Name: Analizy wielobarwnej cytometrii przepływowej komórkowej odpowiedzi immunologicznej u makaków rezusów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-22T17:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Poznaj metodę wielobarwnej cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi immunologicznej u makaków rezusów. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie podzbiorów komórek T CD4+ i CD8+ w kontekście badań nad szczepionką przeciwko HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Pramod Nehete i pani Bharti Nehete za próbki krwi i PBMC makaków; praca ta była częściowo finansowana ze środków z grantu NIH AI 46969, a wszystkie pożywki do hodowli komórkowych zostały przygotowane przez Central Media Laboratory, które jest finansowane z grantu NIH CA 16672.

Procedury szczegółowych analiz fenotypowych i funkcjonalnych całkowitej populacji oraz podzbiorów pamięci limfocytów T można podzielić na cztery części: 1) przygotowanie komórek i stymulację antygenową, 2) barwienie markerów powierzchniowych, 3) wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin oraz 4) analizy cytometryczne.
1. Przygotowanie komórek i stymulacja antygenowa
<ol>
	<li>W niniejszym protokole wykorzystano zarówno świeżo izolowane, jak i krio-konserwowane mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC). Komórki PBMC izolowano z heparynowanych lub cytrynianowych próbek krwi żylnej makaków rhesus poprzez sedymentację w gradiencie gęstości przy użyciu Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO). Alikwoty PBMC przechowywano w zamrożeniu w 90% FCS i 10% DMSO w ciekłym azocie.</li>
	<li>W przypadku użycia krio-konserwowanych PBMC, fiolki z zamrożonymi komórkami wyjmowano z ciekłego azotu i szybko rozmrażano w kąpieli wodnej o temperaturze 37 C, delikatnie mieszano, przemywano medium RPMI-1640 (HyClone laboratories, logan, UT) w celu usunięcia medium do zamrażania i resuspendowano w medium kompletnym [CM; RPMI-1640 uzupełnione o 10% inaktywowanego ciepłem FCS (HyClone laboratories), 2mM L-glutaminy (Sigma-Aldrich), 100U/ml penicyliny/streptomycyny (Invitrogen)], a następnie hodowano w 6-dołkowych płytkach do hodowli tkanek przez noc w temperaturze 37°C w humidyfikowanej atmosferze 5% CO2. Następnego ranka określono liczbę żywych komórek metodą wykluczania barwnika trypan-błękitu i resuspendowano je w CM.</li>
	<li>Komórki traktowano różnie w zależności od tego, czy przeprowadzano stymulację nieswoistą, czy swoistą antygenowo, przed kolejnymi analizami cytokin: (a) do stymulacji nieswoistej za pomocą 12-mirystylanu 13-octanu forbolu (PMA) i jonomycyny (I) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), alikwoty komórek w objętości 0,1ml (1,0 x 106 komórek/dołek) wysiano do poszczególnych dołków 96-dołkowych płytek do hodowli tkanek (BD Biosciences, Franklin lake, NJ). PMA i jonomycynę stosowano w końcowych stężeniach odpowiednio 50ng/ml i 500ng/ml. Końcowa objętość całkowita dla 96-dołkowej płytki do hodowli tkanek wynosiła 0,2ml/dołek: (b) do stymulacji swoistej antygenowo, 1,0 x 106 komórek w objętości 1,0 ml wysiano do poszczególnych dołków 24-dołkowych płytek do hodowli tkanek (BD Biosciences, Franklin lake, NJ), w których dołki zostały wcześniej potraktowane zgodnie z opisaną wcześniej modyfikacją9. W skrócie, 24-dołkowe płytki do hodowli tkanek powlekano przeciwciałami kozimi anty-mysimi IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD) w stężeniu 2,5 μg/ml/dołek w 50mM roztworze Tris (pH 8,6) przez noc w temperaturze 4°C. Następnego ranka płytki przemyto dwukrotnie sterylnym PBS i dodano kostymulujące mAb CD49d, klon 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA) w stężeniu 10 μg/ml/dołek, a następnie inkubowano przez jedną godzinę w 37°C. Po inkubacji płytki przemyto dwukrotnie sterylnym PBS w temperaturze pokojowej. Antygeny docelowe (w tym koktajl sześciu peptydów otoczki HIV8) dodano w końcowym stężeniu 10μg/ml dla każdego peptydu. Dodatkowe dołki z komórkami w samym CM przygotowano jako kontrolę negatywną. Końcowa objętość całkowita dla każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek wynosiła 1,0 ml.</li>
