Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem zestawu Thermo Scientific Solaris qPCR Assay
17 czerwca 2010
Zestawy do analizy ekspresji genów Solaris qPCR to nowoczesne, gotowe kombinacje starterów i sond qPCR, opracowane w celu uproszczenia procesu qPCR bez utraty specyficzności i odporności analizy.
W niniejszym artykule wideo zaprezentowano metodę real-time PCR z wykorzystaniem testów Solaris QPCR. Testy Solaris QPCR to specyficzne dla genów pary starterów i sond zaprojektowane w celu wykrywania wszystkich znanych wariantów splicingowych danego genu. W uniwersalnych warunkach termocyklowania sonda Solaris posiada w części 5' grupę wiążącą małą bruzdę oraz reporter fluorescencyjny FA, a w części 3' przesłonięty ciemny wygaszacz (dark quencher).
Podczas etapu denaturacji w procesie real-time PCR sonda pozostaje w roztworze, a fluorescencja reportera FAM jest wygaszana. Podczas fazy przyłączania i elongacji primery oraz sonda wiążą się z sekwencją docelową, co powoduje oddzielenie wygaszacza od FAM. FAM emituje wówczas silny sygnał fluorescencyjny, a po dysocjacji sondy fluorescencja zostaje ponownie wygaszona.
Wyniki analizy real-time PCR wykazują czułość, swoistość oraz powtarzalność tego wydajnego testu. Dzień dobry, nazywam się James Covino i reprezentuję zespół badawczo-rozwojowy Thermo Fisher Scientific w Lafayette w Kolorado. Dzisiaj przedstawimy procedurę przygotowania standardowej reakcji QPCR z wykorzystaniem odczynników do analizy ekspresji genów Lars QPCR.
W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania wyciszania wybranych genów z wykorzystaniem technologii interferencji RNA. Przejdźmy zatem do szczegółów. Zestaw Solaris QPCR assay STEM charakteryzuje się unikalnym algorytmem wykorzystującym technologie MGB i super base, co pozwala na zastosowanie jednego wygodnego testu dla 98% adnotowanych genów człowieka i myszy.
Zazwyczaj projektowanie sond i starterów DNA jest ograniczone temperaturą topnienia sondy, która jest określana przez liczbę i rodzaj zasad. Dłuższe sekwencje oraz sekwencje bogate w GC mają wyższe temperatury topnienia. Grupa wiążąca w małej bruździe stosowana w sondach Solaris dopasowuje się do małej bruźdy helisy DNA i stabilizuje oddziaływanie sondy z sekwencją docelową.
Zwiększa to temperaturę topnienia, co umożliwia zastosowanie krótszych sond. Algorytm Solaris selektywnie wprowadza również zmodyfikowane nukleotydy, zwane superbazami, aby poprawić stabilność wiązań AT i wyeliminować samoprzyleganie GG w sekwencjach bogatych w guaninę. Pozwala to na wykorzystanie sekwencji docelowych, których w przeciwnym razie należałoby uniknąć.
Zwiększona elastyczność sekwencji zapewniana przez zastosowanie tych technologii umożliwia projektowanie zestawów starter-sonda rozpoznających wszystkie znane warianty splicingowe pojedynczego genu. Należy zauważyć, że wszędzie tam, gdzie było to możliwe, w miejscu docelowym włączono regiony obejmujące złącza eksonów, aby zwiększyć swoistość poprzez uniknięcie amplifikacji zanieczyszczającego genomowego DNA; uzyskane zestawy starter-sonda poddano analizie BLAST z wykorzystaniem trzech różnych baz danych: genomowej, transkrypty oraz pseudogenów, aby zapewnić swoistość. Ponadto zestawy starter-sonda firmy Solaris zostały całkowicie zoptymalizowane w taki sposób, że warunki cykliczności dla wszystkich analiz QPCR są identyczne, co pozwala na ocenę ekspresji różnych transkryptów w pojedynczych seriach PCR.
Aby rozpocząć planowanie eksperymentu qPCR R, zidentyfikuj odczynniki niezbędne do przeprowadzenia qPCR dla badanego genu, korzystając z wyszukiwarki produktów Genius, która znajduje się pod adresem thermo.com/solaris. Kliknij w polu zapytania wyszukiwania i wybierz odpowiedny organizm docelowy. Wyszukiwarka produktów Genius obsługuje wiele różnych identyfikatorów genów.Tutaj.
