Name: Wizualizacja lokalizacji RNA w oocytach Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji transportu RNA w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych transkryptów wstrzykniętych do oocytów Xenopus. Technika ta pozwala badać dynamikę RNA za pomocą mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nasze prace nad lokalizacją RNA są finansowane z grantu NIH (R01GM071049) przyznanego KLM.

Część 1: Transkrypcja mRNA znakowanego fluorescencyjnie.
<ol>
 <li>Zlinearyzuj DNA plazmidowe zawierające element lokalizacji RNA lub inną odpowiednią sekwencję i resuspenduj do stężenia 1 μg/μl w H2O traktowanej DEPC. Matryca DNA musi posiadać w górze miejsca promotorowe dla transkrypcji przez polimerazę RNA T7, SP6 lub T3.</li>
 <li>Do sterylnej probówki 1,5 ml dodaj następujące odczynniki:
 <table>
 <tbody>
 <tr><td>a. Bufor 10X Tx (patrz M&amp;M)</td><td>2 μl</td></tr>
 <tr><td>b. Mieszanina 20X cap/NTP (patrz M&amp;M)</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>d. UTP, [α-32P](1 μCi/μl) (Perkin Elmer)</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>e. DEPC-H2O</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>f. 0,2 M DTT</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>g. RNasin (Promega)</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>h. liniowa matryca DNA</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>i. Polimeraza RNA (Promega)</td><td>1 μl</td></tr>
 </tbody>
 </table>
 </li> 
 <li>Delikatnie wymieszaj odczynniki i krótko odwiruj (10 sek. w mikrocentryfudze).</li>
 <li>Inkubuj przez 2-4 godziny w temperaturze 37° C, osłaniając probówkę folią aluminiową, aby zapobiec fotowyblakaniu fluoroforu.</li>
 <li>Dodaj 1 μl 1 mg/ml DNazy wolnej od RNaz (Promega) w celu degradacji matrycy DNA.</li>
 <li>Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37° C.</li>
 <li>Dodaj 79 μl 20 mM EDTA (pH 8,0), aby zatrzymać reakcję.</li>
 <li>Pobierz 1 μl do osobnej probówki, oznakuj jako „input” i zachowaj.</li>
 <li>Przepuść mieszaninę reakcyjną przez kolumnę G50 1 ml (patrz Materiały i Metody), co pozwoli na usunięcie niewbudowanych nukleotydów przy jednoczesnym zachowaniu pełnowymiarowego mRNA.</li>
 <li>Skoncentruj RNA poprzez precypitację etanolem:
 <ol class="lalpha">
 <li>Dodaj 250 μl 100% etanolu, 10 μl 7M CH3COONH4, 1 μl RNA nośnikowego (tRNA drożdżowe, 10 μg/μl) lub 1 μl glikogenu (20 mg/ml).</li>
 <li>Wymieszaj dokładnie i zamroź do stanu stałego w temperaturze -80° C przez &gt;30 minut lub na suchym lodzie przez 15 minut.</li>
 <li>Wiruj z maksymalną prędkością w mikrocentryfudze przez 15 minut, odlej nadosad.</li>
 <li>Przemyj 150 μl 75% etanolu.</li>
 <li>Wiruj przez 3 minuty z maksymalną prędkością w mikrocentryfudze, odlej nadosad.</li>
 <li>Osusz osad w temperaturze 37° C przez 3 minuty, upewniając się, że cały etanol odparował.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Resuspenduj w 1 μl DEPC-H2O i pobierz 1 μl do osobnej probówki, oznakuj jako „incorporated”.</li>
 <li>Wyznacz procent wbudowania i rozcieńcz RNA do stężenia 50 nM (patrz Materiały i Metody w celu obliczeń).</li>
 <li>RNA należy zamrozić w aliquotach po 5 μl do jednorazowego użycia, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania; można je przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze -80° C.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie do mikroiniekcji.
<ol>
 <li>Przygotowanie RNA: Odmrozić alikwot RNA (50 nM) i denaturować RNA w temperaturze 70° C przez 3-5 minut. Wirować przez 10 minut w mikrocentryfudze w temperaturze pokojowej z maksymalną prędkością, aby usunąć wszelkie cząstki, a następnie przechowywać na lodzie.</li>
 <li>Przygotowanie oocytów:
 <ol class="lalpha">
 <li>Chirurgicznie usunąć jajnik od samic Xenopus laevis (Nasco). </li>
 <li>Pokroić fragmenty jajnika Xenopus laevis i umieścić w probówce stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml roztworu kolagenazy (patrz Materiały i Metody). </li>
 <li>Wstrząsać delikatnie w temperaturze 18° C przez 15 minut lub do momentu, aż oocyty zostaną widocznie oddzielone od jajnika. Ze względu na zmienność między partiami, czas traktowania kolagenazą może się różnić i powinien być uważnie monitorowany poprzez inspekcję wizualną w celu zapewnienia defolikulacji. </li>
 <li>Pozwolić oocytom osiąść w probówce, usunąć roztwór i przemyć oocyty buforem MBSH (patrz Materiały i Metody). </li>
