Name: Okno na mikroświat: proste systemy mikroprzepływowe do badania transportu mikrobiologicznego w ośrodkach porowatych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-03T16:11:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Poznaj mikroprzepływowe systemy eco chip do badania transportu bakterii w ośrodkach porowatych. Ta metoda umożliwia wizualizację wzrostu mikroorganizmów i procesów transportowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie było wspierane przez grant nr 0649883 z National Science Foundation, Vanderbilt Institute for Integrative Biosystems Research and Education (VIIBRE) oraz program Searle Systems Biology and Bioengineering Undergraduate Research Experience (Searle SyBBURE).

I. Wytwarzanie urządzenia mikrofluidycznego
 <ol>
 <li>Pierwszym krokiem w tworzeniu urządzenia mikroprzepływowego jest narysowanie dwuwymiarowego projektu urządzenia w programie do wspomaganego komputerowo projektowania (CAD). Użyliśmy programu AutoCAD, ale dostępne są również inne programy do rysowania, takie jak CleWin lub CorelDraw.</li>
 <li>Kolejnym krokiem jest wykonanie maski fotolitograficznej. W zależności od wymiarów urządzenia, wymaganej rozdzielczości i budżetu, maski te mogą być wykonane z chromu (najwyższa rozdzielczość, wysoki koszt), stworzone na błonie fotograficznej, a nawet wydrukowane bezpośrednio na folii do rzutnika za pomocą drukarki o wysokiej rozdzielczości. W tym przypadku użyliśmy masek Cr wykonanych przez Advance Reproductions Corp., North Andover, MA.</li>
 <li>Następnym krokiem jest przeniesienie wzoru z maski na światłoczułą żywicę epoksydową w celu stworzenia formy wypukłej.
 <ol>
 <li>Najpierw warstwa negatywowego fotorezystu SU8 jest nanoszona metodą wirowania na wafel krzemowy do pożądanej grubości, a następnie wypalana w celu odparowania nadmiaru rozpuszczalnika. Skład fotorezystu i prędkości wirowania kontrolują grubość naniesionej warstwy.</li>
 <li>Następnie wzór jest naświetlany określoną dawką światła UV przez maskę. Wypalanie po naświetlaniu powoduje sieciowanie naświetlonych obszarów powłoki fotorezystu, czyniąc je nierozpuszczalnymi.</li>
 <li>Następnym etapem jest wywoływanie, podczas którego nienaświetlony rezyst jest usuwany za pomocą chemicznego wywoływacza, pozostawiając pozytywną strukturę wypukłą zwaną matrycą.</li>
 <li>Trzeci etap wypalania, zwany wypalaniem utwardzającym, jest opcjonalny i służy do dalszej stabilizacji struktur.</li>
 </ol></li>
 <li>Formowanie PDMS
 <ol>
 <li>Do formowania replik urządzeń mikroprzepływowych stosujemy elastomer silikonowy poli(dimetylosiloksan) 1. Najpierw materiał bazowy miesza się w stosunku wagowym 10:1 z utwardzaczem, wlewa do płytkiego naczynia, takiego jak szalka Petri, na formę i odgazowuje w próżni, aż znikną wszystkie widoczne pęcherzyki powietrza.</li>
 <li>Matryca z nieutwardzonym PDMS jest następnie umieszczana w precyzyjnie wypoziomowanym piekarniku przez co najmniej 4h w temperaturze 65°C, aby doszło do sieciowania polimeru.</li>
 <li>Po zestaleniu PDMS uformowana sekcja jest wycinana z szalki Petri. W górnej części urządzenia wykonuje się otwory, aby uzyskać dostęp do przestrzeni mikroprzepływowych w gotowym urządzeniu.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przytwierdzanie do szkła
 <ol>
 <li>Czysty PDMS jest nieodwracalnie łączony z czystym szkłem poprzez ekspozycję na plazmę tlenową. Najpierw uformowany i dziurkowany PDMS oraz czysta płytka szklana są umieszczane powierzchnią wiążącą do góry w oczyszczaczu plazmowym. Użyliśmy oczyszczacza plazmowego PDC-32G Harrick.</li>
 <li>Po zamknięciu komory operator uruchamia pompę próżniową, a następnie źródło wysokiej częstotliwości (rf). W komorze dojdzie do samozapłonu plazmy, co objawi się lekkim fioletowym blaskiem.</li>
 <li>Po 30 sekundach ekspozycji na plazmę wyłącza się źródło rf, a następnie pompę próżniową.</li>
 <li>Szybko wyjmuje się płytkę szklaną i urządzenie z PDMS z komory i doprowadza do bezpośredniego kontaktu (powierzchnią formowanego PDMS do dołu). Stworzy to nieodwracalne wiązanie i sprawi, że właściwości powierzchni staną się hydrofilowe.</li>
 <li>W razie potrzeby można uzyskać różną chemię powierzchni PDMS poprzez unieruchomienie białek na powierzchni za pomocą adsorpcji lub wiązania kowalencyjnego.</li>
 <li>Urządzenie można następnie napełnić cieczą, taką jak woda dejonizowana, pożywka wzrostowa lub sztuczne wody gruntowe, wykorzystując siły kapilarne lub delikatny nacisk za pomocą strzykawki.</li>
 </ol>
</li>
 </ol>
II. Ilościowe określanie przepływu w urządzeniu mikrofluidycznym za pomocą analizy grawimetrycznej
 <ol>
 <li>Aby skalibrować przepływ wymuszany ciśnieniem w urządzeniu, mikrostrukturalne komory przepływowe wstępnie napełniono wodą DI.</li>
 <li>Zbiornik zawierający ciecz, taki jak plastikowa strzykawka lub moduł przepływowy (pokazany na Rysunku 1), zostaje podłączony do górnego otworu wlotowego, a wysokość cieczy w zbiorniku jest utrzymywana powyżej wysokości dolnego otworu.</li>
