Name: Zapisy ssania pojedynczych komórek z fotoreceptorów stożków myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: Poznaj technikę zapisu odpowiedzi błyskowych z pojedynczych stożków myszy przy użyciu elektrody ssącej. Metoda obejmuje preparację siatkówki i izolację komórek fotoreceptorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez Career Development Award z Research to Prevent Blindness, grant NIH EY 019312 oraz nieograniczony grant z Research to Prevent Blindness i EY 02687 (Department of Ophthalmology &amp; Visual Sciences na Washington University).

Wykonanie elektrod
<ol>
 <li>Wykonaj elektrody rejestrujące za pomocą wyciągarki do mikropipet i wypoleruj je za pomocą włókna grzewczego pod mikroskopem. Dla rejestracji z zasysaniem pojedynczych komórek czopkowych myszy średnica wewnętrzna końcówki elektrody powinna wynosić około 6-7 μm.</li>
 <li>Przygotuj elektrody odniesienia. Odważ 1% agar w wodzie destylowanej. Rozpuść roztwór agaru w łaźni wodnej. Wypełnij pipety szklane (L = 100 mm, OD/ID = 1/0.75 mm) 1% agarem za pomocą strzykawki. Pozostaw agar do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
 <li>Przetnij pipety na pół za pomocą noża diamentowego.</li>
 <li>Namocz elektrody odniesienia w roztworze odniesienia przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
Przygotowanie eksperymentu
<ol start="5">
 <li>Poddać mysz adaptacji do ciemności w czarnej klatce przez noc.</li>
 <li>Przygotować 100 mL roztworu referencyjnego oraz 1 L roztworu perfuzyjnego (patrz poniżej), a następnie przefiltrować roztwór.</li>
 <li>Rozpuścić 0,1% BSA oraz 10 mM glukozy w 20 mL roztworu referencyjnego.</li>
 <li>Zkalibrować natężenie światła stymulatora optycznego za pomocą fotometru.</li>
 <li>Zamocować komorę rejestracyjną na stoliku mikroskopu odwróconego.</li>
 <li>Napowietrzyć roztwór perfuzyjny mieszanką 95% O2/5% CO2 i inkubować go w kąpieli wodnej o temperaturze 40 °C, aby zwiększyć rozpuszczalność CO2. Roztwór przepływa z butelki do komory rejestracyjnej przez ceramiczny rezystor grzejny, który ogrzewa go do 36-38 °C. Grzejnik powinien znajdować się jak najbliżej komory rejestracyjnej, idealnie na stoliku mikroskopu.</li>
 <li>Ustawić regulator przepływu na wartość około 1-1,5 mL/min.</li>
 <li>Napełnić elektrodę rejestrującą roztworem referencyjnym. Umieścić elektrodę w uchwycie do elektrod. Upewnić się, że w elektrodzie nie ma pęcherzyków powietrza. Zamocować uchwyt na przedwzmacniaczu (headstage) wzmacniacza. Podłączyć uchwyt do urządzenia ssącego, zbudowanego poprzez połączenie rurki częściowo wypełnionej olejem mineralnym z portem bocznym uchwytu elektrody. Drugi koniec rurki jest połączony z małym zbiorniczkiem oleju mineralnego, do którego można przyłożyć ciśnienie ustami.</li>
 <li>Podłączyć elektrodę referencyjną do drugiego bieguna przedwzmacniacza. Przymocować termoparę (TC) do elektrody referencyjnej. Upewnić się, że końcówki elektrody i termopary znajdują się blisko siebie, aby pomiar temperatury odbywał się jak najbliżej komórki.</li>
 <li>Włączyć podświetlenie podczerwienią, aby zwizualizować elektrodę. Elektrodę obserwuje się za pomocą kamery podczerwieni podłączonej do monitora. Wycentrować obraz elektrody w polu widzenia monitora za pomocą mikromanipulatora.</li>
 <li>Ustawić końcówkę elektrody referencyjnej blisko (2-4 mm) końcówki elektrody rejestrującej.</li>
