Implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumoksydami w ubytkach chrząstki

Celem prezentacji jest zademonstrowanie prostej i powtarzalnej metody produkcji MASI z wykorzystaniem HME znakowanych para-tlenkami do monitorowania terapii opartych na komórkach macierzystych. W procesie znakowania obrazowaniem MR, przygotowane medium dodaje się do kolby T 75 i inkubuje przez cztery godziny. Następnie komórki poddaje się trypsynizacji i przemywaniu.

Po trzykrotnym przemyciu komórki są resuspensowane, a do probówki dodaje się żel agros. Teraz komórki są gotowe do implantacji w ubytki chrząstki. Cześć, jestem Alex.

Nazywam się Irene Peel i pochodzę z laboratorium High Delta Blink, Laboratorium Środków Kontrastowych w Katedrze Radiologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Jestem Lydia Men, również z Laboratorium Środków Kontrastowych.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę znakowania mezenchymalnych komórek macierzystych nanocząsteczkami tlenku żelaza, tworzenia konstruktów komórkowych w hydrożelu oraz implantowania tych konstruktów w ubytek chrząstki. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do nieinwazyjnego śledzenia mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym. Zapraszamy do oglądania.

W pierwszej kolejności komórki hoduje się do uzyskania 80% konfluencji na co najmniej 18 godzin przed znakowaniem. W tym czasie należy przygotować pożywkę do znakowania, aby była gotowa do użycia w momencie osiągnięcia konfluencji przez komórki. W tym celu do próbki dodaje się end durum w dawce 100 µg żelaza na 1 mL pożywki bezsurowiczej.

Po doprowadzeniu komórek do konfluencji odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki PBS lub pożywką bezsurowiczą. Następnie odessać roztwór płuczący i dodać przygotowaną pożywkę do znakowania. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide przez cztery godziny.

Po czterogodzinnej inkubacji odessać medium do znakowania. Przepłukać komórki PBS, a następnie dodać trypsynę. Po odklejeniu komórek przemyć je trzykrotnie PBS i odwirować przy 400 RCF przez pięć minut.

Po tym etapie płukania resuspenduj komórki, policz je, oceń ich żywotność, a następnie wykorzystaj je zgodnie z potrzebami do eksperymentów. Teraz zobaczmy, jak przygotować implanty komórek macierzystych związane z macierzą. Rozpocznij od przygotowania świeżego roztworu agarozy.

Po schłodzeniu agarosy do 42 °C należy policzyć komórki i odwirować je w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Po wirowaniu należy odrzucić nadsącz i wymieszać komórki z modyfikowaną pożywką Eagle'a (DMEM), aby uzyskać stężenie 30 × 10⁶ komórek/ml. Przed wymieszaniem komórek z ciepłą agarosą należy podgrzać końcówkę pipety, zasysając i wypuszczając gorący, sterylny PBS. Zapobiegnie to krzepnięciu agarosy wewnątrz końcówki.

Następnie pobierz taką samą objętość agarosy, jaka została użyta do medium, i dokładnie wymieszaj ją z zawiesiną komórek w medium, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Podczas mieszania trzymaj probówkę Eppendorf w podgrzewanej łaźni wodnej, aby agarosa nie ochłodziła się na tyle, by uległa zestaleniu, aż do uzyskania homogenicznej zawiesiny. Komórki są implantowane w ubytek i są teraz gotowe do obrazowania MR.

Teraz przedstawimy reprezentatywne wyniki, najpierw dotyczące naszej techniki znakowania, a następnie techniki implantacji. Po znakowaniu komórki w kolbach nadal wyglądają tak samo jak komórki nieznakowane. Zgodnie z oczekiwaniami, żywotność znakowanych komórek pozostaje bez zmian, co zostało wykazane w teście na obecność kaspazy 3.

Połączenie znakowanych komórek z hydrożelami prowadzi do utraty sygnału w implantach, co widoczne jest na obrazach MR ważonych w czasie T2; komórki nieznakowane nie wykazują żadnego sygnału. Przekroje konstrukcji z komórek i hydrożeli barwi się błękitem pruskim. Potwierdza to wewnątrzkomórkową akumulację żelaza.

Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak znakować mezenchymalne komórki macierzyste za pomocą nanocząsteczek tlenku żelaza, jak tworzyć konstrukty hydrożelowe z zaznakowanymi komórkami oraz jak implantować je w defekty chrząstki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o uprzednim ogrzaniu końcówki pipety przed dodaniem ciepłego hydrożelu do zawiesiny komórek w medium.

Kluczowe jest również, aby podczas obrazowania unikać powstawania pęcherzyków powietrza. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.