Name: Wytwarzanie i eksploatacja wkładu tlenowego do przylegających kultur komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-06T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania wkładu tlenowego do kontroli stężenia tlenu w kulturach komórkowych. Urządzenie umożliwia precyzyjną manipulację przestrzenną i czasową poziomów tlenu w badaniach gojenia ran.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten był finansowany przez Departament Zdrowia Publicznego stanu Illinois oraz Narodową Fundację Naukową (National Science Foundation, DBI-0852416).

1. Funkcja urządzenia
<ol>
 <li>Urządzenie do generowania hipoksji składa się z 6 filarów, które są dopasowane do standardowej płytki 6-dołkowej. Gaz przepływa do filara, przez sieć mikroprzepływową u jego podstawy, a następnie wypływa z urządzenia. U podstawy filara, tworząc dolną ściankę mikrokanału, znajduje się przepuszczalna dla gazów membrana PDMS o grubości 100 μm, która umożliwia dyfuzję tlenu między mikrokanałem gazowym a pożywką hodowlaną. W ten sposób urządzenie działa poprzez ustanowienie gradientu stężeń, który dąży do osiągnięcia pożądanej wartości stężenia tlenu w pożywce.</li>
 <li>Urządzenie oferuje szereg zalet w porównaniu do komór hipoksycznych i innych systemów natleniania komórek: 1) minimalizuje drogę dyfuzji tlenu, co umożliwia szybszą kontrolę czasową, 2) zwiększa przestrzenną kontrolę nad natlenianiem, zależnie od konstrukcji mikrokanału w filarze, 3) zajmuje mniej miejsca w laboratorium i zapewnia wyższą przepustowość, co zwiększa wydajność eksperymentalną, oraz 4) jest kompatybilne z powszechnymi narzędziami do hodowli komórkowych (np. płytkami wielodołkowymi) bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy i sprzętu.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie urządzenia
<ol>
 <li>W pierwszej kolejności macierz filarów jest odlewana z PDMS przy użyciu wcześniej wykonanej formy z materiału Delran.</li>
 <li>Następnie mikrokanał gazowy u podstawy każdego filara jest wytwarzany przy użyciu standardowej fotolitografii z zastosowaniem SU-8 oraz odlewania z PDMS.</li>
 <li>Membranę przepuszczalną dla gazów wykonuje się poprzez precyzyjne wirowanie PDMS na waflu krzemowym w celu uzyskania pożądanej grubości. W tym przykładzie zastosowano membranę o grubości 100 μm, którą wykonano poprzez wirowanie z prędkością 500 rpm przez 10 sekund, a następnie z prędkością 900 rpm przez 30 sekund.</li>
 <li>Wszystkie elementy są ze sobą łączone po obróbce plazmą tlenową za pomocą przenośnego urządzenia plazmowego (Model BD-20, Electro-Technic Products).</li>
</ol>
3. Konfiguracja urządzenia
<ol>
 <li>Ostrożnie włóż urządzenie do płytki, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Wprowadzanie urządzenia pod kątem pomaga usunąć pęcherzyki jedną ze stron. W przypadku rzeczywistych eksperymentów z wykorzystaniem komórek, ten etap musi zostać przeprowadzony w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ryzyko kontaminacji jest znacznie mniejsze po włożeniu urządzenia, więc zmontowany układ można przenieść do inkubatora w środowisku niesterylnym.</li>
 <li>Podłącz rurki z butli z gazem źródłowym do wlotu i wylotu urządzenia. W przypadku eksperymentów z komórkami, inkubator do hodowli powinien posiadać otwór umożliwiający wprowadzenie rurek; rurki należy podłączyć po przeniesieniu urządzenia i umieszczeniu go w inkubatorze. Należy uważać, aby nie wywierać nadmiernego nacisku na urządzenie, co mogłoby odkształcić PDMS na tyle, by zmiażdżyć znajdujące się pod nim komórki.</li>
 <li>Przed otwarciem regulatora butli upewnij się, że precyzyjny regulator przepływu jest zamknięty, aby zapobiec przepełnieniu urządzenia. Uruchom przepływ gazu. Powoli otwórz precyzyjny regulator przepływu do pożądanej wartości (50-100 mL/min). Przez następną godzinę uważnie obserwuj wartość i w razie potrzeby wprowadzaj korekty, ponieważ spadek ciśnienia będzie się zmieniać podczas równoważenia systemu, co wpłynie na szybkość przepływu. Aby uniknąć powstawania pęcherzyków w pożywce, po początkowym 15-minutowym czasie równoważenia przy wyższym przepływie, zmniejsz szybkość przepływu do poziomu 10-20 mL/min.</li>
