Name: Zautomatyzowany protokół mikroprzepływowej lizy krwi w celu wzbogacenia krążących komórek jądrzastych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę mikroprzepływową do wzbogacania krążących komórek jądrzastych z krwi obwodowej. Technika ta zapewnia izolację wysokiej jakości próbek przy minimalnej utracie komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania zostały wsparte przez Wallace H. Coulter Foundation Early Career Award in Translational Research. Podziękowania kierujemy do Tima Andrewsa z Oddziału Hematologii i Onkologii Dziecięcej za pomoc w pobieraniu próbek krwi. Dziękujemy również dr. Samowi Wellhausenowi z Flow Cytometry Core w James Graham Brown Cancer Center za pomoc w analizie próbek metodą cytometrii przepływowej.

Część 1. Fabrykacja urządzenia mikrofluidycznego
Krzemowa forma matrycowa urządzenia do lizy mikroprzepływowej została wykonana przy użyciu standardowych technik fotolitograficznych z wykorzystaniem sprzętu znajdującego się w czystym pomieszczeniu University of Louisville [1]. Program AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) posłużył do wygenerowania maski transparentnej (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) w celu stworzenia negatywnych replik kanałów. Urządzenie do lizy mikroprzepływowej wykonano z krzemowej formy matrycowej przy użyciu technik soft-litografii z wykorzystaniem elastomeru poli(dimetylosiloksanu) (PDMS; Dow Corning, Midland, MI). Elastomer z replikowanymi kanałami został oddzielony od formy, a otwory dostępowe do kanałów wykonano za pomocą igły o rozmiarze 20-gauge (Small Parts, Miramar, FL.). Wafer z PDMS został nieodwracalnie połączony ze szkiełkiem przedmiotowym za pomocą plazmy tlenowej i poddany testom eksperymentalnym.
Część 2. Protokół obsługi urządzenia do lizy
Po wykonaniu i przetestowaniu urządzenia mikrofluidycznego można rozpocząć eksperymenty z lizą erytrocytów. W następującej sekcji szczegółowo opisano protokół dla urządzenia mikrofluidycznego.
2.1 Pobieranie próbek
<ol>
 <li>Pobrać 4 ml próbki krwi z żyły łokciowej środkowej na przedniej stronie przedramienia pacjenta do dwóch 2 ml probótek próżniowych z zielonym zamknięciem zawierających heparynę jako antykoagulant.</li>
 <li>Odrzucić pierwszą probówkę 2 ml, ponieważ zawiera ona oderwane dojrzałe komórki śródbłonka (wyniki fałszywie dodatnie).</li>
 <li>Resuspendować zawartość drugiej probówki, mieszając heparynę z krwią poprzez obracanie probówką w górę i w dół; natychmiast umieścić próbkę w lodzie.</li>
 <li>Przenieść 1 ml krwi do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Próbkę krwi należy przetworzyć niezwłocznie (w ciągu jednej godziny od pobrania).</li>
</ol>
2.2 Nasycenie urządzenia mikroprzepływowego PBS
<ol>
 <li>Należy przygotować urządzenie mikrofluidyczne złączone ze szkłem. W wlotach i wylocie należy zamontować na wcisk rurki doprowadzające (Small Parts, Miramar, FL) o nieco większej średnicy (Rycina 1).</li>
 <li>Do rurek w każdym z wlotów należy przymocować igłę strzykawki o rozmiarze 30G (Small Parts, Miramar, FL), tworząc interfejs makro-mikro.</li>
 <li>Strzykawkę o pojemności 1 ml należy napełnić roztworem 1X PBS, usuwając pęcherzyki powietrza poprzez lekkie stuknięcie w igłę strzykawki. Strzykawkę 1 ml z PBS należy podłączyć do wlotu 1 w urządzeniu mikrofluidycznym. Należy delikatnie, ręcznie docisnąć tłok strzykawki z 1X PBS, aż roztwór zacznie wypływać z wlotu 2, a następnie niezwłocznie zacisnąć wlot 2 za pomocą standardowego biurowego klipsa.</li>
 <li>Należy kontynuować podawanie 1X PBS, aż płyn dotrze do portu wylotowego urządzenia mikrofluidycznego. Gdy roztwór wypłynie z wylotu, rurkę wylotową należy zacisnąć innym klipsem.</li>
 <li>Należy dalej dociskać tłok strzykawki 1 ml, aż 1X PBS wypłynie z wlotu 3, a następnie zacisnąć port wlotu 3 kolejnym klipsem biurowym. Urządzenie mikrofluidyczne jest teraz w pełni przygotowane (przepłukane).</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="Schemat urządzenia mikroprzepływowego; wloty dla PBS, wody dejonizowanej, próbki; analiza przepływu cieczy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Schemat urządzenia przedstawiający wloty dla poszczególnych roztworów oraz wylot.
2.3 Przygotowanie pomp strzykawkowych i roztworu
<ol>
 <li>Aby skalibrować pompy, należy wykonać następujące kroki:
 <ol class="lalpha">
 <li>W przypadku dużej pompy strzykawkowej Harvard (Harvard, PHD 22/2000 Part # 702000): ustawić konfigurację średnicy na 22.5 mm i szybkość przepływu na 600 μl/min. </li>
