Name: Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu testu qPCR Thermo Scientific Solaris (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Poznaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym z testami Solaris do analizy ekspresji genów. Ta metoda umożliwia wykrywanie wszystkich znanych wariantów splicingowych z wysoką czułością i specyficznością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Algorytm projektowania testów qPCR Thermo Scientific Solaris
<ol>
 <li>Algorytm stosowany w projektowaniu par sond i starterów Solaris qPCR dostosowuje Tm każdego komponentu, co umożliwia stosowanie uniwersalnych warunków cyklicznych. Wprowadzenie do sondy grupy MGB (minor groove binding – wiążącej się z małym rowkiem) zwiększa Tm i pozwala na projektowanie krótszych sond, co zapewnia większą elastyczność i wydajność testu. Jak wynika z nazwy, MGB to klasa antybiotyków, które mogą dopasować się do małego rowka helisy DNA. MGB są przyłączane do końca 3' lub 5' sondy DNA. W roztworze fluorescencja reportera FAM sondy jest wygaszana przez Eclipse Dark Quencher. Gdy sonda wiąże się z sekwencją docelową, wynikająca z tego zmiana konformacji 3D sondy umożliwia uzyskanie silnego sygnału fluorescencyjnego. Wiązanie sondy DNA z sekwencją docelową jest stabilizowane przez MGB, co pozwala na stosowanie wysoce specyficznych, krótszych sond przy zachowaniu odpowiedniej temperatury topnienia dla PCR. W związku z tym detekcja sygnału zachodzi podczas fazy przyłączania (annealing) amplifikacji celu. W etapie elongacji sonda MGB dysocjuje, a fluorescencja jest ponownie wygaszana. Ponieważ sonda dysocjuje, nie wpływa ona na wydajność PCR.</li>
 <li>Kolejną cechą algorytmu Solaris jest wykorzystanie Superbaz. Superbazy to zmodyfikowane zasady o zwiększonych zdolnościach wiązania, które poprawiają stabilność wiązań A-T i eliminują samoasocjację G-G w sekwencjach bogatych w guaninę. Co więcej, nie wygaszają one sąsiednich fluoroforów przyłączonych do terminu 5'. Zasady te są rozmieszczane selektywnie, zgodnie z algorytmem, aby rozszerzyć dostępność sekwencji docelowych. Umożliwia to wykorzystanie sekwencji, takich jak regiony bogate w G-C, których w przeciwnym razie unikano by przy projektowaniu starterów i sond.</li>
 <li>Ilekroć jest to możliwe, algorytm Solaris uwzględnia regiony obejmujące złącza eksonowe w miejscu docelowym. Zwiększa to specyficzność poprzez zapobieganie amplifikacji zanieczyszczającego genomowego DNA.</li>
 <li>Co istotne, algorytm identyfikuje również sekwencję konsensusową dla wszystkich znanych wariantów splicingowych, tak aby wszystkie były objęte jednym zestawem sonda/starter. Dzięki temu do analizy konkretnego genu zainteresowania potrzebny jest tylko jeden test.</li>
 <li>Wreszcie, algorytm projektowania testów Solaris qPCR wykorzystuje bardzo rygorystyczne parametry w kluczowych kwestiach projektowych, w tym zawartość GC, długość, Tm oraz odcinki jednorodnych nukleotydów. Wynikowe sekwencje są analizowane za pomocą BLAST pod kątem specyficzności przy użyciu trzech różnych baz danych: genomowej, transkryptomowej i pseudogenowej.</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie odczynników Solaris
<ol>
 <li>Aby uzyskać odpowiednie odczynniki Solaris, odwiedź stronę <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com/solaris</a></li>
 <li>Po wejściu na stronę kliknij „GENEius Product Search”. Aby przejść bezpośrednio do wyszukiwania produktów GENEius, wejdź na <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com/SolarisSearch</a> </li>
 <li>Kliknij w polu wyszukiwania i wybierz odpowiedny organizm docelowy. </li>
 <li>Wyszukiwarka produktów GENEius może przetwarzać wiele różnych identyfikatorów genów. W tym miejscu wprowadź jeden z sugerowanych terminów wyszukiwania, aby znaleźć interesujący Cię gen, np. numer dostępu Ref Seq, Gene ID, symbol genu, opis genu, numer Sanger ID lub numer dostępu, lub numer katalogowy. Następnie kliknij „Search”. </li>
 <li>Zidentyfikuj interesujący Cię gen i kliknij „Select” po lewej stronie. Otworzy się okno wyświetlające dostępne produkty Thermo Scientific dla wybranego genu. W sekcji „Products” wybierz zakładkę „qPCR Detection”. </li>
 <li>W sekcji „Solaris Gene Expression Assay” zobaczysz jeden optymalnie zaprojektowany zestaw sondy i starterów Solaris. Ten jeden zestaw obejmuje wszystkie znane warianty splicingowe Twojego genu docelowego. Wybierz żądaną ilość. Dostępne są opakowania po 100, 200, 400 oraz 
 1000 X 25 μl reakcji (jeśli zestaw jest oznaczony jako wykonywany na zamówienie, opakowanie 100 sztuk nie będzie dostępne). Kliknij „Add to Cart”.</li>
 <li>Następnie wybierz odpowiedni master mix do termocyklera, który zostanie użyty. Aby ustalić, który master mix będzie najlepiej współpracował z dostępnym urządzeniem, kliknij „Find out which Master Mix works best with your PCR Cycler!”. </li>
 <li>Znajdź w menu używany cykler qPCR, aby określić, którego mieszaniny należy użyć. </li>
 <li>Wróć do okna wyszukiwania produktów GENEius i wybierz odpowiedni master mix. Master mix jest dostępny w rozmiarach 100, 200, 400 i 1000 reakcji. Kliknij „Add to Cart”.</li>
 <li>Do przeprowadzenia pełnej analizy qRT-PCR można zamówić również sugerowane geny referencyjne oraz zestawy do syntezy cDNA verso.</li>
