Analizy wielobarwnej cytometrii przepływowej komórkowej odpowiedzi immunologicznej u makaków rezusów

Ten film przedstawia procedurę stymulacji i barwienia komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub pbmc. W celu analizy wielokolorowej cytometrii przepływowej Aleca Wattsa z pbmc wyizolowanego z krwi pełnej umieszcza się na płytkach do hodowli tkankowych. Komórki są stymulowane chemicznie lub biologicznie do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej.

Po stymulacji dodaje się koktajl przeciwciał w celu identyfikacji typów komórek na podstawie wyrażonych markerów powierzchniowych. Komórki są następnie przenikane i dodaje się inny koktajl przeciwciał w celu wykrycia ekspresji cytokin wewnątrzkomórkowych, komórki są następnie analizowane na podstawie faktów w celu określenia profili cytokin dla określonych podzbiorów pbmc. Cześć, nazywam się Amy Courtney i pracuję w laboratorium dr Jagana SASA na Wydziale Immunologii w University of Texas MB Anderson Cancer Center.

Cześć, jestem Hong ona też z laboratorium. Dzisiaj pokażemy Ci analizę multicytometryczną odpowiedzi limfocytów T. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania komórkowych odpowiedzi immunologicznych w Reus Maca.

Więc zacznijmy. Rozpocznij ten protokół za pomocą hemocytometru w celu określenia żywotnej liczby komórek pbmc z Reuss Maca metodą wykluczenia Trian Blue Dye. Praca w okapie z przepływem laminarnym reus.

Zawiesić komórki w kompletnym podłożu o stężeniu 10 milionów komórek na mililitr w celu niespecyficznej stymulacji przy 100 mikrolitrach zawiesiny komórkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki zawierającej PMA i CIN, aby uzyskać całkowitą objętość do 0,2 mililitra przy końcowym stężeniu 50 nanogramów na mililitr PMA i 500 nanogramów na mililitr CIN dla studzienek kontroli ujemnej, dodaj do każdej po 100 mikrolitrów kompletnej pożywki. Dobrze inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonej atmosferze 5% dwutlenku węgla po 1,5 godziny.

Felden A do kultury w końcowym stężeniu 10 mikrogramów na mililitr i inkubować przez dodatkowe 4,5 godziny. Felden A jest dodawany do cytokiny wychwytującej w aparacie złota G w celu zwiększenia widoczności przy barwieniu immunologicznym, po wirowaniu stymulacyjnym w celu usunięcia pożywki, a następnie przepłukaniu przez dodanie 200 mikrolitrów płukania przepływem na zimno, buforu i wirówki przy niskiej prędkości. Powtórz to pranie, a następnie ponownie wyślij 50 mikrolitrów buforu do płukania.

Komórki są teraz gotowe do barwienia w celu ekspresji markerów powierzchniowych do każdego dołka ponownie zawieszonych komórek. Dodaj jeden mikrolitr żywego, martwego, utrwalalnego barwnika reaktywnego aqua fluorescencyjnego, przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta i S. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez 30 minut, podczas gdy komórki wysiadują.

Przygotuj roztwory barwiące, które zostaną użyte do faktów w mikroprobówkach. Najpierw przygotuj koktajl na stojąco, aby odpowiednio zawierał następujące elementy. Miareczkowane przeciwciała monoklonalne znakowane fluorescencyjnie, anty CD trzy PE SCI siedem, anty CD osiem Alexa 700 anty CD 28 na CCP SCI 5.5, anty CD 95 A PC i anty CD cztery Pacific Blue Inflow Wash Buffer.

Następnie przygotuj kontrole kompensacyjne, które zostaną wykorzystane do określenia współczynników rozlewania się każdego pojedynczego barwnika do innych detektorów poprzez przygotowanie probówki z każdym fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem indywidualnie jako pojedyncze barwienie barwne. Na koniec przygotuj barwniki fluorescencyjne minus one lub FMO, łącząc wszystkie odczynniki oprócz tego, który Cię interesuje. Zostanie to wykorzystane do wyznaczenia granicy między populacją dodatnią i ujemną poprzez powielenie poziomów autofluorescencji i danych obecnych w całkowicie wybarwionych próbkach.

