Badanie basenów pęcherzyków synaptycznych za pomocą fotokonwersji barwników styrylowych

Ten film przedstawia procedurę konwersji zdjęć barwnika styro FM 1 43. W celu zbadania pul pęcherzyków synaptycznych u Drosophila melanogaster najpierw larwy Drosophila są preparowane w celu odsłonięcia mięśni brzusznych, które stanowią połączenie nerwowo-mięśniowe lub preparat NMJ. Preparaty są inkubowane w buforze zawierającym FM D pokazanym tutaj na szarym znakowaniu błony komórkowej.

Są one następnie stymulowane elektrycznie lub chemicznie w celu wywołania fizycznej błony pęcherzykowej fuzji, która zostaje zinternalizowana. Stymulowana egzocytoza zostanie wybarwiona FM D. Zewnątrzkomórkowy barwnik FM jest następnie myty, usuwając go z błony plazmatycznej, a tkanka jest utrwalana pod ciągłym oświetleniem o wysokiej intensywności. Barwnik jest całkowicie wybielony, a kolor pojawia się z powodu di amino Ben i wytrącania się.

Osad ten można następnie uwidocznić za pomocą transmisji em. Cześć, nazywam się Philippe o Paso i pracuję w laboratorium Sylvii Olli w Europejskim Instytucie Neuronauki w Gaon w Niemczech. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę konwersji zdjęć FM w połączeniu nerwowo-mięśniowym.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania recyklingu synaptycznego pęcherzykowego. Okej, więc zacznijmy pracować pod mikroskopem preparacyjnym. Zacznij od przypięcia larwy Drosophila grzbietową stroną do góry w naczyniu pokrytym tak osłoną.

Przykryj go solą fizjologiczną Drosophila za pomocą igły strzykawkowej i znajdź nożyczki do preparowania, które przecinają grzbietową stronę wzdłużnie. Następnie usuń narządy wewnętrzne. Następnie rozciągnij preparat i ponownie przypnij go do naczynia z sygarem.

Kilka mięśni brzusznych można następnie wykorzystać do ochrony barwników FM używanych w tej procedurze przed wybielaniem. Ta procedura powinna być wykonywana w warunkach słabego oświetlenia. Przykryj uszczypnięty preparat Drosophila solą fizjologiczną zawierającą 90 milimolowy chlorek potasu i 10 mikromolowy FM.1 43 obumiera, aby chemicznie stymulować nerwy.

Po stymulacji inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór stymulujący i zanurz naczynie z przypiętą Drosophila. Preparat w zlewce wypełnionej 100 mililitrami soli fizjologicznej Drosophila dwa razy w celu usunięcia zewnątrzkomórkowej matrycy FM 1 43 pracującej pod kapturem bezpieczeństwa chemicznego.

Utrwalić preparat połączenia nerwowo-mięśniowego w 2,5% aldehydzie glutarowym w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Umyj preparat raz PBS, a następnie wyjmij go z naczynia na cygaro i zanurz w 100 milimolowym chlorku amonu na 15 minut. Aby ugasić wolne grupy aldehydowe pozostałego utrwalacza aldehydu pośladkowego.

Za pomocą zwykłego PBS przemyj roztwór chlorku amonu, umieść preparat połączenia nerwowo-mięśniowego w nowym naczyniu na cygaro i zanurz go w przefiltrowanym 1,5 miligrama na mililitr. Diamina, benzyna lub DAB w PBS i inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieścić próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w źródło światła z lampą rtęciową z obudową zawierającą tylne lusterko, używając suchego obiektywu o stosunkowo małym powiększeniu.

Znajdź przykład. Następnie, używając normalnej niebieskiej kostki filtra fluorescencyjnego z zielonym wzbudzeniem, ustaw ostrość sygnału fluorescencyjnego. Połączenia nerwowo-mięśniowe pojawiają się jako jasne punkty na mięśniach.

Następnie, używając tego samego zestawu filtrów fluorescencyjnych, oświetlaj próbkę z maksymalną intensywnością, aż FM D zostanie całkowicie wybielony. Przy użyciu soczewki obiektywowej o kącie powiększenia 20 x powinno wystarczyć od 30 do 45 minut. Jednak czas konwersji zdjęcia różni się w zależności od intensywności oświetlenia, siły penetracji DAB w preparacie i zastosowanej soczewki obiektywowej.