 <li>Powtórzyć przemywanie jeszcze dwukrotnie, łącznie trzy razy. Ten protokół izolacji oocytów jest podobny do opisanego w Cohen et al., 209. </li>
 <li>Ręcznie wyselekcjonować oocyty w stadium III/IV (Dumont, 1972) w buforze MBSH pod standardowym mikroskopie stereoskopowym. Oocyty w stadium III są całkowicie nieprzezroczyste, ale białe, podczas gdy oocyty w stadium IV są nieco większe i nakrapiane pigmentem. Oocyty, które są lekko przezroczyste, są zbyt młode, a oocyty w pełni spigmentowane lub wykazujące polaryzację rozkładu pigmentu są zbyt stare.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotowanie igieł: Wytworzyć i ściąć końcówki igieł do średnicy zewnętrznej ok. 0.05 mm. (Używamy kapilar Drummond Scientific 3,5 cala (nr zamówienia 3-0-203-G/X), wyciągacza mikropipet Sutter Instrument Co. oraz ściągacza WPI Inc.).</li>
</ol>
Część 3: Mikroiniekcja
<ol>
 <li>Skalibrować igłę za pomocą DEPC-H2O, aby dostarczała 2 nl na jedną iniekcję. Wypełniamy igłę od strony przedniej, korzystając z mikrowstrzykiwacza sterowanego gazem (patrz Materiały i Metody), a wielkość kropli kalibrujemy za pomocą mikrometru.</li>
 <li>Wprowadzić RNA do igły.</li>
 <li>Umieścić wyselekcjonowane oocyty w naczyniu do iniekcji zawierającym bufor MBSH. Mikrowstrzykiwania przeprowadzamy w naczyniu z warstwą czarnej pianki gumowej. Blade oocyty są dobrze widoczne na białym tle.</li>
 <li>Ostrożnie wstrzyknąć do każdego oocytu 2 nl RNA o stężeniu 50 nM.</li>
 <li>Wypłukać pozostałe RNA, przemyć igłę za pomocą DEPC-H2O i wprowadzić kolejną porcję RNA do iniekcji.</li>
</ol>
Część 4: Hodowla oocytów
<ol>
 <li>Umieścić oocyty w studzience sterylnej płytki 24-dołkowej (Sigma Aldrich). Hodujemy do tysiąca oocytów na jedną studzienkę.</li>
 <li>Usunąć bufor i zastąpić go 40 μl Oocyte Culture Medium (OCM; patrz Materiały i Metody) na studzienkę. Umieścić płytkę hodowlaną w szczelnym plastikowym pojemniku z mokrym ręcznikiem papierowym, aby utrzymać wilgotne środowisko podczas inkubacji.</li>
 <li>Inkubować oocyty w temperaturze 18° C w przedziałach czasowych od 8 do 48 godzin.</li>
</ol>
Część 5: Fixacja, odwodnienie i przechowywanie oocytów
<ol>
 <li>Oddziel martwe oocyty, a oocyty przeżywalne umieść w probówkach szklanych. Rutynowo obserwujemy przeżywalność &gt;90%.</li>
 <li>Umieść oocyty w fiksatywie MEMFA (patrz Materiały i Metody) i inkubuj przez 20 minut na kołysarce. Chroń oocyty przed światłem, owijając probówki folią aluminiową.</li>
 <li>Przepłucz oocyty, usuwając fiksatyw i zastępując go równą objętością buforu MBSH. Powtórz to płukanie jeszcze raz, tak aby łącznie wykonać dwa płukania.</li>
 <li>Przeprowadź odmywanie oocytów w bezwodnym metanolu:
 <ol class="lalpha">
 <li>Usuń połowę objętości roztworu, zastępując ją metanolem.</li>
 <li>Powtórz krok „a” dwukrotnie.</li>
 <li>Usuń cały roztwór, zastępując go metanolem.</li>
 <li>Powtórz płukanie metanolem.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Oocyty można przechowywać w temperaturze -20° C do momentu obrazowania.</li>
</ol>
Część 6: Obrazowanie lokalizacji RNA za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
 <li>Przed obrazowaniem należy dodać medium przejaśniające Murraya (2:1 benzożeniu benzylowy-alkohol benzylowy) do szklanego naczynia FluoroDish (WPI Inc.), aby pokryć powierzchnię obrazowania.</li>
 <li>Ostrożnie przenieść oocyty z metanolu do naczynia FluoroDish, minimalizując objętość przeniesionego metanolu.</li>
 <li>Wykonać obrazowanie przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego (pomyślnie zastosowano Zeiss LSM510 oraz Leica TCS SP2).</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy erytrocytów ilustrujący wariacje w strukturze błony oraz intensywność fluorescencji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1: Wizualizacja subkomórkowej lokalizacji RNA poprzez mikroiniekcję transkryptów znakowanych fluorescencyjnie.  A.  Po mikroiniekcji RNA znakowane Alexa Fluor 546 jest początkowo ograniczone do jądra komórkowego. B. Po ośmiu godzinach hodowli w cytoplazmie oocytu widoczne jest równomiernie rozmieszczone, znakowane fluorescencyjnie kontrolne RNA. C. Można jednak zaobserwować fluorescencyjnie znakowane RNA zawierające sekwencje rekrutujące aparat transportowy w procesie lokalizacji subkomórkowej w biegunie wegetatywnym oocytu (w kierunku dołu). Pasek skali = 50 μm.