	<li>Komórki hodowano przez 6 godzin w temperaturze 37°C w humidyfikowanej atmosferze 5% CO2. Brefeldyna A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) została dodana do hodowli w stężeniu 10μg/ml przez ostatnie 4,5 godziny stymulacji. Następnie komórki przeniesiono do 5 ml probówek polipropylenowych i przemyto zimnym (4°C) buforem do płukania w cytometrii (PBS Dulbecco (DPBS, bez Ca2/Mg2; Life technologies, Rockville, MD) z 2% inaktywowanym ciepłem FCS), a następnie poddano barwieniu za pomocą różnych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie.</li>
</ol>
2. Immunofluorescencyjne barwienie markerów powierzchniowych
<ol>
	<li>Stymulowane komórki najpierw barwiono 1ul fluorescencyjnym barwnikiem reaktywnym live/dead fixable aqua w temperaturze 4°C w ciemności przez 30 minut, a następnie raz przemywano zimnym buforem do płukania w cytometrii przepływowej.</li>
<li>Następnie do komórek dodano odpowiednio miareczkowane przeciwciała monoklonalne znakowane fluorescencyjnie: anty-CD3 PE-Cy7 (SP34-2), anty-CD8 Alexa700 (RPA-T8), anty-CD28 PerCP-cy5.5 (L293), anty-CD95 APC (DX2) oraz anty-CD4 pacific blue (OKT4); wszystkie pochodziły od BD Biosciences (Franklin lake, NJ), z wyjątkiem anty-CD4 pacific blue (OKT4) od eBioscience (San Diego, CA). Komórki inkubowano przez 30 minut w temperaturze 4°C w ciemności.</li>
<li>W każdym eksperymencie wykorzystano zarówno kontrole kompensacji, jak i kontrole FMO (fluorescence minus one)10,11. Kontrole kompensacji służyły do wyznaczenia współczynników przenikania (spillover) każdego z poszczególnych barwników do innych detektorów. W przypadku kontroli kompensacji komplet probówek zawierających zawiesiny komórkowe od jednego małpy barwiono poszczególnymi mAb sprzężonymi z fluorochromem jako barwienia jednobarwne. FMO to wielobarwna kombinacja barwień, która zawiera wszystkie odczynniki z wyjątkiem badanego, i służy do wyznaczenia granicy między populacją pozytywną a negatywną poprzez odtworzenie poziomu autofluorescencji i danych obecnych w próbce w pełni zbarwionej.</li>
<li>Zbarwione komórki przemyto następnie zimnym buforem do płukania w cytometrii przepływowej i utrwalono w roztworze do utrwalania i permeabilizacji (BD Biosciences; San Jose, CA) przez co najmniej 10 minut (na tym etapie komórki można przechowywać przez noc w temperaturze 4°C w ciemności) przed przeprowadzeniem wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin.</li>
</ol>
3. Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin
<ol>
	<li>Utrwalone komórki przemyto buforem do płukania w cytometrii przepływowej, a następnie dodano bufor Perm/Wash (BD Biosciences; San Jose, CA) zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, komórki inkubowano w 0,1 ml 1X buforu Perm/Wash przez 10 minut w temperaturze 4°C w ciemności.</li>
	<li>Następnie komórki inkubowano z odpowiednio miareczkowanym przeciwciałem anty-IFN-γ (B27) znakowanym FITC oraz przeciwciałem anty-IL-2 (MQ1-17H12) znakowanym PE przez 60 minut w temperaturze 4°C w ciemności.</li>
	<li>Następnie komórki przemyto jeszcze dwukrotnie roztworem do permeabilizacji.</li>
<li>Po ostatnim płukaniu komórki zawieszono ponownie w 1% paraformaldehydzie w DPBS i poddano analizie cytometrycznej w ciągu 24 godzin.</li>
</ol>
4. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Barwione komórki analizowano za pomocą cytometru przepływowego LSR II (BD Biosciences; San Jose, CA) lub CyAn ADP (Dako, Carpinteria, CA). Dane FACS analizowano przy użyciu oprogramowania FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).</li>
