Name: Kokultura mikroprzepływowa komórek nabłonkowych i bakterii w celu badania rozpuszczalnych interakcji za pośrednictwem sygnału (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-20T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Poznaj mikroprzepływową kokulturę komórek nabłonkowych i bakterii do badania interakcji patogenów z komensalnym mikrośrodowiskiem. Ta metoda umożliwia wizualizację kolonizacji EHEC przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo finansowana przez National Science Foundation (CBET 0846453) oraz National Institutes of Health (1R01GM089999).

1. Wykonanie krzemowych matryc za pomocą standardowej fotolitografii SU-81 (nie pokazano w tym filmie).
<ol>
 <li> Zastosuj standardowe metody fotolitografii z użyciem SU-8 w celu stworzenia „matryc” z SU-8 (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) do wytwarzania różnych komponentów (membran PDMS o różnej grubości, komory do kokultury) w czystym pomieszczeniu. Takie formy matrycowe mogą być wykonane w każdym zakładzie mikrofabrykacji (np. Stanford Microfluidics Foundry; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a>). </li>
 <li> Przed replikacją PDMS należy poddać matryce SU-8 działaniu oparów fluorosilanu w eksykatorze podłączonym do źródła próżni, aby ułatwić oddzielenie PDMS od matrycy.. Nanieś kroplę fluorosilanu na ręcznik papierowy i zastosuj próżnię przez jedną minutę. Usuń próżnię i odczekaj 30 minut do czasu osadzenia się fluorosilanu. Przechowuj matrycę SU-8 w zamkniętym pojemniku do późniejszego użycia. </li>
</ol>
2. Odlewanie replik PDMS z matrycy SU-82
<ol>
 <li>Warstwa płynowa i warstwa sterująca są wykonywane poprzez odlewanie replikacyjne PDMS z matrycy SU-8.</li>
 <li>Wymieszaj prepolimer PDMS i utwardzacz w stosunku masowym 10:1 i odgazuj w desykatorze przez 1 godzinę (lub do momentu usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszaniny PDMS).</li>
 <li>Umieść matrycę SU-8 w szalce Petriego i ostrożnie wlej mieszaninę PDMS na wierzch matrycy SU-8. Ponownie odgazuj PDMS.</li>
 <li>Wirować formę przy 120 rpm przez jedną minutę, aby uzyskać jednorodną grubość PDMS na poziomie około 10μm na formie.</li>
 <li>Podgrzewaj szalkę Petriego zawierającą PDMS i matrycę SU-8 w temperaturze 80°C przez jedną godzinę, aby utwardzić PDMS.</li>
 <li>Zdejmij utwardzoną matrycę SU-8 pokrytą PDMS z płyty grzewczej.</li>
 <li>Odlep formę PDMS od matrycy SU-8.</li>
 <li>Wywierć cztery otwory w formie PDMS za pomocą tępokoniecznej igły 20G, tworząc dwa wloty dla bakterii, jeden wylot oraz jeden port pneumatyczny.</li>
</ol>
3. Bondowanie urządzeń z wielowarstwowego PDMS: Urządzenie to składa się z trzech warstw – górnej warstwy zawierającej główny kanał, środkowej warstwy pneumatycznej oraz dolnej warstwy bakteryjnej z kanałami dla bakterii. Trzy warstwy są montowane zgodnie z poniższym opisem.
<ol>
 <li> Zwilżone metanolem membrany PDMS należy ostrożnie oddzielić od formy matki SU-8 za pomocą czystej pęsety. Następnie należy umieścić membranę na arkuszu teflonowym.</li>
 <li> Umieść membranę pneumatyczną i warstwę fluidyczną w komorze do plazmy tlenowej. Włącz plazmę na 40 s (przepływ tlenu 10 sccm, moc RF 10 W). </li>
 <li> Po ekspozycji na plazmę, w ciągu 10 minut, należy wyrównać membranę względem dolnego kanału PDMS za pomocą pęsety. Dodanie metanolu na membranę i warstwy PDMS ułatwia przesuwanie warstw, co usprawnia proces wyrównywania. W tym przypadku urządzenie umieszcza się na kawałku gazy, aby umożliwić odparowanie oparów metanolu.</li>
 <li> Utwardzaj wyrównane warstwy PDMS na płycie grzewczej w temperaturze 80°C przez 8 h.</li>
 <li> Po przyklejeniu membrany pneumatycznej do warstwy dolnej, powtórz kroki 3.2 – 3.4, aby przykleić górny kanał do złożonego kompozytowego urządzenia z PDMS.</li>
</ol> 
4. Montaż urządzenia z PDMS3,4
<ol>
	<li> Wywierć otwory w portach wlotowych i wylotowych używanych do zasiewu komórek eukariotycznych i bakterii.</li>
 <li> Podłącz rurki Tygon (0.01 inch O.D.) do portów i uruchom warstwę pneumatyczną, zasysając ciecz strzykawką 20mL.</li>
 <li> Umieść model PDMS oraz uprzednio oczyszczone szkiełko przedmiotowe w komorze plazmy tlenowej. Włącz plazmę na 20 sec (przepływ tlenu 20 sccm, moc RF 30W) bez przykładania próżni. </li>
 <li> Aby zapobiec przywieraniu ścianki wyspy (PDMS) do szkiełka przedmiotowego, natychmiast podłącz strzykawkę do urządzenia i wytwórz podciśnienie, zasysając tłok strzykawki i utrzymując go w tej pozycji.</li>
 <li> Delikatnie dociśnij model PDMS do szkła (w ciągu 2 minut).</li>
 <li> Utwardź urządzenie PDMS w temperaturze 80°C przez 10 minut.</li>
</ol>
5. Obróbka powierzchni szklanej fibonektyną
<ol>
 <li>Sterylizować urządzenie pod działaniem promieniowania UV przez 15 minut po podłączeniu przewodów Tygon do każdego portu.</li>
