Name: Wytwarzanie i wszczepianie elektrod w Aplysia californica do wielokanałowych nagrań neuronalnych i mięśniowych u nienaruszonych, swobodnie zachowujących się zwierząt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Naucz się wytwarzać i wszczepiać wielokanałowe elektrody w Aplysia californica do rejestracji aktywności nerwowo-mięśniowej podczas zachowań pokarmowych. Ta metoda umożliwia badanie neurokontroli u swobodnie zachowujących się zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność za wsparcie finansowe udzielone przez NIH (NS047073 dla H.J.C.). Jesteśmy również wdzięczni Catherine Kehl za przeprowadzenie wstępnych eksperymentów z Kwik-Sil, które zachęciły nas do wykorzystania tego materiału w naszej aplikacji.

1. Wykonanie elektrody
<ol>
<li>Aby przygotować elektrodę, należy za pomocą nożyczek odciąć fragment drutu ze stali nierdzewnej w izolacji emaliowanej o średnicy 0,01 cala i długości około 2 stóp. Do każdego końca drutu należy przymocować małą kulkę masy plastycznej, złożyć drut na pół i skręcić końce, tworząc parę splotową, zwaną elektrodą różnicową.</li>
<li> Przyklej taśmą oba końce przewodu, aby zapobiec jego rozplątaniu. Wykonaj cztery elektrody różnicowe, używając dla każdej z nich taśmy w innym kolorze w celu ich identyfikacji (Rycina 1A).</li>
<li> Spleć ze sobą dwie elektrody różnicowe, pozostawiając dwa cale niesplecionych na jednym końcu i jeden cal na drugim końcu. Powtórz tę czynność z pozostałą parą elektrod różnicowych (Rysunek 1B).</li>
<li> Skręć ze sobą obie pary elektrod różnicowych, dbając o to, aby ich końce pozostały nieskręcone. Podnieś zestaw elektrod i nałóż domowy klej silikonowy w miejscu połączenia czterech elektrod różnicowych, pozostawiając końce wolne. Zawieś zestaw i pozostaw do wyschnięcia kleju na co najmniej 4 godziny (Rycina 1C).</li>
<li> Aby odizolować odnogi, położyć zespół elektrod na płaskiej, ruchomej powierzchni, na przykład na kawałku drewna. Rozłożyć końce w kształcie wachlarza i zabezpieczyć je taśmą. Użyć niewielkiego kawałka plastiku, aby unieść zespół elektrod tuż przed miejscem rozgałęzienia, a następnie zabezpieczyć go taśmą.</li>
<li> Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą pęsety, pokryć odnogi klejem silikonowym. Końce o długości 1 cala będą znajdować się wewnątrz organizmu, dlatego powinny zostać pokryte bardzo cienką warstwą kleju. Pozostawić klej do wyschnięcia przez co najmniej 3 godziny.</li>
<li> Skróć 1-calowy koniec jednej elektrody różnicowej do dwóch centymetrów. Z każdego przewodu usuń 1 cm silikonu i emalii. Zagnieć jeden odsłonięty przewód w kształt haczyka do rejestracji. Zegnij drugi przewód w górę, odsuwając go od haczyka; będzie on służył jako przewód uziemiający. Powtórz czynność dla pozostałych trzech elektrod.</li>
<li> Wybierz jedną z czterech elektrod znajdujących się na 2-calowym końcu. Za pomocą pęsety zeskrob silikon i emalię, odsłaniając 1 cm gołego drutu ze stali nierdzewnej na każdym z dwóch przewodów. Do każdego z dwóch przewodów przylutuj złącze złote. Użyj kawałka taśmy laboratoryjnej, aby zabezpieczyć koniec i zachować odstęp między pinem uziemiającym a rejestrującym. Powtórz czynność dla pozostałych trzech elektrod.
</li>
<li> Przytwierdź do kabla kuleczkę kleju silikonowego o średnicy 1-2 cm, około 1,5 cala od końca z haczykiem, aby zakotwiczyć elektrody wewnątrz organizmu zwierzęcia. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę (Rysunek 1D). <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig1.jpg" alt="Schemat metody oczyszczania białek z wykorzystaniem systemu chromatograficznego w wieloetapowym procesie rozdziału." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Wytwarzanie zestawu elektrod. (A) Pojedyncza elektroda różnicowa składająca się zgiętego i skręconego drutu z końcami zabezpieczonymi taśmą. (B) Dwie elektrody różnicowe skręcone ze sobą, z pozostawieniem nieskręconych odcinków na końcach. Do zidentyfikowania końców należy użyć taśmy w innym kolorze lub innego oznaczenia. (C) Wszystkie cztery elektrody różnicowe połączone w jeden zestaw elektrod, tworzący pojedynczy kabel z oddzielnymi odnogami poszczególnych elektrod na każdym końcu, oznaczonymi taśmami w różnych kolorach. (D) Końcowa forma zestawu elektrod. Po lewej stronie znajdują się zwinięte haczyki dla przewodów rejestrujących oraz przewodów uziemiających dla każdej elektrody różnicowej. Po prawej stronie do przewodów przylutowano złote piny złącza w celu podłączenia do wzmacniacza. Po lewej stronie zestawu umieszczono również kotwiczącą kulkę kleju silikonowego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierzęcia do implantacji