 <li>W przypadku małej pompy strzykawkowej Harvard (Harvard, Pico Plus Part # 702213): ustawić konfigurację średnicy na 4.61 mm i szybkość przepływu na 20 μl/min. </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Napełnić strzykawkę 30 ml sterylną wodą dejonizowaną. Można to zrobić, pobierając roztwór bezpośrednio z probówki stożkowej 50 ml. (Oznaczyć strzykawkę)</li>
 <li>Napełnić drugą strzykawkę 30 ml 2X fosforanem buforowanym solą (PBS) z 2% paraformaldehydem (PFA), stosując procedurę opisaną w kroku 9. (Oznaczyć strzykawkę)</li>
 <li>Napełnić strzykawkę 1 ml 1X PBS z alikwotów przechowywanych w probówkach stożkowych 15 ml, stosując procedurę opisaną w kroku 9.</li>
 <li>Podłączyć strzykawkę 30 ml z wodą dejonizowaną do wlotu 2, a strzykawkę 30 ml z 2X PBS do wlotu 3 (należy upewnić się, że w rurkach lub urządzeniu mikroprzepływowym nie pozostały pęcherzyki powietrza). Zdjąć zaciski z wlotów 2 i 3 oraz z rurki wylotowej. Podłączyć strzykawkę 1 ml z 1X PBS do wlotu 1. Aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków, należy napełnić igłę strzykawki cieczą, podłączyć strzykawkę, a następnie stuknąć w igłę, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
</ol>
2.4 Lizacja erytrocytów
<ol>
 <li>Zamocuj wszystkie strzykawki w odpowiednich pompach Harvard zgodnie z poniższymi instrukcjami:
 <ol class="lalpha">
 <li>Zamocuj dwie strzykawki o pojemności 30 ml (jedna zawierająca sterylną wodę dejonizowaną, a druga 2X PBS, 2% PFA) razem w dużej pompie strzykawkowej Harvard.</li>
 <li>Zamocuj strzykawkę o pojemności 1 ml (zawierającą 1X PBS) w małej pompie strzykawkowej Harvard.</li>
 <li>Umieść dren odpływowy w pojemniku na odpady (probówce stożkowej 50 ml z etykietą waste).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Włącz dużą pompę strzykawkową Harvard (ze strzykawkami 30 ml) i pozostaw ją włączoną przez jedną minutę. (Upewnij się, że w urządzeniu lub w drenach nie ma pęcherzyków powietrza ani wycieków).</li>
 <li>Włącz małą pompę strzykawkową Harvard i pozostaw ją włączoną przez dodatkową minutę. (Upewnij się, że w urządzeniu lub w drenach nie ma pęcherzyków powietrza ani wycieków). Zatrzymaj pompy. Urządzenie mikroprzepływowe jest teraz gotowe do użycia.</li>
 <li>Zdejmij strzykawkę 1 ml zawierającą 1X PBS z małej pompy strzykawkowej Harvard.</li>
 <li>Po pobraniu próbki krwi napełnij strzykawkę 1 ml ilością 0,05 ml sterylnego 1X PBS, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Następnie napełnij strzykawkę ilością 0,5 ml krwi pobranej z probówki Eppendorf. (Strzykawka 1 ml będzie teraz zawierać końcową objętość 0,55 ml krwi i buforu 1X PBS). Uwaga: Podczas napełniania trzymaj strzykawkę w pozycji pionowej, aby uniknąć wymieszania 0,05 ml PBS z krwią.</li>
 <li>Podłącz strzykawkę zawierającą krew do wlotu 1 i ostrożnie zamocuj strzykawkę (unikając przepchnięcia krwi przez dren do urządzenia) w małej pompie strzykawkowej Harvard (strzykawkę montuje się pionowo w pompie).</li>
 <li>Wyjmij dren odpływowy z probówki waste i zastąp go czystą probówką wirówkową 50 ml, a następnie ustaw ją w naczyniu z lodem.</li>
 <li>Włącz najpierw dużą pompę strzykawkową Harvard i pozostaw ją włączoną przez 1 minutę. Rozpocznij zbieranie próbki z odpływu do probówki wirówkowej 50 ml.</li>
 <li>Włącz małą pompę strzykawkową Harvard.</li>
 <li>Gdy próbka krwi ze strzykawki 1 ml całkowicie przepłynie przez urządzenie, zatrzymaj obie pompy. Powinno to zająć około 20 minut.</li>
 <li>Wirowarkuj zebraną próbkę przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem.</li>
 <li>Usuń nadsącz, umieszczając końcówkę pipety po przeciwnej stronie białego osadu. Usuń jak najwięcej nadsączu, zwłaszcza zanieczyszczeń z czerwonych krwinek, nie naruszając białego osadu.</li>
 <li>Resuspenduj próbkę w 1 ml buforu przepływowego (1X PBS, 1% BSA [albuminy surowicy bydlęcej], 2% PFA) poprzez pipetowanie w górę i w dół. Przenieś próbkę do probówki Eppendorf 1,5 ml.</li>
 <li>Wirowarkuj zebraną próbkę w mikrowirówce przez 5 minut przy 4 x g w temperaturze pokojowej. Z taką samą precyzją jak wcześniej usuń nadsącz.</li>
 <li>Resuspenduj próbkę w 1 ml buforu przepływowego za pomocą wortexowania.</li>
</ol>
2.5 Przygotowanie do analizy cytometrycznej
<ol>
 <li>W celu analizy próbek za pomocą cytometrii przepływowej, należy przenieść 100 μl próbki do probówki do cytometrii przepływowej.</li>