 <li>Napełnić kanał sterylnym PBS i przepuścić go, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z kanału. Przeprowadzać przepływ przez 10 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza mogą łatwo przenikać przez PDMS ze względu na jego przepuszczalność dla gazów.</li>
 <li>Wprowadzić do kanału pneumatycznego roztwór barwnika, aby zapobiec tworzeniu się w nim pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Aby ułatwić osadzanie komórek eukariotycznych na szkle, wprowadzić do urządzenia roztwór fibronektyny o stężeniu 1 μg/mL i inkubować przez 40 min w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Wypłukać nadmiar fibronektyny za pomocą 1 mL pożywki wzrostowej.</li>
</ol>
6. Tworzenie i pomiar biofilmu komensalnego E. coli w wyspach
<ol>
 <li> Rozcień bakterie komensalne (np. E. coli BW2513/pCM18) w minimalnym medium M9 do OD60~1 w celu uformowania biofilmu komensalnego w zamkniętych komorach/wyspach. </li>
 <li> Zamknij ścianę wyspy, przykładając nadciśnienie cieczy. Do zapobiegania powstawaniu pęcherzyków powietrza w kanale zastosowano własnej konstrukcji przetwornik ciśnienia powietrze-ciecz. </li>
 <li> Wprowadź komensalne E. coli do wysp przy zamkniętym zaworze i pozostaw bakterie do przytwierdzenia na 1 godzinę w temperaturze 32°C.</li>
 <li> Wypłucz nieprzytwierdzone bakterie i perfunduj rozcieńczoną zawiesinę bakteryjną (OD60~0.05) z prędkością 0.25mL/hr przez 12 godzin.</li>
 <li> Przepłucz biofilm świeżą pożywką wzrostową DMEM, aby usunąć słabo przytwierdzone bakterie i przygotować układ do przytwierdzenia komórek eukariotycznych.</li>
 <li> Wykonaj obrazowanie biofilmu przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego Leica TCS SP5 (Bannockburn, IL) i zwizualizuj architekturę biofilmu za pomocą oprogramowania IMARIS5.</li>
</ol>
 7. Wysiewanie komórek eukariotycznych wokół wysp bakteryjnych6-8
<ol>
 <li> Poddać komórki HeLa z kolby hodowlanej trypsynizacji i resuspendować w pożywce DMEM do uzyskania gęstości wysiewu 5 x 105 komórek/mL. </li>
 <li> Wprowadzić komórki HeLa do urządzenia z prędkością przepływu 2 mL/min, używając pompy strzykawkowej Picoplus (Harvard Apparattus, MA). Należy upewnić się, że ścianka wyspy jest obniżona, tak aby biofilm bakteryjny był oddzielony od obszaru komórek HeLa. Krok ten należy wykonać na stoliku mikroskopu świetlnego, aby móc określić jednorodność wysiewu.</li>
 <li> Zablokować wylot komórek, aby ograniczyć ruch zawiesiny komórkowej w kanale, i inkubować przez 6 h w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2.</li>
 <li> Przepłukać urządzenie pożywką wzrostową z prędkością 0,5 mL/hr w celu usunięcia nieprzytwierdzonych komórek. </li>
 <li> Odświeżać pożywkę DMEM dla komórek HeLa oraz komensalnych E. coli co 6 godzin. </li>
</ol>
8. Wprowadzenie patogennych bakterii na wyspę i ekspozycja komórek eukariotycznych
<ol>
 <li>Przygotować szczep E. coli O157:H7 (EHEC) do zakażenia komórek HeLa z wielokrotnością zakażenia (m.o.i) wynoszącą od 100:1 do 20:1 (liczba bakterii EHEC na jedną komórkę HeLa).</li>
 <li>Wypłukać i usunąć słabo przytwierdzone bakterie komensalne.</li>
 <li>Wprowadzić rozcieńczoną zawiesinę EHEC (OD60 ~ 0,1) do wysepek.</li>
 <li>Inkubować urządzenie w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 przez 6 godzin bez przepływu, aby umożliwić ekspozycję EHEC na sygnały obecne w biofilmie komensalnym.</li>
 <li>Podnieść ściankę PDMS, aby wystawić EHEC w wysepkach komensalnych na działanie komórek HeLa przez 6 godzin.</li>
 <li>Wypłukać kanał za pomocą PBS i przeprowadzić barwienie komórek żywych i martwych przy użyciu zestawu Live/Dead (L3224, Invitrogen, CA).</li>
 <li>Wykonać obrazy z wielu lokalizacji przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss Axiovert 20M i oszacować liczbę żywych oraz martwych komórek.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki 9
Sekwencja zdarzeń w infekcjach przewodu pokarmowego została odtworzona poprzez wytworzenie monowarstwy komórek HeLa oraz biofilmu komensalnego E. coli , a następnie wystawienie EHEC na działanie biofilmu komensalnego przed zakażeniem komórek HeLa. Kroki zaangażowane w przygotowanie mikrofluidycznego modelu kokultury przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2A przedstawia trójwymiarowy rendering urządzenia do kokultury. Dwa regiony w urządzeniu do kokultury – komora hodowli komórek eukariotycznych oraz wyspa bakteryjna – są pokazane na Rysunku 2B za pomocą barwników o różnych kolorach (fioletowy dla regionów eukariotycznych i zielony dla wyspy bakteryjnej). Możliwość odizolowania regionów hodowli bakteryjnej od otaczającego regionu eukariotycznego została wykazana na Rysunku 2C przy użyciu barwników. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne wyniki kokultury komórek nabłonka i bakterii. Rysunek 3A pokazuje kolonizację wyspy biofilmu komensalnego (zielony) przez EHEC (czerwony). Rysunek 3B przedstawia zestawienie komórek nabłonka i komensalnego E. coli z EHEC na wyspie bakteryjnej. Ekspresujące RFP EHEC oraz ekspresujące GFP bakterie komensalne lokalizują się na wyspie po obniżeniu ścianki PDMS, co ilustruje możliwość odizolowania wyspy bakteryjnej od komórek nabłonka.
