Name: Implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych feumtlenkami w ubytkach chrząstki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Poznaj metodę implantacji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumotlenkami w ubytki chrząstki z wykorzystaniem obrazowania MR. Technika umożliwia nieinwazyjne śledzenie komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant z National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Skin Diseases, NIH RO1AR054458.

1. Znakowanie hMSC za pomocą Endoremu
<ol>
<li> Komórki hoduje się do osiągnięcia 80% konfluencji na co najmniej 18 godzin przed znakowaniem.
</li><li>W tym czasie przygotowuje się pożywkę do znakowania, dodając Endorem do próbki w dawce 100 ug Fe/ml pożywki bezsurowiczej.</li><li>Po osiągnięciu przez komórki odpowiedniej konfluencji odsysa się pożywkę hodowlaną, a następnie komórki płucze się 1x przy użyciu PBS lub pożywki bezsurowiczej.
</li><li>Następnie odsysa się roztwór płuczący i dodaje wcześniej przygotowaną pożywkę do znakowania. Komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 przez 4 godziny.
</li><li>Po 4-godzinnej inkubacji odsysa się pożywkę do znakowania, a komórki płucze się PBS i trypsynizuje w sposób rutynowy.
</li><li>Po trypsynizacji komórki płucze się 3x przy użyciu PBS i wiruje przy 400rcf przez 5 minut.
</li><li>Po tym etapie płukania komórki resuspenduje się, zlicza, ocenia ich żywotność i wykorzystuje zgodnie z potrzebami do dalszych doświadczeń.</li>
</ol>
2. Przygotowanie agarozy
<ol>
<li>Po oznakowaniu komórek należy przygotować roztwór agarozy.
</li><li>Na precyzyjnej wadze odważa się 80mg proszku agarozy i dodaje do 2ml PBS.
</li><li>Roztwór ten należy delikatnie wymieszać, a następnie poddać autoklawowaniu.
</li><li>Po około 40 min płynny roztwór agarozy można wyjąć z autoklawu. Należy zmierzyć jego objętość i odpowiednio dostosować ją, dodając podgrzany wcześniej PBS.
</li><li>Następnie roztwór schładza się do 42°C</li>
</ol>
3. Tworzenie MASI
<ol>
<li> Po osiągnięciu przez roztwór agarozy pożądanej temperatury należy policzyć komórki i odwirować je po raz ostatni w probówce Eppendorf o pojemności 1,5 ml.
</li><li> Po wirowaniu nad precipitates jest odrzucany, a komórki miesza się z DMEM, aby uzyskać stężenie 30 x 106 komórek/ml.
</li><li> Teraz komórki miesza się z 42°C podgrzana agaroza.
</li><li> Zimna końcówka pipety może spowodować zestalenie się agarozy wewnątrz końcówki, dlatego zaleca się jej uprzednie podgrzanie poprzez kilkukrotne pobieranie i wydawanie gorącego, sterylnego buforu PBS.
</li><li> Następnie pobiera się taką samą objętość agarozy, co pożywki, i miesza ją dokładnie z zawiesiną komórek w pożywce, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
</li><li> Podczas mieszania należy trzymać probówkę Eppendorf w podgrzanej uprzednio kąpieli wodnej, aby agaroza nie schłodziła się do temperatury umożliwiającej jej zestalenie.
</li><li> Po uzyskaniu jednorodnej zawiesiny komórki wszczepia się w miejsce ubytku.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1793/1793fig1.jpg" alt="Rozkład znakowanych/nieznakowanych hMSC, obraz mikroskopowy, do analizy inżynierii tkankowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Koronalne obrazy SE ważone w T2 (TR 4000 ms/ TE 18.27 ms) preparatu rzepki z implantowanymi hMSC w ubytkach chrząstki.

