Wizualizacja lokalizacji RNA w oocytach Xenopus
14 stycznia 2010
Wizualizacja transportu RNA in vivo odbywa się poprzez mikroiniekcję fluorescencyjnie znakowanych transkryptów RNA do oocytów Xenopus, a następnie mikroskopię konfokalną.
W tej procedurze znakowane fluorescencyjnie RNA. Transkrypty są wstrzykiwane do XUS Cytes, a ich lokalizacja jest monitorowana. Najpierw RNA jest znakowane nukleotydami fluorescencyjnymi.
W reakcji transkrypcji in vitro RNA jest następnie ładowane do aparatu do mikroiniekcji. Oocyty umieszcza się na naczyniu iniekcyjnym i ostrożnie wprowadza mikroiniekcję. Na koniec oocyty są hodowane, aby umożliwić lokalizację RNA przed obrazowaniem pod mikroskopem konfokalnym.
Cześć, nazywam się James Gagnan i pracuję w laboratorium dr Kimberly Mallory na Wydziale Biologii Molekularnej, Biologii Komórki i Biochemii na Uniwersytecie Browna. Dzisiaj pokażemy Wam procedurę wizualizacji lokalizacji subkomórkowego RNA w oocytach Xap. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania architektury RNA i czynników białkowych wymaganych do lokalizacji RNA podczas wczesnego rozwoju kręgowców.
Więc zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dokonać transkrypcji mRNA, które jest znakowane zarówno radioaktywnie, jak i fluorescencyjnie, zgodnie z opisem w dołączonym pisemnym protokole. Dodaj DS, aby zdegradować matrycę DNA, a następnie zatrzymaj reakcję przez dodanie EDTA.
Usuń nieinkorporowane nukleotydy i inne małe cząsteczki, wirując przez kolumnę G 50. RNA jest następnie zagęszczane przez wytrącanie etanolu, przemywane i ponownie zawieszane. Po określeniu stężenia przez zliczanie scyntylacyjne rozcieńczyć RNA do 50 nanomolowców i przechowywać w pięciu mikrolitrach podwielokrotności w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Gdy będziesz gotowy do wykonania mikroiniekcji, rozmroź Eloqua znakowanej denaturacji RNA w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie wiruj przez 10 minut z maksymalną prędkością w mikrowirówce w temperaturze pokojowej, aby usunąć cząstki stałe i utrzymać na lodzie. Następnie wyizoluj cyty, przytnij kawałki jajnika xap post lavu do 50-mililitrowej stożkowej dwójki zawierającej 25 mililitrów trzech miligramów na mililitr.
Kolagenaza w 0,1-molowym buforze fosforanu potasu o pH 7,4. Delikatnie wstrząsnąć w temperaturze 18 stopni Celsjusza ze względu na różnice w poszczególnych partiach. Czas leczenia kolagenazą może się różnić i powinien być uważnie monitorowany poprzez oględziny.
Aby zapewnić defoliację, kontynuuj wstrząsanie przez 15 minut lub do momentu, gdy oocyty zostaną widocznie oddzielone od jajnika, pozwól oocytom osiąść na dnie stożkowej rurki. Usuń roztwór i zastąp go buforem MBSH. Powtórz to, umyj jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania.
Następnie ręcznie posortuj etap od trzeciego do czterech CYTES i bufor MBSH pod standardowym mikroskopem świetlnym. Cyty trzeciego etapu są całkowicie nieprzezroczyste, ale białe. Podczas etapu czwartego cyty są nieco większe i nakrapiane pigmentem.
Cyty, które są lekko przezroczyste, są zbyt młode, a cyty, które są w pełni pigmentowane lub wykazują spolaryzowaną dystrybucję pigmentu, są zbyt stare. Na koniec przygotuj igły do mikroiniekcji, używając trzyipółcalowych naczyń włosowatych, ciągnąc i ukosując, aby uzyskać igły o średnicy zewnętrznej około 0,05 milimetra. Teraz, gdy oocyty i igły mRNA są gotowe, przystąp do mikroiniekcji.
Należy rozpocząć od skalibrowania igły z wodą do wstrzykiwań, aby dostarczyć dwie nanometry na wstrzyknięcie. Front. Załadować igłę za pomocą mikrowtryskiwacza sterowanego gazem i skalibrować wielkość kropli za pomocą mikrometru, po kalibracji załaduj od przodu RNA, które ma zostać wstrzyknięte do igły. Następnie umieść posortowane oocyty na naczyniu iniekcyjnym W buforze MBSH naczynie zawiera warstwę czarnej gumy piankowej.