Wpisz jeden z sugerowanych terminów wyszukiwania dla interesującego genu, następnie kliknij szukaj, zidentyfikuj interesujący gen i kliknij wybierz po lewej stronie. Otworzy to okno wyświetlające różne dostępne odczynniki dla interesującego genu. Kliknij zakładkę qPCR detection w sekcji Solaris gene expression assay.
Wyświetlono optymalnie zaprojektowany test starterów sondy Solaris. Ten jeden test wykryje wszystkie znane warianty splicingowe badanego genu. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego czynnika starterowego, znajdź w menu cykler QPCR, który zostanie wykorzystany, i określ kompatybilny master mix: albo master mix z oddzielną fiolką z barwnikiem referencyjnym ROX, mix ROX lub mix z niską zawartością ROX.
W niniejszym doświadczeniu wykorzystamy system Roche light cycler 480 oraz zestaw master mix plus rock vial. Ważne jest również upewnienie się, że w badaniu uwzględniono odpowiedni gen referencyjny. Po otrzymaniu wszystkich odczynników Solaris QP CR zostanie wykorzystany gen B2M.
Należy je przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Odczynniki są stabilne przez co najmniej 12 miesięcy. Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
Przygotuj cDNA do qPCR, przeprowadzając reakcje odwrotnej transkrypcji na próbkach RNA. Po przygotowaniu cDNA rozmroź na lodzie zestaw testowy Solaris oraz master mix. Master mix zawiera wszystkie komponenty do ilościowej PCR z wyjątkiem specyficznego dla genu zestawu testowego, a komponenty matrycy obejmują termostat, polimerazę DNA dn oraz TPS rocks.
Jeśli instrument do qPCR wymaga odpowiednich parametrów oraz dedykowanego buforu reakcyjnego zawierającego wewnętrzny niebieski barwnik, należy przygotować również wodę klasy PCR oraz płytki do qPCR. Po rozmrożeniu roztworów wymieszać je poprzez delikatne potrząsanie, a następnie krótko odwirować, aby zapobiec utracie odczynników. Następnie w probówce o pojemności 15 ml przygotować 1x zestaw do qPCR Solaris oraz master mix.
Dla żądanej liczby próbek analizowanych na płytce 384-dołkowej, wymieszaj 5 µL 2x master mix, 0,5 µL 20X Solaris assay oraz wodę klasy PCR, tak aby końcowa objętość w każdym dołku wynosiła 10 µL. Po dodaniu cDNA należy przygotować wystarczającą ilość mieszaniny dla trzech powtórzeń każdej próbki, w tym kontroli bez matrycy (NTC) oraz kontroli bez odwrotnej transkryptazy (no RT), aby odpowiednio sprawdzić odczynniki pod kątem zanieczyszczeń lub obecność zanieczyszczającego genomowego DNA. Następnie przenieś mieszaninę do sterylnego zbiornika.
Następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieś odpowiednią objętość gotowej mieszaniny reakcyjnej (master mix 1x) do odpowiednich dołków płytki PCR. W przypadku użycia białych płytek, zawarty w mieszaninie niebieski barwnik wskaźnikowy ułatwi monitorowanie postępu pipetowania. Na tej samej płytce można analizować wiele bibliotek cDNA oraz genów referencyjnych, ponieważ wszystkie warunki cykliczne są identyczne.
Po dodaniu master mixu o stężeniu 1x do odpowiednich dołków, należy dodać rozcieńczoną matrycę CD NA do każdego dołka tak, aby objętość końcowa wyniosła 10 µL, a następnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Płytkę należy zamknąć za pomocą uszczelki adhezyjnej lub termicznej, jak pokazano tutaj.
