Name: Badanie basenów pęcherzyków synaptycznych za pomocą fotokonwersji barwników styrylowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę fotokonwersji barwników FM 1-43 do badania pęcherzyków synaptycznych u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia wizualizację puli pęcherzyków i mechanizmów synaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1) Przygotowanie złącza nerwowo-mięśniowego (NMJ) Drosophila melanogaster
<ol>
<li>Przygotuj standardowy roztwór soli dla Drosophila (130 mM NaCl, 36 mM sucrose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4).</li>
<li>Wykonaj preparację w roztworze soli (1.1). Larwę Drosophila przytwierdza się szpilkami do płytki Sylgard stroną grzbietową do góry; stronę grzbietową przecina się wzdłużnie, a następnie usuwa organy wewnętrzne. Preparat zostaje następnie rozciągnięty i unieruchomiony szpilkami. Można teraz wykorzystać kilka mięśni brzusznych.</li>
</ol>
2) Stymulacja i barwienie FM
<ol>
<li>Zaleca się wykonywanie wszystkich poniższych kroków w warunkach słabego oświetlenia, aby chronić barwniki FM przed blaknięciem.</li>
<li>Do chemicznej stymulacji nerwów stosuje się bufor z wysoką zawartością potasu. Przygotować sól fizjologiczną dla Drosophila (patrz 1.1) zawierającą 90 mM KCl oraz 10 μM barwnika FM1-43. Roztwór należy przechowywać w ciemności.</li>
<li>Kąpiel preparatu w wcześniej przygotowanym buforze przeprowadzić przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przepłukać standardową solą fizjologiczną dla Drosophila (1.1), aby usunąć pozakomórkowy barwnik FM1-43. Następnie bezzwłocznie przejść do utrwalania.</li>
</ol>
3) Fixacja
<ol>
<li>Kąpiel preparatu w 2,5% glutaraldehydzie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 45 minut w temperaturze pokojowej. W celu lepszego zachowania cech morfologicznych glutaraldehyd jest preferowany nad paraformaldehydem.</li>
<li>Jednokrotne przemycie PBS, a następnie pozostawienie preparatu zanurzonego na 15 minut w 10 mM NH4Cl. Ten krok jest wykonywany w celu zneutralizowania wolnych grup aldehydowych pozostałego fiksatywu z glutaraldehydu.</li>
<li>Wypłukanie roztworu NH4Cl zwykłym PBS.</li>
</ol>
4) Fotokonwersja
<ol>
<li>Inkubować preparat NMJ przez 30 minut w temperaturze 4°C w PBS zawierającym 1,5 mg ml-1 diaminobenzydyny (DAB).</li>
<li>Umieścić próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zlokalizować i ustawić ostrość sygnału fluorescencyjnego, używając obiektywu imersyjnego z wodą o stosunkowo niskim powiększeniu (20x 0,5 NA).</li>
<li>Naświetlać próbkę z maksymalną intensywnością lampy, aż barwnik FM zostanie całkowicie wybielony (Ryc. 1C). Aby sprawdzić, czy nastąpiła fotokonwersja, zaleca się obejrzeć próbkę w świetle przechodzącym przed i po etapie wybielania barwnika FM. W przypadku zajścia fotokonwersji spodziewany jest ciemnobrązowy osad (Ryc. 1C). Czas naświetlania jest zmienny i zależy od mocy oświetlenia oraz stopnia penetracji DAB w preparacie. Dla większości preparatów przy użyciu obiektywu 20x stwierdzono, że optymalny czas naświetlania wynosi ~30-45 minut. W przypadku obiektywów o większym powiększeniu (60x) stosuje się krótsze okresy naświetlania.</li>