 <li>Po otrzymaniu odczynników Solaris qPCR przechowuj je w temperaturze -20°C do momentu użycia. Powinny zostać otrzymane następujące odczynniki: roztwór 20X zawierający dwa startery w stężeniu 800 nM każdy oraz jedną sondę specyficzną dla genu w stężeniu 200 nm, informacje o sekwencji sondy i starterów oraz Solaris qPCR Gene Expression Master Mix w stężeniu 2X. Zestawy Solaris qPCR Gene Expression Assays są stabilne przez minimum 12 miesięcy. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. </li>
</ol>
3. Przygotowanie do qPCR
<ol>
 <li>Protokół qPCR należy rozpocząć od cDNA. Całkowity RNA powinien zostać wyekstrahowany metodą kolumnową. Do odwrotnej transkrypcji w celu otrzymania cDNA zaleca się zestaw do syntezy cDNA Thermo Scientific Verso. </li>
 <li>W celu przygotowania do qPCR rozmrozić primery, sondy i master mix na lodzie. Należy również przygotować wodę klasy PCR oraz nieprzezroczyste białe płytki do qPCR, które mogą poprawić czułość PCR w czasie rzeczywistym. </li>
 <li>Master mix zawiera wszystkie komponenty do PCR w czasie rzeczywistym, w tym: 1) polimerazę DNA Thermo-Start, wersję hot-start polimerazy DNA Thermoprime. Ten rodzaj polimerazy jest stosowany w celu zapobiegania niespecyficznej amplifikacji podczas przygotowania reakcji i wymaga etapu aktywacji w 95°C przez 15 min. 2) dNTP w Solaris Master mix, gdzie dTTP zastępuje dUTP w celu maksymalizacji wydajności amplifikacji. 3) Autorski bufor reakcyjny, zoptymalizowany do pracy z zestawami primer/sonda Solaris. Bufor reakcyjny ten zawiera niebieski barwnik w celu zwiększenia kontrastu między odczynnikiem a plastikiem. 4) ROX, jeśli instrument do qPCR wymaga zastosowania ROX. </li>
 <li>Po rozmrożeniu roztworów wymieszać je poprzez delikatne potrząsanie probówką (nie używać wirówki typu vortex). Odwirować próbki, aby zapobiec utracie odczynnika.</li>
 <li>Następnie przygotować sterylną probówkę Falcon 15 mL do przygotowania mieszaniny reakcyjnej dla genu docelowego oraz jedną dla genu referencyjnego, skalując objętość w zależności od liczby próbek. Przygotować ilość umożliwiającą wykonanie trzech powtórzeń dla każdej próbki, w tym kontroli bez matrycy (NTC) oraz próbek do krzywej standardowej, jeśli do analizy zostanie zastosowana metoda krzywej standardowej.</li>
 <li>Dla każdej próbki na płytce 96-dołkowej wymieszać następujące składniki: 5 μL 2X Solaris qPCR Master Mix, 0,5 μl zestawu Solaris Primer/Probe (20X) oraz wodę klasy PCR w taki sposób, aby końcowa objętość reakcji po dodaniu cDNA wynosiła 25 μL. Dla każdej próbki na płytce 384-dołkowej wymieszać: 12,5 μL 2X Solaris qPCR Master Mix, 1,25 μl zestawu Solaris Primer/Probe (20X) oraz wodę klasy PCR w taki sposób, aby końcowa objętość reakcji po dodaniu cDNA wynosiła 10 μL. </li>
 <li>Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść master mix do odpowiednich dołków płytki. Niebieski barwnik zawarty w master mixie ułatwi monitorowanie postępu pipetowania na białych płytkach. Następnie dodać 1-5 μL matrycy cDNA (dla płytki 96-dołkowej) lub 1-2 μL matrycy cDNA (dla płytki 384-dołkowej). Wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Umieścić płytkę w wirówce i odwirować w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, ponieważ będą one zakłócać odczyty fluorescencji. </li>
 <li>Zaprogramować termocykler: enzym musi zostać aktywowany w 95°C przez 15 min (1 cykl). Następnie wykonać 40 cykli: denaturacja w 95°C przez 15 sekund oraz przyłączanie i elongacja w 60°C przez 60 sekund. </li>
 <li>Umieścić płytkę w urządzeniu do qPCR. Uruchomić program. </li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki qPCR z wykorzystaniem Solaris
<img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Analiza ilościowej PCR, krzywe amplifikacji DNA i wyniki wydajności, przedstawiające zakres dynamiczny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Testy Solaris zapewniają wiarygodną detekcję nawet przy bardzo niskich stężeniach wejściowych, co potwierdzają wartości wydajności PCR oraz r2. Dziesięć 10-krotnych rozcieńczeń cDNA syntetyzowanego z syntetycznej sekwencji amplikonu RNA lub sekwencji amplikonu DNA zostało namnożone na urządzeniu ABI 7900HT przy użyciu odpowiednio Solaris qPCR Gene Expression Assay dla F2RL1 lub CDC20. Przedstawiono krzywe amplifikacji w skali logarytmicznej oraz krzywe wzorcowe wraz z parametrami każdego testu, w tym wydajnością, wartością r2, zakresem dynamicznym z 10 rozcieńczeń log10 oraz dolną granicą detekcji.
<img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Analiza ekspresji genów; wykres słupkowy; detekcja ALDOA, PPIB; porównanie ośrodków; wyniki ekspresji genów docelowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Testy Solaris dają spójne wyniki nawet w przypadku różnych badaczy i laboratoriów. siRNA nakierowane na ALDOA i PPIB, a także kontrola nietargetująca (NTC), zostały przetransfekowane do komórek HeLa w końcowych stężeniach 100, 10, 1 i 0,1 nM. Komórki zebrały i wyizolowano całkowite RNA 48 h po obróbce. cDNA zsyntezowano przy użyciu zestawu Thermo Scientific Verso cDNA Synthesis Kit. Alikwot cDNA poddano amplifikacji w dwóch geograficznie oddzielnych laboratoriach, stosując testy Solaris qPCR Gene Expression Assays do detekcji ALDOA, PPIB oraz GAPDH na platformie Roche LightCycler 480 (384-dołkowej). Poziom wyciszenia (knockdown) obliczono metodą ΔΔCq (z normalizacją względem genu referencyjnego GAPDH i komórek traktowanych NTC). Dla obu genów docelowych wykazano te same poziomy wyciszenia u obu badaczy w obu ośrodkach.

