Znaczenie prawidłowego stężenia białka dla kinetyki i określenia powinowactwa w analizie strukturalno-funkcjonalnej

Ogólnym celem tego artykułu wideo jest udzielenie odpowiedzi na następujące dwa pytania. Po pierwsze, czy badania interakcji białek mogą być prowadzone bardziej wiarygodnie, mierząc frakcję próbki białka, która jest faktycznie zdolna do wiązania się z innym białkiem? Po drugie, w jaki sposób analiza kinetyczna może dać nam lepsze zrozumienie relacji między strukturami i funkcjami?

Oba te pytania zostaną rozwiązane w eksperymencie z udziałem Corp X 100, instrumentu, który wykrywa interakcje białek w czasie rzeczywistym bez użycia etykiet. W tym eksperymencie zbadane zostanie oddziaływanie bydlęcej cystatyny B z papainą proteazy cystyny, struktura krystaliczna dwóch białek w kompleksie wskazuje na kilka reszt zaangażowanych w wiązanie z proteazą, aby określić, w jaki sposób każda z oddziałujących reszt wpływa na interakcję cystatyny B papiny. Kilka wariantów cystatyny B jest wytwarzanych w procesie mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.

W takich eksperymentach zawsze istnieje możliwość, że rekombinowane białka nie będą się prawidłowo fałdować, agregować lub pogarszać, co prowadzi do nieprawidłowych i nieodtwarzalnych wyników. VIACORE X 100 posiada zdolność oznaczania frakcji białka, która jest dostępna do wiązania poprzez analizę stężeń wolnych od kalibracji, w skrócie CFCA. Takie podejście pozwala na określenie stężenia białka z zachowaną aktywnością wiązania nawet wtedy, gdy wzorce kalibracyjne nie są dostępne.

CFCA zostanie tutaj wykorzystana do określenia stężenia wariantów cystatyny B. Dane te zostaną następnie wykorzystane jako dane wejściowe do określenia kinetyki wiązania wariantów cystatyny B z Pepin, która jest również oceniana przy użyciu BOR X 100. Cześć, jestem CLA gram z GE Healthcare w Szwecji.

Dzisiaj moja koleżanka Eva Pool pokaże Ci, jak przeprowadzić analizę zależności funkcji struktury za pomocą BOR X 100 Rekombinowane białka mogą z czasem wykazywać nieprawidłowe fałdowanie lub luźną aktywność pojemnika, a zachowanie to nie może być wykryte metodami, które opierają się na pomiarze całkowitego stężenia. Może to w efekcie prowadzić do nieprawidłowych danych kinetycznych po pomiarach stężenia za pomocą analizy stężeń bez kalibracji. B.A rdzeń X 100 służy do analizy kinetyki i powinowactwa oddziaływania wariantów cystatyny B z pepanem.

Parametry te dadzą wgląd w mechanizm wiązania. Zaczynamy od krótkiego wyjaśnienia projektu eksperymentalnego, więc zacznijmy. Interakcja między cystyną, proteazą, papiną i inhibitorem cystatyną B jest zdominowana przez kontakty hydrofobowe, co ujawnia struktura krystaliczna dwóch białek w kompleksie.

Po stronie inhibitora obszarami styku są końcówki N i C Ns oraz dwie pętle spinki do włosów. W tym badaniu badane są cztery mutanty, z których każdy zawiera cysteinę trzy do mutacji syryjskiej wprowadzonej w celu zapobieżenia dimeryzacji cystatyny B. W oparciu o kontekst ujawniony w strukturze krystalicznej, leucyna 73 została zmutowana do glicyny, histamina 75 do glicyny, a tyrozyna 97 została zmieniona na alaninę. Dwie mutacje glicyny wprowadzono w celu zbadania znaczenia łańcuchów bocznych histydyny 75 i leucyny 73 dla wiązania z Pepin, reszta tyrozyny została zmutowana do alaniny w celu zbadania interakcji między końcem C cystatyny B i Pepin.