<ol><li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li>
<li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+transport+in+ovo%3A+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li>
<li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li>
<li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTB%2FhnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li>
<li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li>
<li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li>
<li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li>
</ol>

Eksperymenty z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Brown University.

Przedstawiliśmy tutaj protokół wizualizacji lokalizacji mRNA w oocytach Xenopus. Metoda ta, wykorzystująca fluorescencyjnie znakowane transkrypty RNA, charakteryzuje się wyższym stosunkiem sygnału do szumu niż uzyskiwany wcześniej przy użyciu transkryptów znakowanych digoksygeniną i jest prostsza oraz szybsza niż podejścia oparte na hybrydyzacji in situ (Mowry and Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Stosując tę metodę, możemy wprowadzać mutacje w sekwencjach RNA i szybko testować ich funkcję in vivo. ...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Bufor Tx 10X&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;60 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;400 mM Tris-HCl (pH 7,5)&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;20 mM spermidyny-HCl&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Lokalizacja RNA jest konserwowanym mechanizmem ustanawiania polarności komórkowej. mRNA Vg1 lokalizuje się w biegunie wegetatywnym oocytów Xenopus laevis i służy do przestrzennego ograniczania ekspresji genu białka Vg1. Ścisła kontrola dystrybucji Vg1 w ten sposób jest niezbędna do prawidłowej specyfikacji warstw zarodkowych w rozwijającym się embrionie. Elementy sekwencji RNA w 3' UTR mRNA, znane jako element lokalizacji Vg1 (VLE), są niezbędne i wystarczające do kierowania transportem. Aby zbadać rozpoznawanie i transport mRNA Vg1 in vivo, opracowaliśmy technikę obrazowania, która pozwala na szeroką analizę mechanizmów transportu kierowanego przez czynniki trans za pomocą prostego odczytu wizualnego. W celu wizualizacji lokalizacji RNA syntetyzujemy znakowane fluorescencyjnie RNA VLE i wstrzykujemy ten transkrypt do poszczególnych oocytów za pomocą mikroiniekcji. Po hodowli oocytów w celu umożliwienia transportu wstrzykniętego RNA, oocyty są utrwalane i odwadniane przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wizualizacja wzorców lokalizacji mRNA umożliwia monitorowanie pełnej ścieżki transportu RNA oraz identyfikację roli elementów cis w obrębie transkryptu oraz czynników trans wiążących się z VLE w kierowaniu transportem RNA (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Rozszerzyliśmy tę technikę poprzez kolokalizację z dodatkowymi cząsteczkami RNA i białkami (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), a także w połączeniu z zaburzeniem funkcji białek motorowych i cytoszkieletu (Messitt et al., 2008), aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw lokalizacji mRNA.&quot;&gt;&lt;strong&gt;mieszanina 20x cap/NTP&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;10 mM CTP&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;10 mM ATP&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu do przetłumaczenia.&quot;&gt;9 mM UTP&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;2 mM GTP&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;20 mM analog czapeczki G(ppp)G (New England Biolabs)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Lokalizacja RNA jest konserwatywnym mechanizmem ustanawiania polarności komórkowej. mRNA Vg1 lokalizuje się w biegunie wegetatywnym oocytów Xenopus laevis i służy do przestrzennego ograniczenia ekspresji genu białka Vg1. Ścisła kontrola dystrybucji Vg1 w ten sposób jest niezbędna do prawidłowej specyfikacji warstw zarodkowych w rozwijającym się embrionie. Elementy sekwencji RNA w 3' UTR mRNA, znane jako element lokalizacji Vg1 (VLE), są niezbędne i wystarczające do kierowania transportem. Aby zbadać rozpoznawanie i transport mRNA Vg1 in vivo, opracowaliśmy technikę obrazowania, która umożliwia rozległą analizę mechanizmów transportu kierowanego przez czynniki trans za pomocą prostego odczytu wizualnego. W celu wizualizacji lokalizacji RNA syntetyzujemy znakowane fluorescencyjnie RNA VLE i wstrzykujemy ten transkrypty do poszczególnych oocytów za pomocą mikroiniekcji. Po hodowli oocytów w celu umożliwienia transportu wstrzykniętego RNA, oocyty są utrwalane i odwadniane przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wizualizacja wzorców lokalizacji mRNA pozwala na monitorowanie pełnej ścieżki transportu RNA oraz identyfikację ról w kierowaniu transportem RNA elementów cis w obrębie transkryptu oraz czynników trans, które wiążą się z VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Rozszerzyliśmy tę technikę poprzez kolokalizację z dodatkowymi cząsteczkami RNA i białkami (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), a także w połączeniu z zaburzaniem białek motorowych i cytoszkieletu (Messitt et al., 2008), aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw lokalizacji mRNA.