Umieść płytkę w wirówce i odwiruj, aby osadzić odczynniki na dnie dołków oraz usunąć pęcherzyki powietrza, które zakłóciłyby program odczytów fluorescencji. W termocyklerze polimeraza hot start zawarta w Solaris QPCR master mix musi zostać aktywowana w temperaturze 95 °C przez 15 minut (jeden cykl), a następnie należy przeprowadzić 40 cykli obejmujących denaturację w 95 °C przez 15 sekund oraz etap wydłużania w 60 °C przez 60 sekund. Protokół ten jest identyczny dla wszystkich testów Soliris QPCR, niezależnie od amplifikowanego genu.
Na koniec umieść płytkę w urządzeniu do qPCR i uruchom program. Rysunek ten obrazuje wysoką wydajność testów Solaris; tutaj 10 dziesięciokrotnych rozcieńczeń syntetycznego DNA lub cDNA zostało amplifikowanych z użyciem testów ekspresji genów Solaris qPCR dla CDC 20 i F two RL one. Krzywe amplifikacji w skali logarytmicznej oraz krzywe wzorcowe dla rozcieńczeń log 10 wykazują wysoką wydajność testu nawet przy niskich stężeniach materiału wejściowego.
Wydajność każdego testu jest mierzona za pomocą efektywności, kwadratu wartości zakresu dynamicznego w skali do 10, rozcieńczeń log 10 oraz dolnej granicy wykrywalności. Przedstawione tutaj dane demonstrują powtarzalność testów Solaris. W tym przypadku alikwoty cDNA zostały powielone w dwóch oddzielonych geograficznie laboratoriach z wykorzystaniem testów ekspresji genów Solaris QPCR oraz master mixu.
W obu laboratoriach obliczono te same poziomy ekspresji dla dwóch genów docelowych. Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować standardową reakcję QPCR z wykorzystaniem odczynników do badania ekspresji genów Solaris QPCR. Podczas przeprowadzania tego eksperymentu ważne jest, aby pamiętać o przygotowaniu mieszanin master mix z prawidłowym stężeniem końcowym odczynników oraz o uwzględnieniu odpowiednich powtórzeń biologicznych i/lub technicznych.
Dodatkowo niezbędne jest zaprogramowanie instrumentu do qPCR z odpowiednimi warunkami termocyklowania dla Solaris. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Zestawy Solaris qPCR Gene Expression Assays zapewniają usprawnione podejście do techniki real-time PCR, gwarantując wysoką specyficzność i powtarzalność wyników. Testy te zostały zaprojektowane w celu wykrywania wszystkich znanych wariantów splicingowych genów docelowych, co zwiększa efektywność badań ekspresji genów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Analiza ekspresji genów
- Technologia Real-time PCR
- Optymalizacja testu
Wprowadzenie
- Real-time PCR jest kluczową techniką służącą do ilościowego oznaczania ekspresji genów.
- Tradycyjne projektowanie sond i starterów może być ograniczone przez wymogi dotyczące temperatury topnienia.
- Testy Solaris wykorzystują innowacyjne technologie w celu zwiększenia stabilności i swoistości sond.
- Testy te są zoptymalizowane dla szerokiego zakresu genów ludzkich i mysich.
Cel badania
- W celu zaprezentowania konfiguracji i przeprowadzenia qPCR z wykorzystaniem testów Solaris.
- W celu podkreślenia zalet stosowania technologii Solaris w badaniach ekspresji genów.
- W celu dostarczenia protokołu do stosowania przez badaczy podczas przeprowadzania eksperymentów qPCR.
Zastosowane metody
- Przygotowanie cDNA z próbek RNA.
- Zastosowanie testów Solaris qPCR oraz master mixu do amplifikacji.
- Wdrożenie uniwersalnych warunków termocyklingu.
- Optymalizacja warunków cyklowania dla różnych transkryptów.
Główne wyniki
- Wykazanie wysokiej czułości i swoistości w wykrywaniu ekspresji genów.
- Skuteczna amplifikacja wszystkich znanych wariantów splicingowych genów docelowych.
- Powtarzalność wyników w wielu analizach.
- Efektywne wykorzystanie zasobów dzięki możliwości oceny wielu genów w jednym przebiegu.
Wnioski
- Testy Solaris qPCR upraszczają proces analizy ekspresji genów.
- Testy te zapewniają badaczom wiarygodne i powtarzalne wyniki.