 <li>Próbki są zbierane w otworze odpływowym w regularnych odstępach czasu i ważone na wadze analitycznej.</li>
 <li>Nachylenie krzywej przedstawiającej całkowitą objętość w funkcji całkowitego czasu pozwala wyznaczyć średni wolumetryczny przepływ (Rysunek 2). Uzyskano powtarzalne, liniowe średnie prędkości dla szerokiego zakresu ciśnień hydrostatycznych oraz dla różnych systemów utrzymywania ciśnienia.</li>
</ol>
III. Wizualizacja przepływu, mapowanie prędkości oraz oddziaływania hydrofilowe / hydrofobowe
 <ol>
 <li>Do kalibracji modelu wykorzystano fluorescencyjne kule lateksowe o średnicy 3 μm z powierzchniami Carboxy YG oraz Plain YG, zakupione w Polysciences, Inc., rozcieńczone w wodzie DI do stężenia 0,01 % ciał stałych.</li>
 <li>Kule przepływające przez habitaty wizualizowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss Axiovert 25 wyposażonego w monochromatyczną kamerę Mightex BCE-B013-U.</li>
 <li>Poszczególne klatki obrazu rejestrowano w szybkiej sekwencji, a następnie łączono w filmy za pomocą pakietu oprogramowania ImageJ (Rysunek 3).</li>
</ol>
IV. Urządzenie mikrofluidyczne (EcoChip) do modelowania wzrostu i transportu bakterii
<ol>
 <li>Niepatogenny organizm Vibrio sp. GFP Kan, wykazujący ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, hodowano przez 14 godzin w pożywce Luria-Bertani do uzyskania stężenia około 109 komórek/ml.</li>
 <li>Bakterie w pożywce wprowadzono do urządzeń EcoChip, pozwalając im na kolonizację urządzenia oraz utworzenie kłaczków i biofilmu w ciągu nocy przez 19 godzin.</li>
 <li>Następnie z dołków usunięto pożywkę, a wszystkie siedliska przepłukano sztuczną wodą morską (przepis na ASW znajduje się w pracy Wang et al. 2), tak aby w różnych siedliskach pozostały bakterie o różnej gęstości.</li>
 <li>Jedno siedlisko pozostawiono szczelnie zamknięte bez przepływu, podczas gdy w pozostałych 3 siedliskach utrzymano warunki wolnego przepływu.</li>
 <li>Zdjęcia wzrostu bakterii w świetle fluorescencyjnym i białym wykonywano co 15-20 godzin przez okres kilku dni (rycina 4).</li>
</ol>
V. Reprezentatywne wyniki
Moduł przepływu zapewnia prosty sposób regulacji i dystrybucji przepływów przez wiele środowisk. Analiza grawimetryczna okazała się łatwą i bezpośrednią metodą określania szybkości przepływu przez struktury środowisk, które zależą od oporu hydraulicznego środowisk oraz różnic ciśnień między studnią wlotową a wylotową. W eksperymentach z przepływem kulek zaobserwowaliśmy znacznie większą akumulację kulek na powierzchniach urządzenia w przypadku kulek niekarboksylowanych (Rycina 2). Dodatkowo kulki o większej średnicy, 6 i 10 mm, znacznie częściej ulegały uwięzieniu w mniejszych otworach porów i zaczynały gromadzić się w urządzeniu. Wyższe szybkości przepływu ograniczały retencję i uwięzienie cząstek.
Podczas eksperymentów dotyczących wzrostu bakterii wpływ warunków przepływu jest wyraźnie widoczny. Ciągłe siły ścinania powodują agregację bakterii i tworzenie kłaczków, zamiast występowania w formie pojedynczych komórek. Transport dużych kłaczków bakteryjnych jest istotnym procesem środowiskowym, który jest niezwykle trudny do zbadania w systemie makroskopowym.
<img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig1.jpg" alt="Schemat mikroprzepływowego urządzenia PDMS dla przepływu w ustrukturyzowanym mikrośrodowisku i systemu zbiornika na próbki." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Schemat przedstawiający cechy i działanie modułu przepływowego.
<img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig2.jpg" alt="Wykres porównujący zależności liniowe: y=1,0397x-0,0587, y=0,7092x+1,3279, dane czasu w funkcji wysokości." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Szybkość przepływu przez ustrukturyzowane siedlisko wyznaczona za pomocą analizy grawimetrycznej dla różnych wysokości kolumn. Stosunek wysokości kolumn: 60 / 40 = 1,5, wyznaczony stosunek szybkości przepływu: 1,04 / 0,71 = 1,46. Uzyskane szybkości przepływu dla H = 40 mm wynoszą V = 0,71 μL/min, a dla H = 60 mm V = 1,04 μL/min. Szacowane średnie prędkości liniowe wynoszą odpowiednio 3,1 mm/s oraz 4,6 mm/s. 
<img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig3.jpg" alt="Rozkład lateksowych kulek karboksylowanych w porównaniu do zwykłych; mikroskopia świetlna; porównanie time-lapse; kulki 3 μm." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Transport lateksowych kulek 3um z i bez karboksylowania przepływających przez ustrukturyzowane siedliska.
<img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig4.jpg" alt="Analiza rozkładu komórek w czasie w różnych siedliskach przepływu; obrazy mikroskopowe w 0h, 115h, 212h." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Zmiana wzrostu bakterii i tworzenia biofilmu w funkcji gęstości szczepionki w warunkach powolnego przepływu.