 <li>Po pożądanym czasie trwania eksperymentu zatrzymaj przepływ gazu, wyjmij płytkę i odpowiednio przetwórz komórki (np. przeprowadź lizę, barwienie, zliczanie itp.).</li>
</ol>
4. Walidacja urządzenia
<ol>
 <li>Kalibracja
 <ol>
 <li>Wybierz liczbę i położenie punktów na szkiełku fluorescencyjnego czujnika tlenu 
 (FOXY) (zależnie od wymagań walidacyjnych), które zostaną wykorzystane do pomiaru tlenu. Szkiełko pokryte jest fluorescencyjnym barwnikiem rutenowym, którego fluorescencja jest gaszona przez tlen.</li>
 <li>Naraź szkiełko bezpośrednio na działanie 0, 10 i 21% tlenu z butli gazowej i wykonaj zdjęcia po 5 minutach w celu zapewnienia odpowiedniej równowagi.</li>
 <li>Wyeksportuj średnią intensywność obrazu dla każdego punktu i wykreśl stężenie tlenu w funkcji intensywności fluorescencji.</li>
 <li>Wyznacz krzywą kalibracyjną poprzez dopasowanie krzywych liniowych do odcinka 0-10% oraz odcinka 10-21%.</li>
</ol>
 </li>
 <li>Heterogeniczność
 <ol>
 <li>Wyznacz wiele punktów obejmujących szerokość kanału w określonych odstępach (np. co 1 mm). Należy pamiętać, że w zależności od odstępów obrazy mogą na siebie nachodzić.</li>
 <li>Zmierz stężenie tlenu na powierzchni dołka w obrębie urządzenia.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Równowagowanie
 <ol>
 <li>Wybierz trzy punkty na szkiełku FOXY, w których zmierzysz stężenie tlenu.</li>
 <li>Natychmiast po wykonaniu pierwszego zdjęcia przy poziomach tlenu otoczenia, otwórz precyzyjny regulator przepływu, aby rozpocząć przepływ gazu do urządzenia. Wykonuj zdjęcia w odpowiednich odstępach czasu, aby ocenić czas trwania i zakres równowagowania stężenia tlenu (np. co 10 sekund przez 30 min).</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. Zastosowania
<ol>
 <li>Gojenie ran
 <ol>
 <li>Dzień przed eksperymentem należy namoczyć wysterylizowany wkład z PDMS w medium bezsurowiczym, aby ograniczyć powstawanie pęcherzyków gazu w dołku. </li>
 <li>Hodować komórki do osiągnięcia 100% konfluencji w płytce 6-dołkowej. </li>
 <li>Za pomocą końcówki do pipety p200 wykonaj proste zarysowania w monowarstwach, aby zasymulować rany.</li>
 <li>Odssać pożywkę komórkową, przepłukać 5 ml pożywki, a następnie ponownie odessać. Ważne jest, aby nie naruszyć monowarstwy komórek. </li>
 <li>Napełnić ponownie dołki 4 ml pożywki bezsurowiczej, aby ograniczyć proliferację komórek.</li>
 <li>Umieść wkład w dołkach i połącz każdy dołek z odpowiadającą mu koncentracją tlenu. </li>
 <li>Umieść płytkę 6-dołkową z wkładką na podgrzewanym stoliku przy 37°C.</li>
 <li>Wykonaj zdjęcia poklatkowe komórek w wybranym odstępie czasu i całkowitym czasie trwania. Program MATLAB Test zadrapania, algorytm pomiaru rany, może być wykorzystany do analizy niezagojonego obszaru powierzchni.</li>
	 </ol>
</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
<ol>
 <li>Walidacja urządzenia 
Wkładka hipoksyczna wykazuje znaczną poprawę w porównaniu z komorą hipoksyczną pod względem czasu i zakresu wyrównania poziomu tlenu, wymagając mniej niż 2 minut do stabilizacji na poziomie 0,5% tlenu. Przerwa między membraną urządzenia a dnem dołka była krytycznym czynnikiem determinującym wydajność wyrównywania, przy czym większe przerwy wymagały więcej czasu do osiągnięcia stanu stacjonarnego stężeń tlenu. Urządzenie pozwala również na dużą kontrolę nad przestrzennym natlenieniem w obrębie jednego dołka, umożliwiając tworzenie wielu warunków, a nawet generowanie cyklicznego profilu natlenienia na powierzchni dołka.</li>
 <li>Gojenie ran 
Monowarstwy komórek poddano działaniu 10% lub 21% tlenu, a powierzchnia rany była analizowana w czasie. Zadrapania wystawione na 21% tlenu goiły się najwolniej, a na 10% najszybciej. Rycina 1 przedstawia obrazy zadrapania w ciągu 17 godzin. Wykresy na Rycini 5 pokazują procent otwartej powierzchni rany dla obu stężeń tlenu w trakcie trwania eksperymentu.</li>