 <li>Dostosować napięcie DC grzałki tak, aby temperatura roztworu wynosiła około 36-38 °C.</li>
 <li>Przeprowadzić test szczelności (seal test), aby sprawdzić oporność elektrody rejestrującej, która normalnie wynosi około 900 kΩ.</li>
</ol>
Izolacja siatkówki mysiej
<ol start="18">
 <li>W słabym czerwonym świetle uśmierć mysz zaadaptowaną do ciemności za pomocą CO2 i zwichnięcia szyjnego. Zaznacz gałki oczne, lekko przypalając najbardziej grzbietowy punkt twardówki końcówką rozgrzanej metalowej wypalarki. Wyciśnij gałki oczne za pomocą nożyczek. Wszystkie kolejne procedury wykonuje się w świetle podczerwonym.</li>
 <li>Przecięcie gałek ocznych na pół wykonaj pod mikroskopem z oświetleniem podczerwonym i konwerterami obrazu.</li>
 <li>Usuń rogówkę i soczewkę. Usuń jak największą ilość ciała szklistego.</li>
 <li>Aby zarejestrować odpowiedzi czopków typu M, usuń brzuszną część oczodołu 4 za pomocą żyletki, orientując się na podstawie znaku wypalenia.</li>
 <li>Oddziel siatkówkę od warstwy nabłonka pigmentowego.</li>
 <li>Rozprostuj siatkówkę i umieść ją na dnie szalki Petriego wypełnionej 1-2 mL roztworu referencyjnego.</li>
 <li>Pokrój siatkówkę na małe, cienkie kawałki za pomocą żyletki i inkubuj preparat w szczelnym pudełku odpornym na światło, nasyconym czystym tlenem.</li>
</ol>
Nagrania
<ol start="25">
 <li>Wyłączyć tymczasowo podgrzewacz. Przekierować przepływ perfuzyjny do przewodu obejściowego, aby zapobiec wyschnięciu komory.</li>
 <li>Odessać większość roztworu z komory za pomocą chusteczki Kimwipe. Przenieść zawiesinę siatkówki do komory rejestracyjnej przy użyciu szklanej pipety.</li>
 <li>Odczekać około 2 minut, aż skrawki siatkówki osiądą. Przywrócić perfuzję. Włączyć podgrzewacz.</li>
 <li>Włączyć oświetlenie podczerwone, aby zwizualizować preparat. Odnaleźć fragment siatkówki leżący w komorze, w którym zewnętrzne segmenty fotoreceptorów wystają na zewnątrz (patrz rycina przykładu). Delikatnie wciągnąć segmenty wewnętrzne do elektrody za pomocą ssania. W tej konfiguracji do elektrody powinny zostać wciągnięte kilka jąder oraz segmenty wewnętrzne. Zarejestrować odpowiedź na jasny błysk, aby sprawdzić, czy w elektrodzie znajduje się segment wewnętrzny czopka oraz czy komórka jest zdrowa, oceniając to po kinetyce i amplitudzie odpowiedzi.</li>
 <li>Obniżyć rezerwuar mineralny, aby przyłożyć lekkie podciśnienie do końcówki elektrody, co pomoże utrzymać segment wewnętrzny w elektrodzie.</li>
 <li>Po znalezieniu odpowiedniej komórki zarejestrować odpowiedzi na błyski testowe o natężeniu od słabego do silnego. Błyski testowe są generowane przez skalibrowany stymulator optyczny 5. Natężenie błysku i długość fali są kontrolowane odpowiednio przez zestaw filtrów neutralnych oraz filtrów interferencyjnych wąskopasmowych. Czas trwania błysku testowego (20 ms) jest kontrolowany przez sterowane komputerowo migawki.</li>
</ol>
Roztwory
<ol>
 <li>Roztwór do perfuzji myszy: 112.5 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7.4), 20 mM NaHCO3, 3 mM bursztynianu sodu, 0.5 mM glutaminianu sodu, 0.02 mM EDTA oraz 10 mM glukozy.</li>
 <li>Roztwór do elektrody rejestrującej u myszy: 140 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCl2, 3 mM HEPES (pH 7.4), 0.02 mM EDTA.</li>
</ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