<ol><li>Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+protozoa+through+narrow+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mobility of protozoa through narrow channels.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).</li>
</ol>

System EcoChip można dostosować do potrzeb konkretnego eksperymentu. Nowe formy matrycowe można tworzyć stosunkowo łatwo, a po wykonaniu matrycy można odlewać dodatkowe, dokładnie powielone urządzenia w zależności od potrzeb. Moduł przepływowy jest prosty w obsłudze, nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani złożonych połączeń i może być modelowany jako prosty system przepływu napędzanego ciśnieniem z opadającym poziomem cieczy. Trwają prace nad dalszym rozwojem tego rozwiązania, które obejmują tworzenie kanałów powlekany...

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU8-2025</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki fluorescencyjne</td><td>Polysciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

okno na mikroświat: proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Wzrost i transport drobnoustrojów w ośrodkach porowatych mają istotny wpływ na jakość wód podziemnych i powierzchniowych, recykling składników odżywczych w środowisku, a także bezpośrednio na przenoszenie patogenów do ujęć wody pitnej. Naturalne ośrodki porowate charakteryzują się złożoną topologią fizyczną, zróżnicowaną chemią powierzchni, dynamicznymi gradientami składników odżywczych i akceptorów elektronów oraz niejednorodnym rozmieszczeniem drobnoustrojów. Cechy te zmieniają się znacząco w skali mikronowej, co utrudnia interpretację wyników badań transportu drobnoustrojów w skali makro oraz stanowi wyzwanie dla walidacji modeli mechanistycznych. W niniejszej pracy demonstrujemy, w jaki sposób proste urządzenia mikrofluidyczne mogą być wykorzystane do wizualizacji interakcji drobnoustrojów ze ustrukturyzowanymi mikrośrodowiskami, identyfikacji kluczowych procesów wpływających na obserwowane zjawiska oraz systematycznej walidacji modeli predykcyjnych. Proste, łatwe w użyciu komory przepływowe zostały wykonane z przezroczystego, biokompatybilnego i przepuszczalnego dla tlenu materiału, jakim jest poli(dimetylosiloksan). Do wykonania mikrostrukturalnych matryc wykorzystano standardowe metody fotolitografii, a następnie zastosowano odlewanie replik w celu wytworzenia ustrukturyzowanych komór przepływowych z tych matryc. Konstrukcja fizyczna komory przepływowej jest dostosowana do wymagań eksperymentalnych: mikrokanały mogą być zarówno prostymi połączeniami liniowymi, jak i złożonymi topologiami z elementami o rozmiarach sięgających 2 μm. Nasza modułowa macierz komór przepływowych EcoChip zawiera dziesiątki identycznych komór i system kontroli przepływu sterowany modułem grawitacyjnym. Wykazujemy, że dzięki zastosowaniu urządzeń EcoChip można utrzymywać stałe struktury fizyczne i ciśnienia hydrauliczne lub zmieniać je systematycznie, badając jednocześnie wpływ chemii powierzchni, właściwości cieczy lub charakterystyki populacji drobnoustrojów. W ramach eksperymentów transportowych z wykorzystaniem niepatogennego szczepu wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnegoVibriowykorzystując szczep bakteryjny, ilustrujemy znaczenie struktury siedliska, warunków przepływu oraz wielkości inokulum dla fundamentalnych zjawisk transportu i za pomocą obserwacji cząstek w czasie rzeczywistym wykazujemy, że mikrofluidyka oferuje przekonujący wgląd w ukryty świat.