<img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig1.jpg" alt="Schemat układu mikroprzepływowego dla procesu stopniowej ekspozycji bakterii i komórek HeLa; zawory, ciśnienia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Schemat wysiewu komórek w modelu kokultury(1) Ściankę z PDMS opuszczono, aby utworzyć wyspę, następnie do wnętrza wyspy wprowadzono bakterie komensalne, a wokół niej przepływiono fibronektyną. (2) Komórki HeLa wysiano w obszarach otaczających wyspę. (3) Po osiągnięciu przez komórki HeLa konfluencji oraz wykształceniu się biofilmu bakteryjnego komensali, do wyspy wprowadzono EHEC. (4) Ściankę z PDMS podniesiono, aby odsłonić komórki HeLa otaczające wyspę na działanie EHEC. Wstawka przedstawia szczegóły działania zaworu.
<img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2a.jpg" alt="Schemat mikrofluidycznego wzorca z celą przepływową do badań nad bakteriami i komórkami eukariotycznymi." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2a"> <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2bc.jpg" alt="Schemat eksperymentu mikroprzepływowego przedstawiający izolację bakterii w pneumatycznym systemie kanałów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2bc"> Rysunek 2: Mikropłynowy model do kokultury komórek nabłonkowych i bakterii(A) Trójwymiarowe przedstawienie urządzenia do kokultury, pokazujące pneumatycznie sterowane obszary wychwytywania służące do tworzenia wysp bakteryjnych wśród komórek nabłonkowych. Każda wyspa bakteryjna (1200 μm średnica i 1000 μm (apart) posiada oddzielny wlot i wylot służący do dostarczania pożywki wzrostowej i usuwania produktów przemiany materii z wyspy. (B) Mikrofotografia urządzenia do kokultury z barwnikami kolorystycznymi obrazującymi poszczególne obszary (strefę komórek nabłonkowych, wyspy bakteryjne). (C) Precyzję pneumatycznego systemu pułapkowania wykazano poprzez obniżenie ścianki PDMS (panel lewy) za pomocą pneumatycznie aktywowanego kanału (kolor niebieski), wprowadzenie fioletowego barwnika do zamkniętych wysp oraz przepływ żółtego barwnika wokół nich przez 48 h. Po podniesieniu ścianki PDMS (panel prawy) obszar wyspy zostaje wystawiony na działanie otaczającego go żółtego barwnika. Pasek skali oznacza 500 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig3.jpg" alt="schemat wyspy E. coli, badanie wzrostu drobnoustrojów, komórki HeLa, granica PDMS, kanał pneumatyczny" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3: Współuprawa komórek HeLa i bakterii(A) Obraz fluorescencyjny EHEC wykazującego ekspresję RFP oraz wykazującego ekspresję GFP E. coli BW25113 na wyspie. (B) Nałożenie obrazów w świetle przechodzącym oraz fluorescencji zielonej i czerwonej w urządzeniu. Pasek skali reprezentuje 200 μm.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+integrated+passive+valves+and+pumps+for+flexible+polymer+3-dimensional+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems.</a> Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).</li>
<li>Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatically+controllable+flexible+and+polymeric+microfluidic+valve+fabricated+via+in+situ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromech+Microeng%22%5BJournal%5D)">A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development.</a> J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).</li>
<li>Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+multiplexed+control+of+latching+pneumatic+valves+using+microfluidic+logical+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures.</a> Lab Chip. 6, 623-631 (2006).</li>
<li>Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indole+is+an+inter-species+biofilm+signal+mediated+by+SdiA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA.</a> BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+with+tunable+topographies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices with tunable topographies.</a> Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).</li>
<li>Hui, E. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+sensing+hydrogel+microstructures+into+micropatterned+hepatocellular+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures.</a> Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).</li>
<li>Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+epithelial+cells+and+bacteria+for+investigating+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab-on-Chip%22%5BJournal%5D)">Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions.</a> Lab-on-Chip. , (2009).</li>
</ol>