Metoda rejestracji prądów za pomocą ssania pojedynczej komórki z fotoreceptorów została opracowana 3 dekady temu. Umożliwia ona rejestrację zmian prądu błonowego indukowanych stymulacją świetlną bez penetrowania błony komórkowej. Ze względu na silną adhezję międzykomórkową, izolacja zdrowych pojedynczych pręcików i czopków z siatkówki myszy jest trudniejsza niż w przypadku siatkówki płazów, a odnalezienie poszczególnych czopków jest utrudnione z powodu ich niskiego odsetka (3%) i niewielkiego rozmiaru. Metoda rejestracji...

rejestracje metodą ssania z pojedynczych komórek fotoreceptorów czopkowych myszy

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Fotoreceptory pręcikowe i czopkowe w siatkówce są odpowiedzialne za detekcję światła. W ciemności kanały sterowane cyklicznymi nukleotydami (CNG) w segmencie zewnętrznym pozostają otwarte, co umożliwia stały napływ kationów przez błonę, prowadząc do depolaryzacji komórki. Ekspozycja na światło wywołuje zamknięcie kanałów CNG, co blokuje dopływ kationów i w konsekwencji prowadzi do hiperpolaryzacji komórki. Wykorzystując polarność fotoreceptorów, w latach 70. opracowano metodę rejestracji ssącej, która w przeciwieństwie do klasycznej techniki patch-clamp nie wymaga penetracji błony plazmatycznej.1Wciągnięcie segmentu zewnętrznego do ściśle dopasowanej szklanej pipety wypełnionej roztworem pozakomórkowym umożliwia rejestrację zmian prądu w pojedynczych komórkach po naświetleniu błyskiem testowym. Jednak ta dobrze ugruntowana metoda rejestracji ssącej z segmentem zewnętrznym wewnątrz (OS-in) nie nadaje się do rejestracji z czopków mysich ze względu na niski odsetek czopków w siatkówce myszy (3%) oraz trudności w identyfikacji segmentów zewnętrznych czopków. Niedawno opracowano konfigurację rejestracji z segmentem wewnętrznym wewnątrz (IS-in), aby wciągnąć segment wewnętrzny/obszar jądrowy fotoreceptora do pipety rejestrującej.2,3W tym filmie pokażemy, jak rejestrować odpowiedzi świetlne pojedynczych czopków myszy przy użyciu ssącej elektrody jednokomórkowej.

Przedstawimy sposób rejestracji odpowiedzi na błysk z pojedynczych czopków mysich przy użyciu elektrody ssącej.

Rejestracje metodą ssania z pojedynczych komórek fotoreceptorów czopkowych myszy

Fotoreceptory w postaci pręcików i czopków w siatkówce odpowiadają za detekcję światła. W ciemności kanały cyklicznie nukleotydowo-bramkowane (CNG) w segmencie zewnętrznym...