Autorzy tego artykułu są pracownikami firmy Thermo Scientific.

Zestawy qPCR Thermo Scientific Solaris zapewniają prostą i ulepszoną metodę przeprowadzania analiz qPCR. Dzięki zastosowaniu algorytmu o wysokiej rygorystyczności, technologii MGB oraz superbaz (Superbases), zestawy starterów i sond te maksymalizują wierność i powtarzalność eksperymentów qPCR. Jeden zestaw startera i sondy rozpoznaje wszystkie znane warianty splicingowe danego genu. Miejsce docelowe, whenever possible, obejmuje regiony obejmujące złącza eksonów, aby zapewnić, że DNA genomiczne nie zostanie amplifikowane. Cechy te umożliwiają jednoczesne badanie licznych próbek, co znacznie skraca czas potrzebny na przeprowadzenie złożonych eksperymentów. Ponieważ master mix jest niebieski, możliwe jest stosowanie białych nieprzezroczystych płytek, które zwiększają czułość qPCR, bez ryzyka pomylenia próbek podczas pipetowania.
Podsumowując, cechy konstrukcyjne testu Solaris qPCR sprawiają, że ten nowatorski test qPCR jest prostym, a jednocześnie wysokowydajnym narzędziem, które charakteryzuje się zarówno specyficznością, jak i odpornością.