Trzy podwójne mutanty, a także INE od trzech do syryjskiego pojedynczego mutanta są testowane pod kątem ich interakcji z katalizowanym wariantem papainy S metylopopiny. Ta katalitycznie nieaktywna forma Proteusa ma grupę metylową przyłączoną do CYS 25 w aktywnej szczelinie. Dla uproszczenia będziemy nazywać ten wariant propanem w całym protokole.

CFCA opiera się na pomiarze szybkości wiązania w warunkach, w których szybkość jest ograniczona przez dyfuzję cząsteczek analitu na powierzchnię. Sprzyja temu wysoki poziom unieruchomienia liganda. Przed rozpoczęciem procedury unieruchomienia należy umieścić bufor HEPs używany w eksperymentach na lewej tacy i włożyć oba rurki.

Umieść również pustą butelkę na odpady na prawej tacy. Następnie włóż nowy czujnik gipsowy pięć do urządzenia, zainicjuj za pomocą oprogramowania Core X 100, a na ekranie startowym kliknij element narzędzia do chipa dokującego. Kliknij start doc w oprogramowaniu.

Następnie użyj kreatora unieruchomienia, aby ustawić pape i unieruchomienie, celując w sprzężenie z cenzurą CM pięć z ekranu startowego, kliknij przycisk innych opcji, a następnie wybierz czarodziejów. Spowoduje to wyświetlenie okna z dostępnymi kreatorami. Wybierz unieruchomienie, a następnie kliknij nowy przycisk W prawym dolnym rogu pojawi się pierwszy ekran kreatora unieruchomienia, którego domyślnym ustawieniem jest połączenie z czujnikiem gips piąty.

Zaznacz pole pod drugą komórką przepływu, aby unieruchomić w drugiej komorze przepływowej. Pierwsza komórka przepływowa pozostaje niezmodyfikowana w celu użycia jej jako powierzchni odniesienia spośród trzech dostępnych poniżej opcji. Zaznacz pole Określ czas kontaktu po prawej stronie poziom docelowy zmienia się na czas kontaktu, określ czas kontaktu 900 sekund.

Następnie wprowadź parametry unieruchomienia pod roztworem liganda do wychwytywania cząsteczek ukośnych. Do akcji wkracza papaina. Następnie kliknij przycisk Dalej.

Na następnym ekranie zostanie wyświetlony układ stojaka na próbki. Pozycja pierwsza będzie trzymać et etanoloamina używana do dezaktywacji pozostałych aktywnych po celowaniu sprzężenia liganda papainy z powierzchnią chipa. Umieścić roztwór etanoloaminy w pozycji pierwszej w pozycji drugiej.

Umieść ligand papaina papaina jest przechowywana w nadmiarze siarczanu metylu i odnosi się do 50 mikrogramów na mililitr w 10-milimolowym buforze octanu sodu. pH 4,5 rozpuść odczynniki sprzęgające EDC i NHS z zestawu sprzęgającego aminy za pomocą pipety do wody podwójnie destylowanej 85 mikrolitrów EDC do fiolki. Zakryj go i umieść w pozycji trzeciej.

Użyj tej samej objętości dla NHS na pozycji czwartej. Zauważ, że plik piąty powinien być zamknięty i pusty, aby instrument mógł mieszać ED, C i NHS w tym pliku. Należy również pamiętać o napełnieniu pilnika myjącego w pozycji H2O świeżą wodą dejonizowaną.

Gdy stojak zostanie napełniony zgodnie z konturem na ekranie, kliknij załaduj próbki i załaduj stojak do urządzenia. Po załadowaniu stojaka kliknij przycisk Dalej. Przed rozpoczęciem przebiegu wyświetlana jest lista kontrolna.