	<li>Rysunek 1 przedstawia schemat bramkowania wykorzystany do analizy różnych subpopulacji limfocytów T u reprezentatywnego zwierzęcia. Limfocyty wyodrębniono najpierw za pomocą bramkowania rozproszenia przedniego (FSC) względem rozproszenia bocznego (SSC), a następnie zidentyfikowano żywe limfocyty na podstawie SSC i populacji aqua-ujemnej. Limfocyty T zidentyfikowano pozytywnie poprzez ekspresję CD3, a następnie wykryto populacje CD4+ CD8- (limfocyty T CD4+) oraz CD4- CD8+ (limfocyty T CD8+) w obrębie populacji limfocytów T CD3+. Limfocyty T CD4+ i CD8+ podzielono dalej na różne subpopulacje na podstawie ekspresji CD28 i CD95 jako komórki naiwne (Tn, CD28+ CD95-), pamięci centralnej (Tcm, CD28+ CD95+) i pamięci efektorowej (Tem, CD28- CD95+), zgodnie z opisami w literaturze5, 10.</li>
	<li>Rysunek 2 przedstawia sposób oceny wydolności funkcjonalnej różnych subpopulacji limfocytów T CD4+ i CD8+ pod kątem produkcji cytokin (INF-γ i/lub IL-2) w odpowiedzi na stymulację PMA i jonomycyną (PMA+I).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne dane FACS
Skład PBMC u makaków rhesus określono za pomocą analizy FACS. Rysunek 1 przedstawia schemat bramkowania wykorzystany do analizy różnych subpopulacji limfocytów T u reprezentatywnego zwierzęcia. Limfocyty wyodrębniono najpierw poprzez bramkowanie rozpraszania w przód (FSC) względem rozpraszania bocznego (SSC), a następnie zidentyfikowano żywe limfocyty na podstawie SSC oraz populacji aqua-negatywnej. Limfocyty T zidentyfikowano następnie na podstawie ekspresji CD3. W obrębie populacji limfocytów T CD3+ określono również populacje CD4+ CD8- (limfocyty T CD4+) oraz CD4- CD8+ (limfocyty T CD8+). Jak pokazano na Rysunku 2, limfocyty T CD4+ i CD8+ podzielono dalej na różne subpopulacje na podstawie ekspresji CD28 i CD95 na komórki naiwne (Tn, CD28+ CD95-), pamięci centralnej (Tcm, CD28+ CD95+) oraz pamięci efektorowej (Tem, CD28- CD95+). Rysunek 2A przedstawia produkcję INF- γ i IL-2 w niepobudzonych oraz pobudzonych PMA / jonomycyną limfocytach T CD4+ i ich subpopulacjach, a Rysunek 2B przedstawia produkcję INF- γ i IL-2 w niepobudzonych oraz pobudzonych PMA / jonomycyną limfocytach T CD8+ i ich subpopulacjach. Należy zwrócić uwagę na odmienne profile cytokin wywołane stymulacją w każdej z subpopulacji.
<img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig1tmb.jpg" alt="Schemat bramkowania cytometrii przepływowej CD3+, CD8+, CD4+; analiza limfocytów, komórek T, profilowanie immunologiczne." border="0" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Strategia bramkowania zastosowana w analizie cytometrycznej składu PBMC u makaków rezus. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.
<img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2atmb.jpg" alt="Wykres cytometrii przepływowej przedstawiający subpopulacje limfocytów T; analiza stymulacji PMA/ION z markerami IL-2 i IFN." border="0" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure 2a"> <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2btmb.jpg" alt="Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej; IL-2 vs IFN-γ; subpopulacje limfocytów T; stymulacja PMA/IONO vs kontrola." border="0" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure 2b"> Rysunek 2. (A) Profil produkcji cytokin dla całkowitej populacji limfocytów T CD4+ i ich subpopulacji. (B) Profil produkcji cytokin dla całkowitej populacji limfocytów T CD8+ i ich subpopulacji. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2a.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 2a, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2b.jpg">lub tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 2b.

