Okno na mikroświat: Proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

Wykazujemy, że dzięki zastosowaniu urządzeń typu eco chip można utrzymać stałe lub zmieniać struktury fizyczne i ciśnienia hydrauliczne. Podczas gdy wpływ właściwości chemicznych powierzchni, właściwości cieczy oraz charakterystyki cząstek lub drobnoustrojów jest badany systematycznie w eksperymentach transportowych z wykorzystaniem niepatogennego szczepu bakterii VIO wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, ilustrujemy znaczenie struktury siedliska, warunków przepływu i wielkości inokulum dla fundamentalnych zjawisk transportu. Oprogramowanie mikrofluidyczne umożliwia wgląd w ukryty świat.

Witajcie, jestem Dimitri Marker z Vanderbilt Institute for Integrative Biosystem Restoration Education na Vanderbilt University. A ja jestem David Schafer, inżynier ds. badań i rozwoju w Viro Laboratories. Cześć, jestem Leslie Sho z Departamentu Inżynierii Materiałów Chemicznych i Biomolekularnych w Center for Environmental Science and Engineering na University of Connecticut. A ja jestem added Dicot, również z Zebra.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia modułowych macierzy mikroprzepływowych siedlisk do podstawowych badań z zakresu nauk o środowisku i inżynierii. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu zbadania wpływu struktur w skali mikrometrów na interakcje transportowe mikroorganizmów w podłożach leśnych. Przejdźmy zatem do szczegółów.

Pierwszym krokiem w tworzeniu urządzenia mikrofluidycznego jest sporządzenie dwuwymiarowego projektu urządzenia w programie do wspomaganego projektowania komputerowego (CAD). W tym przypadku wykorzystaliśmy program AutoCAD, lecz dostępne są również inne programy do rysowania, takie jak Clue In czy CorelDraw. Oprogramowanie to pozwala projektantowi na wierne odwzorowanie struktur fizycznych w skali makroskopowej, podczas gdy poszczególne elementy są definiowane z rozdzielczością mniejszą niż 5 µm.

Na podstawie rysunku CAD tworzona jest maska fotograficzna. Używamy maski chromowej wyprodukowanej przez Advanced Reproductions Corporation z północnej części Massachusetts. Kolejne kilka etapów produkcji urządzenia mikroprzepływowego odbywa się w pomieszczeniu czystym w celu stworzenia formy matrycowej.

Czysty wafle krzemowy jest powlekany fotorezystem w urządzeniu do nanoszenia warstw metodą wirowania (spin coder). Najpierw wafle mocuje się do platformy urządzenia, a na jego środek wlewa się kilka gramów fotorezystu SU 8 20 25. Następnie wafle poddaje się wstępnemu cyklowi rozprowadzania przez 15 sekund przy 500 RPM, a następnie cyklowi nakładania cienkiej warstwy przy 4 000 RPM przez 35 sekund.

Po wirowaniu wafer zostaje umieszczony na płycie grzejnej na 10 minut w temperaturze 95 °C w celu odparowania nadmiaru rozpuszczalnika. Ostatnim etapem przygotowania wafera jest usunięcie krawędziowego wybrzuszenia. Odbywa się to poprzez ponowne umieszczenie wafera w urządzeniu do nanoszenia warstwy i aplikację stałego strumienia środka do usuwania krawędzi SUA na zewnętrzną krawędź powleczonego wafera.

Kolejnym krokiem jest naświetlenie fotorezystu poprzez selektywną ekspozycję na światło UV. Najpierw powleczony wafela umieszcza się na płaskiej powierzchni, a bezpośrednio na nim kładzie maskę chromową. Czerwona folia maskująca Rubylith blokuje przenoszenie wzorów poza obszar docelowy.

Następnie, za pomocą systemu pozycjonowania plamki, na pokryty wafelek przez maskę dostarcza się dawkę światła UV o wartości 300 mJ/cm². Na koniec wafelek jest wypalany przez 15 minut w temperaturze 95 °C, aby usieciować naświetlone obszary fotorezystu, czyniąc je nierozpuszczalnymi. Ostatnim etapem tworzenia matrycy jest usunięcie nieusieciowanych obszarów fotorezystu, co pozostawia wypukłe struktury reliefowe.

