Okno na mikroświat: proste systemy mikroprzepływowe do badania transportu mikrobiologicznego w ośrodkach porowatych

Pokazujemy, że dzięki zastosowaniu urządzeń z układem scalonym, struktury fizyczne i głowice ciśnieniowe mogą być utrzymywane na stałym poziomie lub w różnych odstępach. Podczas gdy wpływ właściwości płynów chemicznych powierzchni lub charakterystyki cząstek lub drobnoustrojów jest systematycznie badany poprzez eksperymenty transportowe z użyciem niepatogennego zielonego białka fluorescencyjnego eksprymującego szczep bakteryjny VIO, ilustrujemy znaczenie struktury siedliska, warunków przepływu i wielkości inokulum dla podstawowych zjawisk transportowych. Oprogramowanie mikroprzepływowe fascynujący obraz ukrytego świata.

Cześć, nasz marker Dimitri z Vanderbilt Institute for Integrative Biosystem Restoration Education na Uniwersytecie Vanderbilt. Nazywam się David Schafer, jestem inżynierem ds. badań i rozwoju w Viro Laboratories. Cześć, nazywam się Leslie Sho z Wydziału Materiałów Chemicznych i Inżynierii Biomolekularnej w Centrum Nauk o Środowisku i Inżynierii na Uniwersytecie Connecticut, a także jestem Dicot z Zebry.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę tworzenia modułowych mikroprzepływowych macierzy siedliskowych dla podstawowych nauk o środowisku i badań inżynieryjnych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania wpływu struktur w skali mikrometrycznej na interakcje transportowe drobnoustrojów w podłożach leśnych. Więc zacznijmy.

Pierwszym krokiem w tworzeniu urządzenia mikroprzepływowego jest narysowanie dwuwymiarowego układu urządzenia w programie do rysowania wspomaganego komputerowo lub CAD. Korzystaliśmy z programu AutoCAD, ale dostępne są również inne programy do rysowania, takie jak clue in czy coral draw. Oprogramowanie umożliwia projektantowi wierne odwzorowanie struktur fizycznych w całym polu makroskopowym, przy czym poszczególne cechy są definiowane z rozdzielczością mniejszą niż pięć mikronów.

Na podstawie rysunku CAD tworzona jest maska fotograficzna. Używamy chromowanej maski wyprodukowanej przez Advanced Reproductions Corporation, północny kraniec Massachusetts. Kolejne etapy produkcji urządzenia mikroprzepływowego odbywają się w czystym pomieszczeniu w celu stworzenia wzorca.

Czysta płytka krzemowa jest pokryta fotorezystem w koderze spinowym. Najpierw wafel jest mocowany do platformy kodera spinowego, a na środek wafla wylewa się kilka gramów fotorezystu SU 8 20 25. Następnie wafel jest wirowany przez początkowy 15-sekundowy cykl rozprowadzania przy 500 obr./min, a następnie cykl cienkiego powlekania z prędkością 4 000 obr./min przez 35 sekund.

Po odwirowaniu wafel umieszcza się na gorącej płycie na 10 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, aby ulatniać się nadmiar rozpuszczalnika. Ostatnim krokiem w przygotowaniu wafla jest usunięcie listwy krawędziowej. Odbywa się to poprzez powrót płytki do kodera wirowego i nałożenie stałego strumienia środka do usuwania prędkości krawędzi SUA na zewnętrzną krawędź powlekanej płytki.

Następnym krokiem jest modelowanie fotorezystu poprzez selektywną ekspozycję na światło UV. Najpierw powlekaną płytkę umieszcza się na płaskiej powierzchni, a chromowaną maskę umieszcza się bezpośrednio na wierzchu. Czerwona folia maskująca Rubylith blokuje przenoszenie wzorów poza pożądany obszar.

Następnie dawka światła UV o mocy 300 mililitrów JUUL na centymetr kwadratowy jest dostarczana do powlekanej płytki przez maskę za pomocą systemu nośnego punktowego. Na koniec wafel jest wypiekany przez 15 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, aby usieciować naświetlone obszary fotorezystu, czyniąc je nierozpuszczalnymi. Ostatnim krokiem w tworzeniu wzorca jest usunięcie nieusieciowanych obszarów fotorezystu, pozostawiając wypukłe struktury reliefowe.

