Mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

Niniejszy protokół przedstawia zastosowanie nowatorskiego mikroprzepływowego modelu kokultury, który umożliwia niezależną hodowlę komórek eukariotycznych oraz bakterii w celu zbadania wpływu komensalnego mikrośrodowiska na kolonizację patogenów. Model kokultury zademonstrowano poprzez wytworzenie biofilmu komensalnego e coli wśród komórek hela, a następnie wprowadzenie enterokrwotocznej e coli lub EHEC do komensalnej wyspy, w sekwencji naśladującej przebieg zdarzeń podczas infekcji przewodu pokarmowego.

Zakres kolonizacji komórek nabłonkowych przez EHEC jest wizualizowany przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Dzień dobry, reprezentuję laboratorium biotechnologii systemów molekularnych w Katedrze Inżynierii Chemicznej na Texas A&M University. Dzisiaj przedstawimy procedurę wspólnej hodowli bakterii i komórek eCard w urządzeniu mikroprzepływowym w sposób naśladujący organizację w ludzkim przewodzie pokarmowym.

W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania, w jaki sposób kolonizacja komórek nabłonkowych przez bakterie patogenne jest wpływana przez sygnały, z którymi spotykają się one w przewodzie pokarmowym przed kolonizacją. Zacznijmy zatem. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy przygotować silikonową matrycę, zaprojektowaną i wykonaną zgodnie z przeznaczeniem eksperymentalnym.

Na przykład Stanford Microfluidics Foundry wykona zaprojektowane formy matrycowe, z których można będzie stworzyć kolejne eksperymentalne formy replikacyjne. Dla urządzenia trójwarstwowego opisanego w niniejszym protokole wymagane są formy dla dwóch membran — dla warstwy hodowli komórek eukariotycznych oraz warstwy pneumatycznej — oraz jedna forma dla kanału bakteryjnego; wysokości kanałów dla warstw bakteryjnej, pneumatycznej i hodowli komórek eukariotycznych wynoszą odpowiednio 5, 200 i 100 µm. Przed przygotowaniem formy replikacyjnej należy poddać matrycę z SU-8 działaniu oparów fluorocykliny w eksyكاته podłączonym do źródła próżni. Aby ułatwić oddzielenie formy z PDMS od matrycy, należy nanieść kroplę fluorolanu na ręcznik papierowy w komorze próżniowej i zastosować próżnię przez jedną minutę.

Usunąć próżnię i odczekać 30 minut na osadzenie fluoro. Przechowywać matrycę SU eight w szalce Petri do późniejszego wykorzystania w celu wykonania form replikacyjnych. Przygotować prepolimer PDMS i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1 i dokładnie wymieszać, a następnie odgazować mieszaninę w komorze próżniowej przez jedną godzinę.

Aby usunąć pęcherzyki powietrza, umieść matrycę SU-8 w szalce Petriego i ostrożnie wlej PDMS na matrycę, stosując 5 g PDMS dla części górnej oraz 30 g PDMS dla warstwy bakteryjnej. Ponownie odgazuj PDMS przez 10 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie wiruj formę przez jedną minutę, aby rozprowadzić PDMS w równomierną membranę.

W niniejszym protokole membranę hodowli komórek eukariotycznych wiruje się z prędkością 1200 RPM w celu uzyskania grubości 150 mikrometrów, a membranę pneumatyczną z prędkością 800 RPM dla grubości 250 mikrometrów. Po wirowaniu szalkę Petriego zawierającą rozwirowany PDMS i formę główną z SU eight pozostawia się na 15 minut w temperaturze pokojowej przed podgrzaniem na płycie grzejnej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Aby utwardzić PDMS, po procesie sieciowania zwilża się PDMS metanolem i ostrożnie oddziela od form głównych z SU eight za pomocą czystej pęsety.

Umieść warstwę bakteryjną pod stereomikroskopem i używając igły stępionej o rozmiarze 20 G, wykonaj trzy otwory: dwa wloty dla bakterii oraz jeden wylot. Urządzenie trójwarstwowe montuje się w następującej kolejności: poprzez połączenie warstwy pneumatycznej z warstwą bakteryjną, a następnie połączenie warstwy hodowli komórek eukariotycznych z połączoną warstwą bakteryjną i pneumatyczną.