&quot;&gt;&lt;strong&gt;kolumna G-50&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;Nawodnić 5 g kulek Sephadex G-50 (Sigma Aldrich) w 100 ml odjonizowanej wody H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Poddać działaniu DEPC przez 30 min. i wysterylizować w autoklawie. Niedopełniony zapas przechowywać w temperaturze pokojowej. Przed użyciem dodać następujące roztwory wolne od RNaz:&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;0,5 ml 0,2 M EDTA&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;1 ml 1 M Tris pH 8,0&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;0,5 ml 20% SDS&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;Przechowywać gotowy roztwór G-50 w temperaturze 4°C &amp;deg; C.&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;Wyjąć i usunąć tłok z 3 ml strzykawki (BD Biosciences), a następnie umieścić korpus strzykawki w 15 ml probówce stożkowej (Corning). Zatkać strzykawkę niewielką ilością wełny szklanej (czop o rozmiarze około połowy monety jednocentowej).&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Proszę podać tekst do tłumaczenia.&quot;&gt;Dokładnie wymieszaj roztwór G-50, aby resuspendować koraliki.&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu do przetłumaczenia.&quot;&gt;Do pustej kolumny dodać 2 ml roztworu G-50.&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;Wirować przez 1 minutę przy 1000 x g &lt;em&gt;g&lt;/em&gt; w wirówce laboratoryjnej.&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Przykro mi, ale nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia. Proszę o podanie treści, którą mam przełożyć na język polski.&quot;&gt;Dodać 200 &amp;mu;oddejonizowana H2O traktowana DEPC&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Do każdej kolumny. Wirować.&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;Powtórzyć płukanie jeszcze dwukrotnie, tak aby łącznie przeprowadzić trzy cykle płukania.&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Brak treści do tłumaczenia.&quot;&gt;Przenieś zawartość strzykawki do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Lokalizacja RNA jest konserwowanym mechanizmem ustanawiania polarności komórkowej. mRNA Vg1 lokalizuje się w biegunie wegetatywnym oocytów Xenopus laevis i służy do przestrzennego ograniczenia ekspresji genu białka Vg1. Ścisła kontrola dystrybucji Vg1 w ten sposób jest niezbędna do prawidłowej specyfikacji warstw zarodkowych w rozwijającym się embrionie. Elementy sekwencji RNA w 3' UTR mRNA, tzw. element lokalizacji Vg1 (VLE), są niezbędne i wystarczające do kierowania transportem. Aby badać rozpoznawanie i transport mRNA Vg1 in vivo, opracowaliśmy technikę obrazowania, która umożliwia szeroką analizę mechanizmów transportu kierowanego przez czynniki trans za pomocą prostego odczytu wizualnego. W celu wizualizacji lokalizacji RNA syntetyzujemy znakowane fluorescencyjnie RNA VLE i wstrzykujemy ten transkrypty do poszczególnych oocytów za pomocą mikroiniekcji. Po inkubacji oocytów w celu umożliwienia transportu wstrzykniętego RNA, oocyty są utrwalane i odwadniane przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wizualizacja wzorców lokalizacji mRNA pozwala na monitorowanie pełnej ścieżki transportu RNA oraz identyfikację ról elementów cis w obrębie transkryptu oraz czynników trans wiążących się z VLE w kierowaniu transportem RNA (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Rozszerzyliśmy tę technikę poprzez kolokalizację z dodatkowymi cząsteczkami RNA i białkami (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), a także w połączeniu z zaburzaniem białek motorowych i cytoszkieletu (Messitt et al., 2008), aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw lokalizacji mRNA.