. W temperaturze pokojowej ostrożnie usuń nadsącz, tak jak w poprzednim etapie wirowania. Na koniec dodaj 1 ml buforu przepływowego i wymieszaj na wortexie, aby resuspendować próbkę, a następnie przystąp do analizy próbki metodą cytometrii przepływowej.

Teraz przedstawimy reprezentatywne wyniki w formie wykresów FACS z próbki krwi wzbogaconej za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i przeanalizowanej metodą cytometrii przepływowej. Znaczenie wzbogacenia poprzez lizę można zauważyć na wykresie FACS, na którym widoczna jest chmura erytrocytów. Wykres rozrzutu uzyskany dzięki protokołowi wzbogacania mikroprzepływowego jest przejrzysty i wykazuje zdefiniowane populacje komórek jądrzastych występujących w krążeniu.

Region czerwony reprezentuje limfocyty, zielony reprezentuje monocyty, niebieski reprezentuje granulocyty, a region fioletowy nie został jeszcze scharakteryzowany. Brak usunięcia szczątków erytrocytów w protokole powoduje powstanie skupiska zdarzeń na wykresie fax widocznym w regionie cyjanowym. Populacje komórek można zwizualizować na oddzielnych wykresach fax.

Limfocyty zidentyfikowano za pomocą CD3 i CD4, monocyty za pomocą CD14, a granulocyty za pomocą CD66p. Przedstawiliśmy właśnie sposób przygotowania i analizy próbki krwi z użyciem mikrofluidycznego urządzenia do lizy krwi. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby niezwłocznie podać próbkę krwi, aby zapobiec mieszaniu się PBS z krwią przed wprowadzeniem do urządzenia oraz uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza do kanałów urządzenia.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.