Po oświetleniu zbadaj próbkę w świetle transmisyjnym. Jeśli konwersja zdjęcia miała miejsce, powinien być widoczny ciemnobrązowy osad. Wróć do lunety preparucyjnej, a następnie użyj nożyczek, aby wyciąć przekonwertowane zdjęcie miejsce z larwy.

Wróć do zakresu sekcji. Następnie użyj nożyczek, aby wyciąć przekonwertowane zdjęcie miejsce z larw. Teraz umieść próbkę w mikroprobówce zawierającej PBS, pracuj pod kapturem bezpieczeństwa chemicznego i nosząc odpowiedni sprzęt ochronny, w tym rękawice i ochronę oczu.

Przygotuj 300 mikrolitrów 1% tetratlenku osmu na próbkę. Teraz umieścić próbkę w szklanej kolbie z plastikową pokrywą i dodać przygotowany roztwór tetratlenku osmu w celu utrwalenia preparatu. Podczas inkubacji próbki należy przygotować oddzielne roztwory zawierające 30, 50, 70, 90, 95 i 100% etanolu.

Przemyć próbkę cztery do pięciu razy PBS przez pięć minut każde. Po każdym myciu użyj plastikowego PE do pipety, aby przenieść próbkę do nowej kolby. Po ostatnim przemyciu przenieść próbkę do czystej szklanej kolby.

Następnie odwodnić próbkę, umieszczając ją w szeregu roztworów etanolu. Zacznij od inkubacji w jednym mililitrze 30% etanolu. Następnie po pięciu minutach usuń etanol za pomocą pipety pastwiskowej i zastąp go jednym mililitrem 50% etanolu.

Kontynuuj odwodnienie, inkubując preparat połączenia nerwowo-mięśniowego w roztworach 70, 90, a następnie 95%. Próbka będzie następnie inkubowana w 95% roztworze etanolu do więcej razy niż inkubowana w 100% etanolu trzy razy po odwodnieniu. Dodaj dwa mililitry żywicy EIN jeden do jednego do etanolu i umieść próbkę w inkubatorze rotatorowym.

Dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej po obracaniu w temperaturze 100% ein i umieścić próbkę w otwartej kolbie, aby umożliwić odparowanie pozostałego etanolu przez cztery do sześciu godzin. Wlej świeży numer EIN do formy. Dodaj preparaty i inkubuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 36 godzin.

Gdy preparaty osadzone w EIN są gotowe, użyj ultramikrotomu, aby przygotować cienkie odcinki o grubości od 50 do 80 nanometrów za pomocą noża diamentowego. Próbki są cięte na cienkie kawałki. Sekcje przepływają na kąpieli wodnej noża, a następnie mogą być zbierane na normalnych siatkach EM.

Preparaty są teraz gotowe do obrazowania przy użyciu konwencjonalnych procedur EM. Izolowane połączenia nerwowo-mięśniowe z Drosophila Melan gaster stymulowano za pomocą wysokiego poziomu potasu i zinternalizowanych błon. Zostały wybarwione przy użyciu FM 1 43, jak pokazano tutaj.

Fluorescencję zakończenia nerwowego można zaobserwować za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego epi. Przy ciągłym oświetleniu barwnik jest całkowicie wybielony, a gdy oświetlenie jest kontynuowane, pojawia się kolor z powodu wytrącania się dino benzyny. To zakończenie nerwowe zawiera pęcherzyki synaptyczne, ale żaden z nich nie jest konwertowany na zdjęcia.

Może to być spowodowane niewystarczającym oświetleniem lub słabą penetracją aminobenzyny DIA w tkance. W przeciwieństwie do tego, zbyt duże oświetlenie powoduje ogólnie ciemny terminal, w którym nie można odróżnić pęcherzyków ani organelli przy odpowiedniej ilości oświetlenia, w którym można zobaczyć konwersję zdjęć. Ta mikrofotografia pokazuje bhuton synaptyczny, w którym widoczna jest pula ciemnych pęcherzyków, wskazująca na konwersję zdjęć FM.

Właśnie pokazaliśmy, jak konwertować zdjęcia pęcherzyków synaptycznych oznaczonych kostką do krwi. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby zawsze dokładnie skalibrować czasy oświetlenia dla etapu konwersji. Więc to wszystko.

Dzięki za oglądanie. Powodzenia w eksperymentach.