&quot;&gt;&lt;strong&gt;Roztwór kolagenazy&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;75 mg kolagenazy z &lt;em&gt;Clostridium histolyticum&lt;/em&gt; (Sigma Aldrich)&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;25 ml 0,1 M KPO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;+ (pH 7,4)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;bufor MBSH&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;88 mM NaCl&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;1 mM KCl&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;brak&quot;&gt;2,4 mM NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;0,82 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; X 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;0,33 mM Ca(NO3)2&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 4 h x&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;0,41 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; X 6h&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;10 mM HEPES (pH 7,6)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Pożywka do hodowli oocytów&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;50% pożywki L15&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;15 mM HEPES (pH 7,6)&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Dokument nie zawiera tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;1 mg/ml insuliny&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;100 mg/ml gentamycyny&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;50 J/ml nystatyny&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;50 J/ml penicyliny&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;50 mg/ml streptomycyny&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;roztwór MEMFA&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;0,1 M MOPS (pH 7,4)&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;2 mM EGTA&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Tekst źródłowy nie został podany.&quot;&gt;1 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;3,7% formaldehydu&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Lokalizacja RNA jest konserwatywnym mechanizmem ustanawiania polarności komórkowej. mRNA Vg1 lokalizuje się w biegunie wegetatywnym oocytów Xenopus laevis i służy do przestrzennego ograniczania ekspresji genu białka Vg1. Ścisła kontrola rozkładu Vg1 w ten sposób jest niezbędna do prawidłowej specyfikacji warstw zarodkowych w rozwijającym się embrionie. Elementy sekwencji RNA w regionie 3' UTR mRNA, tzw. element lokalizacji Vg1 (VLE), są wymagane i wystarczające do kierowania transportem. Aby zbadać rozpoznawanie i transport mRNA Vg1 in vivo, opracowaliśmy technikę obrazowania, która umożliwia szeroką analizę mechanizmów transportu sterowanego przez czynniki trans za pomocą prostego odczytu wizualnego. Aby zwizualizować lokalizację RNA, syntetyzujemy znakowane fluorescencyjnie RNA VLE i wstrzykujemy ten transkrypty do poszczególnych oocytów za pomocą mikroiniekcji. Po hodowli oocytów w celu umożliwienia transportu wstrzykniętego RNA, oocyty są utrwalane i odwadniane przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wizualizacja wzorców lokalizacji mRNA umożliwia monitorowanie pełnej ścieżki transportu RNA oraz identyfikację roli elementów cis w obrębie transkryptu oraz czynników trans wiążących się z VLE w kierowaniu transportem RNA (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Rozszerzyliśmy tę technikę poprzez kolokalizację z dodatkowymi cząsteczkami RNA i białkami (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008) oraz w połączeniu z zaburzeniem białek motorowych i cytoszkieletu (Messitt et al., 2008), aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw lokalizacji mRNA.&quot;&gt;&lt;strong&gt;Obliczanie wydajności RNA&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;Wyznaczenie CPM w &quot;wejście&quot; i &quot;włączony&quot; próbki przy użyciu standardowego licznika scyntylacyjnego.&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Brak tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;wbudowanie = (&quot;włączony&quot;) / (10 x &quot;wejście&quot;)&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;W dostarczonym tekście źródłowym nie znaleziono treści do przetłumaczenia.&quot;&gt;Typowe wartości wbudowania mieszczą się w zakresie od ok. 0,03 do 0,10.&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano treści do przetłumaczenia.&quot;&gt;Maksymalne teoretyczne wydajności dla różnych polimeraz: T7, T3, SP6 – 2,64 &amp;mu;g&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;Wydajność reakcji w &amp;mu;g = (maksymalna wydajność użytej polimerazy) X (inkorporacja)&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&quot;&gt;Rozcieńczyć RNA do stężenia 50 nM = (&amp;mu;g RNA) / 320 / (długość RNA w zasadach) / (5X10&lt;sup&gt;-8&lt;/sup&gt;)&lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;Proszę podać tekst do przetłumaczenia.&quot;&gt;Reakcja ta zazwyczaj daje wydajność rzędu ~50-100 &amp;mu;RNA w stężeniu 50 nM.&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