<li>Do naświetlania zaleca się stosowanie lampy rtęciowej z obudową wyposażoną w lustro tylne, które zbiera wstecznie rozproszone wiązki światła, zwiększając tym samym całkowitą intensywność.</li>
</ol>
5) Przygotowanie próbki do EM
<ol>
<li>Osmowanie
 <ol class="lalpha">
 <li>Przygotować roztwór zawierający jedną objętość czwartotlenku osmu w trzech objętościach wody (ok. 30 μl na próbkę). Prace z czwartotlenkiem osmu należy prowadzić pod wyciągiem, stosując rękawice i środki ochrony oczu.</li>
 <li>Inkubować preparat w roztworze czwartotlenku osmu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (pod wyciągiem).</li>
 <li>Przepłukać dokładnie buforem PBS (4-5 razy po 5 minut) i przenieść każdą próbkę do czystej szklanej kolby.</li>
 </ol>
 </li>
<li>Odwadnianie
 <ol class="lalpha">
 <li>Przygotować oddzielne roztwory etanolu o stężeniach 30, 50, 70, 90, 95 i 10%.</li>
 <li>Dodać 1 ml 30% etanolu do każdej próbki na 5 minut.</li>
 <li>Dodać 1 ml 50% etanolu do każdej próbki na 5 minut.</li>
 <li>Dodać 1 ml 70% etanolu do każdej próbki na 5 minut.</li>
 <li>Dodać 1 ml 90% etanolu do każdej próbki na 5 minut.</li>
 <li>Dodać 1 ml 95% etanolu do każdej próbki na 5 minut (powtórzyć 3x).</li>
 <li>Dodać 1 ml 10% etanolu do każdej próbki na 5 minut (powtórzyć 3x).</li>
 </ol>
</li>
<li>Zatopienie i dalsza obróbka
 <ol class="lalpha">
 <li>Zmieszać jedną objętość żywicy Epon z jedną objętością etanolu. Dodać mieszaninę do preparatu przy ciągłym obracaniu (2-4 godziny).</li>
 <li>Umieścić preparat w 10% żywicy Epon w otwartych kolbach i pozwolić na odparowanie pozostałego etanolu (4-6 godzin).</li>
 <li>Umieścić preparat w formach w temperaturze 60°C na 36 godzin.</li>
 <li>Obróbka do mikroskopii elektronowej. Przygotować skrawki o grubości 50-80 nm, stosując standardowe procedury ultramikrotomii.</li>
 </ol>
</li>
<li>Obrazowanie w mikroskopii elektronowej
 <ol class="lalpha">
 <li>Obrazowanie preparatu przeprowadza się zgodnie ze standardowymi procedurami EM.</li>
 </ol>
</li>
</ol>
6) Reprezentatywne wyniki
Oczekiwane wyniki przedstawiono na rysunkach 1C i 2. Procedura naświetlania prowadzi do powstania brązowego osadu DAB, który będzie widoczny zarówno w obrazowaniu fluorescencyjnym, jak i transmisyjnym. Pierwszym zjawiskiem występującym podczas naświetlania jest zanik fluorescencji związany z barwieniem barwnikiem FM. Z kolei fluorescencja tła wywołana utrwalaczem aldehydowym będzie widoczna przez cały czas trwania eksperymentu. Wypalanie następuje zazwyczaj w ciągu ~10-20 minut od rozpoczęcia naświetlania. W tym punkcie czasowym zazwyczaj nie można zaobserwować produktu fotokonwersji.
Należy kontynuować naświetlanie; po około 10 minutach preparaty przyjmą brązowy odcień z powodu akumulacji DAB (Rys. 1Civ). Nie jest jasne, dlaczego precypitacja DAB i blaknięcie barwnika FM nie zachodzą jednocześnie; możliwe, że przed agregacją i precypitacją musi nagromadzić się stosunkowo duża ilość utlenionego DAB, w związku z czym reakcja ta przebiega wolniej niż proces blaknięcia. Na tym etapie preparat nie jest jednak gotowy do obróbki do mikroskopii elektronowej, ponieważ precypitacja DAB jest prawdopodobnie niepełna. Zalecamy odczekanie dodatkowych 5–10 minut, podczas których preparat (presynaptyczne zakończenie nerwowe) przyjmuje ciemnobrązowy (lub czarny) kolor, co świadczy o całkowitej konwersji. Na tym etapie można zaobserwować lekką konwersję ogólnej powierzchni preparatu (na przykład włókien mięśniowych w złączu nerwowo-mięśniowym). Jest ona najprawdopodobniej związana z konwersją DAB indukowaną autofluorescencją (i/lub fluorescencją utrwalacza) i nie wpływa negatywnie na przebieg procedury.