Umieść membranę pneumatyczną i warstwę bakteryjną na szkiełku przedmiotowym, a następnie poddaj działaniu plazmy w komorze plazmy tlenowej przez 40 sekund, przy ciśnieniu tlenu 10 standard cubic centimeters per minute, lub SCCM i mocy radiowej RF wynoszącej 100 watts. Dodanie metanolu do membran ułatwia swobodny ruch warstw i upraszcza ich wyrównanie. W ciągu 10 minut od ekspozycji na plazmę tlenową przenieś warstwę bakteryjną do czalki Petriego, używając pęsety i stereomikroskopu.

Dopasuj środkową membranę pneumatyczną do warstwy bakteryjnej, opierając się na otworach wlotowych i wylotowych dla bakterii. Po dopasowaniu umieść szalkę Petriego z wyrównaną strukturą PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez osiem godzin w celu związania warstw. Po zakończeniu tego procesu wywierć otwór w warstwie pneumatycznej, aby umożliwić sterowanie kanałem pneumatycznym.

Następnie powtórz kroki od montażu do dopasowania, aby połączyć kanał do hodowli komórek eukariotycznych z zmontowanym kompozytowym urządzeniem PDMS. Wywierć otwory w portach wlotowym i wylotowym używanych do wysiewu komórek eukariotycznych. Podłącz dreny typu Tigon do portów i steruj warstwą pneumatyczną, odciągając tłok strzykawki o pojemności 20 mililitrów.

Umieść kompozytową strukturę PDMS oraz uprzednio oczyszczone szkiełko przedmiotowe w komorze plazmy tlenowej. Włącz plazmę na 20 sekund bez przykładania próżni. Wyjmij kompozytową strukturę PDMS z komory plazmy tlenowej i podłącz do niej strzykawkę o pojemności 20 mililitrów.

Należy natychmiast pociągnąć, tworząc próżnię, aby zapobiec kontaktowi zaworów ze szkłem. Przesunąć w ciągu jednej minuty. Po ekspozycji na plazmę delikatnie docisnąć kompozytową strukturę PDMS do szkła.

Utwardź urządzenie z PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 80°C przez 10 minut. Następnie podłącz rurki Tigon do każdego portu i wysterylizuj urządzenie pod wpływem promieniowania UV przez 15 minut. W kolejnym kroku nabierz 500 µL sterylnego PBS do strzykawki o pojemności 1 ml i wprowadź go do kanału, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.

W przypadku zauważenia pęcherzyka powietrza, należy zacisnąć rurkę wylotową za pomocą probówki do mikrocentryfugi typu einor i przyłożyć lekki nacisk, aby wypchnąć pęcherzyk przez przepuszczalne dla gazów warstwy PDMS. Następnie do kanału pneumatycznego należy wlać wodę sterylną, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w kanale.

Do zapobiegania powstawaniu pęcherzyków powietrza w kanale pneumatycznym wykorzystuje się domowej roboty konwerter ciśnienia powietrza na ciecz. Aby przygotować szkło do wysiewu komórek eukariotycznych, należy wprowadzić 500 µL fibronektyny do obszaru hodowli komórkowej przez wlot dla hodowli komórek eukariotycznych. Używając strzykawki, należy zachować zamknięty zawór i inkubować przez 40 minut w temperaturze 37 °C.

Na koniec wypłucz nadmiar fibronektyny jednym mililitrem pożywki wzrostowej za pomocą pompy strzykawkowej. Urządzenie jest teraz gotowe do przeprowadzenia eksperymentu w celu utworzenia biofilmu komensalnego; rozcieńcz bakterie w minimalnej pożywce M9 do OD 600 na poziomie około 1. W tym przykładzie wykorzystano szczep laboratoryjny E. coli, lecz można użyć dowolnego niepatogennego szczepu bakterii.

Zamknąć zawór oddzielający obszary hodowli komórek bakteryjnych i eukariotycznych, przykładając dodatnie ciśnienie cieczy. Wprowadzić za pomocą pompy strzykawkowej 0,2 milliliters e coli o OD 600 wynoszącej około 1,0 do wysp i pozwolić bakteriom przytwierdzić się przez jedną godzinę w temperaturze 32 degrees Celsius. Po inkubacji.

Przeprowadź perfuzję rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej o OD 600 około 0,05 oraz świeżego minimalnego medium M9 z szybkością 0,25 ml/h przez 12 godzin. Używając pompy strzykawkowej, wypłucz biofilm 0,5 ml świeżego medium DMEM wolnego od surowicy i antybiotyków z szybkością 0,5 ml/h, aby usunąć słabo przytwierdzone bakterie i przygotować układ do przywierania komórek eukariotycznych. Wykonaj obrazowanie biofilmu za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego Leica TCSSP5 i zwizualizuj architekturę biofilmu przy użyciu oprogramowania MS.