Najpierw wafel jest ponownie zwracany do kodera spinowego i jest pokryty roztworem deweloperskim. Wywoływacz pozostawia się na powlekanej płytce około pięciu minut, a następnie odkręca, co daje wyraźnie widoczny wzór na płytce. Wszelkie pozostałości zmywa się przez spryskanie przędzalni alkoholem izopropylowym na wirującą płytkę.

Do tego kroku używamy prędkości wirowania 2200 obr./min przez około pięć do 10 sekund. Na koniec gotowy mistrz jest suszony za pomocą strumienia azotu i przechowywany w naczyniu, dopóki nie będzie potrzebny do odlewania urządzenia. Wytwarzamy urządzenia mikroprzepływowe z wykorzystaniem elastomeru silikonowego polimetyloalanu.

Po pierwsze, materiał bazowy i utwardzacz są dostarczane w stosunku wagowym 10 do jednego do plastikowego kubka. Następnie mieszaninę miesza się. Andy bąbelkował za pomocą przemyślanego miksera kondycjonującego AR 100.

Po zakończeniu cyklu płynny PDMS wylewa się równomiernie na wzorzec. Naczynie zawierające wzorzec i nieutwardzony PDMS jest następnie umieszczane w komorze próżniowej w celu odgazowania. Bąbelki polimeru pojawiają się niemal natychmiast.

Odgazowanie trwa, aż wszystkie pęcherzyki znikną. Naczynie umieszcza się w równym piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza na co najmniej cztery godziny, aby w pełni umożliwić sieciowanie polimeru. Następnie utwardzony PDMS jest ostrożnie usuwany z wzorca wielokrotnego użytku.

Pierwsze cztery krawędzie są wycinane daleko poza wzorzysty obszar za pomocą skalpela, urządzenie odrywa się od wzorzystego wafla za pomocą pęsety. W razie potrzeby krawędzie urządzenia można przyciąć nożycami. Podsekcja urządzenia może być oddzielona od reszty formowanego urządzenia PDMS.

Następnie otwory dostępowe są wybijane przez PDMS. Używamy stempli do biopsji, które są dostępne w handlu w kilku różnych rozmiarach, montowanych do małej altany. Rdzenie prasy PDMS są usuwane za pomocą kleszczy.

Na koniec przycięte i dziurkowane urządzenie jest czyszczone za pomocą alkoholu izopropylowego i wacika polipropylenowego z piankową końcówką. Urządzenie suszy się przy użyciu azotu, a następnie umieszcza w piekarniku w celu usunięcia wszelkich śladów rozpuszczalnika. Ostatnim krokiem w tworzeniu urządzenia mikroprzepływowego jest przyklejenie PDMS do szklanego podłoża szkiełkowego, a następnie najpierw napełnienie płynem.

Urządzenie PDMS i szkiełko podstawowe umieszcza się w myjce plazmowej w odstępach między powierzchniami łączącymi. W tym eksperymencie używamy myjki plazmowej PDC 32 G herrick. Po ustanowieniu próżni i pojawieniu się niebiesko-fioletowej plazmy, ustawiany jest timer na 30 sekund.

Generator plazmy jest wyłączony. W komorze ponownie znajduje się ciśnienie, a urządzenie i suwak wyjęte z komory oraz powierzchnie łączące są umieszczane w kontakcie. Podczas usuwania aktywowanych składników z komory ważne jest, aby poruszać się szybko, aby powierzchnie pozostały aktywne.

Delikatny nacisk pomaga zapewnić dobre połączenie. Jakość połączenia sprawdza się, pociągając za róg kleszczami. Hydrofilowe wnętrze można następnie łatwo wypełnić roztworem wodnym, takim jak pożywka buforowa lub dejonizowana.