Następnie preparat poddaje się obróbce do mikroskopii elektronowej i należy sprawdzić, czy obecne są ciemne (znakowane) pęcherzyki. Jak wykazaliśmy wcześniej 5,6, pęcherzyki te są znacznie gęstsze niż pęcherzyki nieznakowane, dzięki czemu można je łatwo odróżnić (Rycina 2B). Aby zwiększyć szansę na wyraźne rozróżnienie różnych typów pęcherzyków, nie należy przeprowadzać potranskrypcyjnego barwienia kontrastującego przekrojów (bez barwienia octanem uranylu lub cytrynianem ołowiu); barwienie osmem jest wystarczające do obserwacji większości elementów komórkowych i nie jest tak ciemne jak osad DAB.
<img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig1.jpg" alt="Schematy równowagi statycznej, struktura chemiczna, obrazy mikroskopowe; dyfuzja, analiza molekularna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Barwniki FM i ich zastosowanie w fotokonwersji. (A) Przedstaw etapy klasycznego eksperymentu obciążania i odbarwiania pęcherzyków przy użyciu barwnika FM podczas stymulacji. (i) Inkubować próbkę w buforze zawierającym barwnik FM. (ii) Stymulować (elektrycznie lub chemicznie), aby wywołać fuzję pęcherzyków w obecności barwnika FM. (iiiNastępująca po stymulacji endocytoza spowoduje załadowanie części pęcherzyków barwnikiem FM wciąż obecnym w buforze zewnątrzkomórkowym.dożylnie) Usunąć pozakomórkowy barwnik FM poprzez przemycie buforem. (vNowa stymulacja wywoła u naładowanych pęcherzyków uwalnianie barwnika FM podczas egzocytozy.B) Schemat przedstawiający głowę, mostek i ogon barwnika FM1-43. (C) Przykład eksperymentu z fotokonwersją w Muszka owocowa NMJ. (złącze nerwowo-mięśniowe)iPo załadowaniu złącza neuromięśniowego (NMJ) barwnikiem FM1-43, wypłukaniu cząsteczek barwnika z powierzchni zewnętrznej oraz utrwaleniu, fluorescencję zakończenia nerwowego można obserwować za pomocą konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego (63x).ii-iiiPod wpływem ciągłego naświetlania barwnik ulega całkowitemu wybieleniu.ivPodczas dalszej iluminacji pojawia się kolor czarny w wyniku precypitacji diaminobenzydyny. Pasek skali reprezentuje 10 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii elektronowej, ultrastruktura komórki, analiza składników komórkowych, badanie mikroskopowe" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: Przykłady obrazów EM próbek poddanych fotokonwersji. (ANa obrazie widoczne jest zakończenie nerwowe zawierające pęcherzyki synaptyczne, z których żaden nie uległ fotokonwersji; może to być spowodowane niewystarczającym oświetleniem lub słabą penetracją diaminobenzydyny w tkance.B) Bouton synaptyczny z kilkoma ciemnymi (wypełnionymi) pęcherzykami, które przeszły fotokonwersję FM. (CNadmiar oświetlenia prowadzi do całkowitego zaciemnienia obrazu, w którym nie można rozpoznać pęcherzyków ani organelli. Paski skali odpowiadają 20 nm.