Urządzenia mikrofluidyczne mogą być wykorzystywane do wizualizacji złożonych procesów naturalnych w czasie rzeczywistym i w odpowiednich skalach fizycznych. Opracowaliśmy proste urządzenie mikrofluidyczne, które naśladuje kluczowe cechy naturalnych ośrodków porowatych, służące do badania wzrostu i transportu bakterii w podłożu gruntowym.

Okno na mikroświat: Proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

Wzrost i transport drobnoustrojów w ośrodkach porowatych mają istotne znaczenie dla jakości wód gruntowych i powierzchniowych oraz recyklingu składników odżywczych w ...

Wykazujemy, że dzięki zastosowaniu urządzeń typu eco chip można utrzymać stałe lub zmieniać struktury fizyczne i ciśnienia hydrauliczne. Podczas gdy wpływ właściwości chemicznych powierzchni, właściwości cieczy oraz charakterystyki cząstek lub drobnoustrojów jest badany systematycznie w eksperymentach transportowych z wykorzystaniem niepatogennego szczepu bakterii VIO wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, ilustrujemy znaczenie struktury siedliska, warunków przepływu i wielkości inokulum dla fundamentalnych zjawisk transportu. Oprogramowanie mikrofluidyczne umożliwia wgląd w ukryty świat.Witajcie, jestem Dimitri Marker z Vanderbilt Institute for Integrative Biosystem Restoration Education na Vanderbilt University. A ja jestem David Schafer, inżynier ds. badań i rozwoju w Viro Laboratories. Cześć, jestem Leslie Sho z Departamentu Inżynierii Materiałów Chemicznych i Biomolekularnych w Center for Environmental Science and Engineering na University of Connecticut. A ja jestem added Dicot, również z Zebra.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia modułowych macierzy mikroprzepływowych siedlisk do podstawowych badań z zakresu nauk o środowisku i inżynierii. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu zbadania wpływu struktur w skali mikrometrów na interakcje transportowe mikroorganizmów w podłożach leśnych. Przejdźmy zatem do szczegółów.Pierwszym krokiem w tworzeniu urządzenia mikrofluidycznego jest sporządzenie dwuwymiarowego projektu urządzenia w programie do wspomaganego projektowania komputerowego (CAD). W tym przypadku wykorzystaliśmy program AutoCAD, lecz dostępne są również inne programy do rysowania, takie jak Clue In czy CorelDraw. Oprogramowanie to pozwala projektantowi na wierne odwzorowanie struktur fizycznych w skali makroskopowej, podczas gdy poszczególne elementy są definiowane z rozdzielczością mniejszą niż 5 µm.Na podstawie rysunku CAD tworzona jest maska fotograficzna. Używamy maski chromowej wyprodukowanej przez Advanced Reproductions Corporation z północnej części Massachusetts. Kolejne kilka etapów produkcji urządzenia mikroprzepływowego odbywa się w pomieszczeniu czystym w celu stworzenia formy matrycowej.Czysty wafle krzemowy jest powlekany fotorezystem w urządzeniu do nanoszenia warstw metodą wirowania (spin coder). Najpierw wafle mocuje się do platformy urządzenia, a na jego środek wlewa się kilka gramów fotorezystu SU 8 20 25. Następnie wafle poddaje się wstępnemu cyklowi rozprowadzania przez 15 sekund przy 500 RPM, a następnie cyklowi nakładania cienkiej warstwy przy 4 000 RPM przez 35 sekund.Po wirowaniu wafer zostaje umieszczony na płycie grzejnej na 10 minut w temperaturze 95 °C w celu odparowania nadmiaru rozpuszczalnika. Ostatnim etapem przygotowania wafera jest usunięcie krawędziowego wybrzuszenia. Odbywa się to poprzez ponowne umieszczenie wafera w urządzeniu do nanoszenia warstwy i aplikację stałego strumienia środka do usuwania krawędzi SUA na zewnętrzną krawędź powleczonego wafera.Kolejnym krokiem jest naświetlenie fotorezystu