<ol><li>Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+and+functional+maturation+of+bovine+mesenchymal+stem+cells+in+long-term+agarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Rahfoth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+allograft+chondrocytes+embedded+in+agarose+gel+into+cartilage+defects+of+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).</li>
<li>Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+hESCs+and+hMSCs+with+iron+oxide+nanoparticles+for+non-invasive+in+vivo+tracking+with+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Opisany protokół zapewnia powtarzalny sposób znakowania MSC nanocząsteczkami tlenku żelaza oraz implantacji tych znakowanych MSC w defekty chrząstki. Technika ta umożliwia nieinwazyjne obrazowanie przeszczepów komórek macierzystych w defektach chrząstki za pomocą obrazowania MR, co pozwala na wczesne wykrycie niepowodzenia MASI. Przesunięcie lub odpływ znakowanych komórek można zdiagnozować na podstawie zaniku znacznika w miejscu transplantacji na obrazach MR. Wczesna diagnoza tych zdarzeń jest pożądana i uchroniłaby pac...

<table><tbody><tr><td>D-MEM High Glucose</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>PBS (bez Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0.05%</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>25399-120</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tlenki żelaza (Endorem)</td><td></td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza Typ VII</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9045</td><td>Rozcieńczyć agarozę w PBS do stężenia końcowego 4%</td></tr></tbody></table>

implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumoksydami w ubytkach chrząstki

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Dziedzina inżynierii tkankowej integruje zasady inżynierii, biologii komórki i medycyny w celu regeneracji konkretnych komórek i funkcjonalnych tkanek. Implanty macierzystych komórek związanych z macierzą (MASI) mają na celu regenerację ubytków chrząstki wynikających z artretycznych lub urazowych uszkodzeń stawów. Dorosłe mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) posiadają zdolność do różnicowania się w komórki linii chondrogennej i wykazują obiecujące wyniki w technologiach naprawy chrząstki stawowej opartych na komórkach. Autologiczne MSC mogą być izolowane z różnych tkanek, mogą być namnażane w kulturach komórkowych bez utraty potencjału różnicowania oraz wykazały różnicowanie chondrogenne in vitro i in vivo1, 2.
Aby zapewnić lokalną retencję i żywotność przeszczepionych MSC w ubytkach chrząstki, niezbędne jest zastosowanie rusztowania, które dodatkowo wspiera późniejszą dyferencjację i proliferację. Architektura rusztowania kieruje formowaniem tkanki i umożliwia ekspansję macierzy pozakomórkowej produkowanej przez komórki macierzyste. Wcześniejsze badania wykazały, że rusztowanie z 2% agarozy może wspierać rozwój stabilnej chrząstki szklistej i nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej3.
Długotrwałe utrzymanie przeszczepionych komórek macierzystych w MASI jest kluczowe dla regeneracji chrząstki. Znakowanie MSC nanocząsteczkami tlenku żelaza umożliwia długoterminowe śledzenie in vivo przy użyciu nieinwazyjnych technik obrazowania MR4.
W niniejszej prezentacji zaprezentowano techniki znakowania MSC nanocząsteczkami tlenku żelaza, tworzenie konstruktów z komórek i agarozy oraz implantację tych konstruktów w ubytek chrząstki. Znakowane konstrukty mogą być śledzone nieinwazyjnie za pomocą obrazowania MR.

Celem prezentacji jest zademonstrowanie wysoce powtarzalnej metody generowania implantów komórek macierzystych związanych z macierzą w ubytkach chrząstki, które można wizualizować za pomocą obrazowania MR. Komórki macierzyste są znakowane zatwierdzonymi przez FDA ferumoksydami, mieszane z agarozą, implantowane w ubytkach chrząstki i obrazowane za pomocą skanera MR 7T.

Implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumoksydami w ubytkach chrząstki

Dziedzina inżynierii tkankowej integruje zasady inżynierii, biologii komórki i medycyny w celu regeneracji określonych komórek i...