Upewnij się, że wszystkie punkty są spełnione, gdy są. Bieg rozpoczyna się poprzez naciśnięcie przycisku start. Bieg rozpoczyna się w trakcie zabiegu unieruchomienia.

Dane zbierane są w czasie rzeczywistym. Najpierw wtryskiwane są odczynniki sprzęgające. Następnie pape jest sprzężany z powierzchnią chipa, a procedura kończy się dezaktywacją pozostałych aktywnych estrów.

Po uruchomieniu zostanie wyświetlone okno dialogowe z podsumowaniem wyniku przebiegu. W tym oknie wyświetlany jest poziom unieruchomienia. Cała procedura sprzęgania powinna zakończyć się unieruchomieniem papainy około 3000 RU.

Po unieruchomieniu papainy na chipie czujnika rozpocznij analizę CFCA od rozcieńczenia próbek zmutowanego cystatyny B do całkowitego stężenia około 10 nanomolów w co najmniej 300 mikrolitrach. Zapisz współczynnik rozcieńczenia, ponieważ użyjemy go później w konfiguracji testu. Rozpocznij od wyświetlenia okna dialogowego kreatora zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji w sekcji dotyczącej stężenia w folderze testu.

Wybierz opcję kalibracji bez kalibracji, a następnie wybierz opcję nowa. Pierwszy ekran kreatora pokazuje sekwencję wstrzykiwania. Ustawienia mogą pozostać niezmienione, ponieważ zastosowano tutaj chip czujnika CM five i metodę bezpośredniego testu unieruchomienia.

Kliknij przycisk Dalej na następnym ekranie. Pozostaw zaznaczone pola wyboru prime przed uruchomieniem i uruchom cykle uruchamiania. Pozostaw również domyślną liczbę cykli uruchamiania bez zmian na poziomie trzech.

Wprowadź bufor stert w nazwie pola rozwiązania. Następnie kliknij przycisk Dalej. Na następnym ekranie wprowadź nazwę roztworu regeneracyjnego, którym jest 20 milimolowy wodorotlenek sodu.

Pozostałe parametry pozostaw bez zmian. Kliknij przycisk Dalej, aby wyświetlić przykładową tabelę. Skonfiguruj próbki zgodnie z tabelą próbek.

Każdy wiersz w tabeli próbek jest wynikiem w dwóch cyklach. Jeden o natężeniu przepływu 10 mikrolitrów na minutę i jeden o natężeniu 100 mikrolitrów na minutę. Rozpocznij bieg od pustego miejsca.

Następnie wprowadź nazwę współczynnika rozcieńczenia, współczynnika dyfuzji przy 20 stopniach Celsjusza i masie cząsteczkowej. Dla każdego mutanta współczynnik dyfuzji można obliczyć za pomocą narzędzia internetowego na stronie produktu. Link do tego narzędzia znajduje się w nawigatorze pomocy technicznej oprogramowania.

Ponieważ zaleca się uruchomienie każdej próbki i zduplikowanie, skopiuj całą tabelę od pustego wiersza do ostatniej próbki i wklej ją u dołu tabeli. Kliknij dalej, aby kontynuować. Na następnym ekranie zostanie wyświetlony stojak na próbki.

Umieść próbki i odczynniki w stojaku zgodnie z układem nakreślonym przez oprogramowanie. Załaduj stojak do instrumentu, naciskając przycisk ładowania próbek. Następnie kliknij przycisk Dalej.

Po załadowaniu próbek wyświetlany jest ekran przypomnienia z listą kontrolną. Upewnij się, że wszystko sprawdziłeś, a następnie naciśnij start. Dane są zbierane w czasie rzeczywistym podczas biegu.

Po zakończeniu przebiegu zamknij okno wyświetlające zebrane dane. Zauważ, że w oknie głównym pojawił się nowy element wyniku. W celu obliczenia stężeń na podstawie danych, wybierz nową pozycję wynikową i kliknij przycisk.

