Wytwarzanie i eksploatacja wkładu tlenowego do przylegających kultur komórkowych

Urządzenie do wkładania hipoksyjnego ma sześć filarów, które zagnieżdżają się w studzienkach szóstki. Gaz z płytki studziennej przepływa przez sieć mikroprzepływową u podstawy filaru i może dyfundować przez przepuszczalną dla gazu membranę PDMS, oddzielając sieć gazową i pożywkę hodowlaną. Urządzenie to minimalizuje długość ścieżki dyfuzji między źródłem tlenu, siecią mikroprzepływową u podstawy filaru a ogniwami, umożliwiając szybsze stężenie tlenu. Równowagi.

Urządzenie pozwala również na znacznie większą kontrolę nad wzorcem przestrzennym tlenu wystawionego na działanie komórek, który jest determinowany przez projekt mikroprzepływowej sieci gazowej wykonany za pomocą standardowej fotolitografii przy użyciu fotomasek. Cześć, nazywam się Sean Ard i pracuję w laboratorium dr Davida Edingtona na Wydziale Bioinżynierii Uniwersytetu Illinois w Chicago. Cześć, jestem Ellie również z laboratorium w Edington.

Dzisiaj pokażemy, jak wyprodukować, zweryfikować i wykorzystać niestandardowe urządzenie do wystawiania kultur komórkowych in vitro na sześciokrotnej płytce na różne stężenia tlenu. Zastosowaliśmy tę procedurę w naszym laboratorium do zbadania wpływu tlenu na gojenie się ran, wytwarzanie reaktywnych form tlenu i migrację. Więc zacznijmy.

Aby rozpocząć wytwarzanie wkładki natleniającej, należy przygotować Polymethyl Sloane lub PDMS w stosunku 10 do jednego między prepolimerem a utwardzaczem. Zgodnie z instrukcjami producenta, mieszanina PDMS jest dodawana do wcześniej obrobionej formy Dell run z wzorem naśladowającym kształt standardowej sześciodołkowej płytki hodowlanej. Po utwardzeniu w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez noc, powstała replika formowanego układu filarów utworzy pierwszy z trzech elementów, które składają się na wkładkę natleniającą w celu wytworzenia drugiego kluczowego składnika wkładki natleniającej.

Mistrz SU ósemka jest przygotowywany przez pierwsze zakręcenie SU 8 21 50. Na płytce krzemowej na wafel nakładana jest maska fotograficzna, a ósemka SU jest wystawiana na działanie promieniowania UV przez maskę fotograficzną w celu utworzenia formy wzorcowej o grubości mikrokanalików 300 mikrometrów. Wlej PDMS na wierzch SU eight Master i utwardzaj przez dwie godziny w temperaturze 75 stopni Celsjusza, aby uzyskać dodatnią formę, która ostatecznie utworzy mikrokanaliki na dnie każdego filaru.

Trzeci element urządzenia jest wytwarzany przez wirowanie PDMS na płytce krzemowej z prędkością 500 obr./min przez 10 sekund, a następnie 900 obr./min przez 30 sekund, aby uzyskać mózg z membraną o grubości 100 mikrometrów. Ponieważ PDM jest przepuszczalny dla gazów, tlen może być dostarczany do mikrokanałów bezpośrednio przez tę membranę. Po przygotowaniu wszystkich elementów, każda powierzchnia klejenia jest poddawana obróbce plazmą tlenową przez jedną minutę.

Za pomocą ręcznego urządzenia plazmowego najpierw połącz sześć elementów mikrokanałowych z układem kolumn, a następnie przebij dwa otwory w każdym filarze, które będą służyć jako wloty i wyloty gazu. Na koniec przymocuj membranę do dna mikrokanału, aby ułatwić wiązanie i usunąć wszelkie pęcherzyki. Powierzchnie poddane obróbce plazmowej są dociskane do siebie przez około minutę za pomocą mieszanki, końcówki pęsety, odczekaj godzinę między każdym klejeniem, aby upewnić się, że urządzenie jest całkowicie połączone i można je skalibrować.