<ol>
<li> Należy wybrać zdrowe zwierzę o masie około 350-450 g. W reakcji na małe kawałki wodorostów zwierzę powinno wykonywać ruchy chwytne (kęsy) w odstępach od 3 do 5 sekund. Cały zabieg chirurgiczny wraz z implantacją elektrody powinien potrwać około godziny.</li>
<li> Aby znieczulić zwierzę, należy wstrzyknąć mu 30% (w/v) izotoniczny roztwór MgCl22Aby zapobiec utracie hemolimfy i MgCl22miejsce wstrzyknięcia można pokryć superglue przed wyjęciem igły. <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig2.jpg" alt="Schemat nefronu nerkowego z pętlą Henlego przedstawiający proces zagęszczania moczu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rysunek 2. Schemat przedstawiający sposób unieruchomienia zwierzęcia do implantacji elektrod oraz miejsce nacięcia (oznaczone paskiem). </li>
<li> Umieść znieczulone zwierzę w kuwecie sekcyjnej z stopą skierowaną w dół. Patrząc na zwierzę od strony głowy, przesuń obszar skrzeli w lewo w taki sposób, aby zwierzę znajdowało się częściowo na boku, odchylone w przeciwną stronę. Przypnij przednie czułki (Rysunek 2).</li>
<li> Umieść tackę na stoliku mikroskopu stereoskopowego. Podstaw tackę tak, aby znajdowała się pod kątem około 20 stopni, co pozwoli unieść głowę i spowoduje spłynięcie hemolimfy do ogona, z dala od miejsca nacięcia.</li>
<li> Za pomocą nożyczek do sekcji wykonaj nacięcie nieco na prawo od plamki ocznej, prowadząc je w kierunku przednim na odległość od 1 do 1,5 cm. Użyj rozwieraczy przymocowanych do krawędzi tacki, aby utrzymać nacięcie otwarte (Rysunek 2; pasek w pobliżu plamki ocznej wskazuje miejsce nacięcia).</li>
<li> Aby odsłonić masę policzkową, należy użyć pęsety do uniesienia przezroczystej błony znajdującej się pod skórą, a następnie nożyczek, aby wyciąć otwór odpowiadający głównemu nacięciu. Brzegi błony należy odsunąć i zabezpieczyć za pomocą retraktorów. </li>
</ol>
3. Implantacja elektrod
<ol>
<li>Umieść zespół elektrod na mikromanipulatorze i przesuń go nad nacięcie w ciele zwierzęcia.</li>
<li>Nerw radularny (radular nerve) jest najtrudniejszy do uzyskania dostępu i do niego należy podejść w pierwszej kolejności. Istnieją dwie opcje dostępu do nerwu radularnego.</li>
<li>Pierwszą, preferowaną opcją jest zajrzenie pod zwoj buccalny pomiędzy BN1 a BN2. Jeśli widoczna jest gałąź nerwu radularnego, należy użyć cienkich pęsetek wygiętych w haczyk, aby wyciągnąć gałąź (Rysunek 3, pętla RN pod zwojem oznaczona cyfrą 1).</li>
<li>Jeśli gałąź nerwu radularnego nie jest dostępna nad mięśniem, drugą opcją jest uzyskanie do niej dostępu poprzez małe nacięcie w I2 obok tkanki łącznej u podstawy zwoju buccalnego (Rysunek 3, RN pod mięśniem oznaczone cyfrą 2). Nacięcie w I2 musi przejść przez dwie warstwy mięśnia I2. Przytrzymaj krawędź nacięcia mięśnia prostą pęsetą i użyj pęsety z haczykiem, aby wyciągnąć gałąź RN.</li>
<li>Trzymając nerw pęsetą z haczykiem, użyj drugiej pęsety, aby nasunąć haczyk elektrody na nerw.</li>
<li>Użyj mikromanipulatora, aby podnieść haczyk tak, aby nerw został uniesiony z dala od masy buccalnej i oddzielony od innych nerwów lub tkanek. Nie naciągaj nadmiernie nerwu.</li>
<li>Osusz elektrodę za pomocą chusteczki Kim-Wipe lub odessać nadmiar płynu strzykawką. Napięcie powierzchniowe wody może spowodować zapadnięcie się nerwu lub utworzenie się szczelnej warstwy wody pod nerwem. W obu przypadkach obszar ten należy całkowicie osuszyć przed nałożeniem kleju.</li>
<li>Nałóż małą ilość superglue w miejscu, gdzie podstawa haczyka styka się z dolną częścią nerwu. Nałóż kroplę soli fizjologicznej dla Aplysia lub hemolimfy, aby utwardzić superglue. Gdy klej jest mokry, nie wolno niczego przesuwać, ponieważ dostanie się kleju pomiędzy drut a nerw zablokowałoby połączenie elektryczne.</li>
<li>Ponownie osusz haczyk. Wymieszaj klej Kwik-Sil na okładzie z lodu.</li>