Potraktuj trypsyną komórki HeLa z kolby do hodowli tkankowej i zresuspenduj je w medium DMEM do całkowitej objętości 0,1 ml, osiągając gęstość zasiewu 5 × 10⁵ komórek na ml. Wprowadź komórki HeLa do obszaru eukariotycznego urządzenia z szybkością przepływu 2 ml na minutę, używając pompy strzykawkowej Pico Plus.

Następnie, używając mikroskopu świetlnego, należy upewnić się, że zawór oddzielający obszar bakterii komensalnych od obszaru komórek eukariotycznych jest całkowicie zamknięty, tak aby biofilm bakteryjny był odseparowany od obszaru komórek pomocniczych. Używając probówki do mikrowirówki typu einor, należy zacisnąć wylot komórkowy, aby ograniczyć ruch zawiesiny komórkowej w kanale, a następnie inkubować przez sześć godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2. Po inkubacji należy przepłukać urządzenie za pomocą pompy strzykawkowej, używając 50 µL pożywki wzrostowej DMEM z przepływem 0,5 ml/h.

Aby usunąć niezwiązane komórki, wymieniaj pożywkę DMEM w obszarach z komórkami HeLa i komensalnymi E. coli co sześć godzin. Przygotuj E. coli O157:H7, czyli EHEC, w pożywce M9 w celu zakażenia komórek HeLa z wielokrotnością zakażenia (MOI) od 100 do 200 komórek EHEC na jedną komórkę HeLa. Wypłucz słabo przytwierdzone bakterie komensalne zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Wprowadź 100 µL rozcieńczonej zawiesiny EHEC o OD 600 około 0,1 do wysp za pomocą pompy strzykawkowej z szybkością przepływu 0,25 mL/h.

Następnie inkubuj urządzenie w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% carbon dioxide przez sześć godzin bez przepływu, aby EHEC został poddany działaniu sygnałów obecnych w biofilmie komensalnym. Po inkubacji otwórz zawór oddzielający regiony bakterii komensalnych i komórek eukariotycznych, używając pompy próżniowej do wytworzenia próżni, i pozostaw zawór otwarty przez sześć godzin. Pozwoli to na ekspozycję HEC w biofilmie bakterii komensalnych na komórki heela; po tym czasie ponownie inkubuj przez sześć godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% carbon dioxide.

Wprowadź barwnik do oceny żywotności komórek (live/dead stain) do urządzenia przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta. Aby ocenić żywotność komórek HeLa, wstrzyknij 0,1 ml roztworu roboczego do obszaru eukariotycznego urządzenia za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml w celu uzyskania kontroli do oszacowania śmierci komórek HeLa. W przypadku braku EHEC powtórz trzy poprzednie kroki i wprowadź do urządzenia sterylną pożywkę DMEM bez surowicy i antybiotyków.

Zamiast EHEC, obrazuj wiele lokalizacji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss AIOt 200 M i oszacuj liczbę żywych komórek nabłonkowych (kolor zielony) spośród martwych komórek nabłonkowych (kolor czerwony), licząc liczbę zielonych komórek na obrazach uzyskanych z co najmniej siedmiu lokalizacji. Teraz przedstawimy kilka reprezentatywnych obrazów mikroukładu mikrofluidycznego z warstwą próbnej. Na tym obrazie używamy obojętnego barwnika spożywczego do oznaczenia różnych obszarów hodowli.

Fioletowy barwnik reprezentuje obszar hodowli komórek eukariotycznych, natomiast zielony barwnik reprezentuje biofilm komensalnych bakterii. Na tym obrazie demonstramosy możliwość utrzymania odrębności obszarów eukariotycznych i bakteryjnych, ponieważ fioletowy barwnik w obszarze bakteryjnym wyraźnie odróżnia się od otaczającego go żółtego barwnika. Przedstawiono tutaj kolonizację biofilmu komensalnych bakterii wykazujących ekspresję zielonego białka przez patogenne bakterie wykazujące ekspresję czerwonego białka.

Jak pokazano na tym obrazie, EHEC i bakterie komensalne różnią się od komórek hela otaczających biofilm bakteryjny. Przedstawiliśmy właśnie sposób montażu mikro urządzenia z suchą warstwą do kokultury bakterii i komórek nabłonkowych, zazwyczaj w celu zbadania wpływu sygnałów na kolonizację patogenów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o usunięciu wszelkich pęcherzyków powietrza z urządzenia i zastosowaniu patogenu w odpowiedniej wielokrotności infekcji komórkowej.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.