wizualizacja lokalizacji rna w oocytach xenopus

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Lokalizacja RNA jest konserwatywnym mechanizmem ustalania polaryzacji komórkowej. mRNA Vg1 lokalizuje się w biegunie wegetatywnym oocytów Xenopus laevis i służy do przestrzennego ograniczenia ekspresji genu białka Vg1. Ścisła kontrola rozkładu Vg1 w ten sposób jest niezbędna do prawidłowej specyfikacji warstw zarodkowych w rozwijającym się embrionie. Elementy sekwencji RNA w 3' UTR mRNA, czyli element lokalizacji Vg1 (VLE), są niezbędne i wystarczające do kierowania transportem. Aby zbadać rozpoznawanie i transport mRNA Vg1 in vivo, opracowaliśmy technikę obrazowania, która pozwala na szeroką analizę mechanizmów transportu kierowanego przez czynniki trans za pomocą prostego odczytu wizualnego.
Aby zwizualizować lokalizację RNA, syntetyzujemy znakowane fluorescencyjnie RNA VLE i mikroiniekujemy ten transkrypty do poszczególnych oocytów. Po hodowli oocytów w celu umożliwienia transportu wstrzykniętego RNA, oocyty są utrwalane i odwadniane przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wizualizacja wzorców lokalizacji mRNA umożliwia monitorowanie pełnej ścieżki transportu RNA oraz identyfikację roli elementów cis-działających w obrębie transkryptu oraz czynników trans-działających wiążących się z VLE w kierowaniu transportem RNA (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Rozszerzyliśmy tę technikę poprzez kolokalizację z dodatkowymi cząsteczkami RNA i białkami (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), a także w połączeniu z zaburzeniem białek motorowych i cytoszkieletu (Messitt et al., 2008), aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw lokalizacji mRNA.

Wizualizacja transportu RNA in vivo jest realizowana poprzez mikroiniekcję fluorescencyjnie znakowanych transkryptów RNA do oocytów Xenopus, a następnie za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wizualizacja lokalizacji RNA w oocytach Xenopus

Lokalizacja RNA jest konserwowanym mechanizmem ustalania polaryzacji komórkowej. mRNA Vg1 lokalizuje się w biegunie wegetatywnym oocytów Xenopus laevis i służy do przestrzennego ograniczania ekspresji genu białka Vg1. Ścisła kontrola dystrybucji Vg1 w ten sposób jest niezbędna do prawidłowej specyfikacji warstw zarodkowych w rozwijającym się embrionie. Elementy sekwencji RNA w obszarze 3' UTR mRNA, tzw. element lokalizacji Vg1 (VLE), są niezbędne i wystarczające do kierowania transportem. Aby zbadać rozpoznawanie i transport mRNA Vg1 in vivo, opracowaliśmy technikę obrazowania, która pozwala na szczegółową analizę mechanizmów transportu kierowanego przez czynniki trans za pomocą prostego odczytu wizualnego. W celu wizualizacji lokalizacji RNA syntetyzujemy RNA VLE znakowane fluorescencyjnie i mikroiniekujemy ten transkrypty do pojedynczych oocytów. Po inkubacji oocytów w celu umożliwienia transportu wstrzykniętego RNA, oocyty są utrwalane i odwadniane przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wizualizacja wzorców lokalizacji mRNA umożliwia monitorowanie pełnej ścieżki transportu RNA oraz identyfikację roli elementów cis w obrębie transkryptu i czynników trans wiążących się z VLE w kierowaniu transportem RNA (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Rozszerzyliśmy tę technikę o ko-lokalizację z dodatkowymi cząsteczkami RNA i białkami (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008) oraz zastosowaliśmy ją w połączeniu z zaburzaniem białek motorowych i cytoszkieletu (Messitt et al., 2008) w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw lokalizacji mRNA.