Biały cyt dobrze wyróżnia się na czarnym tle. Następnie ostrożnie wstrzyknij do każdego oocytu dwa litry RNA o natężeniu 50 nanomolowców. Należy pamiętać, aby wstrzyknąć każdą komórkę jajową tylko raz i regularnie sprawdzać, czy igła nie jest zatkana po zakończeniu wstrzyknięcia.
Wydalić pozostały RNA, przepłukać igłę wodą z desyfikacją i załadować następny RNA do wstrzyknięcia. Po wstrzyknięciu przenieś wstrzyknięte cyty do studzienki sterylnej 24-dołkowej płytki do tysiąca. CYTES można hodować na studzienkę.
Usuń bufor i zastąp go 400 mikrolitrami pożywki do hodowli cytów na studzienkę. Następnie umieść płytkę hodowlaną w plastikowym pojemniku z mokrym ręcznikiem papierowym, aby utrzymać wilgotne środowisko podczas hodowli, inkubuj oocyty w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez punkty czasowe od ośmiu do 48 godzin po pożądanym okresie inkubacji. Oocyty można przygotować do mikroskopii po inkubacji wstrzykniętych oocytów.
Uporządkuj wszelkie martwe oocyty i umieść ocalałe oocyty w szklanych fiolkach. Rutynowo obserwuje się przeżywalność komórek jajowych większych niż 90%. Zastąp bufor utrwalaczem M-E-M-F-A i kołysz cyty przez 20 minut.
Chronić oocyty przed światłem słonecznym podczas utrwalania po zakończeniu okresu utrwalania. Umyj oocyty, usuwając utrwalacz i zastępując go równą objętością buforu MBSH. Powtórz to pranie jeszcze raz, w sumie dwa prania.
Następnie umyj oocyty do bezwodnego metanolu. Najpierw usuń połowę objętości i zastąp metanolem. Powtórz to jeszcze dwa razy.
Po tych płukaniach usuń cały roztwór i zastąp go metanolem. Powtórz to płukanie metanolem jeszcze raz. Utrwalone i odwodnione oocyty mogą być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do obrazowania.
Przed obrazowaniem dodaj pożywkę klarującą Marie do naczynia fluorowego WPI ze szklanym dnem, aby pokryć powierzchnię obrazowania. Ostrożnie przenieś oocyty z metanolu na szalkę fluorową, minimalizując objętość przenoszonego metanolu, obraz oocytów na odwróconym mikroskopie konfokalnym, zarówno Zeiss LSM five 10, jak i aica TCSs P dają dobre wyniki. Teraz pokażemy kilka reprezentatywnych obrazów lokalizacji subkomórkowego RNA bezpośrednio po mikroiniekcji: fluorescencyjne RNA można zobaczyć w jądrze po ośmiu godzinach hodowli fluorescencyjnie znakowanej kontroli.
RNA można zobaczyć równomiernie rozmieszczone w cytoplazmie oocytu. Jednak znakowane fluorescencyjnie RNA zawierające sekwencje, które rekrutują maszynerię transportową, można zaobserwować w procesie subkomórkowej lokalizacji do roślinnego bieguna oocytu. Właśnie pokazaliśmy, jak mikrowstrzykiwać fluorescencyjnie znakowane RNA do cytów zap i obserwować lokalizację RNA za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby używać roztworów poddanych działaniu deci, aby uniknąć zanieczyszczenia RNA hodowli, cytów w OCM zawierających antybiotyki oraz chronić cyty przed światłem słonecznym, gdy tylko jest to możliwe, aby uniknąć wybielania zdjęć. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje wizualizację transportu RNA in vivo z wykorzystaniem transkrypcji RNA znakowanych fluorescencyjnie, wstrzykniętych do oocytów Xenopus. Lokalizacja RNA jest monitorowana za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia RNA
Wstęp
- Transport RNA jest kluczowy dla wielu procesów komórkowych.
- Oocyty Xenopus służą jako system modelowy do badania dynamiki RNA.
- Znakowanie fluorescencyjne umożliwia wizualizację RNA w czasie rzeczywistym.
- Mikroskopia konfokalna zapewnia możliwości obrazowania o wysokiej rozdzielczości.
Cel badania
- W celu wizualizacji transportu RNA w żywych komórkach.
- W celu zrozumienia mechanizmów lokalizacji RNA.
- W celu wykorzystania niezawodnej metody badania dynamiki RNA w oocytach.