</ol>
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="Schemat mikrofluidycznej hodowli komórkowej, układ PDMS do badań nad mikrokanałami tlenowymi, zawiera projekt filarów." border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"></a> 
Rycina 1. Schemat i diagramy ilustrujące cechy urządzenia. Urządzenie z wkładem tlenowym jest wytwarzane za pomocą konwencjonalnej fotolitografii (sieć mikrofluidyczna), odlewania replikacyjnego (sieć mikrofluidyczna i rusztowanie wkładu) oraz precyzyjnego wirowania PDMS (membrana przepuszczalna dla gazów). A) Urządzenie tlenowe umieszczone w płytce 6-dołkowej. B) Przykłady macierzy filarów w płytkach 24- i 96-dołkowych. C) Schemat przekroju poprzecznego filara. Tlen wpływa do urządzenia przez wlot i przemieszcza się przez sieć mikrofluidyczną u podstawy filara. Tlen może swobodnie dyfundować przez przepuszczalną dla gazów membranę PDMS u podstawy filara i rozpuszczać się w pożywce hodowlanej. D) Obraz mikroskopowy pokazujący różne cechy pojedynczego filara jednokanałowego widzianego z góry, z przyklejonymi szklanymi wspornikami do badań równowagowych.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="Wykresy stężenia tlenu w funkcji czasu i położenia; eksperymentalna wymiana gazowa, warunki hipoksyjne." border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"></a> 
Rysunek 2. Walidacja urządzenia za pomocą czujników tlenu. Napięcie tlenowe w każdym dołku scharakteryzowano przy użyciu planarnego rutenowego czujnika tlenu. Wszystkie mieszaniny tlenowe zawierały azot jako gaz wypełniający oraz 5% CO2 w celu buforowania medium. A) Wykres ilustrujący wpływ wysokości wspornika, a tym samym odległości dyfuzji tlenu między membraną a komórkami, na czas i skuteczność równoważenia. Wysokości zostały określone przez szklane wsporniki przymocowane do dna urządzenia. Wszystkie trzy rozmiary wsporników zapewniają czasy równoważenia znacznie krótsze niż w komorze hipoksyjnej. Należy zauważyć, że czas przedstawiono w skali logarytmicznej. B) Wykres przedstawiający szybki czas odpowiedzi równoważenia tlenu w urządzeniu ze szczeliną 0,2 mm. C) Wykonano również wielopozycyjne skanowanie liniowe w poprzek dołka pod mikrokanałem, aby zapewnić homogeniczność stężenia tlenu wprowadzanego przez urządzenie. Wykres przedstawia stężenie tlenu zmierzone po infuzji 0%, 10% i 21% tlenu przez 10 min. D) Urządzenie skutecznie utrzymuje 10% tlenu przez 5 dni.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="Wykres stężenia tlenu; pozycja względem stężenia; analiza eksperymentalnego wzorca sinusoidalnego." border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"></a> 
Rysunek 3. Eksperymenty z bardziej złożonymi konstrukcjami mikrokanałów tlenowych. A) Układ mikrokanałów o podwójnych warunkach zapewnia stabilny profil tlenowy 0% i 21% przez 14 dni. B) Przeplatany i kręty wzór mikrokanałów o szerokości 500 μm rozciągających się przez filar skutkuje cyklicznym profilem tlenowym. Należy zauważyć, że dane przedstawiają tylko jedną reprezentatywną próbę, ponieważ wyrównanie mikrokanałów było trudne.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="Diagram dyfrakcyjny krystalografii; analiza wzorca rentgenowskiego; badanie struktury sieci." border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"></a> 
Rycina 4. Obrazy timelapse zamykania rany w 0, 7 i 17 godzinach po początkowym zadrapaniu. Komórki otrzymywały 21% tlenu przez cały czas trwania eksperymentu.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="Wykres redukcji powierzchni rany; czas względem procentu dla stężeń 10% i 21% w ciągu 20 godzin." border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"></a> 
Rycina 5. Wpływ stężenia tlenu na szybkość gojenia ran w teście zarysowania.