<li>Użyj końcówki szpilki, aby nałożyć niewielką ilość kleju Kwik-Sil, całkowicie pokrywając każdy odsłonięty drut haczyka, z wyjątkiem drutu uziemiającego.</li>
<li>Pozostaw klej do utwardzenia na około 5 minut, poprawiając go, jeśli odklei się od fragmentów haczyka. Klej jest utwardzony, gdy nie klei się już przy dotykaniu szpilką (Rysunek 4 przedstawia końcową konfigurację).</li>
<li>Po utwierdzeniu elektrody nerwu radularnego można uzyskać dostęp do mięśnia I2. W obszarze między BN1 a BN2 użyj pęsety z haczykiem, aby zaczepić i oddzielić 2 pasma mięśnia I2 od reszty mięśnia, delikatnie ciągnąc pasma do góry. Przymocuj elektrodę stosując tę samą procedurę.</li>
<li>Nerwy buccalne 2 i 3 są łatwo dostępne, a elektrody mocuje się według tej samej procedury.</li>
<li>Po przymocowaniu wszystkich elektrod wsuń zespół elektrod do ciała zwierzęcia aż do silikonowej kotwicy.</li>
<li>Zaszyj nacięcie wokół wystającego kabla elektrod, pozostawiając kotwicę wewnątrz zwierzęcia. Zabeziecz szwy superglue, aby zapewnić dobrą szczelność.</li>
<li>Wsuń złote końcówki złączy z drugiego końca elektrody w mały blok styropianu. Przenieś zwierzę do głównego zbiornika w napowietrzanym pojemniku izolacyjnym w celu rekonwalescencji przez noc.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig3.jpg" alt="Schemat anatomiczny zwoju gębowego mięczaka; oznaczone drogi nerwowe, zaznaczone położenie elektrod." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rycina 3. Schemat Aplysia aparat pokarmowy znany jako masa bukkalna. Przedstawiono nerwy bukkalne (BN1, BN2, BN3), nerw radularny (RN), który wychodzi z dołu zwoju bukkalnego, a następnie zanurza się pod mięśniem, oraz miejsce na mięśniu I2, w którym przymocowano elektrodę.
<img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig4.jpg" alt="Schemat neurochirurgiczny z aplikacją Kwik-Sil i techniką użycia superglue w naprawie nerwu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rycina 4. Schematyczny rysunek pojedynczej elektrody przymocowanej do nerwu (lub mięśnia) i przyklejonej w miejscu implantacji. Należy zwrócić uwagę, że odizolowany fragment zakrzywionego haczyka znajduje się w bezpośrednim kontakcie z nerwem (lub mięśniem), jest unieruchomiony za pomocą superkleju i odizolowany elektrycznie od ośrodka płynnego za pomocą Kwik-Sil. Należy również zauważyć, że odizolowany koniec elektrody uziemiającej jest wystawiony na działanie ośrodka płynnego.
4. Rejestracja
<ol>
<li>Aklimatyzować zwierzę w napowietrzonym pojemniku, będąc podłączonym do sprzętu rejestrującego, przez co najmniej 1,5 godziny. Monitorować sygnał podczas aklimatyzacji zwierzęcia, aby zweryfikować poprawność działania wszystkich elektrod oraz niski poziom szumów.</li>
<li>Użyć kamery wideo do rejestracji zachowań żywieniowych, jednocześnie wykorzystując komputer do zapisu sygnałów z elektrod nerwowych i mięśniowych. Zsynchronizować nagrania wideo i elektrod za pomocą sygnału prostokątnego, który steruje licznikiem cyfrowym w widoku kamery, będąc jednocześnie rejestrowanym jako dodatkowy kanał w programie Axoscope na komputerze.</li>
<li>Zachowania żywieniowe wywołuje się technikami opisanymi w pracy Morton and Chiel 193.</li>
</ol>
Chociaż zwierzęta bezkręgowe nie wymagają formalnej zgody instytucjonalnej komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt, zapewniliśmy, że wszystkie zabiegi przeprowadzane na Aplysia minimalizują krzywdę i cierpienie zwierzęcia, a wszystkie techniki chirurgiczne są wykonywane przy pełnym znieczuleniu zwierzęcia.
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig5.jpg" alt="Dane elektrofizjologiczne z wykresami aktywności nerwowej oraz eksperymentalny układ rejestracyjny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. (A) Symultaniczne zapisy z czterech kanałów pochodzące z mięśnia (mięsień protraktor I2) oraz z trzech nerwów policzkowych (nerw radularny, RN, nerw policzkowy 2, BN2 i nerw policzkowy 3, BN3) podczas reakcji połykania. (B) Klatka z symultanicznego nagrania wideo zwierzęcia w stanie wolnego zachowania podczas połykania wstępnie przeciętego paska wodorostów (o szerokości 0,5 cm), który został zaznaczony białymi prążkami w odstępach 0,5 cm, aby umożliwić łatwą wizualizację jego ruchów podczas żerowania zwierzęcia.