poprzez selektywną ekspozycję na światło UV. Najpierw powleczony wafela umieszcza się na płaskiej powierzchni, a bezpośrednio na nim kładzie maskę chromową. Czerwona folia maskująca Rubylith blokuje przenoszenie wzorów poza obszar docelowy.Następnie, za pomocą systemu pozycjonowania plamki, na pokryty wafelek przez maskę dostarcza się dawkę światła UV o wartości 300 mJ/cm². Na koniec wafelek jest wypalany przez 15 minut w temperaturze 95 °C, aby usieciować naświetlone obszary fotorezystu, czyniąc je nierozpuszczalnymi. Ostatnim etapem tworzenia matrycy jest usunięcie nieusieciowanych obszarów fotorezystu, co pozostawia wypukłe struktury reliefowe.W pierwszej kolejności wafer zostaje ponownie umieszczony w koderze rotacyjnym i pokryty roztworem wywoływacza. Wywoływacz pozostaje na pokrytym waferze przez około pięć minut, a następnie zostaje usunięty przez wirowanie, co skutkuje uzyskaniem wyraźnego wzoru na waferze. Wszelkie pozostałości są zmywane poprzez rozpylenie izopropanolu na wirujący wafer.W tym kroku stosujemy prędkość wirowania 2200 RPM przez około 5 do 10 sekund. Na koniec gotowa matryca jest suszona strumieniem azotowego gazu i przechowywana w naczyniu do czasu odlewania urządzenia. Wytwarzamy urządzenia mikroprzepływowe przy użyciu elastomeru silikonowego polidimetylosiloksanu.W pierwszej kolejności materiał bazowy i utwardzacz są dozowane do plastikowego kubka w stosunku wagowym 10:1. Następnie mieszanina zostaje wymieszana. Andy usunął pęcherzyki powietrza za pomocą mieszalnika kondycjonującego Thinky AR 100.Po zakończeniu cyklu ciekły PDMS jest równomiernie wylewany na matrycę. Naczynie zawierające matrycę i nieutwardzony PDMS jest następnie umieszczane w komorze próżniowej w celu odgazowania. Pęcherzyki polimeru pojawiają się niemal natychmiast.Odgazowywanie trwa do momentu całkowitego zniknięcia pęcherzyków powietrza. Naczynie umieszcza się w wypoziomowanym piekarniku w temperaturze 65 °C na co najmniej cztery godziny, aby umożliwić pełne sieciowanie polimeru. Następnie utwardzone PDMS ostrożnie zdejmuje się z wielorazowej matrycy.Najpierw cztery krawędzie są wycinane skalpelem daleko poza obszarem wzoru, a następnie urządzenie jest oddzielane od wzorowanego wafla za pomocą pęsety. W razie potrzeby krawędzie urządzenia można przyciąć nożyczkami. Można również oddzielić fragment urządzenia od reszty odlanej struktury z PDMS.Następnie w PDMS wykonuje się otwory dostępowe. Używamy do tego komercyjnie dostępnych wycinaków do biopsji o różnych rozmiarach, zamontowanych na niewielkim trzpieniu. Wycięte rdzenie PDMS usuwa się za pomocą pęsety.Na koniec przycięte i przebite urządzenie oczyszcza się za pomocą alkoholu izopropylowego i polipropylenowego patyczka z piankową końcówką. Urządzenie suszy się azotem, a następnie umieszcza w piecu w celu usunięcia wszelkich śladów rozpuszczalnika. Ostatnim etapem tworzenia urządzenia mikroprzepływowego jest połączenie PDMS z podłożem z szkiełka przedmiotowego, a następnie jego napełnienie cieczą.Urządzenie z PDMS oraz szkiełko przedmiotowe umieszcza się w oczyszczaczu plazmowym, kierując powierzchnie do połączenia do góry. W tym doświadczeniu wykorzystujemy oczyszczacz plazmowy PDC 32 G firmy Herrick. Po wytworzeniu próżni i pojawieniu się widocznej niebiesko-fioletowej plazmy, ustawia się timer na 30 sekund.Generator plazmy zostaje wyłączony. Komora zostaje ponownie poddana ciśnieniu, a urządzenie i suwak zostają wyjęte z komory, po czym powierzchnie wiążące zostają ze sobą zetknięte. Podczas wyjmowania aktywowanych komponentów z komory ważne jest, aby działać szybko, tak aby powierzchnie pozostały aktywne.Lekki nacisk pomaga