W tej procedurze do oocytów Xenopus są wstrzykiwane transkrypty RNA znakowane fluorescencyjnie, a następnie monitorowana jest ich lokalizacja. W pierwszym kroku RNA jest znakowane nukleotydami fluorescencyjnymi.W reakcji transkrypcji in vitro RNA jest następnie wprowadzane do aparatury do mikroiniekcji. Oocyty umieszcza się na płytce do iniekcji i poddaje starannej mikroiniekcji. Na koniec oocyty są hodowane, aby umożliwić lokalizację RNA przed obrazowaniem za pomocą mikroskopu konfokalnego.Witajcie, jestem James Gagnan z laboratorium dr Kimberly Mallory w Departamencie Biologii Molekularnej, Biologii Komórki i Biochemii na Uniwersytecie Brown. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wizualizacji subkomórkowej lokalizacji RNA w oocytach Xap. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania architektury RNA oraz czynników białkowych niezbędnych do lokalizacji RNA podczas wczesnego rozwoju kręgowców.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, przeprowadź transkrypcję mRNA, które jest znakowane zarówno radioaktywnie, jak i fluorescencyjnie, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Dodaj DS w celu degradacji matrycy DNA, a następnie zatrzymaj reakcję poprzez dodanie EDTA.Nieprzyłączone nukleotydy oraz inne małe cząsteczki należy usunąć poprzez wirowanie przez kolumnę G 50. Następnie RNA jest zagęszczane poprzez wytrącanie etanolem, przemywane i resuspenderowane. Po określeniu stężenia za pomocą liczenia scyntylacyjnego, należy rozcieńczyć RNA do stężenia 50 nM i przechowywać w aliquotach po 5 µL w temperaturze -80 °C.Przed przystąpieniem do mikrowstrzyknięcia rozmrozić alikwot znakowanego RNA i denaturować w temperaturze 70°C przez pięć minut. Następnie wirować przez 10 minut z maksymalną prędkością w mikrowirowarce w temperaturze pokojowej w celu usunięcia cząsteczek stałych, a następnie przechowywać na lodzie. W dalszej kolejności wyizolować oocyty, przenosząc fragmenty jajnika Xenopus laevis do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml roztworu o stężeniu 3 mg/ml.Kolagenaza w 0,1 molarnym buforze fosforanowym potasu o pH 7,4. Delikatnie mieszać w temperaturze 18°C ze względu na zmienność między partiami. Czas traktowania kolagenazą może być różny i powinien być starannie monitorowany poprzez inspekcję wizualną.Aby zapewnić defoliację, należy kontynuować wstrząsanie przez 15 minut lub do momentu, aż oocyty zostaną widocznie oddzielone od jajnika, a następnie pozwolić oocytom opaść na dno probówki stożkowej. Usunąć roztwór i zastąpić go buforem MBSH. Powtórzyć tę czynność, płucząc dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania.Następnie, pod standardowym mikroskopem świetlnym, ręcznie wyselekcjonuj cyty w stadium trzecim lub czwartym w buforze MBSH. Cyty w stadium trzecim są całkowicie nieprzezroczyste, ale białe. Z kolei cyty w stadium czwartym są nieco większe i nakrapiane pigmentem.Oocyty, które są lekko przezroczyste, są zbyt młode, natomiast oocyty w pełni pigmentowane lub wykazujące polaryzację rozkładu pigmentu są zbyt stare. Na koniec przygotuj igły do mikroiniekcji, wykorzystując kapilary o długości trzech i pół cala; wyciągnij i ścinij je tak, aby uzyskać igły o średnicy zewnętrznej około 0,05 milimetra. Po przygotowaniu mRNA, oocytów oraz igieł można przystąpić do mikroiniekcji.Zacznij od skalibrowania igły wodą dejonizowaną, aby dostarczać dwa nanolitry podczas każdego wstrzyknięcia. Napełnij igłę za pomocą mikrowstrzykiwacza sterowanego gazem i skalibruj wielkość kropli za pomocą mikrometru; po kalibracji napełnij igłę RNA przeznaczonym do wstrzyknięcia. Następnie umieść wyselekcjonowane oocyty na płytce do iniekcji w buforze MBSH; płytka zawiera warstwę czarnej pianki gumowej.Białe oocyty wyraźnie odcinają się od czarnego tła. Następnie ostrożnie wstrzyknij do każdego oocytu 2 µL RNA w stężeniu 50 nM. Należy upewnić się, że do każdego oocytu wykonano tylko jedną iniekcję, a po zakończeniu procesu regularnie sprawdzać, czy igła nie jest zapchana.Usunąć pozostałe RNA, wypłukać igłę wodą destylowaną i nabrać kolejną porcję RNA do iniekcji. Po iniekcji przenieść wstrzyknięte cytocyty do dołka sterylnej płytki 24-dołkowej; w jednym dołku można hodować do tysiąca CYTES.Usuń bufor i zastąp go 400 µL pożywki do hodowli cyte na każdą studzienkę. Następnie umieść płytkę hodowlaną w plastikowym pojemniku z mokrym ręcznikiem papierowym, aby utrzymać wilgotne środowisko podczas hodowli; inkubuj oocyty w temperaturze 18 °C przez czas od 8 do 48 godzin, zależnie od pożądanego okresu inkubacji. Po inkubacji wstrzykniętych oocytów można je przygotować do analizy mikroskopowej.Odsiać martwe oocyty, a pozostałe przenieść do szklanych fiolek. Rutynowo obserwuje się przeżywalność powyżej 90% oocytów. Zastąpić bufor utrwalaczem M-E-M-F-A i inkubować oocyty w ruchu kołyszącym przez 20 minut.Chroń oocyty przed światłem słonecznym podczas i po zakończeniu procesu fiksacji. Przemyj oocyty, usuwając utrwalacz i zastępując go równą objętością buforu MBSH. Powtórz to przemywanie jeszcze raz, aby w sumie przeprowadzić dwa przemycia.Następnie przemyj oocyty w bezwodnym metanolu. Najpierw usuń połowę objętości i zastąp ją metanolem. Powtórz tę czynność jeszcze dwa razy.Po tych etapach przemywania odessać cały roztwór i zastąpić go metanolem. Powtórzyć przemywanie metanolem jeszcze raz. Utrwalone i odwodnione oocyty można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu obrazowania.Przed obrazowaniem należy dodać medium przejrzystościącego Marie do szklanego naczynia fluoro WPI, aby pokryć powierzchnię obrazowania. Ostrożnie przenieść oocyty z metanolu do naczynia fluoro, minimalizując objętość przenoszonego metanolu. Obrazować oocyty za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego; zarówno Zeiss LSM 510, jak i Leica TCS SP dają dobre wyniki. Poniżej przedstawiamy reprezentatywne obrazy subkomórkowej lokalizacji RNA bezpośrednio po mikroiniekcji; fluorescencyjne RNA można zaobserwować w jądrze po ośmiu godzinach hodowli kontroli znakowanej fluorescencyjnie.Można zauważyć, że RNA jest rozłożone równomiernie w cytoplazmie oocyta. Jednakże RNA znakowane fluorescencyjnie, zawierające sekwencje rekrutujące aparat transportowy, można zaobserwować w procesie lokalizacji subkomórkowej w biegunie wegetatywnym oocyta. Przedstawiliśmy właśnie sposób mikroiniekcji znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek RNA do oocytów oraz obserwacji lokalizacji RNA przy użyciu mikroskopii konfokalnej.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest stosowanie roztworów traktowanych DEPC, aby uniknąć kontaminacji RNA w hodowli, hodowanie oocytów w pożywce OCM zawierającej antybiotyki oraz chronienie oocytów przed światłem słonecznym, kiedy tylko jest to możliwe, aby uniknąć fotowyblaknięcia. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