Urządzenie jest wytwarzane standardową fotolitografią SU-8, odlewaniem replikacyjnym oraz definiowanym wirowaniem i składa się w całości z polidimetylosiloksanu. Gaz jest wprowadzany do urządzenia w celu ustanowienia gradientu stężeń między mikrokanałem filara a podłożem hodowlanym, co dąży do osiągnięcia pożądanego stanu równowagi stężenia tlenu. Wykazano, że urządzenie skutecznie moduluje czasową i przestrzenną oksygenację wewnątrz studzienki, a także odpowiednio modyfikuje zachowanie komórkowe. Przestrzenny wzór oksygenacji jest definiowany przez mikrokanał u podstawy filara, zatem podczas projektowania fotomaski można zaimplementować różne konfiguracje. Dodatkowo oczekuje się, że wprowadzenie pożądanego gazu do fazy gazowej studzienki poprawi czas wyrównywania stężeń oraz stopień hipoksji. Do urządzenia można by dostosować mikrofluidyczną sieć mieszającą, aby umożliwić wytwarzanie nowych mieszanin gazowych przy użyciu zaledwie kilku butli z gazami wzorcowymi. Wreszcie, mechanizm wymiany podłoża wyeliminowałby konieczność wyjmowania urządzenia z płytki wielodołkowej, na co komórki mogłyby zareagować.
Urządzenie to znajduje zastosowanie w każdym eksperymencie in vitro lub ex vivo, który wymaga kontroli nad stężeniem tlenu. Ponieważ tlen jest istotną zmienną fizjologiczną wpływającą na ogromną większość szlaków sygnalizacyjnych, obszary badań, które mogą odnieść korzyść z jego zastosowania, są ograniczone jedynie kreatywności badacza. Niektóre dziedziny, które skorzystałyby na usprawnionej kontroli czasowej stężenia tlenu, obejmują m.in. przerzuty nowotworowe, bezdech senny oraz uszkodzenia reperfuzyjne w niedokrwieniu mięśnia sercowego. Na przykład wykazano korelację między przerywaną hipoksją a bardziej inwazyjnymi nowotworami, co prowadzi do zwiększonej ekspresji szeregu genów związanych z przerzutowaniem w porównaniu z hipoksją ciągłą i normoksją. Istotna jest również kontrola przestrzenna, ponieważ gradienty tlenu mają krytyczne znaczenie w rozwoju, zonacji wątroby, toksyczności leków oraz w niszy komórek macierzystych. Urządzenie przedstawione w niniejszym artykule przyniesie korzyści wielu obszarom badań, zapewniając system zajmujący mniej miejsca w laboratorium, o stosunkowo prostych wymaganiach operacyjnych i znacznie większej kontroli nad ekspozycją komórek na tlen.