 <li>Do 100 μl próbki należy dodać określone przeciwciało (zachowując odpowiednie stężenie).</li>
 <li>Próbkę inkubować przez 30 minut w temperaturze 40 C.</li>
 <li>Przed przeprowadzeniem cytometrii przepływowej próbkę należy dwukrotnie przemyć buforem do cytometrii. Etap płukania obejmuje dodanie 250 μl buforu do cytometrii, wymieszanie w wortexie, wirowanie przez 5 minut przy 350 x g oraz usunięcie supernatantu jednym ruchem odwrócenia probówki do cytometrii przepływowej.</li>
 <li>Osad należy resuspender w 250 μl buforu do cytometrii. Próbka jest gotowa do analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Krew pełna została przepuszczona przez mikrofluidyczne urządzenie do lizy oraz poddana protokołowi postprocesowania, co pozwoliło na usunięcie erytrocytów i wzbogacenie frakcji krążących komórek jądrzastych (CNCs). Idealne wyniki powinny dać przejrzysty wykres rozrzutu z cytometrii przepływowej z oddzielnymi populacjami CNC. Na poniższych Rysunkach 2 i 3 przedstawiono porównanie wykresów rozrzutu próbki krwi pełnej bez lizy erytrocytów oraz z lizą erytrocytów przeprowadzoną zgodnie z protokołem mikrofluidycznym, gdzie osie reprezentują rozproszenie światła w przód (FSC) względem rozproszenia bocznego (SSC). Można zauważyć, że protokół wzbogacania metodą mikrofluidyczną jest niezbędny do uzyskania przejrzystego wykresu rozrzutu w cytometrii przepływowej.
<img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="Wynik cytometrii przepływowej, wykres kropkowy, FSC vs SSC, analiza komórkowa, diagram rozkładu punktów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Wykres kropkowy z cytometrii przepływowej próbki krwi pełnej bez lizy erytrocytów z osiami FSC i SSC.
<img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="Cytometria przepływowa, wykres kropkowy SSC vs FSC, analiza populacji komórek, diagram rozproszenia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Wykres rozproszenia z cytometrii przepływowej krążących komórek jądrzastych z mikrofluidyczną lizą erytrocytów, z populacjami oznaczonymi na osiach FSC i SSC. Region 1 (czerwony) reprezentuje limfocyty, Region 2 (zielony) reprezentuje monocyty, Region 3 (niebieski) reprezentuje granulocyty, a Region 4 (fioletowy) nie został jeszcze scharakteryzowany.
Usunięcie resztek krwinek czerwonych za pomocą pipety w protokole jest również istotne, gdy jest to konieczne. Poniżej, na Rysunku 4, przedstawiono wykres rozrzutu wykazujący nadmiar resztek krwinek czerwonych. Choć nie zaciemniają one wykresu rozrzutu tak jak na Rysunku 2, podczas analizy danych należy uwzględnić dodatkowe zdarzenia wynikające z obecności resztek erytrocytów.
<img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="Wykres rozrzutu cytometrii przepływowej; analiza FSC vs SSC; zróżnicowane populacje komórek R2, R3, R4." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Wykres rozrzutu cytometrii przepływowej przedstawiający detrytus krwinek czerwonych, widoczny jako skupisko zdarzeń w Regionie 5 (cyjan).
Barwienie komórek na określone fenotypowe markery przeciwciał również przyniesie charakterystyczne wyniki. Na poniższych rysunkach przedstawiono barwienia fenotypowe przeciwciał dla 3 odrębnych populacji leukocytów: limfocytów, monocytów i granulocytów. Rysunek 5 przedstawia populacje limfocytów wykreślone na osiach CD3 i CD4. Monocyty i granulocyty pokazano na rysunkach 6-7 z osiami odpowiednio FSC względem CD14 oraz CD66b.
<img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="Wykres cytometrii przepływowej, analiza ekspresji antygenów CD3 i CD4, dane dotyczące populacji komórek odpornościowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5. Wykres punktowy z cytometrii przepływowej przedstawiający limfocyty na osiach CD3 i CD4.
<img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="Wykres kropkowy cytometrii przepływowej; FSC vs. CD14; analiza populacji komórek, wizualizacja danych rozproszenia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> Rysunek 6. Wykres rozproszenia z cytometrii przepływowej przedstawiający monocyty na osiach FSC i CD14.
<img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="Wykres kropkowy cytometrii przepływowej; CD66b vs FSC, przedstawiający analizę populacji komórek, kolorowe klastry." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"> Rysunek 7. Wykres rozrzutu cytometrii przepływowej przedstawiający granulocyty z osiami FSC i CD66b.