W niniejszym filmie zaprezentowano technikę dysekcji siatkówki myszy oraz późniejsze wykonanie rejestracji metodą ssania pojedynczych komórek (single cell suction recordings) w przypadku czopków. Gałki oczne uśpionej myszy zaadaptowanej do ciemności zostają wypalone w części grzbietowej i pozbawione soczewki w słabym czerwonym świetle. Następnie gałki oczne są przecinane w poprzek na pół.Wzdłuż równika usuwa się rogówkę oraz brzuszne części gałek ocznych. Siatkówkę grzbietową izoluje się od warstwy nabłonka pigmentowego, a następnie przecina na małe, cienkie fragmenty za pomocą żyletki. Plasterki siatkówki umieszcza się w komorze rejestrującej dopasowanej do stolika mikroskopu.Kilka ciał komórek fotoreceptorowych zostaje wciągniętych do elektrody rejestrującej. Gdy do elektrody zostanie wciągnięty fotoreceptor typu czopka, jasny błysk testowy wywoła odpowiedź świetlną o amplitudzie powyżej czterech pA. Cześć. Jestem Jin z laboratorium dr. Mira Kopsa w Departamencie Okulistyki i Zmysłów Wzrokowych na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę rejestracji odpowiedzi fotowych pojedynczych fotoreceptorów typu czopków. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania właściwości adaptacyjnych czopków ssaków, czyli fotoreceptorów odpowiadających za widzenie dzienne. Zapraszamy do oglądania.Na jeden dzień przed rejestracją przeprowadź adaptację do ciemności. Adaptuj mysz, umieszczając ją na noc w klatce całkowicie odcinającej dostęp światła. Używając wyciągarki do mikropipet, wykonaj elektrody rejestrujące z rurek szklanych borokrzemianowych pod mikroskopem złożonym.Do wypalania należy użyć drutu oporowego. Końcówkę każdej elektrody należy wypolerować, aby ją wygładzić i zredukować otwór do pożądanej średnicy. W przypadku ssania pojedynczej komórki z stożka mysiego, średnica wewnętrzna na końcówce elektrody powinna wynosić około sześciu do siedmiu mikrometrów.Przygotuj 1% roztwór agaru w wodzie destylowanej. Umieść roztwór w wrzącej wodzie, aby roztopić agar. Po roztopieniu agaru przelej go do strzykawki i napełnij roztworem pipety szklane.Aby przygotować elektrody odniesienia, należy pozostawić je do zastygnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej. Po zastygnięciu agaru należy użyć noża diamentowego, aby przeciąć każdą pipetę na pół i uzyskać dwie elektrody odniesienia. Elektrody odniesienia należy umieścić w fiolce scyntylacyjnej wypełnionej roztworem odniesienia i moczyć przez co najmniej 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby roztwór mógł spenetrować żel agarowy.Elektrod referencyjnych można używać do trzech miesięcy od daty przygotowania. Zużyte elektrody są utylizowane po zakończeniu eksperymentu. System rejestracji składa się z mikroskopu odwróconego zamontowanego na stole z zawieszeniem pneumatycznym w celu zminimalizowania szumów wibracyjnych, osłoniętego klatką Faradaya w celu zminimalizowania zakłóceń elektromagnetycznych.Do pozycjonowania elektrody rejestrującej używany jest zmotoryzowany mikromanipulator. Stymulator optyczny składa się z włókna wolframowego, sterowanych komputerowo migawki oraz filtrów optycznych służących do kontrolowania długości fali i natężenia światła. Wzmacniacz patch-clamp służy do wykrywania prądów błonowych z pojedynczych komórek fotoreceptorów.Przez cały czas trwania rejestracji tkanka będzie poddawana perfuzji. Umieść jeden litr przygotowanego buforu do perfuzji w kąpieli wodnej o temperaturze 40°C w pobliżu systemu rejestracyjnego. Następnie za pomocą drenów podłącz bufor do perfuzji do mieszaniny 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla, tak aby w roztworze