<ol><li>Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extracellular+stimulation+of+individual+neurons+in+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia.</a> J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+buccal+nerve+activity+that+distinguishes+ingestion+from+rejection+can+be+used+to+predict+behavioral+transitions+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia.</a> J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).</li>
<li>Warman, E. N., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+chronic+single+extracellular+recording+in+freely+behaving+animals+using+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).</li>
<li>Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nbsp%3BNeuromechanics+of+multifunctionality+during+rejection+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica.</a> J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).</li>
</ol>

Kluczową innowacją, która przyczyniła się do sukcesu tych pomiarów, jest połączenie elektrod w jednym kablu. Wcześniej stosowano rejestrację z dwóch elektrod, jednak zwiększenie ich liczby do czterech osobnych elektrod prowadziło do powstawania zrostów chirurgicznych, które często uniemożliwiały zwierzęciu wykonywanie naturalnych ruchów podczas żerowania. Połączenie elektrod w jednym kablu zmniejsza objętość elektrod wewnątrz organizmu zwierzęcia, co z kolei ogranicza odpowiedź immunologiczną i pozwala zwierzęciu na swob...

<table><tbody><tr><td>Stalowy drut powlekany emalią</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>0.001D, powłoka h</td></tr><tr><td>Domowy klej silikonowy Silicone II</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klej Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superglue Duro Qwik-Gel</td><td>Henkel Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz A-M Systems model 1700</td><td>A-M Systems</td><td></td><td>Ustawienia filtra: 100-1000Hz nerwy, 10-1000Hz mięsień I2</td></tr><tr><td>Axoscope 10.1</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Złote piny złącza</td><td>Bulgin</td><td>SA3148/1</td><td></td></tr><tr><td>Złote gniazda złącza</td><td>Bulgin</td><td>SA3149/1</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i implantacja elektrod u aplysia californica do wielokanałowych rejestracji aktywności neuronalnej i mięśniowej u nienaruszonych zwierząt w swobodnym zachowaniu