<table><tbody><tr><td>Solaris aPCR Gene Expression ROX Master Mix (rozmiar zestawu wprowadzającego)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dharmacon.com/catalog/catalogitemtemplate.aspx?id=4064&amp;amp;imageid=4062&quot; target=&quot;_blank">AB-4351/INT&lt;/a&gt;</td><td>100 x 25 &amp;#x03BC;L reakcji</td></tr><tr><td>Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dharmacon.com/catalog/catalogitemtemplate.aspx?id=4064&amp;amp;imageid=4062&quot; target=&quot;_blank">AB-4351/A&lt;/a&gt;</td><td>200 x 25 &amp;#x03BC;L reakcji</td></tr><tr><td>Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dharmacon.com/catalog/catalogitemtemplate.aspx?id=4064&amp;amp;imageid=4062&quot; target=&quot;_blank">AB-4351/B&lt;/a&gt;</td><td>400 x 25 &amp;#x03BC;L reakcji</td></tr><tr><td>Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dharmacon.com/catalog/catalogitemtemplate.aspx?id=4064&amp;amp;imageid=4062&quot; target=&quot;_blank">AB-4351/C&lt;/a&gt;</td><td>1000 x 25 &amp;#x03BC;L reakcji</td></tr><tr><td>Zestawy Solaris qPCR Gene Expression Assays</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>AX-XXXXXX-XX-XXXX*</td><td>100 reakcji (1 x 125 &amp;#x03BC;L)&lt;br/&gt; 200 reakcji (2 x 125 &amp;#x03BC;L)&lt;br/&gt; 400 reakcji (4 x 125 &amp;#x03BC;L)&lt;br/&gt; lub 1000 reakcji (10 x 125 &amp;#x03BC;L) </td></tr><tr><td>Zestaw Verso cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dharmacon.com/product/productlandingtemplate.aspx?id=1177&quot; target=&quot;_blank">AB-1453/A&lt;/a&gt; &lt;a href=&quot;http://www.dharmacon.com/product/productlandingtemplate.aspx?id=1177&quot; target=&quot;_blank">AB-1453/B&lt;/a&gt;</td><td>40 x 20 &amp;#x03BC;L reakcji&lt;br/&gt;100 x 20 &amp;#x03BC;L reakcji</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa ABgene (ze spodem, niski profil, biała) **</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dharmacon.com/Product/ProductLandingTemplate.aspx?id=2084&quot; target=&quot;_blank">AB-0800/W&lt;/a&gt;</td><td>25 płytek</td></tr><tr><td>Płytka PCR 384-dołkowa ABgene Diamond Ultra, biała **</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dharmacon.com/Product/ProductLandingTemplate.aspx?id=2166&quot; target=&quot;_blank">AB-2150/W&lt;/a&gt;</td><td>25 płytek</td></tr><tr><td>Klejowa folia uszczelniająca Absolute qPCR</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dharmacon.com/Product/ProductLandingTemplate.aspx?id=2008&quot; target=&quot;_blank">AB-1170&lt;/a&gt;</td><td>50 arkuszy</td></tr><tr><td colspan="4">*Numer katalogowy zależy od produktu. W celu wybrania odpowiedniego zestawu prosimy odwiedzić stronę &lt;a href=&quot;http://www.thermo.com/solaris&quot; target=&quot;_blank">www.thermo.com/solaris&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">**W celu sprawdzenia kompatybilności z termocyklerem oraz dostępnych kolorów należy zapoznać się z naszym aktualnym katalogiem lub odwiedzić stronę &lt;a href=&quot;http://www.thermo.com/pcrplastics&quot; target=&quot;_blank">www.thermo.com/pcrplastics&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem zestawu thermo scientific solaris qpcr assay