Oceń za pomocą rdzenia X 100. Uruchamiane jest oprogramowanie ewaluacyjne, które wyświetla wszystkie zebrane dane z paska narzędzi, wybiera analizę stężenia, a następnie kalibruje bez użycia menu. W pierwszym oknie wybierz dane, które mają zostać uwzględnione w analizie.

Przewiń listę i przejdź przez listę widoków, aby wyświetlić dane dla wszystkich próbek. Jeśli chcesz wykluczyć dowolne dane, usuń znacznik wyboru z listy. Kliknij przycisk Dalej, aby rozpocząć obliczenia.

Model interakcji CFCA jest automatycznie dopasowywany do danych eksperymentalnych po zakończeniu dopasowania, a wyniki są podawane dla każdej próbki w oknie wyników. Przejdź przez łączniki dla każdej próbki, wybierając odpowiedni wiersz w tabeli. Kolumna o nazwie zmierzone stężenie pokazuje stężenie w próbce, która była analizowana.

Stężenie w oryginalnej próbce jest obliczane przy użyciu współczynnika rozcieńczenia wprowadzonego wcześniej i pokazanego w kolumnie obliczone stężenie Po zakończeniu kliknij przycisk Zakończ, aby zapisać wynik. Teraz, gdy znamy już stężenia białek z analizy CFCA, mamy doskonałą podstawę do naszych późniejszych pomiarów kinetycznych. Analiza kinetyczna pomoże nam teraz zrozumieć znaczenie reszt aminokwasowych kluczowych dla mechanizmu wiązania.

Zacznijmy od konfiguracji analizy kinetycznej. Analiza kinetyczna rozpoczyna się od zadokowania nowego chipa czujnika CM five do przyrządu na ekranie startowym. Wybierz, aby utworzyć proces testowania powinowactwa kinetyki.

W lewym górnym rogu pojawi się okno dialogowe, w którym wprowadzane są informacje o ligandzie. Wpisz nazwę papaina w polu nazwy liganda i wybierz inne białko z listy typów gatunków. Następnie wybierz unieruchomić ligand kowalencyjnie za pomocą chipa czujnika CM pięć z dwóch przedstawionych alternatywnych podejść do przyłączania ligandów, zalecany przebieg testu jest teraz przedstawiony po prawej stronie okna.

Rozpoczyna się od etapu unieruchomienia, po którym następuje etap testu. Naciśnij kontynuuj, aby kontynuować. Zapisz przepływ pracy testu zgodnie z żądaniem, wprowadzając nazwę i naciskając przycisk Zapisz.

Oprogramowanie przedstawia teraz przebieg pracy testu za pomocą przycisków powiązanych z każdym krokiem. Pierwszym krokiem w ramach przygotowania powierzchni czujnika jest znalezienie mobilizacyjnego pH. Ponieważ to pH jest znane, naciśnij wprowadź znaną wartość w wyświetlonym oknie dialogowym.

Wprowadź nazwę buforu, octan i pH 4,5, a następnie wybierz opcję zapisz. Przepływ pracy testu jest teraz aktualizowany za pomocą zielonego znacznika wyboru, aby wskazać, że ten krok został ukończony. Teraz nadszedł czas, aby unieruchomić, nacisnąć przycisk uruchamiania w unieruchomionym kroku.

Spowoduje to wyświetlenie tego samego kreatora, który został użyty do propanu i unieruchomienia do analizy CFCA: unieruchomienie papiny do analizy kinetycznej jest tutaj ustawione w ten sam sposób, z wyjątkiem tego, że bardziej rozcieńczony roztwór jest wstrzykiwany na krótszy czas. Ma to na celu unieruchomienie mniejszej ilości papiny, aby uniknąć sytuacji, w których szybkość wiązania cystatyny jest ograniczona przez dyfuzję, tak aby dane kinetyczne można było mierzyć w izolacji. Ponieważ nazwa liganda i pH immobilizacji zostały wprowadzone w poprzednich krokach w procesie testu, są one tutaj wstępnie ustawione.