W pierwszej kolejności wafer zostaje ponownie umieszczony w koderze rotacyjnym i pokryty roztworem wywoływacza. Wywoływacz pozostaje na pokrytym waferze przez około pięć minut, a następnie zostaje usunięty przez wirowanie, co skutkuje uzyskaniem wyraźnego wzoru na waferze. Wszelkie pozostałości są zmywane poprzez rozpylenie izopropanolu na wirujący wafer.

W tym kroku stosujemy prędkość wirowania 2200 RPM przez około 5 do 10 sekund. Na koniec gotowa matryca jest suszona strumieniem azotowego gazu i przechowywana w naczyniu do czasu odlewania urządzenia. Wytwarzamy urządzenia mikroprzepływowe przy użyciu elastomeru silikonowego polidimetylosiloksanu.

W pierwszej kolejności materiał bazowy i utwardzacz są dozowane do plastikowego kubka w stosunku wagowym 10:1. Następnie mieszanina zostaje wymieszana. Andy usunął pęcherzyki powietrza za pomocą mieszalnika kondycjonującego Thinky AR 100.

Po zakończeniu cyklu ciekły PDMS jest równomiernie wylewany na matrycę. Naczynie zawierające matrycę i nieutwardzony PDMS jest następnie umieszczane w komorze próżniowej w celu odgazowania. Pęcherzyki polimeru pojawiają się niemal natychmiast.

Odgazowywanie trwa do momentu całkowitego zniknięcia pęcherzyków powietrza. Naczynie umieszcza się w wypoziomowanym piekarniku w temperaturze 65 °C na co najmniej cztery godziny, aby umożliwić pełne sieciowanie polimeru. Następnie utwardzone PDMS ostrożnie zdejmuje się z wielorazowej matrycy.

Najpierw cztery krawędzie są wycinane skalpelem daleko poza obszarem wzoru, a następnie urządzenie jest oddzielane od wzorowanego wafla za pomocą pęsety. W razie potrzeby krawędzie urządzenia można przyciąć nożyczkami. Można również oddzielić fragment urządzenia od reszty odlanej struktury z PDMS.

Następnie w PDMS wykonuje się otwory dostępowe. Używamy do tego komercyjnie dostępnych wycinaków do biopsji o różnych rozmiarach, zamontowanych na niewielkim trzpieniu. Wycięte rdzenie PDMS usuwa się za pomocą pęsety.

Na koniec przycięte i przebite urządzenie oczyszcza się za pomocą alkoholu izopropylowego i polipropylenowego patyczka z piankową końcówką. Urządzenie suszy się azotem, a następnie umieszcza w piecu w celu usunięcia wszelkich śladów rozpuszczalnika. Ostatnim etapem tworzenia urządzenia mikroprzepływowego jest połączenie PDMS z podłożem z szkiełka przedmiotowego, a następnie jego napełnienie cieczą.

Urządzenie z PDMS oraz szkiełko przedmiotowe umieszcza się w oczyszczaczu plazmowym, kierując powierzchnie do połączenia do góry. W tym doświadczeniu wykorzystujemy oczyszczacz plazmowy PDC 32 G firmy Herrick. Po wytworzeniu próżni i pojawieniu się widocznej niebiesko-fioletowej plazmy, ustawia się timer na 30 sekund.

Generator plazmy zostaje wyłączony. Komora zostaje ponownie poddana ciśnieniu, a urządzenie i suwak zostają wyjęte z komory, po czym powierzchnie wiążące zostają ze sobą zetknięte. Podczas wyjmowania aktywowanych komponentów z komory ważne jest, aby działać szybko, tak aby powierzchnie pozostały aktywne.

Lekki nacisk pomaga zapewnić dobre wiązanie. Jakość wiązania sprawdza się, pociągając za róg za pomocą pęsety. Hydrofilowe wnętrze można następnie łatwo wypełnić roztworem wodnym, takim jak bufor lub woda dejonizowana.