<ol><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li>
<li>Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li>
<li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li>
<li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optically+determined+size+of+exo%2Fendo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li>
<li>Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li>
<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li>
<li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li>
<li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li>
<li>Lange, R. P. J. de, de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li>
<li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li>
</ol>

Należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków:
<ul>
<li>Inkubację z DAB należy przeprowadzić dopiero po dokładnym przemyciu i gaszeniu preparatów. W przeciwnym razie niezwiązana glutaraldehyd zareaguje z DAB i spowoduje jego wytrącenie (zazwyczaj w formie płaskich kryształów, które nie są gęste elektronowo). Preparaty, w których dochodzi do intensywnego wytrącania, są rzadko użyteczne w mikroskopii elektronowej.</li>
<li>Czasy naświetlania należy zoptymalizować, testując kilka identycznych preparatów przy różnych ...

<table><tbody><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen</td><td>F10317</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Epon</td><td>Plano GmbH</td><td>R1030</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek diaminobenzydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>50% glutaraldehyd</td><td>AppliChem</td><td>A3166</td><td>klasa EM</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>104186298</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop 2 FS plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 20x 0.5 NA</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Obiektyw suchy</td></tr><tr><td>Lampa Hg 100W</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obudowa lampy z lustrem tylnym</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>1007-980</td><td></td></tr><tr><td>Kamera MRm</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>0445-554</td><td>Akwizycja obrazu</td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia (HQ 470/40)</td><td>AHF</td><td>F49-671</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne (495 DCLP)</td><td>AHF</td><td>F33-100</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisji (HQ 500 LP)</td><td>AHF</td><td>F42-018</td><td></td></tr><tr><td>EM</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proscan CCD HSS</td><td>Proscan Electronic Sys.</td><td></td><td>1024 x 1024</td></tr></tbody></table>

badanie pul pul pęcherzyków synaptycznych z wykorzystaniem fotokonwersji barwników styrylowych

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Fuzja pęcherzyków synaptycznych z błoną plazmatyczną (egzocytoza) jest niezbędnym etapem uwalniania neurotransmiterów i komunikacji neuronalnej. Pęcherzyki są następnie odzyskiwane z błony plazmatycznej (endocytoza) i dołączane do ogólnej puli pęcherzyków w obrębie zakończenia nerwowego, aż do momentu przejścia przez nowy cykl egzocytozy i endocytozy (recykling pęcherzyków). Procesy te badano przy użyciu różnych technik, takich jak mikroskopia elektronowa, rejestracje elektrofizjologiczne, amperometria oraz pomiary pojemności. Co istotne, w ciągu ostatnich dwóch dekad pojawiło się szereg markerów znakowanych fluorescencyjnie, co pozwoliło na zastosowanie technik optycznych do śledzenia dynamiki recyklingu pęcherzyków. Jednym z najczęściej stosowanych markerów są barwniki styrylowe lub FM 1; strukturalnie wszystkie barwniki FM zawierają hydrofilową głowę i lipofilowy ogon połączone pierścieniem aromatycznym oraz jedną lub więcej wiązaniami podwójnymi (Ryc. 1B). Klasyczny eksperyment z użyciem barwnika FM w celu oznakowania puli pęcherzyków polega na kąpieli preparatu (Ryc. 1Ai) w barwniku podczas stymulacji nerwu (elektrycznie lub wysokim stężeniem K+). Indukuje to recykling pęcherzyków i następcze ładowanie barwnika do niedawno endocytowanych pęcherzyków (Ryc. 1Ai-iii). Po załadowaniu pęcherzyków barwnikiem, druga runda stymulacji w kąpieli bez barwnika wywoła uwalnianie FM poprzez egzocytozę (Ryc. 1Aiv-v), proces, który można monitorować poprzez obserwację spadku intensywności fluorescencji (odbarwianie).

Chociaż barwniki FM wniosły ogromny wkład w badania nad recyklingiem pęcherzyków, konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna nie pozwala na określenie dokładnej lokalizacji ani morfologii poszczególnych pęcherzyków. Z tego powodu wyjaśniamy w niniejszym opracowaniu, w jaki sposób barwniki FM mogą być wykorzystane jako markery endocytyczne w mikroskopii elektronowej poprzez fotokonwersję. Technika fotokonwersji wykorzystuje właściwość barwników fluorescencyjnych do generowania reaktywnych form tlenu pod wpływem intensywnego oświetlenia. Preparaty znakowane fluorescencyjnie zanurza się w roztworze zawierającym diaminobenzydynę (DAB), a następnie naświetla. Gatunki reaktywne generowane przez cząsteczki barwnika utleniają DAB, co prowadzi do powstania stabilnego, nierozpuszczalnego osadu o ciemnym wyglądzie, który można łatwo rozpoznać w mikroskopii elektronowej 2,3. Ponieważ DAB ulega utlenieniu wyłącznie w bezpośrednim sąsiedztwie cząsteczek fluorescencyjnych (ze względu na krótki czas życia reaktywnych form tlenu), technika ta gwarantuje, że jedynie struktury znakowane fluorescencyjnie będą zawierać elektronowo gęsty osad. Metoda ta pozwala zatem na badanie dokładnego położenia i morfologii organelli uczestniczących w aktywnym recyklingu.

