Name: Pobieranie nasienia i sztuczne zapłodnienie myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę sztucznego zapłodnienia myszy poprzez pobieranie nasienia z samców i inseminację samic. Technika ta umożliwia precyzyjne kontrolowanie czasu rozrodu w badaniach transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragnę podziękować Mike'owi Deweyowi z Peromyscus Genetic Stock Center za jego cenne spostrzeżenia, cierpliwość oraz wiedzę w zakresie reprodukcji gryzoni.

Sztuczne zapłodnienie
Sztuczne zapłodnienie stosuje się zamiast naturalnych kopulacji, aby zwiększyć szanse na zajście w ciążę u wszystkich samic. Na każdą jedną superowulowaną samicę lub samicę w znanej rui przypadało dwóch samców. Ogony najądrzy dojrzałych samców myszy umieszczono w 9% zawiesinie mleka i rozcięto za pomocą igieł o rozmiarze 18 G. Pozwolono plemnikom na swobodne pływanie przez kilka minut, a następnie wyjęto najądrza z mieszaniny. Zawiesinę oceniono pod mikroskopem pod kątem gęstości oraz ruchliwości plemników. Do podania nasienia użyto tępej igły o rozmiarze 22 G i długości 1½ cala. Zagięcie pod kątem 120° wykonano w odległości około 3/4W tej sekcji omówiono przygotowanie i charakterystykę warstw cienkich tlenku indu i cyny (ITO) osadzonych metodą rozpylania magnetronowego. Przedstawiono optymalizację parametrów procesu, takich jak ciśnienie gazu roboczego, moc przyłożona oraz temperatura podłoża, w celu uzyskania wysokiej przewodności elektrycznej i przejrzystości optycznej. Analiza morfologii powierzchni za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) oraz pomiary rezystancji powierzchniowej pozwoliły na ocenę jakości otrzymanych powłok. Wyniki wskazują, że precyzyjna kontrola warunków osadzania jest kluczowa dla uzyskania jednorodnych warstw o właściwościach odpowiednich dla zastosowań w optoelektronice i ogniwach fotowoltaicznych. wzdłuż igły. Igłę wprowadzano do pochwy aż do miejsca zgięcia, a następnie wstrzykiwano 0,025–0,05 ml. W przypadku wykorzystania asystenta do utrzymania samicy w odpowiedniej pozycji, stosowanie środków znieczulających nie jest konieczne.
Przygotowanie
<ol>
<li>Użyć 4 samców na 6 samic</li>
<li>Poddać samce eutanazji w iwarium</li>
<li>Przygotować około 5 ml 9% mleka z mleka w proszku</li>
<li>Wlać 1,5 ml do małej szalki Petriego</li>
<li>Wyciąć najdziewek i przewody nasienne</li>
<li>Umieścić je w 1,5 ml 9% mleka</li>
<li>Używając dwóch igieł o rozmiarze 18 G i wykonując długie ruchy tnące igłami, rozciąć najdziewek i przewody nasienne, aby uwolnić plemniki</li>
<li>Usunąć pozostałości tkanki i sprawdzić obecność plemników pod mikroskopem</li>
</ol>
Iniekcja
<ol>
<li>Użyć tępej igły pod kątem 120°</li>
<li>Trzymać mysz w dłoni i wstrzyknąć mieszaninę. Jeśli jedna osoba nie jest w stanie jednocześnie trzymać zwierzęcia i wykonywać iniekcji, można zaangażować dwie osoby. Nie należy stosować znieczulenia, ponieważ wpływ tego środka na procedurę nie jest znany.</li>
<li>Użyć 0,05ml mieszaniny plemników i mleka na jedną samicę</li>
</ol>
Samice biorczynie
<ol>
<li>Wykonać wymaz z pochwy u samic biorców (do tego czasu samice biorców powinny znajdować się w fazie proestrusu/estrusu)</li>
<li>Samice, które do 5. dnia nie weszły w fazę estrusu, &nbsp;prawdopodobnie nie powinny być wykorzystane</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Szkło Petriego</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-30</td><td></td></tr><tr><td>Igła 18 G</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Mleko w proszku</td><td>Odczynnik</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 mL</td><td>Narzędzie</td><td>National Scientific Company</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Narzędzie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Narzędzie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Tępa igła 22 G</td><td>Narzędzie</td><td>Give to me</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pozyskiwanie nasienia i sztuczne zapłodnienie myszy