<ol><li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li>
<li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+CD8%2B+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li>
<li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li>
<li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li>
<li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li>
<li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li>
<li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Primatol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li>
<li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4%2B+T+cell+responses+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li>
<li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 11-color <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13-parameter+flow+cytometry%3A+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype%2C+function%2C+and+T-cell+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li>
<li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Roztwory i bufory&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;pożywka RPMI-1640 (HyClone laboratories, Logan, UT)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;płodowa surowica bydlęca (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;L-glutamina (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;penicylina/streptomycyna (Invitrogen; Carlsbad, CA)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;odczynnik błękit trypanu (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;50 mM Tris, pH 8,6; przefiltrowany i przechowywany w 4 &amp;deg;C&lt;/li&gt; &lt;li&gt;bufor DPBS Dulbecco (DPBS, bez Ca2/Mg2; Life technologies, Rockville, MD)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;bufor do płukania w cytometrii: DPBS uzupełniony o 2% FBS, przechowywać w 4 &amp;deg;C&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Zestaw roztworów do utrwalania i permeabilizacji BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences; San Jose, CA)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Czynniki aktywujące&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;forbol 12-mirystynian 13-octan (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) &lt;/li&gt; &lt;li&gt;jonomycyna (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;kostymulujący przeciwciało monoklonalne mAb CD49d, klon 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA) &lt;/li&gt; &lt;li&gt;oczyszczone powinowactwem fragmenty (ab )2 przeciwciała przeciwko mysiej IgG (H + L) pochodzące od kozy (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;specyficzne czynniki aktywujące mogą obejmować pule peptydów, pojedyncze peptydy lub całe białka&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Inhibitory sekrecji cytokin&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;brefeldyna A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;alternatywnie można zastosować Golgi Plug (BD Biosciences; San Jose, CA)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Przeciwciała&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;zestaw fluorescencyjnego barwnika aqua do utrwalania żywych/martwych komórek (Invitrogen; Carlsbad, CA)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA) &lt;/li&gt; &lt;li&gt;CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