Barwniki FM okazały się nieocenioną pomocą w zrozumieniu dynamiki synaptycznej. Barwniki FM są zazwyczaj śledzone pod mikroskopem fluorescencyjnym w różnych warunkach stymulacji. Jednakże fotokonwersja barwników FM w połączeniu z mikroskopią elektronową umożliwia wizualizację odrębnych pul pęcherzyków synaptycznych, a także innych komponentów ultrastruktury, w pączkach synaptycznych.

Badanie pul pul pęcherzyków synaptycznych z wykorzystaniem fotokonwersji barwników styrylowych

Fuzja pęcherzyków synaptycznych z błoną plazmatyczną (egzocytoza) jest niezbędnym etapem uwalniania neuroprzekaźników i komunikacji neuronalnej. ...

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę konwersji fotoindukowanej barwnika Styro Dye FM 1 43. Aby zbadać pule pęcherzyków synaptycznych u drosophila melanogaster, w pierwszej kolejności przeprowadzana jest dyssekcja larw muszki owocówki w celu odsłonięcia mięśni brzusznych, które stanowią preparat złącza nerwowo-mięśniowego (NMJ). Preparaty inkubuje się w buforze zawierającym FM D, pokazany tutaj na szaro, który znakuje błonę komórkową.Następnie poddaje się je stymulacji elektrycznej lub chemicznej, aby wywołać fizyczną fuzję, po której następuje internalizacja błony pęcherzyka. Stymulowana egzocytoza zostanie zabarwiona barwnikiem FM D. Następnie wypłukuje się pozakomórkowy barwnik FM, usuwając go z błony plazmatycznej, a tkankę utrwala pod wpływem ciągłego oświetlenia o wysokim natężeniu. Barwnik ulega całkowitemu wybieleniu, a czarny kolor pojawia się w wyniku precypitacji diaminobenzydyny.Osad ten można następnie zwizualizować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Witajcie, jestem Philippe o Paso z laboratorium Sylvii Olli w Europejskim Instytucie Neuronauki w Gießen w Niemczech. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę fotokonwersji FM w złączu nerwowo-mięśniowym.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania recyklingu pęcherzyków synaptycznych. Zatem zacznijmy. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, należy najpierw przymocować larwę drosophila grzbietem do góry w szalce pokrytej agarozą.Przykryj preparat solą fizjologiczną dla drosofil za pomocą igły strzykawki, a następnie nacinaj stronę grzbietową wzdłuż za pomocą nożyczek do sekcji. Następnie usuń organy wewnętrzne. W kolejnym kroku rozciągnij preparat i ponownie przypnij go do szalki Petriego.Następnie można wykorzystać kilka mięśni brzusznych, aby chronić barwniki FM stosowane w tej procedurze przed blaknięciem. Procedurę tę należy przeprowadzać w warunkach słabego oświetlenia. Przykryć unieruchomiony preparat drosophila roztworem soli dla drosophila zawierającym 90 millimolar KCl oraz 10 micromolar FM.1 43 w celu chemicznej stymulacji nerwów.Po stymulacji inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór stymulujący i, pracując pod wyciągiem chemicznym, dwukrotnie zanurzyć szalkę z przypiętą muszką owocniczką w zlewce wypełnionej 100 mililitrami soli fizjologicznej dla drosophila, aby usunąć pozakomórkowy barwnik FM 1 43.Utrwal preparat złącza nerwowo-mięśniowego w 2,5% glutaraldehydzie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj preparat raz w PBS, a następnie wyjmij go z naczynia typu cigar dish i zanurz w 100 mM chlorku amonu na 15 minut, aby zneutralizować wolne grupy aldehydowe pozostałego utrwalacza glutaraldehydowego.Używając zwykłego PBS, wypłucz roztwór chlorku amonu, umieść preparat złącza nerwowo-mięśniowego w nowej szalce typu cigar i zanurz go w przefiltrowanym roztworze diaminobenzydyny (DAB) o stężeniu 1,5 mg/mL w PBS, a następnie inkubuj przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Umieść próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w źródło światła w postaci lampy rtęciowej z obudową lampy zawierającą lustro odbijające, korzystając z suchego obiektywu o stosunkowo małym powiększeniu.Zlokalizuj próbkę. Następnie, korzystając z normalnego kostki filtrów do wzbudzenia niebieskiego i fluorescencji zielonej, ustaw sygnał fluorescencyjny w ostrości. Złącza