<table><tbody><tr><td>PDMS-Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Planarny czujnik FOXY</td><td>Ocean Optics</td><td>FOXY-SGS-M</td><td>Powlekane szkiełko mikroskopowe</td></tr><tr><td>Regulator gazu</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>FL-1472-G</td><td></td></tr><tr><td>Gaz</td><td>Airgas</td><td>Mieszanki niestandardowe</td><td>Wszystkie zawierają 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>SU-8 2150</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu MDCK z L-glutaminą</td><td>SAFC Global</td><td>M3803</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i obsługa wkładki tlenowej do adherentnych kultur komórkowych

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Tlen jest kluczowym modulatorem wielu szlaków komórkowych, jednak obecne urządzenia umożliwiającein vitromodulacja poziomu tlenu nie spełnia potrzeb badawczych w dziedzinie biomedycyny. Komora hipoksyczna oferuje prosty system kontroli natlenienia w standardowych naczyniach hodowlanych, ale brakuje w niej precyzyjnej kontroli czasowej i przestrzennej nad stężeniem tlenu na powierzchni komórek, co uniemożliwia jej zastosowanie w badaniu wielu zjawisk fizjologicznych. Inne systemy usprawniły działanie komory hipoksycznej, lecz wymagają one specjalistycznej wiedzy i sprzętu do obsługi, co czyni je onieślającymi dla przeciętnego badacza. Opracowano mikrofabrykowaną wkładkę do płytek wielodotykowych, która pozwala na skuteczniejszą kontrolę czasową i przestrzenną stężenia tlenu, aby lepiej modelować występujące zjawiska fizjologicznein vivoPlatforma składa się z wkładki z polidimetylosiloksanu, która jest osadzona w standardowej płytce wielodobowej i służy jako pasywna mikrofluidyczna sieć gazowa z membraną przepuszczalną dla gazów, mającą na celu modulowanie dostarczania tlenu do komórek adherentnych. Urządzenie jest proste w obsłudze i podłączone do butli z gazem, które zapewniają ciśnienie niezbędne do wprowadzenia pożądanej koncentracji tlenu do platformy. Produkcja obejmuje kombinację standardowej fotolitografii SU-8, odlewania replikacyjnego oraz precyzyjnego nanoszenia PDMS metodą spin-coatingu na waflu krzemowym. Komponenty urządzenia są łączone po obróbce powierzchniowej przy użyciu ręcznego systemu plazmowego. Walidację przeprowadzono za pomocą płaskiego fluorescencyjnego czujnika tlenu. Czas równoważenia wynosi od kilku minut, a dzięki konstrukcji urządzenia można uzyskać szeroką gamę profili tlenowych, takich jak profil cykliczny osiągnięty w niniejszym badaniu, a nawet gradienty tlenu naśladujące te występującein vivoUrządzenie można sterylizować do hodowli komórkowych za pomocą powszechnych metod bez utraty funkcjonalności. Możliwość zastosowania urządzenia do badaniain vitroreakcja gojenia rany zostanie zaprezentowana.