Celem prezentacji jest zademonstrowanie prostej i powtarzalnej metody produkcji MASI z wykorzystaniem HME znakowanych para-tlenkami do monitorowania terapii opartych na komórkach macierzystych. W procesie znakowania obrazowaniem MR, przygotowane medium dodaje się do kolby T 75 i inkubuje przez cztery godziny. Następnie komórki poddaje się trypsynizacji i przemywaniu.Po trzykrotnym przemyciu komórki są resuspensowane, a do probówki dodaje się żel agros. Teraz komórki są gotowe do implantacji w ubytki chrząstki. Cześć, jestem Alex.Nazywam się Irene Peel i pochodzę z laboratorium High Delta Blink, Laboratorium Środków Kontrastowych w Katedrze Radiologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Jestem Lydia Men, również z Laboratorium Środków Kontrastowych.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę znakowania mezenchymalnych komórek macierzystych nanocząsteczkami tlenku żelaza, tworzenia konstruktów komórkowych w hydrożelu oraz implantowania tych konstruktów w ubytek chrząstki. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do nieinwazyjnego śledzenia mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym. Zapraszamy do oglądania.W pierwszej kolejności komórki hoduje się do uzyskania 80% konfluencji na co najmniej 18 godzin przed znakowaniem. W tym czasie należy przygotować pożywkę do znakowania, aby była gotowa do użycia w momencie osiągnięcia konfluencji przez komórki. W tym celu do próbki dodaje się end durum w dawce 100 µg żelaza na 1 mL pożywki bezsurowiczej.Po doprowadzeniu komórek do konfluencji odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki PBS lub pożywką bezsurowiczą. Następnie odessać roztwór płuczący i dodać przygotowaną pożywkę do znakowania. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide przez cztery godziny.Po czterogodzinnej inkubacji odessać medium do znakowania. Przepłukać komórki PBS, a następnie dodać trypsynę. Po odklejeniu komórek przemyć je trzykrotnie PBS i odwirować przy 400 RCF przez pięć minut.Po tym etapie płukania resuspenduj komórki, policz je, oceń ich żywotność, a następnie wykorzystaj je zgodnie z potrzebami do eksperymentów. Teraz zobaczmy, jak przygotować implanty komórek macierzystych związane z macierzą. Rozpocznij od przygotowania świeżego roztworu agarozy.Po schłodzeniu agarosy do 42 °C należy policzyć komórki i odwirować je w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Po wirowaniu należy odrzucić nadsącz i wymieszać komórki z modyfikowaną pożywką Eagle'a (DMEM), aby uzyskać stężenie 30 × 10⁶ komórek/ml. Przed wymieszaniem komórek z ciepłą agarosą należy podgrzać końcówkę pipety, zasysając i wypuszczając gorący, sterylny PBS. Zapobiegnie to krzepnięciu agarosy wewnątrz końcówki.Następnie pobierz taką samą objętość agarosy, jaka została użyta do medium, i dokładnie wymieszaj ją z zawiesiną komórek w medium, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Podczas mieszania trzymaj probówkę Eppendorf w podgrzewanej łaźni wodnej, aby agarosa nie ochłodziła się na tyle, by uległa zestaleniu, aż do uzyskania homogenicznej zawiesiny. Komórki są implantowane w ubytek i są teraz gotowe do obrazowania MR.Teraz przedstawimy reprezentatywne wyniki, najpierw dotyczące naszej techniki znakowania, a następnie techniki implantacji. Po znakowaniu komórki w kolbach nadal wyglądają tak samo jak komórki nieznakowane. Zgodnie z oczekiwaniami, żywotność znakowanych komórek pozostaje bez zmian, co zostało wykazane w teście na obecność kaspazy 3.Połączenie znakowanych komórek z hydrożelami prowadzi do utraty sygnału w implantach, co widoczne jest na obrazach MR ważonych w czasie T2; komórki nieznakowane nie wykazują żadnego sygnału. Przekroje konstrukcji z komórek i hydrożeli barwi się błękitem pruskim. Potwierdza to wewnątrzkomórkową akumulację żelaza.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak znakować mezenchymalne komórki macierzyste za pomocą nanocząsteczek tlenku żelaza, jak tworzyć konstrukty hydrożelowe z zaznakowanymi komórkami oraz jak implantować je w defekty chrząstki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o uprzednim ogrzaniu końcówki pipety przed dodaniem ciepłego hydrożelu do zawiesiny komórek w medium.Kluczowe jest również, aby podczas obrazowania unikać powstawania pęcherzyków powietrza. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

implantation-ferumoxides-labeled-human-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wdrożenie oznaczonych feroksydami ludzkich komórek mezenchymalnych w ubytkach chrząstki

W celu oceny nowych terapii komórkami macierzystymi istotne jest nieinwazyjne śledzenie wstrzykniętych komórek in vivo. W tym filmie dowiedzą się Państwo, jak znakować ludzkie mezenchymalne i embrionalne komórki macierzyste za pomocą środków kontrastowych opartych na tlenku żelaza w celu późniejszego obrazowania MR in vivo.