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Rejestracja z kluczowych nerwów i mięśniAplysiapodczas zachowań żerowania pozwala nam badać wzorce kontroli neuronalnej u nienaruszonego zwierzęcia. Jednoczesne rejestrowanie sygnałów z wielu nerwów i mięśni dostarcza nam precyzyjnych informacji o czasie trwania aktywności neuronalnej. Poprzednie metody rejestracji sprawdzały się w przypadku dwóch elektrod, jednak badanie dodatkowych nerwów lub mięśni wymagało łączenia i uśredniania zapisów z wielu zwierząt, co utrudniało określenie szczegółów dotyczących czasu i fazowania ze względu na zmienność między poszczególnymi odpowiedziami oraz osobnikami. Implantacja czterech oddzielnych elektrod charakteryzuje się bardzo niskim wskaźnikiem sukcesu z powodu tworzenia się zrostów, które uniemożliwiają zwierzętom wykonywanie normalnych ruchów żerowania. Opracowaliśmy nową metodę wytwarzania elektrod, która zmniejsza ich objętość wewnątrz organizmu zwierzęcia, umożliwiając naturalne ruchy podczas żerowania. Zastosowanie kombinacji klejów do mocowania elektrod skutkuje bardziej niezawodną izolacją elektrody, która utrzymuje się dłużej, co pozwala na rejestrację przez okresy do jednego tygodnia. Opisana przez nas technika wytwarzania mogłaby zostać rozszerzona o kilka dodatkowych elektrod i byłaby możliwa do zastosowania u zwierząt kręgowców.

Opisano technikę implantacji czterech elektrod in vivo w celu monitorowania neuromięśniowej kontroli zachowania żerowania u Aplysia californica.

Wytwarzanie i implantacja elektrod u Aplysia californica do wielokanałowych rejestracji aktywności neuronalnej i mięśniowej u nienaruszonych zwierząt w swobodnym zachowaniu

Rejestracja aktywności kluczowych nerwów i mięśni *Aplysia* podczas zachowań żerowania pozwala na badanie wzorców kontroli neuronalnej u nienaruszonego zwierzęcia.