<ol><li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+%28SCD%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li>
<li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li>
</ol>

Opisano zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi. W protokole znajdują się kluczowe kroki, na które należy zwrócić uwagę. W sekcji P.2.1 ważne jest odrzucenie pierwszej pobranej probówki z krwią, ponieważ próbka zawiera oderwane dojrzałe komórki śródbłonka, które dają wyniki fałszywie dodatnie. Należy również upewnić się, że analiza próbki krwi zostanie przeprowadzona w ciągu godziny od momentu pobrania. Podczas przygotowania urządzenia mikrofluidycznego w sekcji P.2.2 ważne jest początkowe usunięcie pęcherzyk...

<table><tbody><tr><td>Baza elastomeru silikonowego Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Utwardzacz elastomeru silikonowego Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła do strzykawki G30</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>NE-301PL-25</td><td></td></tr><tr><td>Przewód Tygon (.010&quot; ID)</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>TGY-010</td><td></td></tr><tr><td>Igła do strzykawki G20</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>NE-201PL-25</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa (Harvard PHD 22/2000)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702000</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa (Harvard Pico Plus)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702213</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do cytometrii przepływowej</td><td>DB Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Barwniki przeciwciałowe</td><td>DB Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka 30 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seryjowa albumina bydlęca (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi w celu wzbogacenia frakcji krążących komórek jądrzastych