wielokolorowe analizy cytometryczne odpowiedzi immunologicznej komórkowej u makaków rezus

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Model z użyciem makaki rhesus jest obecnie najlepszym dostępnym modelem HIV/AIDS w kontekście zrozumienia patogenezy, a także opracowywania szczepionek i terapii1,2,3W niniejszej pracy opisujemy metodę szczegółowych analiz fenotypowych i funkcjonalnych odpowiedzi immunologicznych komórkowych, a konkretnie wewnątrzkomórkowej produkcji cytokin przez limfocyty T CD4+ i CD8+ oraz poszczególne subpopulacje komórek pamięci. Uzyskaliśmy precyzyjne pomiary ilościowe i jakościowe produkcji interferonu gamma (INF-γ) i interleukiny (IL)-2 w limfocytach T CD4+ i CD8+ z PBMC makaka rezusa stymulowanych PMA oraz jonomycyną (PMA+I). Profile cytokin różniły się w zależności od subpopulacji komórek pamięci. Co więcej, protokół ten zapewnił nam czułość pozwalającą na wykazanie nawet niewielkich frakcji antygenowo swoistych subpopulacji limfocytów T CD4+ i CD8+ w próbkach PBMC od makaków rezusów immunizowanych opracowaną w naszym laboratorium koktajlową szczepionką peptydową z białek otoczki HIV. Wielokolorowa cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem do precyzyjnej identyfikacji różnych populacji limfocytów T4,5ze zdolnością do produkcji cytokin6po stymulacji nieswoistej lub swoistej antygenowo5,7(empty)

Przedstawiamy użyteczność wielokolorowej cytometrii przepływowej w szczegółowej charakterystyce fenotypowej i funkcjonalnej całkowitych populacji, a także podzbiorów komórek pamięci limfocytów T CD4+ i CD8+ u makaków rhesus, które stanowią idealny model w badaniach nad szczepionkami przeciwko HIV/AIDS.