Aby przygotować zespół elektrod do wielokanałowych pomiarów in vivo, wykonuje się cztery elektrody różnicowe, które następnie splata się razem, pozostawiając poszczególne elektrody różnicowe rozdzielone na końcach. Następnie znieczulone zwierzę zostaje unieruchomione za pomocą szpilek, a obok plamki oka wykonuje się nacięcie. Po zlokalizowaniu docelowych nerwów i mięśni, elektrody przytwierdza się za pomocą kropli superglue u podstawy haczyka, a następnie izoluje uszczelniaczem typu quick seal.Witam, nazywam się Miranda Collins i pracuję w laboratorium dr. Halala Thiela w Katedrze Biologii na Case Western Reserve University. Dzisiaj zaprezentuję procedurę montażu i implantacji elektrod do rejestracji in vivo u SIA z Kalifornii. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania nerwowo-mięśniowej kontroli karmienia i sia.Zacznijmy. Aby przygotować elektrodę, użyj nożyczek, aby odciąć kawałek drutu ze stali nierdzewnej o średnicy 0,001 cala w izolacji emaliowej o długości około dwóch stóp. Przymocuj małą kuleczkę masy plastycznej do każdego końca drutu.Zgiąć drut na pół i skręcić jego końce, tworząc splot zwany elektrodą różnicową. Zakleić oba końce drutu taśmą, aby zapobiec rozplątaniu. Przygotować cztery elektrody różnicowe, używając dla każdej z nich taśmy w innym kolorze.W celach identyfikacyjnych skręć ze sobą dwie elektrody różnicowe, pozostawiając dwa cale nieskręconego odcinka na jednym końcu i jeden cal na drugim końcu. Powtórz tę czynność z pozostałą parą elektrod różnicowych. Skręć oba zestawy dwóch elektrod różnicowych, upewniając się, że końce pozostają nieskręcone.Przytrzymaj zestaw elektrod i nanieś domowy klej silikonowy na połączenie czterech elektrod różnicowych, pozostawiając końce wolne. Podwieś zestaw i pozostaw klej do wyschnięcia na co najmniej cztery godziny. Aby zaizolować odnogi, połóż zestaw elektrod na płaskiej, ruchomej powierzchni, np. na kawałku drewna.Użyj małego kawałka plastiku, aby unieść zespół elektrod tuż przed miejscem ich rozgałęzienia, a następnie zabezpiecz go taśmą. Rozstaw końce wachlarzowato i przymocuj je taśmą. Pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą pęsety pokryj odgałęzienia klejem silikonowym.Końce o długości jednej cala będą znajdować się wewnątrz zwierzęcia, dlatego powinny zostać pokryte bardzo cienką warstwą kleju. Pozostaw klej do wyschnięcia na co najmniej trzy godziny. Skróć jeden cal końcówki jednej elektrody różnicowej do dwóch centymetrów na każdym końcu elektrody.Używając pęsety, zeskrob silikon i emalię z obu przewodów. Aby odsłonić jeden centymetr gołego drutu, zagnij jeden z nich w kształt haczyka do rejestracji. Następnie odsuń drugi przewód od haczyka, aby pełnił funkcję przewodu uziemiającego; na końcach o długości dwóch cali przylutuj do każdego przewodu złoty pin łączący.Użyj kawałka taśmy, aby zabezpieczyć koniec i zachować odstęp między pinem masy a pinem rejestrującym. Powtórz te kroki, aby na wszystkich czterech elektrodach różnicowych znajdowały się haczyki i złote złącza. Przyczep kulkę kleju silikonowego o średnicy od jednego do dwóch centymetrów do kabla, około 1,5 cala od końca z haczykiem.Aby przymocować elektrody w organizmie zwierzęcia, pozostawionego do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę, należy wybrać zdrowe zwierzę o masie około 350 do 450 g, które reaguje na małe kawałki wodorostów. Zwierzę powinno wykonywać ruchy chwytne (gryzienie) w odstępach od trzech do pięciu sekund. Cały zabieg chirurgiczny wraz z implantacją elektrod powinien trwać około godziny.Połóż znieczulone zwierzę w kuwecie sekcyjnej stopą w dół, skierowaną w stronę głowy zwierzęcia. Przesuń obszar skrzeli w lewo, tak aby zwierzę znajdowało się częściowo na boku, odchylone w przeciwną stronę, a następnie przypnij przednie macki. Umieść kuwetę na stoliku mikroskopu sekcyjnego.Ustaw taczkę pod kątem około 20 stopni, aby unieść głowę i zebrać hemolimfę w ogonie, z dala od miejsca nacięcia, używając nożyczek chirurgicznych; wykonaj nacięcie nieco na prawo od plamki oka i przedłuż je o 1 do 1,5 centymetra w kierunku głowy. Użyj rozwieraczy. Przymocuj je do krawędzi tacki, aby utrzymać nacięcie w pozycji otwartej.Aby odsłonić masę policzkową, należy użyć pincety do uniesienia przezroczystej błony znajdującej się pod skórą, a następnie nożyczek do wycięcia otworu odpowiadającego głównemu nacięciu. Brzegi błony należy wsunąć pod