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

W niniejszym raporcie szczegółowo opisano protokół wykorzystujący zautomatyzowane mikrofluidyczne urządzenie do lizy krwi. Krążące komórki jądrzaste (CNC), w tym leukocyty i komórki śródbłonka, stanowią idealną platformę do aktualizacji stanu układu odpornościowego danej osoby. Protokół mikrofluidyczny umożliwia wzbogacenie frakcji CNC bez selektywnej utraty komórek oraz bez zmienności w przygotowaniu próbek wynikającej z etapów realizowanych przez operatora. W skrócie protokół obejmuje wykonanie urządzenia, pobranie próbek, konfigurację urządzenia oraz przepuszczenie krwi przez komorę mikrofluidyczną. Wewnątrz urządzenia krew pełna jest gwałtownie mieszana z wodą dejonizowaną przez około 10 sekund w kanale mikrofluidycznym o wymiarach 50 μm x 150 μm. W tym przedziale czasowym erytrocyty ulegają lizie ze względu na warunki hipotoniczne. Struktury typu herringbone na dnie kanału zapewniają dokładne mieszanie i ekspozycję komórek na stałe środowisko. Pozostałe komórki są przywracane do warunków izotonicznych na wylocie z urządzenia, utrwalane przy użyciu 2% paraformaldehydu, wirowane w celu oddzielenia szczątków erytrocytów od CNC, a następnie zawieszane w buforze przepływowym w celu barwienia i analizy metodą cytometrii przepływowej. Wyniki wykazują czyste wykresy rozrzutu w cytometrii przepływowej z zachowaniem populacji CNC. Znaczenie tego urządzenia i protokołu przejawia się w badaniu i zrozumieniu patogenezy chorób poprzez analizę populacji CNC. Tym samym wykazano automatyzację, skuteczność i prostotę protokołu mikrofluidycznego.

Opracowano zautomatyzowane urządzenie mikroprzepływowe do wzbogacania krążących komórek z jądrem z krwi obwodowej poprzez lizę erytrocytów, co zapewnia izolację wysokiej jakości próbki bez utraty komórek.

Zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi w celu wzbogacenia frakcji krążących komórek jądrzastych

W niniejszym raporcie szczegółowo opisano protokół dotyczący zautomatyzowanego mikrofluidycznego urządzenia do lizy krwi. Krążące komórki jądrzaste (CNC), w tym leukocyty i ...