zapewnić dobre wiązanie. Jakość wiązania sprawdza się, pociągając za róg za pomocą pęsety. Hydrofilowe wnętrze można następnie łatwo wypełnić roztworem wodnym, takim jak bufor lub woda dejonizowana.Wodny płyn wprowadza się do każdego otworu wlotowego i przez odpowiadającą mu mikroporowatą komorę przepływową. Po wypełnieniu wszystkich komór, na całe urządzenie nakłada się cienką warstwę utwardzonego PDMS, aby ograniczyć parowanie i zachować sterylność. W celu skalibrowania przepływu wymuszonego ciśnieniem w urządzeniu, należy wstępnie napełnić mikrostrukturalne komory przepływowe wodą dejonizowaną, a następnie umieścić na górze urządzenia moduł przepływowy, który pełni funkcję interfejsu doprowadzania płynu oraz sterylnej uszczelki.Ten moduł przepływowy może być używany samodzielnie lub podłączony do zewnętrznego zbiornika z cieczą, takiego jak plastikowa strzykawka. Podłącz zbiornik z cieczą, np. plastikową strzykawkę, lub moduł przepływowy do wlotu doprowadzającego (upstream). Należy utrzymywać poziom cieczy w zbiorniku powyżej poziomu wylotu (downstream).Różnica wysokości pomiędzy zbiornikiem dopływowym a każdym z dolnych otworów wylotowych definiuje siłę napędową przepływu wymuszonego ciśnieniem, co pozwala na określenie szybkości przepływu przez urządzenia. Do pobierania próbek z dolnych otworów w regularnych odstępach czasu używa się igły tępej o rozmiarze 25 G. Próbki pobieramy na przykład co 15–20 minut, starannie odnotowując rzeczywisty czas, który upłynął pomiędzy kolejnymi pobraniami.Wagę strzykawki rejestruje się przed i po pobraniu próbek za pomocą wagi analitycznej. Zależność objętości agregatu od czasu agregacji przedstawia się na wykresie, gdzie nachylenie linii odpowiada średniemu natężeniu przepływu masy. Duży przekrój poprzeczny zbiornika wlotowego w stosunku do studni wylotowych zapobiega znacznym zmianom natężenia przepływu podczas przemieszczania się cieczy przez urządzenia; nanosi się pobraną objętość na osi Y względem czasu pobierania próbek na osi X.W prostym programie graficznym, takim jak Excel, w celu wyznaczenia nachylenia linii, wartość nachylenia jest wykorzystywana do obliczenia średniego natężenia przepływu objętościowego. Do wizualizacji przepływu oraz badania oddziaływań powierzchniowych stosuje się rozcieńczony roztwór kulek lateksowych fluorescencyjnych o stężeniu 3 µM z powierzchniami karboksylowymi, YG oraz zwykłymi YG. W pierwszej kolejności przygotowuje się roztwór kulek w wodzie dejonizowanej o stężeniu 0,01% części stałych.Roztwór dodaje się do studni położonych powyżej, a następnie ponownie przytwierdza moduł przepływowy do zu. Przepływ kulek monitoruje się wizualnie przez godzinę, rejestrując obraz w odstępach około 10 minut za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu Zeiss AIOt 25, wyposażonego w monochromatyczną kamerę MITx BCEB 0 1 3 U. Poszczególne klatki są przechwytywane w szybkim następstwie, a następnie składane w filmy przy użyciu programu komputerowego, takiego jak Image J, z wykorzystaniem oświetlenia fluorescencyjnego i oświetlenia prześwieconego.Zarówno koraliki, jak i struktury są widoczne. Po zablokowaniu światła przechodzącego widoczne są jedynie jasne koraliki fluorescencyjne. Stacjonarne koraliki osadzone wzdłuż dolnej powierzchni lub przytwierdzone do kolektorów są widoczne w całym urządzeniu.Do eksperymentów z wykorzystaniem żywych bakterii, takich jak gatunki Vibrio, przygotowywana jest niepatogenna bakteria wykazująca ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego. Najpierw kulturę stokową wyjmuje się z głębokiego zamrażania. Kolbę ze sterylną pożywką wzrostową LB szczepi się kulturą stokową.Przy