rozwieraki.Umieść zestaw elektrod na mikromanipulatorze i przesuń go nad nacięcie u zwierzęcia. Podłączenie każdej z czterech elektrod zajmie około 10 do 15 minut; najpierw pokazany zostanie dostęp do nerwów, a następnie podłączenie elektrody do ostatniego nerwu. W praktyce jednak każdy nerw powinien zostać podłączony do elektrody przed odsłonięciem kolejnego nerwu.Nerw ulnarny jest najtrudniejszy do uzyskania dostępu, dlatego należy podejść do niego w pierwszej kolejności. Istnieją dwie opcje uzyskania dostępu do nerwu ulnarnego. Pierwsza opcja, która jest preferowana, polega na szukaniu go pod zwojem policzkowym pomiędzy BN 1 a VN 2.Jeśli widoczna jest gałąź nerwu ulnarnego, należy użyć pęsety z cienkimi końcówkami zagiętej w haczyk, aby ją unieść. Jeśli gałąź nerwu ulnarnego nie jest dostępna nad mięśniem, drugą opcją jest dostęp do niej poprzez małe nacięcie w I two obok tkanki łącznej u podstawy zwoju policzkowego. Nacięcie w I two musi przejść przez dwie warstwy mięśnia I two, aby przymocować elektrodę do I two.Użyj pęsety z haczykiem, aby unieść i rozdzielić dwa pasma mięśnia I two muscle access, odsłaniając nerw policzkowy dwa w tym miejscu. Tutaj znajduje się nerw policzkowy trzy, który zostanie wykorzystany do zademonstrowania mocowania elektrod. Wszystkie elektrody są mocowane w ten sam sposób, jak pokazano teraz na nerwie policzkowym trzy.Po uchwyceniu nerwu pęsetą, należy użyć drugiej pęsety i mikromanipulatora, aby nasunąć jeden haczyk elektrody na nerw. Unieś haczyk tak, aby nerw został odseparowany od masy policzkowej. Upewnij się, że nie zostały uniesione żadne inne nerwy ani tkanki, podnosząc nerw na jak najmniejszą wysokość, maksymalnie do 0,5 cm.Aby zapobiec nadmiernemu naciągnięciu nerwu, należy osuszyć elektrodę i przyległy obszar nerwu za pomocą chusteczki typu kim wipe. Do nałożenia kleju należy użyć szpilki entomologicznej; elektrodę stabilizuje się niewielką ilością superglue w miejscu, gdzie podstawa haczyka styka się z dolną częścią nerwu. Następnie należy nanieść kroplę soli fizjologicznej dla alysia lub hemolimfy, aby utrwalić superglue.Następnie osusz hak na mieszance z okładem z lodu. Szybko nałóż klej. Dzięki temu klej pozostaje plastyczny przez około 30 minut.W trakcie operacji mogą być konieczne dodatkowe mieszania. Użyj szpilki entomologicznej, aby całkowicie pokryć każdy odsłonięty fragment drutu haczyka niewielką ilością uszczelniacza szybkowiążącego (quick seal). Omijaj drut uziemiający.Pozostaw klej do zastygnięcia na pięć minut. Popraw położenie kleju. Jeśli odsunie się on od haczyka, należy odczekać do całkowitego wyschnięcia kleju przed przejściem do następnego nerwu.Po przymocowaniu wszystkich elektrod, wsuń zestaw elektrod do organizmu zwierzęcia aż do silikonowego kotwica. Zaszyj nacięcie wokół wystającego kabla elektrod. Pozostawiając kotwicę wewnątrz organizmu zwierzęcia, zaklej szwy superglue, aby zapewnić szczelność.Włóż złote końcówki złączy znajdujące się na drugim końcu elektrody w mały blok styropianu. Przenieś zwierzę z powrotem do głównego zbiornika, umieszczając je w napowietrzanym pojemniku izolacyjnym na noc w celu rekonwalescencji. Aklimatyzuj zwierzę w napowietrzanym pojemniku, będąc podłączonym do sprzętu rejestrującego, przez co najmniej 1,5 godziny.Monitoruj sygnał podczas aklimatyzacji zwierzęcia, aby zweryfikować poprawność działania wszystkich elektrod oraz niskie poziomy szumów. Użyj kamery wideo do rejestracji zachowań żywieniowych, jednocześnie wykorzystując komputer do zapisu sygnałów z elektrod neuronowych i mięśniowych. Zsynchronizuj nagrania wideo i zapisy z elektrod za pomocą sygnału prostokątnego, który steruje licznikiem cyfrowym w polu widzenia kamery, będąc jednocześnie rejestrowanym jako dodatkowy kanał w komputerze.W zakresie widzenia, gdy zwierzę się żywi, występują serie aktywności nerwów i mięśni. Oto przykład wzorca połykania z aktywnością EMG z I dwa oraz ENG z RN BN dwa i BN trzy. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykonania i implantacji elektrod wielokanałowych w celu rejestracji aktywności neuronalnej i mięśniowej podczas zachowań żywieniowych u swobodnie poruszających się sia.Podczas wykonywania tej procedury należy ostrożnie obchodzić się z nerwem oraz upewnić się, że haki rejestrujące są całkowicie uszczelnione, tak aby żaden fragment drutu nie był odsłonięty. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