Płyn wodny jest podawany do każdej studzienki źródłowej i przez odpowiednią mikroporowatą komórkę przepływową. Gdy wszystkie komory są pełne, cienka warstwa utwardzonego PDMS jest umieszczana na całym urządzeniu, aby opóźnić parowanie i utrzymać sterylność. Aby skalibrować przepływ sterowany ciśnieniem w urządzeniu, należy wstępnie załadować mikrostrukturalne komórki przepływowe wodą dejonizowaną, umieścić moduł przepływu, który działa jako interfejs dostarczania płynu i sterylne uszczelnienie na górze urządzenia.

Ten moduł przepływu może być używany samodzielnie lub podłączony do zewnętrznego zbiornika zawierającego płyn, takiego jak plastikowa strzykawka. Podłącz zbiornik zawierający płyn, taki jak plastikowa strzykawka lub moduł przepływowy, do wlotu przed cieczą. Dobrze utrzymuj wysokość płynu w zbiorniku powyżej wysokości dolnego strumienia.

Otóż różnica wysokości między zbiornikiem w górę rzeki a każdym odwiertem wylotowym za nim określa siłę napędową przepływu sterowanego ciśnieniem w celu ilościowego określenia natężenia przepływu przez urządzenia. igła o rozmiarze 25 służy do pobierania próbek z dalszych studni w regularnych odstępach czasu. Na przykład pobieramy próbki co 15 do 20 minut, uważnie odnotowując rzeczywisty czas, jaki upłynął między próbkami.

Masa strzykawki jest rejestrowana na wadze analitycznej przed i po pobraniu próbki. Zagregowana objętość w funkcji zagregowanego czasu jest przedstawiana na wykresie ze spadkiem równym średniemu masowemu natężeniu przepływu. Duży przekrój poprzeczny zbiornika wlotowego w stosunku do studzienek wylotowych pomaga zapobiegać znacznym zmianom natężenia przepływu podczas przepływu płynu przez urządzenia, wykreślając objętość próbki na osi Y w funkcji czasu próbkowania na osi x.

W prostym programie do tworzenia wykresów, takim jak Excel, w celu uzyskania nachylenia linii, nachylenie jest używane do średniego objętościowego natężenia przepływu. Rozcieńczony roztwór trzech mikromolowych fluorescencyjnych kulek lateksowych z powierzchniami karboksylowymi, YG i zwykłymi YG służy do wizualizacji przepływu i badania interakcji powierzchniowych. Najpierw przygotowuje się roztwór kulek w wodzie dejonizowanej o stężeniu 0,01% ciał stałych.

Roztwór jest dodawany do studni upstream, a moduł przepływu jest ponownie podłączany do zu. Przepływ perełek jest wizualizowany w ciągu jednej godziny i rejestrowany mniej więcej co 10 minut na mikroskopie fluorescencyjnym Zeiss AIOt 25, wyposażonym w kamerę monochromatyczną MITx BCEB 0 1 3 U. Poszczególne klatki są rejestrowane w krótkich odstępach czasu i łączone w filmy za pomocą oprogramowania, takiego jak Image J z oświetleniem fluorescencyjnym i oświetleniem światłem przechodzącym.

Widoczne są zarówno koraliki, jak i struktury. Gdy przepuszczane światło jest zablokowane, widoczne są tylko jasne koraliki fluorescencyjne. Nieruchome koraliki osadzone wzdłuż dolnej powierzchni lub przymocowane do kolektorów są widoczne w całym urządzeniu.

Do eksperymentów z użyciem żywych bakterii przygotowuje się kulturę, taką jak gatunki Vibrio, niepatogenne zielone białko fluorescencyjne wykazujące ekspresję bakterii. Po pierwsze, kultura podstawowa jest usuwana z głębokiego, wolnego magazynu. Kolbę ze sterylną pożywką wzrostową LB zaszczepia się kulturą podstawową.

Używając jednorazowej pętli do zaszczepiania, kolba jest inkubowana przez noc z wytrząsaniem, aby uzyskać kulturę w fazie stacjonarnej o stężeniu około 10 do dziewiątych komórek na mililitr. W zależności od zastosowania, początkowe stężenie bakterii może być dokładniej określone ilościowo. Przygotowuje się urządzenie mikroprzepływowe wypełnione sterylnym buforem.