stale powstawały pęcherzyki gazu.Za pomocą fotometru zmierz nieosłabioną moc światła zygenerowanego przez stymulator optyczny; detektor fotometru należy umieścić na stoliku mikroskopu w płaszczyźnie, w której znajdzie się preparat. Następnie przelicz odczyt podany w mikrowatach na liczbę fotonów na mikrometr kwadratowy na sekundę, aby oszacować liczbę fotonów przypadających na jeden błysk, uwzględniając tłumienie światła przez filtry neutralne.Po zmierzeniu nieosłabionej mocy światła należy zdjąć fotometr ze stolika i zamontować na stoliku mikroskopu odwróconego komorę rejestracyjną, która będzie wykorzystywana w eksperymentach. Za pomocą rurek połączyć butelkę z roztworem perfuzyjnym z komorą rejestracyjną poprzez zawór regulacyjny. Rurki należy poprowadzić przez rezystor grzejny.Upewnij się, że grzałka oporowa jest umieszczona bezpośrednio przed komorą rejestracyjną. Następnie podłącz prowadnicę obejściową z zaworu regulacyjnego do komory rejestracyjnej. Rozpocznij perfuzję, otwierając i regulując zawór regulujący przepływ do wartości od 1 do 1,5 ml/min.Roztwór perfuzyjny odpływa z komory rejestracyjnej do kolby zbiorczej pod wpływem grawitacji. Należy użyć strzykawki z tępą igłą, aby napełnić uchwyty elektrod roztworem referencyjnym. Za pomocą igły mikrostrzykawki należy napełnić i przepłukać elektrodę rejestrującą roztworem referencyjnym, upewniając się, że w elektrodzie nie ma pęcherzyków powietrza.Włóż elektrodę odniesienia do uchwytu elektrody i podłącz ją do bieguna odniesienia wzmacniacza. Użyj gumowej obręczy, aby przymocować termoparę do elektrody odniesienia. Upewnij się, że końcówki elektrody i termopary znajdują się blisko siebie, aby odczyt temperatury był dokonywany jak najbliżej komórki.Następnie włóż elektrodę rejestrującą do uchwytu elektrody, a uchwyt zamocuj do głowicy wzmacniacza. Za pomocą rurki podłącz niewielki zbiornik z olejem mineralnym do bocznego portu uchwytu elektrody. Delikatne zasysanie ustami przez rurkę podłączoną do zbiornika wciągnie komórkę do wnętrza elektrody.Za pomocą oprogramowania komputerowego otwórz jedną z migawek stymulatora optycznego. Aby zwizualizować obszar wiązki błysku testowego na stole mikroskopu, ustaw ostrość mikroskopu na dno komory rejestracyjnej. Za pomocą mikromanipulatora przesuń elektrodę do centrum obszaru wiązki błysku testowego.Umieść elektrodę odniesienia blisko końcówki elektrody rejestrującej. Dostosuj napięcie grzałki tak, aby temperatura roztworu w komorze rejestrującej wynosiła około 36 do 38 °C. Przeprowadź test uszczelnienia, który mierzy napięcie przy określonej amplitudzie prądu, aby obliczyć i sprawdzić rezystancję elektrody rejestrującej, która zazwyczaj wynosi około 900 kΩ.Test szczelności umożliwia wykrycie pęcherzyków powietrza w elektrodach pomiarowych lub referencyjnych oraz stwierdzenie niewłaściwego rozmiaru końcówki elektrody pomiarowej. Test szczelności jest sterowany programowo przez program akwizycyjny clamp X. Odczyt rezystancji jest wyświetlany na ekranie komputera. Jeśli rezystancja jest zbyt niska, poniżej 500 kilo ohms, końcówka elektrody jest prawdopodobnie zbyt duża i konieczna będzie instalacja nowej elektrody.Jeśli rezystancja jest wyższa niż 1 mΩ, w elektrodzie może znajdować się pęcherzyk powietrza lub jej końcówka jest zbyt wąska, co będzie wymagało przepłukania lub wymiany elektrody. Po przygotowaniu aparatury rejestrującej należy przygotować przekroje siatkówki do eksperymentu przy słabym czerwonym świetle; za pomocą końcówki gorącej igły sekcyjnej należy wypalić twardówkę w najbardziej grzbietowym punkcie każdego gałki ocznej uśpionej myszy przystosowanej