Po wyprodukowaniu kompletnego urządzenia należy skalibrować poziom tlenu odbieranego przez komórki podczas korzystania z wkładki natleniającej w rzeczywistych eksperymentach. Do kalibracji należy użyć fluorescencyjnego czujnika tlenu lub szkiełka podstawowego, które zawiera fluorescencyjną powłokę barwnika rutenowego, która jest gaszona tlenem. Szkiełka Foxy są wstępnie przycięte tak, aby pasowały do dna sześciodołkowej płytki.

Lisią zjeżdżalnię należy przyciąć tak, aby pokryła jak największą powierzchnię studni. Ponieważ szkiełko foxy ma grubość około jednego milimetra, zmodyfikuj urządzenie, aby zachować żądaną odległość dla odpowiedniej membrany. Dyfuzja suwakowa.

Odległość ta zależy od eksperymentu, ale w większości przypadków powinna wynosić poniżej jednego milimetra przy użyciu ręcznego mikroskopu plazmowego z czterema szkłami o grubości jednego milimetra. Przesuwaj słupki o długości około sześciu milimetrów i szerokości czterech milimetrów do dolnej części urządzenia. Urządzenie będzie spoczywać na słupkach na szczycie wycięcia ślizgowego.

Szklane szkiełka nakrywkowe mogą być również używane do szczeliny dyfuzyjnej 0,17 milimetra w celu sprawdzenia zużycia tlenu. W trzech mililitrach dejonizowanej wody o temperaturze pokojowej do studzienek płyty sześciostudziennej, gdzie będzie mierzony tlen. Umieść urządzenie w płycie i za pomocą oprogramowania metamorph wybierz liczbę i lokalizację żądanych pozycji na czujniku foxy.

Przesunąć, aby oznaczyć stężenie tlenu. Podłącz rurkę pistoletu tai między zbiornikiem tlenu a urządzeniem do wkładania hipoksyjnego. Precyzyjny regulator przepływu ustawiony na natężenie przepływu od 50 do 100 mililitrów na minutę służy do precyzyjnej kontroli dostarczanego gazu.

Upewnij się, że precyzyjny regulator przepływu jest zamknięty. Najpierw otwórz regulator górny zbiornika, a następnie regulator precyzyjny. Po 15 minutach zmniejsz natężenie przepływu do 10 do 20 na minutę.

Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w wodzie, uważnie obserwuj wartość natężenia przepływu przez następną godzinę i dokonuj regulacji w razie potrzeby, ponieważ spadek ciśnienia zmieni się, podczas gdy system równoważy zmianę natężenia przepływu, aby uchwycić obrazy płytki i czujników foxy. Używany jest wyposażony we fluorescencję mikroskop Olympus IX 71 oraz kamera z urządzeniem do ładowania firmy Q Imaging Tiga, SRV i oprogramowanie do akwizycji obrazów Metamorpho. Mikroskop jest wyposażony w Olympus 3 1 0 2 0, filtr fluorescencyjny kompatybilny z foxy o długości fali wzbudzenia 475 nanometrów i długości fali emisji 600 nanometrów.

Aby przetestować czas równowagi i stopień natlenienia urządzenia, wybierz trzy punkty na szkiełku foxy, w których chcesz zmierzyć stężenie tlenu. Zrób obraz szkiełka bezpośrednio przed rozpoczęciem przepływu gazu. Rejestruj obrazy i rób interwały 10-sekundowe w ciągu 30 minut, gdy gaz przepływa przez urządzenie, aby przetestować niejednorodność i dostarczanie tlenu.

Ustal wiele punktów w odstępach jednego milimetra rozciągających się na szerokość kanału i zmierz stężenie tlenu na powierzchni odwiertu za pomocą metamorfu. Eksportuj średnią intensywność obrazu dla każdej pozycji i wykreśl stężenie natlenienia w zależności od intensywności fluorescencji. Wygeneruj krzywą kalibracyjną, dopasowując krzywe liniowe do linii od zera do 10% i linii od 10 do 21% łączącej intensywność fluorescencji ze stężeniem tlenu Dla każdej pozycji zmierzone surowe dane intensywności można wyeksportować z metamorfu i dalej analizować za pomocą programu Microsoft Excel lub innego oprogramowania statystycznego.