Koncepcja, wykonanie i walidacja platformy dodatkowej, która zapewnia zwiększoną kontrolę nad przestrzennym i czasowym natlenieniem w płytce 6-dołkowej. Urządzenie jest dostosowane do wielu systemów hodowli i może być wykorzystywane do badania wpływu tlenu na gojenie ran.

Wytwarzanie i obsługa wkładki tlenowej do adherentnych kultur komórkowych

Tlen jest kluczowym modulatorem wielu szlaków komórkowych, jednak obecnie dostępne urządzenia umożliwiające modulację poziomu tlenu in vitro nie zaspokajają potrzeb biomedycznych...

Urządzenie do insertów hipoksycznych posiada sześć filarów, które mieszczą się w dołkach płytki sześciodołkowej. Gaz przepływa przez sieć mikrofluidyczną u podstawy filara i może dyfundować przez gazoprzepuszczalną membranę PDMS, która oddziela sieć gazową od pożywki hodowlanej. Urządzenie to minimalizuje długość drogi dyfuzji między źródłem tlenu, siecią mikrofluidyczną u podstawy filara a komórkami, co pozwala na szybsze wyrównanie stężenia tlenu.Urządzenie to umożliwia również znacznie większą kontrolę nad przestrzennym rozkładem tlenu dostarczanego do komórek, który jest określany przez konstrukcję mikrofluidycznej sieci gazowej wykonaną metodą standardowej fotolitografii z użyciem masek fotograficznych. Cześć, jestem Sean Ard z laboratorium dr. Davida Edingtona w Katedrze Bioinżynierii na Uniwersytecie Illinois w Chicago. Cześć, jestem Ellie, również z laboratorium Edingtona.Dzisiaj pokażemy Państwu, jak wykonać, zwalidować i wykorzystać niestandardowe urządzenie do eksponowania hodowli komórkowych in vitro w płytce sześciodołkowej na różne stężenia tlenu. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania wpływu tlenu na gojenie ran, generowanie reaktywnych form tlenu oraz migrację. Zapraszamy do rozpoczęcia.Aby rozpocząć wykonanie wkładki natleniającej, należy przygotować polidimetylosiloksan (PDMS), mieszając prepolimer z utwardzaczem w stosunku 10:1. Zgodnie z instrukcjami producenta, mieszaninę PDMS dodaje się do wcześniej obrobionej formy z Delranu, której wzór naśladuje kształt standardowej płytki hodowlanej z sześcioma dołkami. Po utwardzeniu w temperaturze 75 °C przez noc, otrzymana odlewiona matryca filarów będzie stanowić pierwszy z trzech komponentów tworzących wkładkę natleniającą, co pozwoli na wykonanie drugiego kluczowego elementu wkładki natleniającej.Matrycę SU-8 przygotowuje się najpierw poprzez nanoszenie SU 8 21 50 metodą spin-coatingu. Na wafelek krzemowy nakłada się maskę fotolitograficzną, a następnie naświetla SU-8 promieniami UV przez maskę, aby stworzyć matrycę z mikrokanałami o grubości 300 µm. Na wierzch matrycy SU-8 wlewa się PDMS i utwardza przez dwie godziny w temperaturze 75 °C, aby uzyskać formę pozytywową, która ostatecznie stworzy mikrokanały u podstawy każdego filarka.Trzeci komponent urządzenia jest wytwarzany poprzez nanoszenie PDMS metodą wirowania na płytce krzemowej z prędkością 500 RPM przez 10 sekund, a następnie z prędkością 900 RPM przez 30 sekund, aby uzyskać membranę o grubości 100 µm. Ponieważ PDMS jest przepuszczalny dla gazów, tlen może być dostarczany do mikrokanałów bezpośrednio przez tę membranę. Po przygotowaniu wszystkich komponentów każda powierzchnia wiązania jest poddawana działaniu plazmy tlenowej przez jedną minutę.Używając ręcznego urządzenia plazmowego, najpierw połącz sześć komponentów mikrokanałowych z macierzą filarów, a następnie wykonaj dwa otwory w każdym filarze, które będą służyć jako wloty i wyloty gazu. Na koniec przymocuj membranę do dna mikrokanału, aby ułatwić łączenie i usunąć pęcherzyki powietrza. Powierzchnie potraktowane plazmą dociska się do siebie przez około minutę za pomocą tępego końca pęsety; należy odczekać godzinę pomiędzy kolejnymi etapami łączenia, aby upewnić się, że urządzenie jest całkowicie scalone i może zostać skalibrowane.Po wykonaniu kompletnego urządzenia należy skalibrować poziom tlenu docierającego do komórek podczas stosowania wkładki natleniającej w rzeczywistych eksperymentach. Do kalibracji należy użyć fluorescencyjnego czujnika tlenu lub płytki foxy, która posiada powłokę z fluorescencyjnego barwnika rutenowego, ulegającego gaszeniu przez tlen. Płytki foxy są docięte tak, aby pasowały do dna płytki 6-dołkowej.Szkiełko obiektowe należy dociąć tak, aby pokryło jak największą powierzchnię dołka. Ponieważ szkiełko obiektowe ma grubość około 1 mm, należy zmodyfikować urządzenie, aby zachować pożądaną odległość dla odpowiedniej dyfuzji przez membranę.Odległość ta zależy od eksperymentu, jednak w większości przypadków powinna wynosić poniżej 1 mm. Używając ręcznego urządzenia plazmowego, wytnij cztery szklane podstawki do preparatów o grubości 1 mm, długości około 6 mm i szerokości 4 mm, a następnie przymocuj je do spodu urządzenia. Urządzenie będzie spoczywać na podstawkach umieszczonych na szkiełku przedmiotowym.Do walidacji zużycia tlenu można również zastosować szklane lamellerki, aby uzyskać szczelinę dyfuzyjną o szerokości 0.17 millimeters. Do otworów płytki 6-dołkowej, w których mierzony będzie tlen, należy wlać trzy milliliters wody dejonizowanej w temperaturze pokojowej. Umieść urządzenie w płytce, a następnie w oprogramowaniu Metamorph wybierz liczbę i położenie pożądanych pozycji na czujniku Foxy.Przesuń slajd, aby przeprowadzić analizę stężenia tlenu. Połącz rurki pistoletu tai pomiędzy butlą z tlenem a urządzeniem z wkładką hipoksyczną. Do precyzyjnej kontroli podawanego gazu stosuje się precyzyjny regulator przepływu ustawiony na wartość od 50 do 100 ml/min.Należy upewnić się, że precyzyjny regulator przepływu jest zamknięty. Najpierw otwórz regulator górny zbiornika, a następnie regulator precyzyjny. Po 15 minutach zmniejsz natężenie przepływu do poziomu od 10 do 20 na minutę.Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza w wodzie, należy uważnie monitorować wartość natężenia przepływu przez następną godzinę i wprowadzać niezbędne korekty, ponieważ spadek ciśnienia ulegnie zmianie podczas równoważenia systemu, co zmieni natężenie przepływu podczas obrazowania płytki i czujników foxy. Do obrazowania wykorzystuje się mikroskop Olympus IX 71 wyposażony w moduł fluorescencyjny, kamerę CCD firmy Q Imaging Tiga oraz oprogramowanie do akwizycji obrazu SRV i Metamorpho. Mikroskop jest wyposażony w filtr fluorescencyjny Olympus 3 1 0 2 0, kompatybilny z foxy, o długości fali wzbudzenia 475 nanometrów i długości fali emisji 600 nanometrów.Aby sprawdzić czas wyrównania i stopień natlenienia w urządzeniu, należy wybrać trzy punkty na szkiełku foxy, w których zmierzona zostanie koncentracja tlenu. Należy wykonać zdjęcie szkiełka bezpośrednio przed rozpoczęciem przepływu gazu. Następnie należy wykonywać zdjęcia w odstępach 10 sekund przez 30 minut podczas przepływu gazu przez urządzenie, aby przetestować heterogeniczność oraz dostarczanie tlenu.Wyznacz wiele punktów w odstępach jednego milimetra w poprzek szerokości kanału i zmierz stężenie tlenu na powierzchni otworu za pomocą oprogramowania Metamorph. Eksportuj średnią intensywność obrazu dla każdej pozycji i przedstaw zależność stężenia natlenienia od intensywności fluorescencji. Wygeneruj krzywą kalibracyjną poprzez dopasowanie linii liniowych do zakresu od 0 do 10% oraz od 10 do 21%, odnosząc intensywność fluorescencji do stężenia tlenu. Dla każdej zmierzonej pozycji surowe dane dotyczące intensywności mogą zostać wyeksportowane z programu Metamorph i poddane dalszej analizie w programie Microsoft Excel lub innym oprogramowaniu statystycznym.Po skalibrowaniu urządzenia można przystąpić do eksperymentów, takich jak testy gojenia ran; należy wysterylizować skalibrowaną wkładkę w autoklawie w temperaturze 121°C przez 15 minut w ciągu 24 godzin przed eksperymentem i pracować z nią w laminarnym dygestorium do kultur komórkowych, aby zapobiec późniejszemu zanieczyszczeniu. Namoczyć wysterylizowaną wkładkę z PDMS w medium bezsurowiczym przez 24 godziny, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków gazu podczas umieszczania w dołkach płytki; hodować komórki MDCK lub inne komórki adherentne do 100% konfluencji w płytce sześciodołkowej, a następnie wykonać proste zadrapania w monowarstwach za pomocą końcówki pipety P 200. Zadrapania te symulują rany w adherentnej monowarstwie.Odssać pożywkę komórkową, uważając, aby nie naruszyć monowarstwy, a następnie przepłukać ją pięcioma mililitrami pożywki. Ponownie odessać płyn i napełnić studzienki trzema mililitrami pożywki bezsurowiczej. Ostrożnie wprowadzić urządzenie do płytki, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.Wprowadzenie urządzenia pod kątem pomaga w usunięciu pęcherzyków powietrza jedną z jego stron. Należy uważać, aby nie wywierać nadmiernego nacisku na urządzenie, co mogłoby doprowadzić do odkształcenia PDMS w stopniu wystarczającym do zmiażdżenia znajdujących się pod nim komórek. Umieść płytkę i urządzenie na podgrzewanym do 37 °C stole mikroskopu i podłącz rurki z butli z gazem źródłowym do portów wlotowego i wylotowego urządzenia.Inkubator do hodowli powinien posiadać otwór umożliwiający wprowadzenie rurek, a rurki powinny zostać podłączone. Po umieszczeniu urządzenia w inkubatorze należy postąpić zgodnie z wcześniej opisaną procedurą uruchamiania przepływu gazu w celu oceny gojenia rany. Należy rejestrować obrazy poklatkowe komórek co 20 minut przez okres od 15 do 18 godzin, korzystając z opisanego wcześniej sprzętu i oprogramowania do obrazowania. Do analizy niezagojonej powierzchni po pożądanym czasie trwania eksperymentu można wykorzystać algorytm pomiarowy dla testu zarysowania (scratch assay). Następnie należy zatrzymać przepływ gazu, wyjąć płytkę i, jeśli jest to wymagane, przystąpić do dalszego przetwarzania komórek. Urządzenie z wkładką hipoksyczną wymaga mniej niż dwóch minut, aby ustabilizować poziom tlenu na poziomie 0.5%oxygen, jak pokazano tutaj.Wielkość szczeliny przy dnie otworu membrany urządzenia była krytycznym czynnikiem określającym wydajność równoważenia, przy czym większe szczeliny wymagały więcej czasu do osiągnięcia stałych wartości stężenia tlenu. Urządzenie umożliwia również dużą kontrolę nad przestrzennym natlenieniem w pojedynczym otworze, co pozwala na tworzenie wielu warunków, a nawet generowanie cyklicznego profilu natlenienia na powierzchni otworu. Monowarstwy komórek MDCK poddano działaniu 10% lub 21% tlenu, a powierzchnia rany była analizowana w czasie przy użyciu algorytmu MATLAB Ts scratch wound tailing.Po 11 z łącznie 17 godzin pozostało 6,87% pierwotnej rany przy ekspozycji na 10% tlenu, podczas gdy przy 21% tlenu pozostało 64,4% rany. Jak tutaj pokazano, stężenia tlenu są ujemnie skorelowane z powierzchnią otwartej rany dla obu stężeń tlenu. Przez cały czas trwania eksperymentu pokazaliśmy, jak wykonać, zwalidować i wykorzystać urządzenie z wkładką hipoksyczną do testu gojenia ran metodą scratch assay. Urządzenie to oferuje szereg zalet w porównaniu z innymi systemami natleniania, takimi jak mniejsza powierzchnia zajmowana w laboratorium oraz znacznie większa kontrola nad przestrzennym i czasowym natlenianiem powierzchni komórek.Urządzenie może być wykorzystywane praktycznie w każdym laboratorium badającym wpływ tlenu lub innych gazów, takich jak dwutlenek węgla, na hodowle komórkowe in vitro. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wysterylizowane urządzenie oraz pożywki hodowlane namoczyć przez noc, a także zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza podczas eksperymentu. Ponadto należy pozwolić układowi na wyrównanie parametrów przed rozpoczęciem doświadczenia.Dzieje się tak, ponieważ szybkość przepływu zmienia się w miarę wyrównywania się ciśnienia w układzie. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