Wielokolorowe analizy cytometryczne odpowiedzi immunologicznej komórkowej u makaków rezus

Model z użyciem makaka rezus jest obecnie najlepszym dostępnym modelem HIV-AIDS pod kątem zrozumienia patogenezy, a także opracowania...

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę stymulacji i barwienia mononuklearnych komórek krwi obwodowej, czyli pbmc. W celu przeprowadzenia wielokolorowej analizy cytometrii przepływowej, Alec Watts wyjaśnia, że pbmc wyizolowane z pełnej krwi nanosi się na płytki do hodowli tkankowej. Komórki są stymulowane chemicznie lub biologicznie w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej.Po stymulacji dodaje się koktajl przeciwciał w celu identyfikacji typów komórek na podstawie ekspresji markerów powierzchniowych. Następnie komórki są poddawane permeabilizacji, a dodawany jest inny koktajl przeciwciał w celu wykrycia ekspresji cytokin wewnątrzkomórkowych; następnie komórki są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, aby określić profile cytokinowe dla konkretnych subpopulacji PBMC. Cześć, jestem Amy Courtney z laboratorium dr. Jagana SAS w Katedrze Immunologii w University of Texas MD Anderson Cancer Center.Cześć, jestem Hong, również z laboratorium. Dzisiaj zaprezentujemy analizę wielobarwną cytometrią przepływową w odpowiedziach limfocytów T. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania komórkowych odpowiedzi immunologicznych u makaków rezus.Zacznijmy. Rozpocznij ten protokół, używając komory licznikowej (hemocytometru) w celu oznaczenia liczby żywych komórek pbmc z Reuss Maca metodą wykluczania barwnika trypanu niebieskiego. Pracuj w laminarnym dygestorium reus.Zawieś komórki w pełnej pożywce w stężeniu 10 milionów komórek na mililitr do niespecyficznej stymulacji, dodając 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studni płytki 96-dołkowej do hodowli tkanek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki zawierającej PMA i CIN, aby uzyskać całkowitą objętość 0,2 mililitra, przy końcowym stężeniu 50 nanogramów na mililitr PMA i 500 nanogramów na mililitr CIN; do studni kontroli negatywnej dodaj 100 mikrolitrów samej pełnej pożywki do każdej z nich. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonej atmosferze z 5% carbon dioxide przez 1,5 godziny.Dodaj felden A do hodowli do końcowej stężenia 10 µg/mL i inkubuj przez dodatkowe 4,5 godziny. Felden A jest dodawany do trapp cytokines w aparacie gold G w celu zwiększenia widoczności podczas barwienia immunocytochemicznego; po stymulacji odwiruj próbki, aby usunąć medium, a następnie przemyj, dodając 200 µL zimnego buforu do płukania w cytometrii przepływowej i wirując przy niskiej prędkości. Powtórz to przemywanie, a następnie resuspenduj w 50 µL buforu do płukania w cytometrii przepływowej.Komórki są teraz gotowe do barwienia w celu oznaczenia ekspresji markerów powierzchniowych w każdej studni z zawiesiną komórek. Dodaj 1 µL barwnika fluorescencyjnego Live Dead Fixable Aqua, przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubuj w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut podczas inkubacji komórek.Przygotuj w mikroprobówkach roztwory barwiące, które zostaną wykorzystane do barwienia. Najpierw przygotuj koktajl barwiący, zawierający odpowiednio następujące składniki: miareczkowane przeciwciała monoklonalne znakowane fluorescencyjnie, anty-CD3 PE SCI 7, anty-CD8 Alexa 700, anty-CD28 per CCP SCI 5.5, anty-CD95 APC oraz anty-CD4 Pacific Blue w buforze do płukania Inflow Wash Buffer.Następnie należy przygotować kontrole kompensacji, które posłużą do wyznaczenia współczynników przenikania sygnału każdego poszczególnego barwnika do pozostałych detektorów; w tym celu przygotowuje się osobne probówki z każdym przeciwciałem koniugowanym z fluorochromem jako pojedynczym barwieniem. Na koniec należy przygotować barwienia typu fluorescence minus one (FMO), łącząc wszystkie odczynniki z wyjątkiem tego, który jest przedmiotem analizy. Posłuży to do wyznaczenia granicy między populacją pozytywną a negatywną poprzez powtórzenie pomiarów poziomu autofluorescencji oraz danych obecnych w próbkach w pełni barwionych.Po inkubacji komórek z barwnikiem żywe/martwe, przemyj je raz zimnym buforem do płukania w cytometrii przepływowej, aby usunąć nadmiar barwnika, a następnie odessaj bufor. Następnie dodaj przygotowane roztwory barwiące. Inkubuj komórki w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut.Przemyj barwione komórki zimnym buforem do płukania w cytometrii przepływowej, aby usunąć nadmiar przeciwciał. Następnie dodaj 100 µL roztworu do fixacji i permeabilizacji BD na co najmniej 10 minut. Przechowuj komórki w temperaturze 4 °C w ciemności do 24 godzin aż do momentu ich użycia lub przejdź do znakowania cytokin wewnątrzkomórkowych w celu ich identyfikacji.Najpierw poddaj komórki permeabilizacji w 100 µL buforu do przemywania 1x perm. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze 4 °C w ciemności podczas inkubacji komórek. Przygotuj przeciwciała do barwienia, kontrole kompensacji oraz kontrole FMO w buforze do przemywania 1x perm, analogicznie jak poprzednio.Po inkubacji komórek przez 10 minut, odwiruj je i usuń bufor do płukania 1x perm. Dodaj odpowiednie przeciwciała barwiące. Następnie inkubuj komórki z przeciwciałami przez 60 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.Przemyj komórki dwukrotnie roztworem do permeabilizacji. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w 1% Paraformaldehydzie w DPBS w celu ich utrwalenia. Przechowuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności do momentu użycia, nie dłużej niż przez 24 godziny.Po zabarwieniu komórek należy użyć cytometru przepływowego LSR II lub CytoDP do przeprowadzenia analizy FACS. Następnie dane analizuje się za pomocą oprogramowania FlowJo lub podobnego. Skład PBMC w reus Maca określono za pomocą analizy FACS.Na tym rysunku przedstawiono schemat bramkowania wykorzystany do analizy różnych subpopulacji limfocytów T u reprezentatywnego zwierzęcia. Limfocyty wyodrębniono najpierw za pomocą bramkowania rozpraszania w przód FSC względem rozpraszania bocznego SSC, a następnie zidentyfikowano żywe limfocyty na podstawie populacji SSC i AQUA-ujemnej. Następnie zidentyfikowano limfocyty T poprzez ekspresję CD3; w obrębie populacji limfocytów T CD3-dodatnich określono również populacje CD4-dodatnie/CD8-ujemne oraz CD4-ujemne/CD8-dodatnie.Komórki T CD4+ i CD8+ zostały następnie podzielone na różne subpopulacje na podstawie ekspresji CD28 i CD95, wyróżniając komórki naiwne, pamięci centralnej oraz pamięci efektorowej. Na tej rycinie przedstawiono produkcję interferonu gamma oraz IL-2 w niepobudzonych oraz pobudzonych PMA i ionomycyną (CIN) komórkach T CD4+ oraz ich subpopulacjach.Zwróć uwagę na odrębne profile cytokin wywołane stymulacją w każdej podgrupie. Pokażemy Państwu, jak przeprowadzić wieloparametryczną analizę cytometryczną PBMC.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przygotować zarówno kontrole kompensacji jednobarwnej, jak i kontrole FMO (fluorescent minus one). Obie te kontrole są niezbędne do prawidłowej analizy danych z cytometrii przepływowej. Więcej informacji na temat wyboru kontroli kompensacji znajduje się w naszym protokole pisemnym.Należy również pamiętać, że podczas stosowania przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie ważne jest zasłonięcie próbek, aby chronić je przed ekspozycją na światło. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

multicolor-flow-cytometry-analyses-cellular-immune-response-rhesus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Analizy wielobarwnej cytometrii przepływowej komórkowej odpowiedzi immunologicznej u makaków rezusów