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Zestaw do analizy ekspresji genów Solaris qPCR to nowatorski rodzaj zestawu starterów i sond, zaprojektowany w celu uproszczenia procesu qPCR przy zachowaniu czułości i dokładności analizy. Zestawy te zostały opracowane w taki sposób, aby objąć &gt;98% genomów ludzkich i mysich, a w porównaniu z wcześniej dostępnymi technologiami oferują one znaczące ulepszenia. Usprawnienia te stały się możliwe dzięki zastosowaniu nowatorskiego algorytmu projektowania, opracowanego przez ekspertów z zakresu bioinformatyki w Thermo Scientific.
W zestawie Solaris qPCR Assay zastosowano kilka praktycznych rozwiązań, aby usprawnić proces przeprowadzania ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Po pierwsze, protokół jest zbliżony do powszechnie stosowanych alternatyw, dzięki czemu metody wykorzystywane podczas qPCR są prawdopodobnie znane użytkownikowi. Po drugie, master mix ma niebieski kolor, co ułatwia monitorowanie przygotowywania reakcji qPCR. Po trzecie, warunki cykli termicznych są identyczne dla wszystkich testów (genów), co umożliwia jednoczesne badanie wielu próbek i zmniejsza ryzyko wystąpienia błędów. Wreszcie, dostarczone zostały informacje o sekwencjach sond i starterów, co upraszcza proces publikacji wyników.
W niniejszym materiale demonstrujemy, jak uzyskać odpowiednie odczynniki Solaris, korzystając z funkcji wyszukiwania produktów GENEius dostępnej na stronie zamówień (www.thermo.com/solaris), oraz jak wykorzystać odczynniki Solaris do przeprowadzenia qPCR z zastosowaniem metody krzywej standardowej.

Zestawy do analizy ekspresji genów Solaris qPCR to nowoczesne, gotowe kombinacje starterów i sond qPCR, opracowane w celu uproszczenia procesu qPCR bez utraty specyficzności i odporności analizy.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem zestawu Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Zestaw do analizy ekspresji genów Solaris qPCR to nowatorski typ zestawu starterów i sond, zaprojektowany w celu uproszczenia procesu qPCR przy jednoczesnym zachowaniu czułości i...

