Pozyskiwanie hemocytów z hawajskiej mątwy Euprymna scolopes i obserwacja ich przylegania do bakterii symbiotycznych i niesymbiotycznych

Po usunięciu dorosłych mątw bobtail z ich zbiorników i znieczuleniu ich 2% roztworem etanolu w filtrowanej wodzie morskiej, pobiera się krew z naczynia krwionośnego w obrębie głowy. Hemolimfa pobrana za pomocą strzykawki o rozmiarze 26,5 G ma niebieski kolor.

Ze względu na obecność hemocyjaniny, hemocyty rozcieńcza się do pożądanego stężenia i nanosi w alykwotach na szkiełko podstawowe z ośmioma komorami. Po przytwierdzeniu hemocytów do szkiełka, barwi się je za pomocą Cell Tracker Orange, barwnika fluorescencyjnego, a następnie poddaje działaniu bakterii znakowanych GFP, które można wizualizować pod mikroskopem fluorescencyjnym. Witam, nazywam się Spencer Olm i pracuję w Katedrze Biologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Connecticut.

Jestem Andrew Collins z NY Home Lab. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę pobierania hemolimfy lub krwi z hawajskiej mątwy bobtail. Przygotowują Państwo tę opis.

Mątwy bobtail są zwierzętami nocnymi występującymi u wybrzeży Hawajów w pobliżu raf koralowych; wykorzystują one światło wytwarzane przez swoje symbionty do kamuflażu w nocy, podczas polowania na ich ulubiony pokarm, którym są krewetki. Powyższą zależność wykorzystujemy w laboratorium do badania sposobu, w jaki pożyteczne bakterie kolonizują tkanki zwierząt. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania oddziaływań pomiędzy komponentami wrodzonego układu odpornościowego gospodarza a jego bioluminescencyjnym partnerem bakteryjnym VIO ide.

Zacznijmy zatem. Przed pobraniem hemolimfy należy znieczulić jedną dorosłą mątwę w zlewce o pojemności jednego litra zawierającej świeżo przygotowany roztwór 2% etanolu w 500 mililitrach filtrowanej i sterylizowanej sztucznej wody morskiej. Po 10 minutach mątwa będzie pływać bezwładnie i nie będzie aktywnie reagować na dotyk.

Należy jednak nadal obserwować proces oddychania, przejawiający się ruchami płaszcza, oraz aktywność chromatoforów, świadczącą o działaniu komórek pigmentowych. Nalać część sterylnego roztworu wody morskiej z etanolem z zlewki do standardowej woskowej kuwety do sekcji i zanurzyć w niej kalmara stroną brzuszną do góry. Za pomocą jednego standardowego końcówki do pipety 200 µL odsunąć lejek i płaszcz, aby odsłonić główne naczynie krwionośne głowy znajdujące się pomiędzy oczami.

Za pomocą sterylnej strzykawki z igłą o rozmiarze 26,5 G nakłuj naczynie krwionośne w głowie i pobierz od 50 do 100 µL hemolimfy lub od 10 do 20 µL. Jeśli zwierzę ma służyć jako dawca wielokrotnie, umieść hemolimfę w sterylnej probówce o pojemności 1,5 mL na lodzie. Należy zauważyć, że w przypadku poprawnego wykonania tego kroku krew kalmara powinna mieć ciemnoniebieski kolor.

Przenieś zwierzę do zbiornika z normalną wodą morską w celu reanimacji, a następnie wiruj hemolimfę w mikrocentryfudze w temperaturze pokojowej, aby odwirować hemocyty i odpipetować nadsącz. Resuspenduj hemocyty w 500 µL roztworu Ringera dla kalmarów w celu przemycia. Następnie ponownie wiruj, aby osadzić komórki i usunąć nadsącz.

Na koniec resuspenduj hemos i roztwór Ringera dla kalmarów. Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Następnie nanieś około 2000 komórek do każdej komory szkiełka podstawowego.

Pozostaw komórki do przywierania do szkła przez około 10 minut. Przy takim zagęszczeniu hemosy powinny utworzyć jednorodną monowarstwę na powierzchni szkła. Przechowuj hemosy w lodzie podczas przygotowywania bakterii w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 28 °C.

Wyhodować jeden lub więcej szczepów bakterii Vireo zawierających zielony fluorescencyjny gen reporterowy do środkowej fazy logarytmicznej w pożywce seawater tritone. Za pomocą spektrofotometru zmierzyć gęstość optyczną hodowli przy 600 nm, aby określić zagęszczenie komórek; bakterie odwirować w wirówce, odrzucić nadsącz i zawiesić osad. W 1 mL roztworu Ringer'a dla kalmarów dodać bakterie do hemocytów.

Na szkiełkach przedmiotowych z komorkami nanieść 100 000 bakterii na każdą komorkę. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Aby uzyskać maksymalne wiązanie, dodać barwnik cell tracker orange do stężenia końcowego 0,005% w celu zabarwienia cytoplazmy.

Inkubować przez 30 minut, a następnie przemyć 150 µL świeżego roztworu ringera dla kalmarów. Przy użyciu mikroskopu konfokalnego obejrzeć barwione hemocyty i związane z nimi bakterie, a następnie przeprowadzić zliczenie bakterii na całej powierzchni hemocytu. Teraz zaprezentujemy reprezentatywne obrazy hemocytów poddanych działaniu niesymbiotycznej bakterii *Vibrio harveyi* znakowanej GFP oraz naturalnej bakterii symbiotycznej kalmarów *Vibrio fischeri*.

Oto obraz miejsca pobrania krwi, które nie zostało poddane działaniu żadnych bakterii. Komórka ma kolor czerwony i uległa aktywacji, co pozwala zauważyć jej wypustki przypominające pseudopodia.

Kiedy komórka jest poddana działaniu symbiotycznej bakterii filio fii, widać kilka bakterii wiążących się z powierzchnią komórki. Jednakże, gdy hemocyty są wystawione na działanie niesymbiotycznej bakterii filio Harvey Harveyi, wiąże się znacznie więcej bakterii. Przedstawiliśmy właśnie sposób ekstrakcji hemolimfy z mątwy bobtail, izolacji hemocytów oraz ich wykorzystania w eksperymentach w celu scharakteryzowania adhezji bakterii do tych komórek mątwy.

Protokół ten można zmodyfikować pod kątem immunochemii poprzez utrwalenie hemocytów po ich przyczepieniu do powierzchni szkiełka podstawowego. Po pozyskaniu hemocytów z organizmu zwierzęcia można również przeprowadzić ekstrakcję RNA, DNA oraz białek. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.