visualizing-rna-localization-in-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizowanie lokalizacji RNA w komórkach jajowych Xenopus

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii sekcji cienkich.<br...

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Komora jajowa Drosophila stanowi doskonały model do badania mechanizmów lokalizacji mRNA. Aby uchwycić dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw procesów lokalizacji, wymagane jest szybkie obrazowanie tkanek żywych w wysokiej rozdzielczości. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół preparatyki i obrazowania żywych próbek przy minimalnej ingerencji w ich strukturę.

Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Opisano protokół obrazowania na żywo białek lub struktur autofluorescencyjnych oznaczonych GFP w pojedynczych oocytach Drosophila.

Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila

Opisujemy zbieranie niezapłodnionych jaj Xenopus tropicalis i produkcję ekstraktu z jaj zatrzymanego przez mejozę II. Ten ekstrakt z jaj może być stosowany do oczyszczania mikrotubul i RNA związanych z mikrotubulami.

Produkcja ekstraktów jajowych Xenopus tropicalis w celu identyfikacji RNA związanych z mikrotubulami

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Aby w sposób powtarzalny zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, zoptymalizowano jednocząsteczkową fluorescencję RNA in situ (RNA-FISH) dla komórek nieprzylegających. Oocyty zebrano, zhybrydyzowano z sondami specyficznymi dla transkryptu i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji obrazu.

Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Opisujemy metodę przygotowania i obrazowania na żywo nierozcieńczonych ekstraktów cytoplazmatycznych z jaj Xenopus laevis.

Xenopus laevis (Xenopus laevis) Przygotowanie ekstraktu z jaj i metody obrazowania na żywo do wizualizacji dynamicznej organizacji cytoplazmy

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych ram do dokumentowania fizycznego wpływu cytoszkieletu na kształt jądra i wewnętrzne organelle pozbawione błony w układzie oocytów myszy. Struktura może być dostosowana do użycia w innych typach komórek i kontekstach.

Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

Opisujemy metody wizualizacji początkowej transkrypcji podczas aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach we wczesnej embriogenezie.

Wizualizacja aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków

Poznaj metodę wizualizacji transportu RNA w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych transkryptów wstrzykniętych do oocytów Xenopus. Technika ta pozwala badać dynamikę RNA za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wizualizacja lokalizacji RNA w oocytach Xenopus

Przeglądaj więcej filmów