W niniejszym artykule wideo zaprezentowano metodę real-time PCR z wykorzystaniem testów Solaris QPCR. Testy Solaris QPCR to specyficzne dla genów pary starterów i sond zaprojektowane w celu wykrywania wszystkich znanych wariantów splicingowych danego genu. W uniwersalnych warunkach termocyklowania sonda Solaris posiada w części 5' grupę wiążącą małą bruzdę oraz reporter fluorescencyjny FA, a w części 3' przesłonięty ciemny wygaszacz (dark quencher).Podczas etapu denaturacji w procesie real-time PCR sonda pozostaje w roztworze, a fluorescencja reportera FAM jest wygaszana. Podczas fazy przyłączania i elongacji primery oraz sonda wiążą się z sekwencją docelową, co powoduje oddzielenie wygaszacza od FAM. FAM emituje wówczas silny sygnał fluorescencyjny, a po dysocjacji sondy fluorescencja zostaje ponownie wygaszona.Wyniki analizy real-time PCR wykazują czułość, swoistość oraz powtarzalność tego wydajnego testu. Dzień dobry, nazywam się James Covino i reprezentuję zespół badawczo-rozwojowy Thermo Fisher Scientific w Lafayette w Kolorado. Dzisiaj przedstawimy procedurę przygotowania standardowej reakcji QPCR z wykorzystaniem odczynników do analizy ekspresji genów Lars QPCR.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania wyciszania wybranych genów z wykorzystaniem technologii interferencji RNA. Przejdźmy zatem do szczegółów. Zestaw Solaris QPCR assay STEM charakteryzuje się unikalnym algorytmem wykorzystującym technologie MGB i super base, co pozwala na zastosowanie jednego wygodnego testu dla 98% adnotowanych genów człowieka i myszy.Zazwyczaj projektowanie sond i starterów DNA jest ograniczone temperaturą topnienia sondy, która jest określana przez liczbę i rodzaj zasad. Dłuższe sekwencje oraz sekwencje bogate w GC mają wyższe temperatury topnienia. Grupa wiążąca w małej bruździe stosowana w sondach Solaris dopasowuje się do małej bruźdy helisy DNA i stabilizuje oddziaływanie sondy z sekwencją docelową.Zwiększa to temperaturę topnienia, co umożliwia zastosowanie krótszych sond. Algorytm Solaris selektywnie wprowadza również zmodyfikowane nukleotydy, zwane superbazami, aby poprawić stabilność wiązań AT i wyeliminować samoprzyleganie GG w sekwencjach bogatych w guaninę. Pozwala to na wykorzystanie sekwencji docelowych, których w przeciwnym razie należałoby uniknąć.Zwiększona elastyczność sekwencji zapewniana przez zastosowanie tych technologii umożliwia projektowanie zestawów starter-sonda rozpoznających wszystkie znane warianty splicingowe pojedynczego genu. Należy zauważyć, że wszędzie tam, gdzie było to możliwe, w miejscu docelowym włączono regiony obejmujące złącza eksonów, aby zwiększyć swoistość poprzez uniknięcie amplifikacji zanieczyszczającego genomowego DNA; uzyskane zestawy starter-sonda poddano analizie BLAST z wykorzystaniem trzech różnych baz danych: genomowej, transkrypty oraz pseudogenów, aby zapewnić swoistość. Ponadto zestawy starter-sonda firmy Solaris zostały całkowicie zoptymalizowane w taki sposób, że warunki cykliczności dla wszystkich analiz QPCR są identyczne, co pozwala na ocenę ekspresji różnych transkryptów w pojedynczych seriach PCR.Aby rozpocząć planowanie eksperymentu qPCR R, zidentyfikuj odczynniki niezbędne do przeprowadzenia qPCR dla badanego genu, korzystając z wyszukiwarki produktów Genius, która znajduje się pod adresem thermo.com/solaris. Kliknij w polu zapytania wyszukiwania i wybierz odpowiedny organizm docelowy. Wyszukiwarka produktów Genius obsługuje wiele różnych identyfikatorów genów.Tutaj.Wpisz jeden z sugerowanych terminów wyszukiwania dla interesującego genu, następnie kliknij szukaj, zidentyfikuj interesujący gen i kliknij wybierz po lewej stronie. Otworzy to okno wyświetlające różne dostępne odczynniki dla interesującego genu. Kliknij zakładkę qPCR detection w sekcji Solaris gene expression assay.Wyświetlono optymalnie zaprojektowany test starterów sondy Solaris. Ten jeden test wykryje wszystkie znane warianty splicingowe badanego genu. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego czynnika starterowego, znajdź w menu cykler QPCR, który zostanie wykorzystany, i określ kompatybilny master mix: albo master mix z oddzielną fiolką z barwnikiem referencyjnym ROX, mix ROX lub mix z niską zawartością ROX.W niniejszym doświadczeniu wykorzystamy system Roche light cycler 480 oraz zestaw master mix plus rock vial. Ważne jest również upewnienie się, że w badaniu uwzględniono odpowiedni gen referencyjny. Po otrzymaniu wszystkich odczynników Solaris QP CR zostanie wykorzystany gen B2M.Należy je przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Odczynniki są stabilne przez co najmniej 12 miesięcy. Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.Przygotuj cDNA do qPCR, przeprowadzając reakcje odwrotnej transkrypcji na próbkach RNA. Po przygotowaniu cDNA rozmroź na lodzie zestaw testowy Solaris oraz master mix. Master mix zawiera wszystkie komponenty do ilościowej PCR z wyjątkiem specyficznego dla genu zestawu testowego, a komponenty matrycy obejmują termostat, polimerazę DNA dn oraz TPS rocks.Jeśli instrument do qPCR wymaga odpowiednich parametrów oraz dedykowanego buforu reakcyjnego zawierającego wewnętrzny niebieski barwnik, należy przygotować również wodę klasy PCR oraz płytki do qPCR. Po rozmrożeniu roztworów wymieszać je poprzez delikatne potrząsanie, a następnie krótko odwirować, aby zapobiec utracie odczynników. Następnie w probówce o pojemności 15 ml przygotować 1x zestaw do qPCR Solaris oraz master mix.Dla żądanej liczby próbek analizowanych na płytce 384-dołkowej, wymieszaj 5 µL 2x master mix, 0,5 µL 20X Solaris assay oraz wodę klasy PCR, tak aby końcowa objętość w każdym dołku wynosiła 10 µL. Po dodaniu cDNA należy przygotować wystarczającą ilość mieszaniny dla trzech powtórzeń każdej próbki, w tym kontroli bez matrycy (NTC) oraz kontroli bez odwrotnej transkryptazy (no RT), aby odpowiednio sprawdzić odczynniki pod kątem zanieczyszczeń lub obecność zanieczyszczającego genomowego DNA. Następnie przenieś mieszaninę do sterylnego zbiornika.Następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieś odpowiednią objętość gotowej mieszaniny reakcyjnej (master mix 1x) do odpowiednich dołków płytki PCR. W przypadku użycia białych płytek, zawarty w mieszaninie niebieski barwnik wskaźnikowy ułatwi monitorowanie postępu pipetowania. Na tej samej płytce można analizować wiele bibliotek cDNA oraz genów referencyjnych, ponieważ wszystkie warunki cykliczne są identyczne.Po dodaniu master mixu o stężeniu 1x do odpowiednich dołków, należy dodać rozcieńczoną matrycę CD NA do każdego dołka tak, aby objętość końcowa wyniosła 10 µL, a następnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Płytkę należy zamknąć za pomocą uszczelki adhezyjnej lub termicznej, jak pokazano tutaj.Umieść płytkę w wirówce i odwiruj, aby osadzić odczynniki na dnie dołków oraz usunąć pęcherzyki powietrza, które zakłóciłyby program odczytów fluorescencji. W termocyklerze polimeraza hot start zawarta w Solaris QPCR master mix musi zostać aktywowana w temperaturze 95 °C przez 15 minut (jeden cykl), a następnie należy przeprowadzić 40 cykli obejmujących denaturację w 95 °C przez 15 sekund oraz etap wydłużania w 60 °C przez 60 sekund. Protokół ten jest identyczny dla wszystkich testów Soliris QPCR, niezależnie od amplifikowanego genu.Na koniec umieść płytkę w urządzeniu do qPCR i uruchom program. Rysunek ten obrazuje wysoką wydajność testów Solaris; tutaj 10 dziesięciokrotnych rozcieńczeń syntetycznego DNA lub cDNA zostało amplifikowanych z użyciem testów ekspresji genów Solaris qPCR dla CDC 20 i F two RL one. Krzywe amplifikacji w skali logarytmicznej oraz krzywe wzorcowe dla rozcieńczeń log 10 wykazują wysoką wydajność testu nawet przy niskich stężeniach materiału wejściowego.Wydajność każdego testu jest mierzona za pomocą efektywności, kwadratu wartości zakresu dynamicznego w skali do 10, rozcieńczeń log 10 oraz dolnej granicy wykrywalności. Przedstawione tutaj dane demonstrują powtarzalność testów Solaris. W tym przypadku alikwoty cDNA zostały powielone w dwóch oddzielonych geograficznie laboratoriach z wykorzystaniem testów ekspresji genów Solaris QPCR oraz master mixu.W obu laboratoriach obliczono te same poziomy ekspresji dla dwóch genów docelowych. Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować standardową reakcję QPCR z wykorzystaniem odczynników do badania ekspresji genów Solaris QPCR. Podczas przeprowadzania tego eksperymentu ważne jest, aby pamiętać o przygotowaniu mieszanin master mix z prawidłowym stężeniem końcowym odczynników oraz o uwzględnieniu odpowiednich powtórzeń biologicznych i/lub technicznych.Dodatkowo niezbędne jest zaprogramowanie instrumentu do qPCR z odpowiednimi warunkami termocyklowania dla Solaris. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą w czasie rzeczywistym za pomocą zestawu Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy test qRT-PCR do analizy sygnatur ekspresji IFN typu I i III. Test dyskryminuje różnice w pojedynczej parze zasad między bardzo podobnymi transkryptami tych genów. Dzięki montażowi wsadowemu i zrobotyzowanemu pipetowaniu testy są spójne i powtarzalne.