Jedyna wymagana aktualizacja to 50 sekund dla czasu kontaktu. Unieruchomienie przebiega następnie w sposób pokazany wcześniej. Przewidywany poziom wiązania po unieruchomieniu wynosi 50 R ru.

Zielony znacznik wyboru obok przycisku uruchamiania oznacza, że unieruchomienie zostało zakończone. Następnie wprowadź rozwiązanie do regeneracji w przepływie pracy w kroku. Znajdź warunki regeneracji, klikając przycisk Wprowadź znane wartości w wyświetlonym oknie dialogowym.

Wprowadź roztwór regeneracyjny i czas kontaktu. Następnie kliknij Zapisz. Teraz, gdy ligand jest unieruchomiony i wprowadzone są warunki regeneracji, wszystko jest ustawione na generowanie danych kinetyki w polu testu powinowactwa kinetyki przebiegu, naciśnij przycisk uruchamiania w pierwszym kroku kinetyki.

Kreator powinowactwa przedstawia sekwencję wtrysku każdego cyklu dla kinetyki pojedynczego cyklu, która jest tutaj używana, nie ma potrzeby niczego zmieniać. Kliknij dalej, aby kontynuować. W następnym kroku zachowaj ustawienia domyślne wskazujące na zalanie systemu przed uruchomieniem.

Wybierz jeden cykl startowy, aby zrównoważyć powierzchnię chipa. Następnie należy zdefiniować parametry wtrysku dla próbki. Ponieważ rozwiązanie regeneracyjne zostało określone wcześniej, a ustawienie jest wstępnie zdefiniowane, nie ma potrzeby zmiany żadnego z parametrów na ekranie.

Kliknij Dalej. Na koniec określ próbki. Wprowadź dwa wiersze dla każdego wariantu mutacji, jeden pusty, a drugi z próbką.

Cykl ślepej próby jest wskazywany przez ustawienie najwyższego parametru stężenia na zero. Dwa. Warianty cystatyny B mogą być dopasowane do każdego biegu. Dla każdego mutanta wprowadź masę cząsteczkową, najwyższe stężenie i współczynnik rozcieńczenia, naciśnij Dalej.

Na poniższym ekranie przedstawiono stojak na próbki. Przygotować serię rozcieńczeń próbek białka i umieścić fiolki z nakrętkami w stojaku Jak pokazano na ekranie, fiolkę z buforem umieszcza się w pozycji 13, a fiolkę z roztworem regeneracyjnym umieszcza się w pozycji 14. Upewnij się, że napełniłeś pozycję wody świeżą wodą.

Umieść stojak w maszynie i załaduj próbki, naciskając przycisk ładowania próbek i kliknij Dalej. Tak jak poprzednio, przed przystąpieniem do uruchamiania eksperymentu wykonaj ostateczną kontrolę, naciskając przycisk start, dane interakcji pojawiają się w czasie rzeczywistym. Po zakończeniu biegu natychmiast przystąp do uruchamiania pozostałych wariantów cystatyny B zgodnie z tym, jak właśnie pokazano.

Jeśli pozostałe warianty cystatyny B są uruchamiane kolejno, pomiń pierwszy krok i cykl uruchamiania, odznaczając odpowiednie pola wyboru w kroku. Po zakończeniu każdego uruchomienia dostęp do danych można uzyskać za pomocą linku. Wszystkie wyniki w procesie testowania.

Pojawi się okno dialogowe ze wszystkimi wynikami wygenerowanymi w ramach tego przepływu pracy. Aby obliczyć stałe szybkości kinetycznej, wybierz wynik do oceny i naciśnij przycisk Oceń, aby ponownie uruchomić oprogramowanie oceniające rdzeń X 100, wyświetlając wszystkie dane zbiorcze. Wybierz powinowactwo kinetyki z menu paska narzędzi.