W celu wzbogacenia frakcji krążących komórek jądrzastych z krwi. Urządzenie mikrofluidyczne jest najpierw przygotowywane za pomocą jednego roztworu XPBS w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie przed załadowaniem próbki krwi przez urządzenie, przy użyciu pomp strzykawkowych, przepuszczana jest woda dejonizowana oraz 2%paraldehyd w dwóch roztworach XPBS. Krew jest następnie przetwarzana w urządzeniu mikrofluidycznym i zbierana; etapy po przetworzeniu próbki obejmują wirowanie i usunięcie nadsączu.Na koniec próbkę analizuje się za pomocą cytometrii przepływowej w celu przygotowania wykresów fax. Witajcie, jestem William White z laboratorium Biotechnologii w Mikroskali na Wydziale Bioinżynierii na Uniwersytecie Wool. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wzbogacania krążących komórek jądrowych poprzez lizę krwi pełnej z wykorzystaniem mikroprzepływów.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania stanu zapalnego w różnych procesach chorobowych, aby zapewnić wzbogacenie w leukocyty i inne krążące komórki jądrzaste bez ich utraty lub aktywacji. Zatem zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dopasować przewody doprowadzające o nieco większej średnicy niż otwory dostępu kanału w otworach wlotowym i wylotowym.Następnie, aby zapewnić interfejs między skalą makro a mikro, należy przymocować igłę strzykawki o rozmiarze 30 G do rurek każdego z wlotów. Następnie należy napełnić strzykawkę o pojemności 1 mL roztworem one XPBS, dbając o usunięcie pęcherzyków powietrza. Podłącz strzykawkę do wlotu one i delikatnie naciskaj tłok ręcznie, aż z wlotu two wypłynie roztwór one XPBS.Następnie natychmiast zacisnąć wlot dwa za pomocą biurowego żabki do papieru. Kontynuować naciskanie tłoka strzykawki, aż roztwór 1x PBS dotrze do portu wylotowego urządzenia mikroprzepływowego. Gdy roztwór wypłynie przez wylot, zacisnąć rurkę wylotową drugą żabką.Kontynuuj wyciskanie strzykawki o objętości jednego mililitra, aż XPBS wypłynie z wlotu trzy, a następnie zaciśnij port wlotu trzy trzecim żabkowym zaciskiem do papieru. Urządzenie mikroprzepływowe jest teraz w pełni przygotowane. Rozpocznij kalibrację pomp strzykawkowych za pomocą dużej pompy strzykawkowej Harvard, ustawiając konfigurację średnicy na 22.5 milimetrów oraz szybkość przepływu na 600 microliters per minute.W przypadku małej pompy strzykawkowej Harvard. Ustaw konfigurację średnicy na 4,61 milimetrów, a szybkość przepływu na 20 µL na minutę. Następnie napełnij jedną strzykawkę 30 mililitrów wodą dejonizowaną, pobierając roztwór bezpośrednio z 50 mililitrowej probówki stożkowej.Pamiętaj o oznakowaniu strzykawki, a następnie napełnij kolejną strzykawkę o pojemności 30 ml roztworem XPBS 2% paraformaldehydu. Ponownie pobierz płyn bezpośrednio z probówki stożkowej i oznakuj strzykawkę. Teraz podłącz strzykawkę z wodą do wlotu dwa, a strzykawkę z 2% paraformaldehydem w XPBS do wlotu trzy, upewniając się, że w przewodach lub w urządzeniu mikroprzepływowym nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza.Następnie zdejmij zaciski z wlotu drugiego, wlotu trzeciego oraz rurki wylotowej, przy podłączonych trzech strzykawkach. Umieść dwie duże strzykawki w dużej pompie strzykawkowej Harvard, a strzykawkę o objętości 1 mL w małej pompie strzykawkowej Harvard. Umieść rurkę wylotową w stożkowatej probówce odpadowej o pojemności 50 mL.Następnie włącz dużą pompę strzykawkową Harvard zawierającą strzykawki o pojemności 30 ml i pozwól jej pracować przez jedną minutę. Sprawdź, czy w urządzeniu lub w przewodach nie ma pęcherzyków powietrza ani wycieków. Następnie włącz małą pompę strzykawkową Harvard i pozwól jej również pracować przez dodatkową minutę.Sprawdzenie obecności pęcherzyków powietrza i wycieków. Zatrzymaj pompy po dwóch minutach. Ponieważ urządzenie mikroprzepływowe jest już gotowe do użycia z próbkami krwi, próbki krwi przeznaczone do analizy zostały pobrane zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym i są wykorzystywane w ciągu jednej godziny od momentu pobrania.Pierwszą pobraną probówkę krwi utylizuje się, aby wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie. Wyjąć strzykawkę 1 ml z małej pompy strzykawkowej Harvard, a następnie wstrzyknąć 1 XPBS ze strzykawki 1 ml, wypełniając igłę strzykawki. Aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, napełnić strzykawkę 1 ml ilością 50 µl 1 XPBS, dbając, by nie uwięzić żadnych pęcherzyków.Następnie należy napełnić strzykawkę 0.5 ml krwi. Podczas napełniania należy trzymać strzykawkę pionowo, aby uniknąć zmieszania PBS z krwią. Następnie strzykawkę zawierającą krew należy ponownie podłączyć do wlotu pierwszego.Wytrzeć nadmiar płynu i zamocować strzykawkę pionowo w małej pompie strzykawkowej Harvard. Należy uważać, aby nie przepchnąć krwi przez cewkę do urządzenia. Wyjąć cewkę wylotową z rurki odpływowej i umieścić ją w czystej probówce wirówkowej o pojemności 50 milliliter znajdującej się w pojemniku z lodem.Rozpocznij teraz proces, włączając najpierw dużą pompę strzykawkową Harvard i pozostawiając ją włączoną przez jedną minutę. Następnie włącz małą pompę strzykawkową Harvard. Próbka zacznie spływać z rurki wylotowej do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.Pozostaw próbkę krwi w strzykawce o pojemności 1 ml, aby przeszła całkowicie przez urządzenie, co zajmuje około 20 minut. Następnie zatrzymaj obie pompy. Po zakończeniu procesu odwiruj zebraną próbkę przez pięć minut przy 350 ×g w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamowaniem.Usunąć nadosad, umieszczając końcówkę pipety po przeciwnej stronie białego osadu. Usunąć jak najwięcej nadosadu, w szczególności szczątki czerwonych krwinek, uważając, aby nie poruszyć białego osadu. Resuspendować próbkę w jednym mililitrze buforu przepływowego zawierającego 1%BSA i 2%paraformaldehydu w 1XPBS poprzez pipetowanie.Przenieś próbkę do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i wiruj przez pięć minut przy 4×g. W temperaturze pokojowej ostrożnie usuń nadsącz, tak jak w poprzednim etapie wirowania. Na koniec dodaj 1 ml buforu przepływowego i wymieszaj na wortexie, aby resuspendować próbkę, a następnie przystąp do analizy próbki metodą cytometrii przepływowej.Teraz przedstawimy reprezentatywne wyniki w formie wykresów FACS z próbki krwi wzbogaconej za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i przeanalizowanej metodą cytometrii przepływowej. Znaczenie wzbogacenia poprzez lizę można zauważyć na wykresie FACS, na którym widoczna jest chmura erytrocytów. Wykres rozrzutu uzyskany dzięki protokołowi wzbogacania mikroprzepływowego jest przejrzysty i wykazuje zdefiniowane populacje komórek jądrzastych występujących w krążeniu.Region czerwony reprezentuje limfocyty, zielony reprezentuje monocyty, niebieski reprezentuje granulocyty, a region fioletowy nie został jeszcze scharakteryzowany. Brak usunięcia szczątków erytrocytów w protokole powoduje powstanie skupiska zdarzeń na wykresie fax widocznym w regionie cyjanowym. Populacje komórek można zwizualizować na oddzielnych wykresach fax.Limfocyty zidentyfikowano za pomocą CD3 i CD4, monocyty za pomocą CD14, a granulocyty za pomocą CD66p. Przedstawiliśmy właśnie sposób przygotowania i analizy próbki krwi z użyciem mikrofluidycznego urządzenia do lizy krwi. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby niezwłocznie podać próbkę krwi, aby zapobiec mieszaniu się PBS z krwią przed wprowadzeniem do urządzenia oraz uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza do kanałów urządzenia.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