Wysokoprzepustowy ilościowy test RT-PCR w czasie rzeczywistym do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu I i III

Designerskie chromosomy projektu Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, można odróżnić od swoich natywnych odpowiedników za pomocą testu genotypowania opartego na PCR zwanego PCRTagging, który ma punkt końcowy obecności/braku. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę wykrywania PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania PCRTag.

Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0

To jest efektywny czasowo i kosztowo protokół in vitro, badający mechanizmy nabytej oporności na ukierunkowane środki terapeutyczne, co jest wysoce niezaspokojoną potrzebą medyczną w leczeniu raka.

Poszukiwanie ścieżek napędzających nabytą oporność na terapię celowaną: wytwarzanie subklonów opornych na leki i przywracanie wrażliwości przez knock-down genów

Szybkie i dokładne wykrywanie patogenów roślin na miejscu, zwłaszcza patogenów przenoszonych przez glebę, jest kluczowe dla zapobiegania dalszej produkcji inokulum i rozprzestrzenianiu się chorób roślin na polu. Opracowana tutaj metoda wykorzystująca przenośny system detekcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwia diagnostykę na miejscu w warunkach polowych.

Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

Tutaj przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do określania natywnej zawartości mikro-RNA (bezwzględnej/względnej) w cząsteczkach lipoprotein. Ponadto przedstawiono metodę zwiększania poziomu mikro-RNA, a także metodę określania szybkości wychwytu komórkowego cząstek lipoprotein.

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

Próbki o mikroobjętości są kwantyfikowane za pomocą systemu spektrofotometrycznego, który wykorzystuje naturalne napięcie powierzchniowe do utrzymania próbek bez użycia kuwet lub kapilar. Zakres dynamiczny stężeń białek oraz szybkość ich pomiaru są znacznie zwiększone dzięki zastosowaniu tej metody.

Oznaczanie stężenia białek w mikroobjętościach z wykorzystaniem spektrofotometru NanoDrop 2000c

Poznaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym z testami Solaris do analizy ekspresji genów. Ta metoda umożliwia wykrywanie wszystkich znanych wariantów splicingowych z wysoką czułością i specyficznością.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem zestawu Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Przeglądaj więcej filmów