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Gryzonie z rodzaju Peromyscus (myszy jeleniowate) są najliczniejszymi rodzimymi ssakami Ameryki Północnej. Gatunki Peromyscus są wykorzystywane w szerokim zakresie badań, w tym w toksykologii, epidemiologii, ekologii oraz w badaniach behawioralnych i genetycznych. W niniejszym materiale stanowią one przydatny model do demonstracji zapłodnienia sztucznego.

Metody podobne do prezentowanych tutaj były wcześniej stosowane w kilku badaniach nad myszą jelenią, jednak nie opublikowano dotąd szczegółowego protokołu. W niniejszym materiale demonstrujemy podstawową metodę zapłodnienia sztucznego. Metoda ta polega na wyjęciu jąder z organizmu gryzonia, a następnie wyizolowaniu plemników z najądrza i przewodu nasiennego. Dojrzałe plemniki, zawieszone w mieszaninie mleka, są wprowadzane do dróg rodnych samicy w czasie owulacji. Dzień zapłodnienia przyjmuje się za dzień 0 w określaniu czasu rozwoju embrionów. Następnie embriony można pobrać w wybranym punkcie czasowym i poddać manipulacjom.

Sztuczne zapłodnienie może być stosowane u wielu gatunków gryzoni, u których precyzyjne określenie czasu rozwoju zarodka jest kluczowe lub trudne do uzyskania. Technika ta jest niezbędna w przypadku gatunków lub szczepów (w tym większości przedstawicieli rodzaju Peromyscus), które mogą nie kopulować natychmiast i/lub u których trudno jest ocenić fakt zajścia kopulacji. Dodatkowo sztuczne zapłodnienie zapewnia dokładne określenie czasu rozwoju zarodka, co jest istotne zarówno przy mapowaniu postępów rozwojowych, jak i w pracach nad transgeniką. Można ograniczyć liczbę wykorzystywanych zwierząt, ponieważ zapłodnienie jest gwarantowane. Metoda ta odegrała kluczową rolę w rozwoju badań nad systemem Peromyscus i z nadzieją przyniesie korzyści również w innych badaniach.

Niniejszy protokół przedstawia metody ekstrakcji plemników z jąder samców oraz następującą po niej inseminację samic myszy. Procedura ta jest przydatna w badaniach rozwojowych wymagających precyzyjnego określenia czasu, a także w pracach nad organizmami transgenicznymi.

Pozyskiwanie nasienia i sztuczne zapłodnienie myszy

Gryzonie z rodzaju Peromyscus (myszy jeleniowate) są najpowszechniejszymi rodzimymi ssakami Ameryki Północnej. Gatunki z rodzaju Peromyscus są wykorzystywane w szerokim zakresie badań...

Nazywam się Amanda Dli i pracuję w laboratorium dr. Paula Verany na University of California Irvine. Dzisiaj zaprezentuję procedurę sztucznego zapłodnienia. Polega ona na pobraniu nasienia od samca, a następnie wprowadzeniu go do owulującej samicy.Powodem, dla którego można zdecydować się na tę metodę, jest fakt, że samiec i samica mogą nie kopulować w pożądanym czasie lub w ogóle nie dojść do zapłodnienia. Ponownie, metodę tę można zastosować w przypadku mrożonych plemników, jeśli dana linia myszy jest szczególnie cenna. Bardzo ważne jest zaprezentowanie tej procedury, ponieważ wiele instrukcji i czasopism nie przedstawia właściwego sposobu postępowania z myszą.Myszkę można utrzymać i poddać iniekcji przez jedną osobę bez stosowania środków znieczulających u samicy. Dzięki temu samica nie zostanie w żaden sposób zraniona, co zapewnia optymalny przebieg zapłodnienia. Wykorzystane narzędzia do sekcji to dwa zestawy ostrych pęset oraz jedna para ostrych nożyczek.Zostaną one wykorzystane do wyizolowania najlepszych fragmentów w obrębie jąder oraz tkanki tłuszczowej. Po zakończeniu tego etapu użyjemy pęsety, aby wyizolować najdziewek. Do przetransportowania plemników do samicy wykorzys