Zastosowane metody
- Fluorescencyjne znakowanie transkryptów RNA przy użyciu nukleotydów.
- Mikroiniekcja RNA do oocytów Xenopus.
- Kultywacja oocytów w celu umożliwienia lokalizacji RNA.
- Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu monitorowania transportu RNA.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja transportu RNA w oocytach.
- Wykazanie efektywności znakowania fluorescencyjnego.
- Wgląd w wzorce lokalizacji RNA.
- Walidacja mikroskopii konfokalnej jako narzędzia do badań nad RNA.
Wnioski
- Metoda ta stanowi potężne podejście do badania dynamiki RNA.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów transportu RNA.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii w celu uzyskania dalszych informacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Wizualizacja lokalizacji RNA w oocytach Xenopus umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów transportu RNA, wspierając wczesne odkrycia i walidację celów w badaniach nad polarnością komórek oraz biologią rozwoju. To podejście oparte na obrazowaniu zapewnia pewność prognostyczną dla funkcjonalnych badań elementów cis- i trans-działających, co pozwala na podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka w rozwoju modeli przedklinicznych. Ilościowe i powtarzalne wyniki tej metody ułatwiają selekcję projektów w portfelu orazB zmniejszenie ryzyka mechanistycznego w strategiach terapeutycznych celujących w RNA.
Strategiczne Zastosowania w Badaniach i Rozwoju Biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację lokalizacji RNA w celu wyjaśnienia szlaków transportu i determinant molekularnych.
- Wspiera walidację funkcjonalną elementów sekwencji i czynników białkowych zaangażowanych w transport RNA.
- Zapewnia mechanistyczne ograniczenie ryzyka poprzez rozróżnienie specyficznych od niespecyficznych zdarzeń lokalizacji.
- Ułatwia opartą na hipotezach analizę oddziaływań białko-RNA istotnych dla polarności komórki.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ustanawia zwalidowany test obrazowy do ilościowego określania wzorców lokalizacji RNA w żywych komórkach.
- Wspiera standaryzację i powtarzalność dzięki kontrolowanym protokołom mikroiniekcji i obrazowania.
- Umożliwia skalowalność w celu przesiewania wpływu potencjalnych cząsteczek lub perturbacji genetycznych na transport RNA.
- Dostarcza ilościowych odczytów odpowiednich do analizy porównawczej w różnych warunkach doświadczalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z systemami istotnymi dla chorób poprzez modelowanie defektów lokalizacji RNA uwikłanych w zaburzenia rozwojowe.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając badania mechanistyczne w modelu kręgowca.
- Wspiera postęp dostosowany do ryzyka poprzez powiązanie mechanizmów molekularnych z efektami fenotypowymi w oocytach.
- Oferuje wartość prognostyczną w identyfikacji translacyjnych biomarkerów w oparciu o dynamikę lokalizacji RNA.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta technika obrazowania wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, walidację mechanistyczną oraz ilościową analizę lokalizacji RNA w systemie modelowym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią wizualizację transportu RNA.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analiz oraz powtarzalność w ocenie wpływu interwencji molekularnych na lokalizację RNA.
- Analityka: Dostarcza ilościowe wyniki obrazowania umożliwiające rzetelne porównania statystyczne grup eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wgląd w mechanizmy z fenotypami istotnymi dla chorób we wczesnym rozwoju kręgowców.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do badania różnorodnych zdarzeń lokalizacji RNA oraz czynników regulacyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad lokalizacją RNA.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów opartych na obrazowaniu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektów (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczanie solidnych odczytów funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów celowanych w RNA z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane dane mechanistyczne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroiniekcji, obrazowania konfokalnego i pracy z RNA.
- Wymaga dostępu do odczynników do znakowania fluorescencyjnego oraz infrastruktury mikroskopowej o wysokiej rozdzielczości.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów iniekcji i obrazowania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Może wymagać adaptacji dla różnych gatunków RNA lub systemów modelowych, w zależności od sekwencji i mechanizmów transportu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują stabilność RNA, fotoblaknięcie oraz ograniczenia wydajności typowe dla ręcznej mikroiniekcji.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Title
0:30
Introduction
1:03
Preparing for Microinjection
3:14
Microinjection and Oocyte Culture
4:35
Fixation, Dehydration, and Storage of Oocytes
5:35
Imaging RNA Localization by Confocal Microscopy
5:59
RNA Localization in Xenopus Oocytes: Representative Results
6:28
Conclusion