Na pierwszym ekranie do oceny wybiera się cysteinę od trzech do syryjskiego mutanta. Dane z tego mutanta są wyświetlane razem z pustym przebiegiem wykonanym dla tego mutanta, kontynuuj przez kliknięcie. Następny. Na następnym ekranie są wyświetlane dane z pustym przebiegiem odjętym od przebiegu z próbką.

Wybierz, aby ocenić kinetykę, klikając przycisk kinetyki. Teraz wybierz, czy chcesz dopasować dane do modelu interakcji jeden-do-jednego. Kliknięcie przycisku dopasowania powoduje, że dopasowanie jest wyświetlane na ekranie w takiej postaci, w jakiej jest obliczane.

Gdy jest gotowy, kontrole jakości są automatycznie stosowane i podświetlane na dole. Przejrzyj elementy kontroli jakości, a następnie spójrz na dane gramów czujnika, aby upewnić się, że gramy czujnika wykazują wystarczającą krzywiznę. Spójrz również na wykres resztkowy pokazujący różnice między zebranymi danymi a dopasowanym modelem.

Zwróć uwagę na systematyczne i nielosowe odchylenia. Takie dopasowanie jest dopuszczalne. Teraz spójrz na dane kinetyczne w zakładce raportu.

Stała szybkości asocjacji, stała szybkości dysocjacji i stała dysocjacji równowagi. Po zakończeniu naciśnij przycisk Zakończ i powtórz tę samą procedurę dla wszystkich innych mutantów. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy CFCA dla różnych badanych wariantów cystatyny B.

Dane dotyczące konkretnych stężeń wiązania są ekstrahowane z gramów czujnika uzyskanych przy natężeniach przepływu 10 i 100 mikrolitrów na minutę. Porównując stężenie określone za pomocą pomiaru dwóch 80 z stężeniem określonym przez CFCA, jasne jest, że podczas gdy w większości przypadków białko jest w pełni aktywne dla wariantu glicyny leucyny 73, frakcja aktywnego białka jest bardzo niska. Kinetykę wiązania wariantów cystatyny B z pepiną określa się za pomocą kinetyki pojedynczego cyklu.

Gramy czujników pokazują puste i odnoszą się do odjętych danych z kinetyką dla modelu interakcji jeden do jednego nałożonego na kolor. Swoiste stężenie wiązania zmierzone przez CFCA dla wariantu leucyny 73 wynosi tylko około 10% całkowitego stężenia białka określonego za pomocą pomiaru dwóch 80. Stosując prawidłowe stężenie przy obliczaniu parametrów kinetycznych, staje się jasne, że współczynnik asocjacji dla Luciena 73 jest podobny do innych wariantów.

Podczas gdy wskaźniki asocjacji mutantów są porównywalne z białkiem typu dzikiego, stała szybkości dysocjacji mutantów może być wyższa o blisko dwa rzędy wielkości przy odpowiednim wzroście stałej dysocjacji równowagi. Zmniejszone powinowactwo zależy głównie od zwiększonych szybkości dysocjacji, co wskazuje, że zarówno druga pętla wiązania, jak i końcowy koniec C cystatyny B przyczyniają się do powinowactwa wiązania poprzez utrzymywanie inhibitora przyłączonego do enzymu po utworzeniu kompleksu, zastosowanie analizy stężenia wolnego od kalibracji było niezbędne do wyciągnięcia tego wniosku, ponieważ jeden z mutantów okazał się mieć bardzo niską aktywność wiązania, Mój kolega Pol pokazał Ci, jak używać bi core X 100 w ustrukturyzowanym badaniu funkcji. Podczas wykonywania tych eksperymentów należy pamiętać, że chociaż zarówno stężenie, jak i analiza kinetyczna opierają się na tej samej procedurze wiązania, warunki eksperymentalne są zupełnie inne.