harvesting-sperm-and-artificial-insemination-of-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pobieranie nasienia i sztuczne unasienianie myszy

W niniejszej pracy prezentujemy nowo opracowany zestaw I•Cryo do krio konserwacji plemników myszy. Dzięki zastosowaniu tego zestawu konsekwentnie poprawiono rozwój embrionów w stadium dwóchkomórkowym po rozmrożeniu plemników w 5 szczepach myszy. W okresie 1,5 roku zarchiwizowano 49 genetycznie zmodyfikowanych linii myszy poprzez krio konserwację plemników za pomocą zestawu I•Cryo, a następnie pomyślnie odzyskano je metodą IVF.

Kriokonserwacja i odzyskiwanie plemników myszy przy użyciu zestawu I·Cryo

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Upłynnienie nasienia jest niezbędne do uwolnienia nasienia z żelu nasiennego. W badaniu przedstawiono procedury pobierania nasienia z żeńskiego układu rozrodczego po stosunku płciowym oraz pomiaru czasu upłynnienia nasienia.

Pobieranie nasienia po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego i pomiar upłynnienia nasienia u myszy

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Wiele modeli endometriozy u gryzoni jest ograniczonych przez techniczną złożoność, powtarzalność i/lub potrzebę stosowania zwierząt z obniżoną odpornością lub specjalnych myszy reporterowych. Przedstawiamy uproszczony system indukcji zmian chorobowych przy użyciu dowolnej myszy eksperymentalnej z niezależnie weryfikowalnym, obiektywnym systemem punktacji i bez konieczności wycinki owariektomii lub operacji przeżycia.

Syngeniczny mysi model endometriozy przy użyciu myszy z naturalną jazdą na rowerze

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Przedstawiona metoda manipulacji szyjką macicy może wywołać pseudociążę u myszy bez potrzeby rozmnażania samic z samcami po wazektomii. Indukcja ciąży rzekomej jest niezbędna do powodzenia niechirurgicznego transferu zarodków i niechirurgicznego sztucznego zapłodnienia, które również zostały przedstawione.

Wywoływanie ciąży rzekomej u samic myszy bez konieczności wazektomii samców przed niechirurgicznym transferem zarodków lub sztucznym zapłodnieniem

Tutaj wprowadzamy metodę wykonywania okrągłych wstrzyknięć spermatyd (ROSI) u myszy, technikę o obiecujących zastosowaniach klinicznych i użyteczność do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego.

Wstrzyknięcie okrągłego plemnika myszy

Tutaj prezentujemy protokół do ustanowienia mysiego modelu docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemnika (ICSI) i transferu zarodków (ET), co pozwala nam obserwować związane z wiekiem zmiany w metabolizmie glukozy, które mogą być przypisane ICSI, dostarczając wglądu w jego potencjalny długoterminowy wpływ na rozwój człowieka.

Monitorowanie stężenia glukozy we krwi u potomstwa myszy po docytoplazmatycznym wstrzyknięciu plemnika

Poznaj metodę sztucznego zapłodnienia myszy poprzez pobieranie nasienia z samców i inseminację samic. Technika ta umożliwia precyzyjne kontrolowanie czasu rozrodu w badaniach transgenicznych.

Pozyskiwanie nasienia i sztuczne zapłodnienie myszy

Przeglądaj więcej filmów