nerwowo-mięśniowe pojawiają się jako jasne punkty na mięśniach.Następnie, korzystając z tego samego zestawu filtrów fluorescencyjnych, naświetlaj próbkę z maksymalną intensywnością do całkowitego wybielenia FM D. Przy użyciu obiektywu 20x czas od 30 do 45 minut powinien być wystarczający. Należy jednak pamiętać, że czas fotokonwersji zależy od intensywności oświetlenia, stopnia penetracji DAB do preparatu oraz zastosowanego obiektywu.Po naświetleniu należy zbadać próbkę w świetle przechodzącym. Jeśli nastąpiła fotokonwersja, powinien być widoczny ciemnobrązowy osad. Należy wrócić do mikroskopu stereoskopowego, a następnie za pomocą nożyczek wyciąć z larwy miejsce, w którym doszło do fotokonwersji.Powróć do stereomikroskopu sekcyjnego. Następnie za pomocą nożyczek wytnij z larwy obszar, który został zidentyfikowany na zdjęciu. Teraz, pracując pod dygestorium i stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice i ochronę oczu, umieść próbkę w probówce do wirówki zawierającej PBS.Przygotuj 300 µL 1%tlenku osmu na każdą próbkę. Następnie umieść próbkę w szklanej kolbie z plastikową zatyczką i dodaj przygotowany roztwór tlenku osmu w celu utrwalenia preparatu. Podczas inkubacji próbki przygotuj oddzielne roztwory zawierające 30, 50, 70, 90, 95 i 100% etanolu.Przemyj próbkę od czterech do pięciu razy w roztworze PBS, po pięć minut każdego mycia. Po każdym myciu użyj plastikowego PE do pipety, aby przenieść próbkę do nowej kolby. Po ostatnim myciu przenieś próbkę do czystej kolby szklanej.Następnie odwodnij próbkę, umieszczając ją w serii roztworów etanolu. Rozpocznij od inkubacji w 1 mL 30% etanolu. Po pięciu minutach usuń etanol za pomocą pipety Pasteura i zastąp go 1 mL 50% etanolu.Kontynuuj odwadnianie, inkubując preparat złącza nerwowo-mięśniowego w roztworach 70%, 90%, a następnie 95%. Próbkę inkubuje się następnie w 95% roztworze etanolu dwa razy, a po odwadnianiu trzy razy w 100% etanolu. Dodaj dwa mililitry żywicy EIN w stosunku jeden do jednego do etanolu i umieść próbkę w inkubatorze rotacyjnym.Od dwóch do czterech godzin w temperaturze pokojowej po rotacji w 100% ein, a następnie umieścić próbkę w otwartej kolbie, aby pozostały etanol odparował przez cztery do sześciu godzin. Wlać świeży EIN do formy. Dodać preparaty i inkubować w temperaturze 60 °C przez 36 godzin.Po przygotowaniu preparatów zatopionych w EIN, należy użyć ultramikrotomu w celu wykonania przekrojów o grubości od 50 do 80 nanometrów przy użyciu noża diamentowego. Próbki są cięte na cienkie sekcje. Sekcje wypływają na kąpiel wodną noża, a następnie mogą zostać przeniesione na standardowe siatki EM.Preparaty są teraz gotowe do obrazowania z wykorzystaniem konwencjonalnych procedur EM. Izolowane złącza nerwowo-mięśniowe z Drosophila Melan gaster zostały stymulowane wysokim stężeniem potasu, a zinternalizowane membrany zabarwiono przy użyciu FM 1 43, jak pokazano tutaj.Fluorescencję zakończenia nerwowego można obserwować przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego w układzie epi. Podczas ciągłego oświetlania barwnik ulega całkowitemu wybieleniu, a przy dalszej iluminacji pojawia się czarny kolor w wyniku precypitacji dinobenzyny. To zakończenie nerwowe zawiera pęcherzyki synaptyczne, jednak żaden z nich nie został poddany fotokonwersji.Może to być spowodowane niewystarczającym oświetleniem lub słabym przenikaniem DIA amino benzyny do tkanki. Z kolei zbyt silne oświetlenie skutkuje całkowitym przyciemnieniem obrazu, przez co pęcherzyki lub organelle stają się nierozpoznawalne; przy odpowiednim natężeniu oświetlenia widoczna jest fotokonwersja. Na tym mikrografie przedstawiono zakończenie presynaptyczne, w którym widoczna jest grupa ciemnych pęcherzyków, co wskazuje na fotokonwersję FM.Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić fotokonwersję pęcherzyków synaptycznych znakowanych barwnikiem fem. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zawsze starannie kalibrować czasy naświetlania dla etapu konwersji. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.