do ciemności. Następnie należy usunąć jądra gałek ocznych za pomocą nożyczek.Za pomocą tępych pęset przenieś gałki oczne pod mikroskop sekcyjny wyposażony w oświetlenie podczerwone i konwertery obrazu podczerwonego. Wszystkie dalsze manipulacje podczas sekcji wykonuje się w świetle podczerwonym. Następnie, używając mikronóżek, rozetnij gałkę oczną wzdłuż równika, z wyjątkiem punktu kauteryzacji.Za pomocą ostrych pęsety należy usunąć soczewkę. Następnie, przyjmując punkt kauteryzacji jako punkt odniesienia, należy usunąć jak największą ilość ciała szklistego. Używając żyletki, należy usunąć brzuszną część oczodołu.Następnie należy usunąć rogówkę. Dalej, za pomocą pęsety oddzielić siatkówkę grzbietową od warstwy nabłonka pigmentowego. Potem umieścić siatkówkę stroną receptorową do góry na dnie nowej szalki Petriego wypełnionej od 1 do 2 ml 10 mM roztworu referencyjnego glukozy z 0,1% BSA, a następnie delikatnie docisnąć ją żyletką, aby ją spłaszczyć.Pokrój siatkówkę na małe, cienkie fragmenty. Następnie inkubuj preparat w komorze do natleniania, stale nasyconej czystym tlenem, przed umieszczeniem fragmentów siatkówki w komorze rejestracyjnej. Tymczasowo wyłącz grzejnik.Przełącz przepływ perfuzyjny na przewód obejściowy. Następnie, używając chusteczki typu Kimwipe, odlej większość roztworu z komory. Włącz podświetlenie podczerwone.Wyjmij zawiesinę siatkówki z inkubatora i przenieś skrawki do komory rejestracyjnej. Używając pipety transferowej z szerokim otworem, odczekaj dwie minuty, aż skrawki osiądą. Po osiądnięciu skrawków siatkówki ponownie włącz perfuzję bezpośrednią oraz podgrzewacz.Zidentyfikuj fragment siatkówki z wystającymi zewnętrznymi segmentami fotoreceptorów. Przy użyciu ssania ustnego umieść końcówkę elektrody rejestrującej nad zewnętrzną warstwą jądrową siatkówki. Delikatnie wciągnij kilka ciał komórek fotoreceptorów do wnętrza elektrody.Wykonaj błysk testowy o długości fali 500 nanometr i czasie trwania 20 milisekund. Zmiana natężenia prądu przepływającego przez fotoreceptor wywołana światłem stanowi odpowiedź na błysk testowy. Zdrowy czop wygeneruje maksymalną amplitudę odpowiedzi od czterech do siedmiu pA.Podczas stymulacji nieosłabionym błyskiem testowym, po znalezieniu odpowiedniej komórki, należy ręcznie i delikatnie obniżyć zbiornik z olejem mineralnym, aby wywrzeć niewielkie podciśnienie na końcówkę elektrody, co pomoże utrzymać segment wewnętrzny komórki w elektrodzie. Jeśli komórka wykazuje reakcję, należy zarejestrować serię odpowiedzi na błyski testowe o natężeniu od progowego do saturacyjnego.Stosując tę technikę, możemy uzyskać odpowiedzi fotyczne czopków z przekrojów siatkówki myszy za pomocą elektrody ssącej. Tutaj przedstawiono nałożenie kilku zapisów z tej samej komórki. Odpowiedzi fotyczne pojedynczego czopka zostały wywołane błyskami testowymi o rosnącym natężeniu – od słabego, który generuje odpowiedź progową wynoszącą tutaj około 1 pA, do silnego natężenia, które generuje odpowiedź nasyconą wynoszącą około 5,5 pA.Wraz ze wzrostem natężenia błysku amplituda odpowiedzi fotoreceptorowej rośnie, aż do osiągnięcia stanu nasycenia. Błyski są emitowane w czasie równym zero. Pokażemy teraz, jak rejestrować odpowiedzi fotoreceptorowe z pojedynczych fotoreceptorów moscon przy użyciu elektrody ssącej.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o pobraniu odpowiedniej części siatkówki, pokrojeniu siatkówki na cienkie plastry, dbałości o czystość elektrody (brak pęcherzyków powietrza) oraz zminimalizowaniu zakłóceń zarówno mechanicznych, jak i elektromagnetycznych. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