Konwencjonalne testy przyczepiania i kolonizacji patogenów wykorzystują monowarstwę komórek eukariotycznych w naczyniach do hodowli tkankowej, do których dodaje się patogeny. Modele te nie są istotne fizjologicznie, ponieważ nie uwzględniają komensalnego biofilmu bakteryjnego rozwijającego się na komórkach eukariotycznych. Proste dodanie wcześniej wyhodowanej kultury bakteryjnej do komórek eukariotycznych mało prawdopodobnie doprowadzi do powstania takiej konfiguracji, gdyż biofilmy są wysoce zorganizowanymi strukturami,...

<table><tbody><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>maska fotolitograficzna o wysokiej rozdzielczości (16 256 dpi)</td><td>Fineline-Imaging Inc, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridekafluorooktylo)silan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77279</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30002.02</td><td></td></tr><tr><td>Programowalna powłokownia wirowa</td><td>Laurell Tech Corp</td><td>WS0650S</td><td></td></tr><tr><td>Saparator masek</td><td>Neurotronix</td><td>Q4000</td><td></td></tr><tr><td>Trawacz plazmowy tlenowy</td><td>March Plasma System, CA</td><td>CS-1701</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oceny żywotności i cytotoksyczności Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

Ludzki przewód pokarmowy (GI) to wyjątkowe środowisko, w którym współistnieją komórki nabłonka jelitowego i bakterie niepatogenne (komensalne). Przysłowiem jest, że mikrośrodowisko, z którym patogen styka się w warstwie komensalnej, odgrywa istotną rolę w określaniu stopnia kolonizacji. Obecne metody hodowli stosowane do badania kolonizacji przez patogeny nie nadają się do weryfikacji tej hipotezy, ponieważ nie umożliwiają współhodowli bakterii i komórek nabłonka w sposób naśladujący mikrośrodowisko przewodu pokarmowego. W niniejszym opracowaniu opisujemy mikrofluidyczny model współhodowli, który umożliwia niezależną hodowlę komórek eukariotycznych i bakterii oraz testowanie wpływu mikrośrodowiska komensalnego na kolonizację przez patogeny. Model współhodowli został zademonstrowany poprzez opracowanie komensalnegoEscherichia colibiofilm wśród komórek HeLa, a następnie wprowadzenie enterohemorragicznejE. coli(EHEC) do wyspy komensalnej, w sekwencji naśladującej przebieg zdarzeń podczas infekcji przewodu pokarmowego.