Po inkubacji komórek w żywej martwej plamie, umyj je raz buforem do płukania na zimno, aby usunąć nadmiar barwnika, odessać bufor do mycia. Następnie dodaj przygotowane roztwory barwiące. Inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez 30 minut.

Przepłukać wybarwione komórki buforem do płukania na zimno, aby usunąć nadmiar przeciwciał. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu do przenikania utrwalającego BD przez co najmniej 10 minut. Przechowuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności do 24 godzin, aż zostaną zużyte lub kontynuuj znakowanie cytokin wewnątrzkomórkowych w celu znakowania cytokin wewnątrzkomórkowych.

Najpierw przebadaj komórki w 100 mikrolitrach jednego X perm. Przemyć bufor, inkubować przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, podczas inkubacji komórek. Przygotować przeciwciała barwiące, kontrole kompensacyjne i kontrole FMO w jednym buforze do płukania po trwałej ondulacji, jak poprzednio.

Po inkubacji komórek przez 10 minut, odwirować i usunąć jeden x bufor do trwałej ondulacji. Dodać odpowiednie przeciwciała barwiące. Następnie inkubować komórki i przeciwciała przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności po inkubacji.

Umyj komórki dwa razy roztworem do przenikania. Po ostatnim umyciu resus zawiesić komórki w 1% aldehydzie Paraform w DPBS, aby utrwalić komórki. Przechowuj ogniwa w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, aż będą używane przez okres do 24 godzin.

Po wybarwieniu komórek użyj cytometru dwuprzepływowego LSR lub cytometru przepływowego DP, aby wykonać fakty. Następnie przeanalizuj dane za pomocą FlowJo lub podobnego oprogramowania. Skład PBMC w reuss Maca określono za pomocą analizy faksowej.

Ten rysunek przedstawia schemat bramkowania wykorzystany do analizy różnych podzbiorów limfocytów T od reprezentatywnego zwierzęcia. Limfocyty najpierw bramkowano za pomocą FSC rozpraszania do przodu w porównaniu z SSC z rozproszeniem bocznym, a następnie zidentyfikowano żywe limfocyty na podstawie populacji SSC i AQUA ujemnej. Limfocyty T zostały następnie zidentyfikowane na podstawie ekspresji CD trzy, CD cztery dodatnie, CD osiem ujemne i CD cztery ujemne CD osiem dodatnich populacji w populacji CD trzy dodatnie komórki T zostały również określone.

Limfocyty T CD cztery dodatnie i CD 8 dodatnie zostały następnie podzielone na różne podzbiory na podstawie ekspresji CD 28 i CD 95 jako naiwne komórki pamięci centralnej i pamięci efektorowej. Rysunek ten pokazuje produkcję interferonu gamma i IL 2 w trybie niestymulowanym i pma. CIN stymulował CD cztery dodatnie limfocyty T i podzbiory.

Zwróć uwagę na wyraźne profile cytokin wywołane stymulacją. W każdym podzbiorze. Musimy pokazać, jak przeprowadzić analizę pbmc za pomocą cytometrii wieloprzepływowej.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o skonfigurowaniu zarówno kontrolek z pojedynczą kompensacją kolorów, jak i kontrolek fluorescencyjnych minus jeden. Obie te kontrole są niezbędne do prawidłowej analizy danych cytometrii przepływowej. Prosimy o zapoznanie się z naszym pisemnym protokołem, aby uzyskać więcej informacji na temat wyboru elementów sterujących kompensacją.

Należy również pamiętać, że w przypadku stosowania przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie ważne jest, aby zakryć próbki w celu ochrony przed ekspozycją na światło. Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.