Następnie sterylna ciecz w studzienkach przed studzienkami jest opróżniana i zastępowana 20 mikrolitrami kultury bakterii. Za pomocą pipety bakterie są wysiewane do urządzenia za pomocą delikatnego odsysania za pomocą strzykawki na dołkach wyjściowych Po inkubacji ilość bakterii w studzienkach można określić poprzez ilościowe określenie intensywności fluorescencji każdej studzienki po kolonizacji. Górna studzienka wlotowa jest opróżniana jak poprzednio i zastępowana buforem przepłukiwanym 25 częściami na tysiąc soli.

Sztuczna woda morska pod delikatnym ciśnieniem jest podawana do studni znajdujących się w górnym biegu za pomocą strzykawki, przepłukując poszczególne komórki przepływowe 20 do 40 mikrolitrami roztworu buforowego. Jest to około 100 do 200 razy więcej niż słaba objętość mikroprzepływowej części gleby komory przepływowej po początkowym spłukiwaniu. Długotrwała perfuzja bakterii przez porowate media jest osiągana dzięki zastosowaniu modułu przepływowego dokładnie tak, jak pokazano wcześniej.

Obrazy fluorescencyjne i w świetle białym przedstawiające wzrost i transport bakterii mogą być mierzone w czasie. W tym eksperymencie zdjęcia są wykonywane co 15 do 20 godzin przez okres siedmiu dni za pomocą kolorowej kamery CCD chłodzonej pięcioma z atramentu do obrazowania Q. Nasze urządzenia mogą być również wykorzystywane do badania wpływu fizycznej struktury siedliska na zapewnienie bakteriom schronienia przed drapieżnictwem pierwotniaków. Oczywisty.

Oto bakterie w mikroporowatej komórce przepływowej ze znacznie większymi orzęsionymi pierwotniakami eulo widocznymi w urządzeniu, pasącymi się na bakteriach. W analizie przepływu płynu w urządzeniu mikroprzepływowym stwierdzamy, że średnie natężenie przepływu wynosi 0,71 mikrolitra na minutę dla 40-milimetrowej głowicy ciśnieniowej. Zwiększając wysokość podnoszenia do 60 milimetrów, natężenie przepływu wzrosło proporcjonalnie do 1,04 mikrolitra na minutę.

Stosując w urządzeniu kulki o różnym składzie chemicznym powierzchni, obserwujemy większe nagromadzenie niekarboksylowanych kulek na powierzchniach urządzenia. Podczas gdy koraliki o średnicy od sześciu do 10 milimetrów były znacznie bardziej podatne na porwanie w mniejszych otworach porów. Szybsze przepływy spowodowane większym ciśnieniem hydrostatycznym skutkowały zmniejszoną retencją i porwaniem koralików, czego można się spodziewać po analizie wzrostu bakterii w urządzeniu mikroprzepływowym eco chipp.

Zwracamy uwagę na jakościowe różnice w intensywności obrazu w różnych sektorach urządzenia. Intensywność fluorescencji można określić ilościowo jako wskaźnik zastępczy dla biomasy mikrobiologicznej w kanale. W trwających eksperymentach obserwujemy, że ciągłe siły ścinające w warunkach niskiego przepływu wydają się powodować agregację bakterii i tworzenie stada, co jest widoczne na tych obrazach, Właśnie pokazaliśmy, jak tworzyć i używać prostych urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru skali cząstek, kolizyjnego transportu przez porowate media lub do badania interakcji mikrobiologicznych w siedliskach mikrostrukturalnych.

Podczas wykonywania badań z wykorzystaniem ogniw przepływowych ważne jest, aby wziąć pod uwagę wyporność kulek oraz chemię powierzchni koloidów i kolektorów. Skalując w dół do reżimu mikroprzepływowego, efekty powierzchniowe mogą zdominować obserwowane zjawiska. Praktycznie każda struktura fizyczna może być włączona do projektu mikroprzepływowej komórki przepływowej.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.