Niniejszy protokół opisuje mikrofluidyczny model kokultury do jednoczesnej i zlokalizowanej hodowli komórek nabłonkowych oraz bakterii. Model ten może być wykorzystany do badania roli różnych rozpuszczalnych sygnałów molekularnych w patogenezie, a także do oceny skuteczności potencjalnych probiotycznych szczepów bakteryjnych.

Mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

Ludzki przewód pokarmowy jest unikalnym środowiskiem, w którym współistnieją komórki nabłonka jelitowego oraz bakterie niepatogenne (komensalne). Posiada on...

Niniejszy protokół przedstawia zastosowanie nowatorskiego mikroprzepływowego modelu kokultury, który umożliwia niezależną hodowlę komórek eukariotycznych oraz bakterii w celu zbadania wpływu komensalnego mikrośrodowiska na kolonizację patogenów. Model kokultury zademonstrowano poprzez wytworzenie biofilmu komensalnego e coli wśród komórek hela, a następnie wprowadzenie enterokrwotocznej e coli lub EHEC do komensalnej wyspy, w sekwencji naśladującej przebieg zdarzeń podczas infekcji przewodu pokarmowego.Zakres kolonizacji komórek nabłonkowych przez EHEC jest wizualizowany przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Dzień dobry, reprezentuję laboratorium biotechnologii systemów molekularnych w Katedrze Inżynierii Chemicznej na Texas A&M University. Dzisiaj przedstawimy procedurę wspólnej hodowli bakterii i komórek eCard w urządzeniu mikroprzepływowym w sposób naśladujący organizację w ludzkim przewodzie pokarmowym.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania, w jaki sposób kolonizacja komórek nabłonkowych przez bakterie patogenne jest wpływana przez sygnały, z którymi spotykają się one w przewodzie pokarmowym przed kolonizacją. Zacznijmy zatem. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy przygotować silikonową matrycę, zaprojektowaną i wykonaną zgodnie z przeznaczeniem eksperymentalnym.Na przykład Stanford Microfluidics Foundry wykona zaprojektowane formy matrycowe, z których można będzie stworzyć kolejne eksperymentalne formy replikacyjne. Dla urządzenia trójwarstwowego opisanego w niniejszym protokole wymagane są formy dla dwóch membran — dla warstwy hodowli komórek eukariotycznych oraz warstwy pneumatycznej — oraz jedna forma dla kanału bakteryjnego; wysokości kanałów dla warstw bakteryjnej, pneumatycznej i hodowli komórek eukariotycznych wynoszą odpowiednio 5, 200 i 100 µm. Przed przygotowaniem formy replikacyjnej należy poddać matrycę z SU-8 działaniu oparów fluorocykliny w eksyكاته podłączonym do źródła próżni. Aby ułatwić oddzielenie formy z PDMS od matrycy, należy nanieść kroplę fluorolanu na ręcznik papierowy w komorze próżniowej i zastosować próżnię przez jedną minutę.Usunąć próżnię i odczekać 30 minut na osadzenie fluoro. Przechowywać matrycę SU eight w szalce Petri do późniejszego wykorzystania w celu wykonania form replikacyjnych. Przygotować prepolimer PDMS i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1 i dokładnie wymieszać, a następnie odgazować mieszaninę w komorze próżniowej przez jedną godzinę.Aby usunąć pęcherzyki powietrza, umieść matrycę SU-8 w szalce Petriego i ostrożnie wlej PDMS na matrycę, stosując 5 g PDMS dla części górnej oraz 30 g PDMS dla warstwy bakteryjnej. Ponownie odgazuj PDMS przez 10 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie wiruj formę przez jedną minutę, aby rozprowadzić PDMS w równomierną membranę.W niniejszym protokole membranę hodowli komórek eukariotycznych wiruje się z prędkością 1200 RPM w celu uzyskania grubości 150 mikrometrów, a membranę pneumatyczną z prędkością 800 RPM dla grubości 250 mikrometrów. Po wirowaniu szalkę Petriego zawierającą rozwirowany PDMS i formę główną z SU eight pozostawia się na 15 minut w temperaturze pokojowej przed podgrzaniem na płycie grzejnej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Aby utwardzić PDMS, po procesie sieciowania zwilża się PDMS metanolem i ostrożnie oddziela od form głównych z SU eight za pomocą czystej pęsety.Umieść warstwę bakteryjną pod stereomikroskopem i używając igły stępionej o rozmiarze 20 G, wykonaj trzy otwory: dwa wloty dla bakterii oraz jeden wylot. Urządzenie trójwarstwowe montuje się w następującej kolejności: poprzez połączenie