użyciu jednorazowej pętli szczepiącej kolbę inkubuje się przez noc z wytrząsaniem, aby uzyskać kulturę w fazie stacjonarnej o stężeniu około 10⁹ komórek na mililitr. W zależności od zastosowania początkowe stężenie bakterii można określić dokładniej. Następnie przygotowuje się urządzenie mikrofluidyczne wypełnione sterylnym buforem.Następnie sterylną ciecz w dołkach dopływowych wylewa się i zastępuje 20 µL kultury bakterii. Za pomocą pipety bakterie są wprowadzane do urządzenia poprzez delikatne zasysanie strzykawką w dołkach odpływowych. Po inkubacji ilość bakterii w dołkach można określić poprzez pomiar intensywności fluorescencji każdego dołka po kolonizacji. Dołek wlotowy dopływowy opróżnia się w ten sam sposób co wcześniej i zastępuje buforem z solami o stężeniu 25‰.Sztuczną wodę morską podaje się pod niewielkim ciśnieniem do otworów doprowadzających, używając strzykawki do przepłukiwania poszczególnych komór przepływowych 20 do 40 µL roztworu buforowego. Po wstępnym przepłukaniu objętość ta odpowiada około 100 do 200 krotności objętości porów mikrofluidycznej części glebowej komory przepływowej. Długotrwałą perfuzję bakterii przez media porowate realizuje się przy użyciu modułu przepływowego dokładnie w sposób przedstawiony wcześniej.Obrazy wzrostu i transportu bakterii w świetle fluorescencyjnym oraz białym mogą być mierzone w czasie. W tym eksperymencie obrazy są rejestrowane co 15 do 20 godzin przez okres siedmiu dni przy użyciu kolorowej chłodzonej kamery CCD z firmy Q imaging ink. Nasze urządzenia mogą być również wykorzystane do badania wpływu fizycznej struktury siedliska na zapewnienie bakteriom schronienia przed drapieżnictwem pierwotniaków.Przedstawiono bakterie w mikroporowatej komórce przepływowej, w której widoczne są znacznie większe rzęskowane pierwotniaki eulo żerujące na bakteriach. W analizie przepływu cieczy w urządzeniu mikrofluidycznym ustalono, że średnia prędkość przepływu wynosi 0,71 µL/min przy słupie ciśnienia 40 mm. Po zwiększeniu słupa ciśnienia do 60 mm prędkość przepływu wzrosła proporcjonalnie do 1,04 µL/min.Podczas stosowania kulek o różnych właściwościach chemicznych powierzchni w urządzeniu, zaobserwowano większe gromadzenie się kulek niekarboksylowanych na powierzchniach urządzenia. Kulki o średnicy od 6 do 10 milimetrów znacznie częściej ulegały uwięzieniu w mniejszych otworach porów. Szybsze prędkości przepływu, spowodowane większym ciśnieniem hydrostatycznym, prowadziły do zmniejszenia retencji i uwięzienia kulek, co było spodziewane przy analizie wzrostu bakterii w mikroprzepływowym urządzeniu eco chipp.Zauważamy jakościowe różnice w intensywności obrazu w różnych sektorach urządzenia. Intensywność fluorescencji może być ilościowo określona jako wskaźnik biomasy drobnoustrojów w kanale. W toczących się eksperymentach obserwujemy, że ciągłe siły ścinania w warunkach niskiego przepływu zdają się powodować agregację bakterii i tworzenie się kłaczków, co jest widoczne na tych obrazach. Przedstawiliśmy właśnie sposób tworzenia i wykorzystywania prostych urządzeń mikrofluidycznych do pomiaru skali cząsteczek, badania transportu koloidalnego przez media porowate lub badania interakcji drobnoustrojów w mikrostrukturalnych siedliskach.Podczas prowadzenia badań z wykorzystaniem cel przepływowych ważne jest uwzględnienie wyporności kulek oraz chemii powierzchni koloidów i kolektorów. Przy skalowaniu do reżimu mikrofluidycznego efekty powierzchniowe mogą dominować nad obserwowanymi zjawiskami. Praktycznie każdą strukturę fizyczną można włączyć do projektu mikrofluidycznej celi przepływowej.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