Wodny płyn wprowadza się do każdego otworu wlotowego i przez odpowiadającą mu mikroporowatą komorę przepływową. Po wypełnieniu wszystkich komór, na całe urządzenie nakłada się cienką warstwę utwardzonego PDMS, aby ograniczyć parowanie i zachować sterylność. W celu skalibrowania przepływu wymuszonego ciśnieniem w urządzeniu, należy wstępnie napełnić mikrostrukturalne komory przepływowe wodą dejonizowaną, a następnie umieścić na górze urządzenia moduł przepływowy, który pełni funkcję interfejsu doprowadzania płynu oraz sterylnej uszczelki.

Ten moduł przepływowy może być używany samodzielnie lub podłączony do zewnętrznego zbiornika z cieczą, takiego jak plastikowa strzykawka. Podłącz zbiornik z cieczą, np. plastikową strzykawkę, lub moduł przepływowy do wlotu doprowadzającego (upstream). Należy utrzymywać poziom cieczy w zbiorniku powyżej poziomu wylotu (downstream).

Różnica wysokości pomiędzy zbiornikiem dopływowym a każdym z dolnych otworów wylotowych definiuje siłę napędową przepływu wymuszonego ciśnieniem, co pozwala na określenie szybkości przepływu przez urządzenia. Do pobierania próbek z dolnych otworów w regularnych odstępach czasu używa się igły tępej o rozmiarze 25 G. Próbki pobieramy na przykład co 15–20 minut, starannie odnotowując rzeczywisty czas, który upłynął pomiędzy kolejnymi pobraniami.

Wagę strzykawki rejestruje się przed i po pobraniu próbek za pomocą wagi analitycznej. Zależność objętości agregatu od czasu agregacji przedstawia się na wykresie, gdzie nachylenie linii odpowiada średniemu natężeniu przepływu masy. Duży przekrój poprzeczny zbiornika wlotowego w stosunku do studni wylotowych zapobiega znacznym zmianom natężenia przepływu podczas przemieszczania się cieczy przez urządzenia; nanosi się pobraną objętość na osi Y względem czasu pobierania próbek na osi X.

W prostym programie graficznym, takim jak Excel, w celu wyznaczenia nachylenia linii, wartość nachylenia jest wykorzystywana do obliczenia średniego natężenia przepływu objętościowego. Do wizualizacji przepływu oraz badania oddziaływań powierzchniowych stosuje się rozcieńczony roztwór kulek lateksowych fluorescencyjnych o stężeniu 3 µM z powierzchniami karboksylowymi, YG oraz zwykłymi YG. W pierwszej kolejności przygotowuje się roztwór kulek w wodzie dejonizowanej o stężeniu 0,01% części stałych.

Roztwór dodaje się do studni położonych powyżej, a następnie ponownie przytwierdza moduł przepływowy do zu. Przepływ kulek monitoruje się wizualnie przez godzinę, rejestrując obraz w odstępach około 10 minut za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu Zeiss AIOt 25, wyposażonego w monochromatyczną kamerę MITx BCEB 0 1 3 U. Poszczególne klatki są przechwytywane w szybkim następstwie, a następnie składane w filmy przy użyciu programu komputerowego, takiego jak Image J, z wykorzystaniem oświetlenia fluorescencyjnego i oświetlenia prześwieconego.

Zarówno koraliki, jak i struktury są widoczne. Po zablokowaniu światła przechodzącego widoczne są jedynie jasne koraliki fluorescencyjne. Stacjonarne koraliki osadzone wzdłuż dolnej powierzchni lub przytwierdzone do kolektorów są widoczne w całym urządzeniu.

Do eksperymentów z wykorzystaniem żywych bakterii, takich jak gatunki Vibrio, przygotowywana jest niepatogenna bakteria wykazująca ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego. Najpierw kulturę stokową wyjmuje się z głębokiego zamrażania. Kolbę ze sterylną pożywką wzrostową LB szczepi się kulturą stokową.