single-cell-suction-recordings-from-mouse-cone-photoreceptors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jednokomórkowe rejestracje aspiracyjne z fotoreceptorów czopków myszy

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Źródło: Laboissonniere, et. al. Jednokomórkowy sekwencjoner RNA zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki. J. Vis. exp. (2017).  Ten film demonstruje technikę fluorescencyjnego śledzenia w celu identyfikacji podtypów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w transgenicznej siatkówce myszy. Proces ten polega na zabezpieczeniu izolowanej siatkówki w komorze rejestracyjnej, utrzymaniu żywotności komórek za pomocą natlenionej perfuzji i celowaniu w znakowane fluorescencyjnie RGC za pomocą...

Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Źródło: Kulkarni, M. et al. Obrazowanie ca2+ Dynamika w stożku fotoreceptorów zakończeń aksonów siatkówki myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków transgenicznej siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy przygotowania wycinków siatkówki, obrazowania biosensorów wapnia opartych na FRET oraz analizy zmian fluorescencji w celu ilościowego określenia poziomu wapnia przy oświetleniu tła i...

Mikroskopia dwufotonowa do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków siatkówki myszy

Opisujemy przygotowanie cienkich wycinków siatkówki z wodnych salamander tygrysich (Ambystoma tigrinum) i wyjaśniamy, jak używamy tych wycinków do badania przetwarzania synaptycznego w siatkówce, uzyskując podwójne zapisy napięcia całego ogniwa z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu.

Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki

Siatkówka nerwowa myszy w wieku 8 dni znajduje się na 4% bloku żelatyny. Po wyizolowaniu warstwy fotoreceptorów (200 μm) za pomocą wibratomu, fotoreceptory są wysiewane po dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej do hodowli. Warstwa fotoreceptorowa może być wykorzystana do analiz molekularnych, biochemicznych lub transplantacji.

Cięcie wibratomem siatkówki myszy w celu przygotowania kultur fotoreceptorowych

Pokażemy, jak przygotować wycinki siatkówki z oka myszy i rejestrować reakcje świetlne w neuronach siatkówki. Cała procedura przeprowadzana jest w warunkach przystosowanych do ciemności.

Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca2 + w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.

Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki dorosłego ssaka z płaszczyzną przekroju równoległą do powierzchni siatkówki. Pola dendrytyczne neuronów siatkówki o orientacji niepromieniowej nie zostały obcięte, co pozwoliło na badanie przetwarzania sygnału za pomocą patch-clamp i technik obrazowania.

Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

Tutaj prezentujemy kombinatoryczne podejście do klasyfikacji typów komórek neuronalnych przed izolacją i późniejszej charakterystyki transkryptomów jednokomórkowych. Protokół ten optymalizuje przygotowanie próbek do udanego sekwencjonowania RNA (RNA-Seq) i opisuje metodologię zaprojektowaną specjalnie w celu lepszego zrozumienia różnorodności komórkowej.

Sekwencja RNA pojedynczej komórki zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki

Opisujemy metodę uzyskiwania pierwotnych kultur fotoreceptorów czopków z siatkówki zarodków kurczaków i jej wykorzystanie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości.

Hodowle wzbogacone w stożki z siatkówki zarodków kurczaka w celu zbadania interakcji komórkowych między pręcikami a czopkami

Poznaj technikę zapisu odpowiedzi błyskowych z pojedynczych stożków myszy przy użyciu elektrody ssącej. Metoda obejmuje preparację siatkówki i izolację komórek fotoreceptorów.

Rejestracje metodą ssania z pojedynczych komórek fotoreceptorów czopkowych myszy

Przeglądaj więcej filmów