- Technologia ta zwiększa elastyczność i specyficzność eksperymentów qPCR.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym pozostaje kamieniem milowym w walidacji celów terapeutycznych i odkrywaniu biomarkerów we wczesnych etapach opracowywania leków. Test Solaris qPCR zwiększa pewność predykcyjną, umożliwiając czułą, specyficzną i powtarzalną detekcję wszystkich znanych wariantów splicingowych w uniwersalnych warunkach cyklicznych. Możliwość ta wspiera efektywne procesy przesiewowe i skraca czas ograniczania ryzyka biologicznego w kampaniach identyfikacji celów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wykrywanie wszystkich znanych wariantów splicingowych genów docelowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną kwantyfikację w różnych laboratoriach, wspierając wysiłki w zakresie walidacji celów w wielu ośrodkach.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność w odniesieniu do celu dzięki projektowaniu starterów obejmujących złącza eksonowe, co pozwala uniknąć kontaminacji genomowym DNA.
Przesiew i rozwój analizy
- Wartość operacyjna: Uniwersalne warunki cyklicznego przetwarzania termicznego umożliwiają zastosowanie testów multipleksowych na płytkach 384-dołkowych, co zwiększa przepustowość.
- Wartość naukowa: Niebieski master mix poprawia dokładność pipetowania i ułatwia monitorowanie reakcji podczas przygotowywania testu.
- Wartość operacyjna: Gotowe zestawy starterów/sond dla >98% genomów ludzkich i mysich skracają czas opracowywania testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia wykrywanie rzadkich transkryptów z wysoką czułością, wspierając odkrywanie biomarkerów w modelach istotnych dla przebiegu chorób.
- Wartość operacyjna: Odczynniki stabilne przez ≥12 miesięcy w temperaturze −20°C zapewniają długoterminową użyteczność w podłużnych badaniach przedklinicznych.
- Wartość naukowa: Technologia Super base poprawia specyficzność w sekwencjach bogatych w GC, zwiększając niezawodność w złożonych kontekstach genomicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test Solaris qPCR wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od weryfikacji hipotez dotyczących celu terapeutycznego po optymalizację wiodących związków, szczególnie w sytuacjach, gdy wymagane jest rozróżnienie wariantów splicingowych oraz precyzja ilościowa.
- Biologia odkryć: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez potwierdzenie zaangażowania celu i modulację szlaków za pomocą detekcji specyficznej dla miejsca splicingowe.
- Przesiewanie: Umożliwia wdrożenie gotowych do użycia testów z identycznymi warunkami cykliczności, co ułatwia przesiewanie związków w płytkach.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych, w tym wydajności, R², zakresu dynamicznego oraz dolnej granicy detekcji, co pozwala na dobór trafień w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną dzięki powtarzalności wyników w różnych laboratoriach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Standaryzowany protokół i wstępnie zaprojektowane zestawy umożliwiają ponowne wykorzystanie w różnych projektach, redukując nadmiarowe prace nad opracowaniem testów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki wysokiej swoistości, czułości oraz pokryciu wariantów splicingowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki uniwersalnym warunkom oraz niebieskiemu master mixowi.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje typu go/no-go dzięki niezawodnej kwantyfikacji celu i ograniczeniu liczby wyników fałszywie dodatnich.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko, wspierana przez powtarzalne dane z wielu ośrodków dotyczące ekspresji celu.
Kwestie implementacyjne
- Wymagana jest wiedza z zakresu biologii molekularnej w obszarze postępowania z kwasami nukleinowymi oraz konfiguracji qPCR.
- Wymagany jest aparat do PCR w czasie rzeczywistym z możliwością ustawienia uniwersalnego cyklu (denaturacja 95°C, przyłączanie/elongacja 60°C).
- W celu zapewnienia integralności danych wymagana jest standaryzacja genów referencyjnych (np. B2M) oraz uwzględnienie powtórzeń (biologicznych/technicznych).
- Przy adaptacji należy zwrócić uwagę na zapewnienie odpowiedniej jakości wprowadzanego cDNA oraz unikanie wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
- Ograniczenia praktyczne: wydajność testu zależy od właściwego rozcieńczenia matrycy oraz kontroli zanieczyszczeń (NTC, no-RT).