electrode-fabrication-implantation-aplysia-californica-for-multi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Produkcja elektrod i ich implantacja w Aplysia californica w celu wielokanałowego rejestrowania aktywności nerwowej i mięśniowej u nietkniętych, swobodnie zachowujących się zwierząt

Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).

Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

Opisujemy technikę pozwalającą na rejestrację i stymulację pozakomórkową nerwów, mięśni oraz pojedynczych, zidentyfikowanych neuronów in vitro przy jednoczesnym wywoływaniu i obserwowaniu różnych rodzajów zachowań żerowania w aparacie gębowym Aplysia.

Przygotowanie in vitro do wywoływania i rejestrowania programów motorycznych żerowania z ruchami fizjologicznymi u Aplysia californica

Ten film demonstruje technikę wszczepiania zespołu elektrod do mózgu myszy. Zespół zawiera elektrody bipolarne do rejestrowania aktywności z hipokampa i elektrodę odniesienia do uzyskiwania podstawowej aktywności z móżdżku. Znieczuloną mysz umieszcza się na stereotaktycznej ramie, a zespół elektrod wszczepia się w docelowy obszar mózgu. Następnie zwierzę może dojść do siebie przed wykonaniem zapisu elektrofizjologicznego.

Wszczepienie zespołu elektrod do mózgu myszy w celu zapisu elektrofizjologicznego

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami (np.), analiza puli motorycznej odbywa się za pomocą technik wewnątrzkomórkowych1,2,3,4. Niedawno opracowaliśmy technikę zewnątrzkomórkowej stymulacji i zapisu pojedynczych neuronów w Aplysia californica5. Opisujemy teraz protokół wykorzystania tej techniki do unikalnej identyfikacji i scharakteryzowania neuronów ruchowych w puli motorycznej.

Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica

Wszczepianie zorganizowanych układów mikroprzewodów do użycia w jednojednostkowych zapisach elektrofizjologicznych stanowi szereg wyzwań technicznych. Opisano również metody wykonywania tej techniki i niezbędny sprzęt. Omówiono również korzystne wykorzystanie zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrywania z różnych podregionów neuronowych o wysokiej selektywności przestrzennej.

Procedura wszczepiania zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrań pojedynczych jednostek u obudzonych, zachowujących się zwierząt

Ślimak morski Aplysia californica był powszechnie używany jako model neurobiologiczny do badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami zachowania. Opisano metodologię badania układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów zidentyfikowanych obwodów neuronalnych.

Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

To badanie wprowadza metodę jednoczesnego rejestrowania lokalnych potencjałów pola w mózgu, elektrokardiogramów, elektromiogramów i sygnałów oddechowych swobodnie poruszającego się szczura. Technika ta, która obniża koszty eksperymentów i upraszcza analizę danych, przyczyni się do zrozumienia interakcji między mózgiem a narządami obwodowymi.

Jednoczesne zapisy lokalnych potencjałów pola korowego, elektrokardiogram, elektromiogram i rytm oddychania swobodnie poruszającego się szczura

Opisana poniżej jest metoda implantacji wielu układów elektrod polimerowych w anatomicznie odległych obszarach mózgu w celu przewlekłego zapisu elektrofizjologicznego u swobodnie poruszających się szczurów. Przygotowanie i implantacja chirurgiczna są szczegółowo opisane, z naciskiem na zasady projektowania, które mają pomóc w adaptacji tych metod do stosowania u innych gatunków.

Przewlekła implantacja wielu elastycznych matryc elektrod polimerowych

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji wszczepialnego systemu do chronologicznego zapisu in vivo wywołanych i spontanicznych potencjałów elektromiograficznych. System jest stosowany do badania unerwienia mięśni krtani po uszkodzeniu nerwów.

Wszczepialny system do przewlekłej elektromiografii in vivo

Opisujemy tutaj metodę wytwarzania matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene i wykorzystywania ich do rejestracji neuronowej in vivo.

Produkcja matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene do rejestracji neuronowej in vivo

Opracowaliśmy uproszczone i opłacalne podejście do produkcji elektrod i przeprowadziliśmy zapisy sygnałów w wielu regionach u swobodnie poruszających się myszy. Wykorzystanie optogenetyki, wraz z elektrofizjologią wieloregionalną i rejestracją sygnału wapnia, umożliwiło ujawnienie aktywności neuronalnej w różnych regionach w modelu rozpalania napadów.

Zintegrowana metoda tworzenia elastycznych i wygodnych optymór elektrofizjologicznych do wieloregionalnego zapisu in vivo

Naucz się wytwarzać i wszczepiać wielokanałowe elektrody w Aplysia californica do rejestracji aktywności nerwowo-mięśniowej podczas zachowań pokarmowych. Ta metoda umożliwia badanie neurokontroli u swobodnie zachowujących się zwierząt.

Wytwarzanie i wszczepianie elektrod w Aplysia californica do wielokanałowych nagrań neuronalnych i mięśniowych u nienaruszonych, swobodnie zachowujących się zwierząt (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie i implantacja elektrod u Aplysia californica do wielokanałowych rejestracji aktywności neuronalnej i mięśniowej u nienaruszonych zwierząt w swobodnym zachowaniu

Przeglądaj więcej filmów