Znakowanie hESC i hMSC nanocząsteczkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Opisujemy technikę znakowania i śledzenia komórek macierzystych przy użyciu zatwierdzonego przez FDA superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO), ferumoksytolu (Feraheme). Ta technika obrazowania komórkowego, wykorzystująca obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) do wizualizacji, jest łatwo dostępna w celu długoterminowego monitorowania i diagnozowania pomyślnych lub nieudanych przeszczepów komórek macierzystych u pacjentów.

Znakowanie komórek macierzystych za pomocą ferumoksytolu, zatwierdzonej przez FDA nanocząsteczki tlenku żelaza

Opisano eksperymentalną technikę leczenia uszkodzeń chrzęstnych w stawie kolanowym królika. Implantacja autologicznych chondrocytów osadzonych na macierzy jest powszechnie akceptowaną metodą przebudowy i naprawy uszkodzeń chrząstki stawowej, zapewniającą satysfakcjonujące długoterminowe wyniki. Transplantacja autologicznych chondrocytów wspomagana macierzą (MACT) oferuje zstandaryzowaną i klinicznie uznaną metodę implantacji.

Przeszczep chrząstki autologicznej wspomagany macierzą w celu przebudowy i naprawy ubytków chrzęstnych w modelu królika

Opisano eksperymentalną technikę leczenia ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika. Implantacja allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w ubytki chrzęstno-kostne stanowi obiecujący kierunek rozwoju w dziedzinie inżynierii tkankowej. Przygotowanie skrzepów fibrynowo-komórkowych in vitro oferuje zestandaryzowaną metodę implantacji.

Leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych (hMSC) za pomocą autologicznej surowicy, zmniejsza ryzyko odrzucenia przez materiał ksenogeniczny i inne negatywne skutki. Pozwala również na odzyskanie podzbioru mezodermalnych komórek progenitorowych, które mogą dostarczać świeże hMSC. Osadzenie hMSC w autologicznym skrzepie fibrynowym umożliwia łatwą obsługę i skuteczną implantację chirurgiczną.

Mezenchymalna hodowla komórek zrębowych i dostarczanie w warunkach autologicznych: inteligentne podejście do zastosowań ortopedycznych

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Ten protokół opisuje skuteczny sposób monitorowania trwałości komórek i biodystrybucji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (haMSC) poprzez znakowanie fluorescencyjne na czerwono w modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego szczura (KOA) poprzez wstrzyknięcie dostawowe (IA).

In vivo (in vivo) Śledzenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura z fluorescencyjnym lipofilowym barwnikiem błonowym

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania i śledzenia nieinwazyjnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza są wykorzystywane jako sonda rezonansu magnetycznego (MRI) do znakowania MSC i nieinwazyjnego śledzenia in vivo po podaniu donosowym za pomocą rezonansu magnetycznego w czasie rzeczywistym.

Śledzenie superparamagnetycznych mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza za pomocą rezonansu magnetycznego po dososowym podaniu w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

Przedstawiamy tutaj zintegrowany protokół generowania kontrolowanych zmian kostnych-chondralnych u kolan owiec, aby ustanowić eksperymentalny model odpowiedni do badań regeneracji tkanek kości i chrząstki. Protokół określa metodę wywołania pełnogrubego ubytku kości kostnodzielnej w kłykciu udowym, wykorzystując techniki minimalizujące wpływ na dobrostan zwierząt oraz zmienność wyników.

Ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego

Poznaj metodę implantacji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumotlenkami w ubytki chrząstki z wykorzystaniem obrazowania MR. Technika umożliwia nieinwazyjne śledzenie komórek w czasie rzeczywistym.

Implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumoksydami w ubytkach chrząstki

Przeglądaj więcej filmów