studying-synaptic-vesicle-pools-using-photoconversion-of-styryl-dyes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Badanie pul ziaren stycznościowych za pomocą fotokonwersji barwników styrylowych

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Opisano technikę obrazowania fluorescencyjnego na żywo, służącą do ilościowego określenia uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Monitorowane są dwie rundy recyklingu SV w tych samych zakończeniach nerwowych, co zapewnia kontrolę wewnętrzną.

Ilościowa analiza uzupełniania puli pęcherzyków synaptycznych w hodowlanych neuronach ziarnistych móżdżku z wykorzystaniem barwników FM

Ten film demonstruje protokół badania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila wykazujących ekspresję rodopsyny kanałowej za pomocą barwnika fluorescencyjnego. Niebieskie światło aktywuje rodopsyny kanałowe, powodując napływ wapnia i egzocytozę pęcherzyków synaptycznych. Barwnik integruje się z błonami neuronalnymi i jest internalizowany podczas endocytozy, co powoduje zwiększoną fluorescencję. Dalsza stymulacja światłem niebieskim indukuje...

Analiza recyklingu pęcherzyków synaptycznych i wychwytu barwnika fluorescencyjnego przez larwy Drosophila

Ten film demonstruje procedurę przygotowania hodowanych neuronów do analizy optycznej przetworzonych pęcherzyków synaptycznych. Proces ten obejmuje znakowanie fluorescencyjne białek pęcherzyków synaptycznych i barwienie immunologiczne w celu oznakowania i wizualizacji pęcherzyków pochodzących z recyklingu w neuronach.

Przygotowanie hodowanych neuronów do analizy optycznej przetworzonych pęcherzyków synaptycznych

Opisujemy użycie styrylowych barwników FM do obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wywołanych, ale także spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych. Protokół rozszerza różnorodność zdarzeń synaptycznych, które można skutecznie ocenić.<br...

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Cykl pęcherzyków synaptycznych (SV) jest podstawowym mechanizmem komunikacji międzykomórkowej w synapsach neuronalnych. Wychwyt i uwalnianie barwnika FM są podstawowymi sposobami ilościowego oznaczania endo- i egzocytozy SV. Tutaj porównujemy wszystkie metody stymulacji w celu napędzania cyklu FM1-43 w synapsie modelu połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Cykl barwnika FM w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej

Opisujemy optyczny test do recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV) w hodowanych neuronach. Połączenie tego protokołu z podwójną transfekcją w celu ekspresji markera presynaptycznego i białka będącego przedmiotem zainteresowania pozwala nam zlokalizować miejsca presynaptyczne, ich zdolność do recyklingu pęcherzyków synaptycznych i określić rolę białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Poznaj metodę fotokonwersji barwników FM 1-43 do badania pęcherzyków synaptycznych u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia wizualizację puli pęcherzyków i mechanizmów synaptycznych.

Badanie pul pul pęcherzyków synaptycznych z wykorzystaniem fotokonwersji barwników styrylowych

Przeglądaj więcej filmów