Przy użyciu jednorazowej pętli szczepiącej kolbę inkubuje się przez noc z wytrząsaniem, aby uzyskać kulturę w fazie stacjonarnej o stężeniu około 10⁹ komórek na mililitr. W zależności od zastosowania początkowe stężenie bakterii można określić dokładniej. Następnie przygotowuje się urządzenie mikrofluidyczne wypełnione sterylnym buforem.

Następnie sterylną ciecz w dołkach dopływowych wylewa się i zastępuje 20 µL kultury bakterii. Za pomocą pipety bakterie są wprowadzane do urządzenia poprzez delikatne zasysanie strzykawką w dołkach odpływowych. Po inkubacji ilość bakterii w dołkach można określić poprzez pomiar intensywności fluorescencji każdego dołka po kolonizacji. Dołek wlotowy dopływowy opróżnia się w ten sam sposób co wcześniej i zastępuje buforem z solami o stężeniu 25‰.

Sztuczną wodę morską podaje się pod niewielkim ciśnieniem do otworów doprowadzających, używając strzykawki do przepłukiwania poszczególnych komór przepływowych 20 do 40 µL roztworu buforowego. Po wstępnym przepłukaniu objętość ta odpowiada około 100 do 200 krotności objętości porów mikrofluidycznej części glebowej komory przepływowej. Długotrwałą perfuzję bakterii przez media porowate realizuje się przy użyciu modułu przepływowego dokładnie w sposób przedstawiony wcześniej.

Obrazy wzrostu i transportu bakterii w świetle fluorescencyjnym oraz białym mogą być mierzone w czasie. W tym eksperymencie obrazy są rejestrowane co 15 do 20 godzin przez okres siedmiu dni przy użyciu kolorowej chłodzonej kamery CCD z firmy Q imaging ink. Nasze urządzenia mogą być również wykorzystane do badania wpływu fizycznej struktury siedliska na zapewnienie bakteriom schronienia przed drapieżnictwem pierwotniaków.

Przedstawiono bakterie w mikroporowatej komórce przepływowej, w której widoczne są znacznie większe rzęskowane pierwotniaki eulo żerujące na bakteriach. W analizie przepływu cieczy w urządzeniu mikrofluidycznym ustalono, że średnia prędkość przepływu wynosi 0,71 µL/min przy słupie ciśnienia 40 mm. Po zwiększeniu słupa ciśnienia do 60 mm prędkość przepływu wzrosła proporcjonalnie do 1,04 µL/min.

Podczas stosowania kulek o różnych właściwościach chemicznych powierzchni w urządzeniu, zaobserwowano większe gromadzenie się kulek niekarboksylowanych na powierzchniach urządzenia. Kulki o średnicy od 6 do 10 milimetrów znacznie częściej ulegały uwięzieniu w mniejszych otworach porów. Szybsze prędkości przepływu, spowodowane większym ciśnieniem hydrostatycznym, prowadziły do zmniejszenia retencji i uwięzienia kulek, co było spodziewane przy analizie wzrostu bakterii w mikroprzepływowym urządzeniu eco chipp.

Zauważamy jakościowe różnice w intensywności obrazu w różnych sektorach urządzenia. Intensywność fluorescencji może być ilościowo określona jako wskaźnik biomasy drobnoustrojów w kanale. W toczących się eksperymentach obserwujemy, że ciągłe siły ścinania w warunkach niskiego przepływu zdają się powodować agregację bakterii i tworzenie się kłaczków, co jest widoczne na tych obrazach. Przedstawiliśmy właśnie sposób tworzenia i wykorzystywania prostych urządzeń mikrofluidycznych do pomiaru skali cząsteczek, badania transportu koloidalnego przez media porowate lub badania interakcji drobnoustrojów w mikrostrukturalnych siedliskach.

Podczas prowadzenia badań z wykorzystaniem cel przepływowych ważne jest uwzględnienie wyporności kulek oraz chemii powierzchni koloidów i kolektorów. Przy skalowaniu do reżimu mikrofluidycznego efekty powierzchniowe mogą dominować nad obserwowanymi zjawiskami. Praktycznie każdą strukturę fizyczną można włączyć do projektu mikrofluidycznej celi przepływowej.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.