fabrication-operation-an-oxygen-insert-for-adherent-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Produkcja i działanie wkładu tlenu do adhezywnych kultur komórkowych

Wprowadzenie do technologii, protokołu i obsługi naczyń Corning HYPERStack oraz akcesoriów wykorzystywanych do wysokowydajnej hodowli komórek adherentnych. Protokół pokaże, jak wykorzystać naczynia z zamkniętym systemem w celu zwiększenia wydajności zbioru komórek w porównaniu do obecnie stosowanych produktów w formie stosów płytek.

Protokół hodowli komórkowej w systemie zamkniętym z wykorzystaniem naczyń HYPERStack z technologią materiału przepuszczającego gazy

Fermentory są używane do zwiększania wydajności hodowli i produktywności komórek bioinżynieryjnych.  Po przesiewie wielu kandydatów na hodowle mikrobiologiczne lub komórki zwierzęce w kolbach wstrząsowych, następnym logicznym krokiem jest zwiększenie biomasy wybranej kultury za pomocą fermentora. Ten film pokazuje konfigurację i działanie typowego systemu bioreaktora laboratoryjnego.

Działanie bioreaktora laboratoryjnego

Trójwymiarowa komora przepływowa to nowatorska technologia in vitro do ilościowej i stopniowej oceny kaskady wynaczynień komórek krążących w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego. W związku z tym urządzenie spełnia krytyczną potrzebę podstawowych, przedklinicznych i klinicznych badań migracji komórek.

Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

Funkcjonalne zachowanie komórek w hodowli można poprawić poprzez hodowlę w bardziej podobnych do in vivo 3-wymiarowych środowiskach hodowli16-21. Niniejszy manuskrypt opisuje konfigurację i działanie systemu bioreaktora z pustymi włóknami do hodowli tkanek ssaków podobnych do in vivo.

Bioreaktory z pustych włókien do hodowli tkanek ssaków podobnych do in vivo

W organizmach wielokomórkowych wydzielane rozpuszczalne czynniki wywołują reakcje różnych typów komórek w wyniku sygnalizacji parakrynnej. Systemy kohodowli typu insert oferują prosty sposób oceny zmian, w których pośredniczą wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu komórka-komórka.

Opracowanie systemu kohodowli inkubacyjnej dwóch typów komórek przy braku kontaktu komórka-komórka

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół dla modelu raka płuc ex vivo, który naśladuje etapy progresji guza i pomaga wyizolować guz pierwotny, krążące komórki nowotworowe i zmiany przerzutowe.

Bezkomórkowy i komórkowy model płuc do badania przerzutów nowotworowych

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

W tym artykule, nowo zaprojektowana wkładka wydrukowana w 3D jest przedstawiona jako model kokultury i zweryfikowana przez badanie parakrynnej komunikacji międzykomórkowej między komórkami śródbłonka a keratynocytami.

Innowacyjna wkładka drukowana w 3D zaprojektowana z myślą o prostych hodowlach komórkowych 2D i 3D

Protokół ten przedstawia metodę wytwarzania dwuwarstwowego chipa mikroprzepływowego i analizy wzrostu drobnoustrojów pod wpływem gwałtownych oscylacji tlenu. Wydajność urządzenia została potwierdzona za pomocą wykrywania tlenu w kanałach płynów i hodowli mikroorganizmów.

Tworzenie szybkich oscylacji tlenu w analizie wzrostu pojedynczych komórek drobnoustrojów przy użyciu dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Poznaj metodę wytwarzania wkładu tlenowego do kontroli stężenia tlenu w kulturach komórkowych. Urządzenie umożliwia precyzyjną manipulację przestrzenną i czasową poziomów tlenu w badaniach gojenia ran.

Wytwarzanie i obsługa wkładki tlenowej do adherentnych kultur komórkowych

Przeglądaj więcej filmów