Ten film demonstruje technikę opartą na cytometrii przepływowej wykorzystującą dwa fluorochromy do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po inkubacji komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko markerom powierzchniowym, podzbiory komórek są identyfikowane przy użyciu optymalnej strategii bramkowania cytometrycznego przepływu.

Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Przedstawiono generowanie ortotopowego szczurzego modelu międzybłoniaka opłucnej przez wszczepienie komórek międzybłoniaka II-45 do jamy opłucnej szczurów o usposobieniu immunologicznym. Opisano również metodę cytometrii przepływowej do analizy siedmiu podzbiorów komórek odpornościowych u tych zwierząt z próbki krwi o objętości 25 μl.

Implantacja ortotopowa i monitorowanie obwodowych komórek odpornościowych w modelu międzybłoniaka syngenicznego szczura II-45

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do liczenia i charakteryzowania limfocytów T CD8+ makaków rezusów przeciwko wirusowi AIDS. Ten artykuł jest przydatny nie tylko w dziedzinie immunologii HIV, ale także w innych obszarach badań biomedycznych, w których wiadomo, że odpowiedzi limfocytów T CD8 + wpływają na wynik choroby.

Analiza limfocytów T CD8 + specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności u makaków rezusów za pomocą barwienia tetramerem peptydowo-MHC-I

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Tutaj opisany jest protokół izolacji i charakterystyki podzbiorów limfocytów T CD4+ z ludzkiej krwi obwodowej. Oczyszczone limfocyty T CD4 + są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia proporcji podzbiorów komórek pomocniczych mieszków T.

Izolacja limfocytów T CD4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu tylko dwóch fluorochromów zamiast siedmiu. Dzięki takiemu podejściu na większości cytometrów przepływowych można zarejestrować pięć dodatkowych markerów.

Dyskryminacja siedmiu podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą dwufluorochromowej cytometrii przepływowej

To badanie demonstruje użycie cytometrii przepływowej do wykrywania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) wynikającej z aktywacji FcγR. Metoda ta może być stosowana do oceny zmian w funkcji sygnalizacji przeciwdrobnoustrojowej i redoks fagocytów w odpowiedzi na kompleksy immunologiczne, opsonizowane mikroorganizmy lub bezpośrednie sieciowanie FcγR.

Pomiar cytometryczny przepływu produkcji ROS w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie FcγR

Tutaj opisujemy szczegółowy i powtarzalny protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji podzbiorów monocytów/makrofagów i limfocytów T za pomocą testów barwienia zarówno zewnątrzkomórkowego, jak i wewnątrzkomórkowego w obrębie śledziony myszy, szpiku kostnego, węzłów chłonnych i tkanki maziowej, wykorzystując sprawdzony model chirurgiczny mysiego zapalenia stawów.

Analiza cytometrii przepływowej podzbiorów komórek odpornościowych w mysiej śledzionie, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i tkance maziowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Napływ wapnia, miara sygnalizacji limfocytów T, jest skutecznym sposobem analizy reakcji na stymulację receptorów limfocytów T. Ten protokół multipleksowania Indo-1 z panelami przeciwciał skierowanymi na cząsteczki powierzchniowe komórki wykorzystuje wysoce elastyczne możliwości cytometrii przepływowej w pełnym spektrum.

Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum

Poznaj metodę wielobarwnej cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi immunologicznej u makaków rezusów. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie podzbiorów komórek T CD4+ i CD8+ w kontekście badań nad szczepionką przeciwko HIV.

Wielokolorowe analizy cytometryczne odpowiedzi immunologicznej komórkowej u makaków rezus

Przeglądaj więcej filmów