automated-microfluidic-blood-lysis-protocol-for-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zautomatyzowany protokół mikrofluidycznego lizy krwi w celu wzbogacenia krążących komórek jądrzastych

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Leukocyty krwi i płytki krwi mogą być używane jako marker ogólnego zdrowia bioenergetycznego danej osoby, a więc mają potencjał do monitorowania procesów patologicznych i wpływu leczenia. Tutaj opisujemy metodę izolacji i pomiaru funkcji mitochondriów oraz wybuchu oksydacyjnego w tych komórkach.

Bioenergetyka i wybuch oksydacyjny: protokoły izolacji i oceny ludzkich leukocytów i płytek krwi

Ten protokół opisuje szybką nieenzymatyczną dysocjację świeżych fragmentów tkanek ludzkich do jakościowej i ilościowej oceny komórek CD45+ (limfocytów/leukocytów) obecnych w różnych normalnych i złośliwych tkankach ludzkich. Dodatkowo, supernatant uzyskany z pierwotnego homogenatu tkankowego może być zbierany i przechowywany do dalszej analizy lub eksperymentów.

Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

Celem tego protokołu jest produkcja specyficznych dla patogenów klinicznych limfocytów T przy użyciu laboratoryjnego, zautomatyzowanego urządzenia do wzbogacania komórek drugiej generacji, które zawiera zamknięty system wychwytywania cytokin i nie wymaga dedykowanego personelu ani korzystania z urządzenia GMP. Wygenerowane limfocyty T specyficzne dla wirusa cytomegalii pp65 mogą być bezpośrednio podawane pacjentom.

Zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów T specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

W tym badaniu demonstrujemy metodę separacji neutrofili bez znaczników z klinicznych wydzielin dróg oddechowych przy użyciu zamkniętej pętli spiralnej inercyjnej mikrofluidyki. Proponowana metoda rozszerzyłaby kliniczne testy in vitro dla różnych chorób układu oddechowego.

Bezznacznikowe wzbogacanie neutrofili z wydzielania przez pacjenta z dróg oddechowych przy użyciu mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej

Charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) jest popularnym tematem w badaniach translacyjnych. Protokół ten opisuje półautomatyczny test immunofluorescencyjny (IF) do charakterystyki PD-L1 i liczenia CTC w próbkach pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC).

Półautomatyczna charakterystyka i liczenie krążących komórek nowotworowych PD-L1 od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca za pomocą immunofluorescencji

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę kompatybilną z automatyzacją o wysokiej przepustowości, polegającą na izolowaniu ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do biobankowania i innych celów.

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od kożuchów za pomocą wysokoprzepustowej separacji kulek immunomagnetycznych

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Poznaj zautomatyzowaną metodę mikroprzepływową do wzbogacania krążących komórek jądrzastych z krwi obwodowej. Technika ta zapewnia izolację wysokiej jakości próbek przy minimalnej utracie komórek.

Zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi w celu wzbogacenia frakcji krążących komórek jądrzastych

Przeglądaj więcej filmów