warstwy pneumatycznej z warstwą bakteryjną, a następnie połączenie warstwy hodowli komórek eukariotycznych z połączoną warstwą bakteryjną i pneumatyczną.Umieść membranę pneumatyczną i warstwę bakteryjną na szkiełku przedmiotowym, a następnie poddaj działaniu plazmy w komorze plazmy tlenowej przez 40 sekund, przy ciśnieniu tlenu 10 standard cubic centimeters per minute, lub SCCM i mocy radiowej RF wynoszącej 100 watts. Dodanie metanolu do membran ułatwia swobodny ruch warstw i upraszcza ich wyrównanie. W ciągu 10 minut od ekspozycji na plazmę tlenową przenieś warstwę bakteryjną do czalki Petriego, używając pęsety i stereomikroskopu.Dopasuj środkową membranę pneumatyczną do warstwy bakteryjnej, opierając się na otworach wlotowych i wylotowych dla bakterii. Po dopasowaniu umieść szalkę Petriego z wyrównaną strukturą PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez osiem godzin w celu związania warstw. Po zakończeniu tego procesu wywierć otwór w warstwie pneumatycznej, aby umożliwić sterowanie kanałem pneumatycznym.Następnie powtórz kroki od montażu do dopasowania, aby połączyć kanał do hodowli komórek eukariotycznych z zmontowanym kompozytowym urządzeniem PDMS. Wywierć otwory w portach wlotowym i wylotowym używanych do wysiewu komórek eukariotycznych. Podłącz dreny typu Tigon do portów i steruj warstwą pneumatyczną, odciągając tłok strzykawki o pojemności 20 mililitrów.Umieść kompozytową strukturę PDMS oraz uprzednio oczyszczone szkiełko przedmiotowe w komorze plazmy tlenowej. Włącz plazmę na 20 sekund bez przykładania próżni. Wyjmij kompozytową strukturę PDMS z komory plazmy tlenowej i podłącz do niej strzykawkę o pojemności 20 mililitrów.Należy natychmiast pociągnąć, tworząc próżnię, aby zapobiec kontaktowi zaworów ze szkłem. Przesunąć w ciągu jednej minuty. Po ekspozycji na plazmę delikatnie docisnąć kompozytową strukturę PDMS do szkła.Utwardź urządzenie z PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 80°C przez 10 minut. Następnie podłącz rurki Tigon do każdego portu i wysterylizuj urządzenie pod wpływem promieniowania UV przez 15 minut. W kolejnym kroku nabierz 500 µL sterylnego PBS do strzykawki o pojemności 1 ml i wprowadź go do kanału, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.W przypadku zauważenia pęcherzyka powietrza, należy zacisnąć rurkę wylotową za pomocą probówki do mikrocentryfugi typu einor i przyłożyć lekki nacisk, aby wypchnąć pęcherzyk przez przepuszczalne dla gazów warstwy PDMS. Następnie do kanału pneumatycznego należy wlać wodę sterylną, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w kanale.Do zapobiegania powstawaniu pęcherzyków powietrza w kanale pneumatycznym wykorzystuje się domowej roboty konwerter ciśnienia powietrza na ciecz. Aby przygotować szkło do wysiewu komórek eukariotycznych, należy wprowadzić 500 µL fibronektyny do obszaru hodowli komórkowej przez wlot dla hodowli komórek eukariotycznych. Używając strzykawki, należy zachować zamknięty zawór i inkubować przez 40 minut w temperaturze 37 °C.Na koniec wypłucz nadmiar fibronektyny jednym mililitrem pożywki wzrostowej za pomocą pompy strzykawkowej. Urządzenie jest teraz gotowe do przeprowadzenia eksperymentu w celu utworzenia biofilmu komensalnego; rozcieńcz bakterie w minimalnej pożywce M9 do OD 600 na poziomie około 1. W tym przykładzie wykorzystano szczep laboratoryjny E. coli, lecz można użyć dowolnego niepatogennego szczepu bakterii.Zamknąć zawór oddzielający obszary hodowli komórek bakteryjnych i eukariotycznych, przykładając dodatnie ciśnienie cieczy. Wprowadzić za pomocą pompy strzykawkowej 0,2 milliliters e coli o OD 600 wynoszącej około 1,0 do wysp i pozwolić bakteriom przytwierdzić się przez jedną godzinę w temperaturze 32 degrees Celsius. Po inkubacji.Przeprowadź perfuzję rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej o OD 600 około 0,05 oraz świeżego minimalnego medium M9 z szybkością 0,25 ml/h przez 12 godzin. Używając pompy strzykawkowej, wypłucz biofilm 0,5 ml świeżego medium DMEM wolnego od surowicy i antybiotyków z szybkością 0,5 ml/h, aby usunąć słabo przytwierdzone bakterie i przygotować układ do przywierania komórek eukariotycznych. Wykonaj obrazowanie biofilmu za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego Leica TCSSP5 i zwizualizuj architekturę biofilmu przy użyciu oprogramowania MS.Potraktuj trypsyną komórki HeLa z kolby do hodowli tkankowej i zresuspenduj je w medium DMEM do całkowitej objętości 0,1 ml, osiągając gęstość zasiewu 5 × 10⁵ komórek na ml. Wprowadź komórki HeLa do obszaru eukariotycznego urządzenia z szybkością przepływu 2 ml na minutę, używając pompy strzykawkowej Pico Plus.Następnie, używając mikroskopu świetlnego, należy upewnić się, że zawór oddzielający obszar bakterii komensalnych od obszaru komórek eukariotycznych jest całkowicie zamknięty, tak aby biofilm bakteryjny był odseparowany od obszaru komórek pomocniczych. Używając probówki do mikrowirówki typu einor, należy zacisnąć wylot komórkowy, aby ograniczyć ruch zawiesiny komórkowej w kanale, a następnie inkubować przez sześć godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2. Po inkubacji należy przepłukać urządzenie za pomocą pompy strzykawkowej, używając 50 µL pożywki wzrostowej DMEM z przepływem 0,5 ml/h.Aby usunąć niezwiązane komórki, wymieniaj pożywkę DMEM w obszarach z komórkami HeLa i komensalnymi E. coli co sześć godzin. Przygotuj E. coli O157:H7, czyli EHEC, w pożywce M9 w celu zakażenia komórek HeLa z wielokrotnością zakażenia (MOI) od 100 do 200 komórek EHEC na jedną komórkę HeLa. Wypłucz słabo przytwierdzone bakterie komensalne zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Wprowadź 100 µL rozcieńczonej zawiesiny EHEC o OD 600 około 0,1 do wysp za pomocą pompy strzykawkowej z szybkością przepływu 0,25 mL/h.Następnie inkubuj urządzenie w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% carbon dioxide przez sześć godzin bez przepływu, aby EHEC został poddany działaniu sygnałów obecnych w biofilmie komensalnym. Po inkubacji otwórz zawór oddzielający regiony bakterii komensalnych i komórek eukariotycznych, używając pompy próżniowej do wytworzenia próżni, i pozostaw zawór otwarty przez sześć godzin. Pozwoli to na ekspozycję HEC w biofilmie bakterii komensalnych na komórki heela; po tym czasie ponownie inkubuj przez sześć godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% carbon dioxide.Wprowadź barwnik do oceny żywotności komórek (live/dead stain) do urządzenia przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta. Aby ocenić żywotność komórek HeLa, wstrzyknij 0,1 ml roztworu roboczego do obszaru eukariotycznego urządzenia za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml w celu uzyskania kontroli do oszacowania śmierci komórek HeLa. W przypadku braku EHEC powtórz trzy poprzednie kroki i wprowadź do urządzenia sterylną pożywkę DMEM bez surowicy i antybiotyków.Zamiast EHEC, obrazuj wiele lokalizacji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss AIOt 200 M i oszacuj liczbę żywych komórek nabłonkowych (kolor zielony) spośród martwych komórek nabłonkowych (kolor czerwony), licząc liczbę zielonych komórek na obrazach uzyskanych z co najmniej siedmiu lokalizacji. Teraz przedstawimy kilka reprezentatywnych obrazów mikroukładu mikrofluidycznego z warstwą próbnej. Na tym obrazie używamy obojętnego barwnika spożywczego do oznaczenia różnych obszarów hodowli.Fioletowy barwnik reprezentuje obszar hodowli komórek eukariotycznych, natomiast zielony barwnik reprezentuje biofilm komensalnych bakterii. Na tym obrazie demonstramosy możliwość utrzymania odrębności obszarów eukariotycznych i bakteryjnych, ponieważ fioletowy barwnik w obszarze bakteryjnym wyraźnie odróżnia się od otaczającego go żółtego barwnika. Przedstawiono tutaj kolonizację biofilmu komensalnych bakterii wykazujących ekspresję zielonego białka przez patogenne bakterie wykazujące ekspresję czerwonego białka.Jak pokazano na tym obrazie, EHEC i bakterie komensalne różnią się od komórek hela otaczających biofilm bakteryjny. Przedstawiliśmy właśnie sposób montażu mikro urządzenia z suchą warstwą do kokultury bakterii i komórek nabłonkowych, zazwyczaj w celu zbadania wpływu sygnałów na kolonizację patogenów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o usunięciu wszelkich pęcherzyków powietrza z urządzenia i zastosowaniu patogenu w odpowiedniej wielokrotności infekcji komórkowej.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.