window-on-microworld-simple-microfluidic-systems-for-studying

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Okno na mikroświat: proste systemy mikroprzepływowe do badania transportu mikrobiologicznego w ośrodkach porowatych

Źródło: Scheidweiler, D. i in. Łączenie urządzeń płynowych z mikroskopią i cytometrią przepływową do badania transportu mikroorganizmów w ośrodkach porowatych na skalach przestrzennych. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do ilościowego określania ruchliwości bakterii poprzez porowatą matrycę złożoną z losowo ułożonych filarów. Do urządzenia wprowadzane są fluorescencyjnie znakowane bakterie, obrazowane mikroskopią podczas przemieszczania się przez...

Ocena ruchliwości bakteryjnej za pomocą urządzenia mikrofluidycznego

Źródło: Kurz, D. L. i in. Platforma mikrofluidyczna do badania biozatkania w porowatych ośrodkach. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do badania powstawania biofilmu. Do mikrokanału wprowadzana jest zawiesina bakteryjna, po której następuje inkubacja, umożliwiająca rozwój biofilmu. Następnie wznawia się przepływ, a monitorowanie ciśnienia wraz z obrazowaniem wykorzystuje się do wykrywania powstawania biofilmu i zatkania porów w czasie.

Urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania w czasie rzeczywistym i śledzenia ciśnienia podczas tworzenia biofilmu

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Mikroprzepływowy chip został stworzony do produkcji par złotych kropek do generowania pęcherzyków tandemowych i pokrytych fibronektyną wysp do tworzenia wzorów pojedynczych komórek w pobliżu. Wynikowe pole przepływu scharakteryzowano za pomocą prędkości obrazu cząstek i wykorzystano do badania różnych efektów biologicznych, w tym poracji błony komórkowej, deformacji błony i wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapnia.

System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

Celem tej procedury jest łatwe i szybkie wyprodukowanie urządzenia mikroprzepływowego z dostosowywalną geometrią i odpornością na pęcznienie przez płyny organiczne do badań nad odzyskiwaniem oleju. Najpierw generowana jest forma z polidimetylosiloksanu, a następnie wykorzystywana do odlewania urządzenia na bazie żywicy epoksydowej. Przedstawiono reprezentatywne badanie przemieszczenia.

Urządzenia mikroprzepływowe do charakteryzowania procesów zdarzeń w skali porów w ośrodkach porowatych do zastosowań związanych z odzyskiwaniem oleju

Krzywe przełomu (BTC) są skutecznymi narzędziami do badania transportu bakterii w porowatych mediach. Tutaj przedstawiamy narzędzia oparte na urządzeniach fluidycznych w połączeniu z mikroskopią i zliczaniem metodą cytometrii przepływowej w celu uzyskania BTC.

Połączenie urządzeń fluidycznych z mikroskopią i cytometrią przepływową w celu badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych w skalach przestrzennych

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Obecny protokół opisuje platformę mikroprzepływową do badania rozwoju biofilmu w porowatych ośrodkach quasi-2D poprzez połączenie obrazowania mikroskopowego o wysokiej rozdzielczości z jednoczesnymi pomiarami różnicy ciśnień. Platforma określa ilościowo wpływ wielkości porów i natężenia przepływu płynu w porowatych ośrodkach na biozatkanie.

Platforma mikroprzepływowa do badania biozatykania w pożywkach porowatych

Ten protokół opisuje rekonfigurowalną platformę hodowli komórkowych opartą na membranie, która integruje format otwartej studni z możliwościami przepływu płynów. Platforma ta jest kompatybilna ze standardowymi protokołami i umożliwia odwracalne przejścia między trybem hodowli w studni otwartej a mikroprzepływowym, dostosowując się do potrzeb zarówno laboratoriów inżynieryjnych, jak i biologicznych.

Przekształcanie statycznych modeli tkanek barierowych w dynamiczne systemy mikrofizjologiczne

Ten protokół przedstawia system mikrofluidyczny do badania mikrobiologiczne precipitacji minerałów tlenku manganu. Powstawanie biomineralu jest mierzone in situ za pomocą mikroskopii optycznej i analizy obrazu. To podejście może być dostosowane do badania precipitacji innych charakterystycznie zabarwionych biogenicznych minerałów w środowiskach porowatych.

Mikropłytka platforma do badania mikrobiologicznego wytrącania tlenków metali w mediach porowatych

Poznaj mikroprzepływowe systemy eco chip do badania transportu bakterii w ośrodkach porowatych. Ta metoda umożliwia wizualizację wzrostu mikroorganizmów i procesów transportowych w czasie rzeczywistym.

Okno na mikroświat: Proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

Przeglądaj więcej filmów