Po skalibrowaniu urządzenia można rozpocząć eksperymenty, takie jak testy gojenia się ran, autoklawować skalibrowaną wkładkę w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut w ciągu 24 godzin przed eksperymentem i pracować z nią w okapie do hodowli z przepływem laminarnym, aby zapobiec późniejszemu zanieczyszczeniu. Namocz wysterylizowaną wkładkę PDMS w pożywce wolnej od surowicy na 24 godziny, aby zahamować pęcherzyki gazu podczas wkładania do hodowli płytek, komórek MDCK lub innych przylegających komórek do 100% płynności co w płytce sześciodołkowej, tworząc proste rysy w monowarstwach za pomocą końcówki pipety P 200. Zadrapania symulują rany w przylegającej monowarstwie.

Odessać pożywkę komórkową bez naruszania monowarstwy i spłukać pięcioma mililitrami pożywki. Ponownie zassać i ponownie napełnić studzienki trzema mililitrami surowicy bez ograniczeń. Medium delikatnie włóż urządzenie do płytki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków.

Ustawienie urządzenia pod kątem podczas wkładania pomaga usunąć bąbelki z jednej strony. Uważaj, aby nie wywierać nadmiernego nacisku na urządzenie, co mogłoby zdeformować PDMS na tyle, aby zmiażdżyć leżące pod nim komórki. Umieść płytkę i urządzenie na mikroskopie podgrzewanym pod kątem 37 stopni Celsjusza stage i podłącz rurki ze zbiornika gazu źródłowego do portów wlotowych i wylotowych urządzenia.

Inkubator do hodowli powinien mieć otwór umożliwiający wprowadzenie rurki, a rurka powinna być podłączona. Po umieszczeniu urządzenia w inkubatorze należy postępować zgodnie z tą samą procedurą uruchamiania przepływu gazu, jak opisano wcześniej, aby ocenić gojenie się ran, przechwytywać poklatkowe obrazy komórek co 20 minut przez 15 do 18 godzin przy użyciu sprzętu i oprogramowania do obrazowania, jak opisano wcześniej, Algorytm pomiaru rany może być użyty do analizy niezagojonej powierzchni po pożądanym czasie trwania eksperymentu. Zatrzymaj przepływ gazu, wyjmij płytkę i w razie potrzeby przystąp do dalszej obróbki komórek. Urządzenie do wkładania hipoksyjnego potrzebuje mniej niż dwie minuty, aby ustabilizować się do 0,5% tlenu, jak pokazano tutaj.

Rozmiar dolnej szczeliny membrany urządzenia był kluczowym czynnikiem określającym wydajność równowagi, przy czym większe rozmiary szczelin wymagały więcej czasu na osiągnięcie wartości stężenia tlenu w stanie ustalonym. Urządzenie pozwala również na dużą kontrolę nad przestrzennym natlenieniem w pojedynczej studni, umożliwiając tworzenie wielu warunków, a nawet generowanie cyklicznego profilu tlenu na powierzchni studni. Monowarstwy komórek MDCK wystawiono na działanie 10% lub 21% tlenu, a powierzchnia rany była analizowana w czasie za pomocą algorytmu MATLAB Ts scratch wound tailing.

Po 11 godzinach z 17 całkowitych godzin, 6,87% pierwotnej rany pozostało po wystawieniu na działanie 10% tlenu, podczas gdy 64,4% rany pozostało poniżej 21%Jak pokazano tutaj, stężenia tlenu są ujemnie skorelowane z otwartą powierzchnią rany dla obu stężeń tlenu. Na czas trwania eksperymentu właśnie pokazaliśmy, jak wyprodukować, zweryfikować i wykorzystać urządzenie do wkładki hipoksyjnej do testu gojenia się ran drapanych. Urządzenie oferuje szereg zalet w porównaniu z innymi systemami natleniania, takich jak mniejsza powierzchnia laboratoryjna i znacznie większa kontrola nad przestrzennym i czasowym natlenieniem na powierzchni komórki.

Urządzenie może być wykorzystywane przez praktycznie każde laboratorium, które bada wpływ tlenu lub innych gazów, takich jak dwutlenek węgla, na hodowle komórkowe in vitro. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby namoczyć wysterylizowane urządzenie i pożywki hodowlane przez noc, zminimalizować tworzenie się pęcherzyków podczas eksperymentu. Ponadto pozwól systemowi na wyrównanie przed rozpoczęciem eksperymentu.

Dzieje się tak, ponieważ natężenie przepływu zmienia się wraz z równaniem się ciśnienia w układzie. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.