microfluidic-co-culture-epithelial-cells-bacteria-for-investigating

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Współhodowla mikrofluidyczna komórek nabłonkowych i bakterii w celu badania interakcji pośredniczynych przez sygnały rozpuszczalne

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Opisujemy protokół in vitro do wspólnej hodowli mikrobiomu jelitowego i kosmków jelitowych przez dłuższy okres przy użyciu ludzkiego systemu mikrofizjologicznego typu gut-on-a-chip.

Współhodowla żywego mikrobiomu z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi człowieka w urządzeniu mikroprzepływowym typu gut-on-a-chip

Przedstawiamy protokół do badania wzajemnych oddziaływań między napromieniowanym promieniowaniem rentgenowskim Caco-2 a komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC). Protokół rozpoczyna się od napromieniania Caco-2 i ustanowienia kokultury z PBMC; następnie regularnie przez 48 godzin mierzy się przeznabłonkowy opór elektryczny, a western blot wykonuje się zarówno w Caco-2, jak i PBMC.

Metoda wspólnej hodowli do badania przesłuchów między napromieniowanymi promieniowaniem rentgenowskim komórkami Caco-2 a PBMC

Ten raport opisuje metodę opartą na chipie mikroprzepływowym, która pozwala na przeprowadzenie eksperymentu z pojedynczą hodowlą komórkową, w którym można uzyskać wysokowydajne parowanie i mikroskopową analizę wielu pojedynczych komórek.

Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

To badanie opisuje mikroskopowe monitorowanie przylegania pneumokoków do ciągów czynnika von Willebranda wytwarzanych na powierzchni zróżnicowanych ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających w określonych warunkach przepływu. Protokół ten można rozszerzyć o szczegółową wizualizację określonych struktur komórkowych i kwantyfikację bakterii poprzez zastosowanie różnicowych procedur barwienia immunologicznego.

Zakażenie pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Prezentowany protokół opisuje rozwój i wykorzystanie techniki barwienia aktyną na bazie falloidyny z konfokalną laserową mikroskopią skaningową (CLSM) do wizualizacji przylegającej struktury warstwy komórkowej w mikroprzepływowych kanałach hodowli dynamicznej i tradycyjnych komorach do hodowli statycznej ze stałą studnią. Takie podejście pomaga w ocenie zbiegu warstw komórkowych, tworzenia monowarstw i jednorodności grubości warstwy.

Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół z kluczowymi krokami prowadzącymi inżynierię i wykorzystanie 3D Flipwell. Opisujemy i pokazujemy, jak składać stosy wkładek do współhodowli oraz wykorzystywać je do współhodowli warstw bakterii jelitowych, nabłonka jelitowego i makrofagów do modelowania środowiska śluzowego jelit.

3D Flipwell Engineering do opracowywania asynchronicznych systemów dla terapii toksykologicznych i immunomodulacyjnych w komórkach bakteryjnych, jelitowych i odpornościowych

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Poznaj mikroprzepływową kokulturę komórek nabłonkowych i bakterii do badania interakcji patogenów z komensalnym mikrośrodowiskiem. Ta metoda umożliwia wizualizację kolonizacji EHEC przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

Przeglądaj więcej filmów