Wykorzystanie systemu frakcjonowania GELFREE 8100 do frakcjonowania na podstawie masy cząsteczkowej z odzyskiem fazy ciekłej

Cześć, nazywam się Jay Harkins. Jestem naukowcem w Protein Discovery. Dzisiaj pokażę, jak łatwo jest użyć nowego systemu frakcjonowania bezżelowego 8, 100 w celu uzyskania frakcjonowania opartego na wysokiej masie cząsteczkowej odzysku.

Używając żelu, możesz załadować do jednego miligrama całkowitego białka na kanał i odtwarzalnie frakcjonować do ośmiu próbek w około 90 minut. Tak więc system zawiera instrument, jednorazowy wkład i wszystkie potrzebne do przeprowadzenia eksperymentu. Więc zacznijmy.

Rozpocznij tę procedurę od ustawienia i oznaczenia do ośmiu probówek o pojemności 500 mikrolitrów do każdej probówki. Dodać do jednego miligrama próbki białka w objętości do 112 mikrolitrów. Ilość białka w próbce zależy od złożoności próbki.

W przypadku bardziej złożonych próbek, takich jak homogenat tkankowy użyty do tej demonstracji, najlepsze wyniki przyniesie od 150 do 200 mikrogramów na kanał. Następnie dodaj 30 mikrolitrów pięciokrotnego buforu do próbek, który znajduje się w zestawie wkładów bezżelowych. Do każdej próbki białka dodaj osiem mikrolitrów jednego molowego DTT.

Następnie dostosuj każdą próbkę z wodą do końcowej objętości 150 mikrolitrów. Następnie podgrzewaj fiolki przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, aby denaturować próbkę. Pozostawić podgrzane próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej, gdy próbka jest chłodna.

Wyjmij bezżelowy wkład 8, 100 z torebki foliowej. Usuń i wyrzuć uszczelniacz do płyt. Wyjmij bufor do przechowywania z komór na wkłady za pomocą pipety.

Jeśli wszystkie osiem komór wkładu będzie używanych, odwróć wkład, aby opróżnić bufor pamięci z komór. Następnie do każdego ze zbiorników buforowych anody dodaje się osiem mililitrów żelowego buforu bezczynnego. Sześć mililitrów dodaje się do każdego ze zbiorników buforowych katody, a 100 mikrolitrów pipetuje się do każdej z komór zbiorczych.

Za pomocą ośmiokanałowego pipetera o pojemności od 100 do 200 mikrolitrów należy usunąć i wyrzucić bufor, który przepłynął ze zbiornika buforowego katody do komory ładowania próbki, a następnie natychmiast załadować próbki do komór załadowczych. Po załadowaniu próbek umieść wkład w stacji frakcjonowania bezżelowego 8, 100. Następnie opuść matryce elektrod i zamknij pokrywę za pomocą łatwego do zaprogramowania graficznego interfejsu użytkownika na ekranie dotykowym przyrządu, przejdź do listy dostępnych, wstępnie zaprogramowanych metod.

Wybierz odpowiednią metodę, naciskając przycisk metody. Naciśnij przycisk odzyskiwania i wprowadź numer żądanej wstępnie zaprogramowanej metody Za pomocą klawiatury ekranowej naciśnij OK. Następnie naciśnij przycisk Zastosuj.

Zastosowana metoda pojawi się u dołu ekranu głównego. Każda z zaprogramowanych metod składa się z ustawionych napięć i pauz czasowych, mających na celu rozdzielenie białek w określonym zakresie mas cząsteczkowych. Po wybraniu odpowiedniej metody naciśnij przycisk kanału na ekranie głównym.

Następnie wybierz kanały, które będą używane w przebiegu. Aby wybrać wszystkie osiem kanałów, naciśnij Zaznacz wszystko. Następnie naciśnij gotowe.

Aby powrócić do ekranu głównego, upewnij się, że pokrywa bezpieczeństwa jest zamknięta, a kontrolka u dołu ekranu świeci na zielono. Teraz naciśnij start, aby rozpocząć eksperyment, gdy system jest uruchomiony, okręgi pokazane w polu po lewej stronie ekranu przedstawiają stan każdego kanału. Zielone kółko oznacza, że kanał jest aktywny.

Zastosowane napięcia i prądy są wyświetlane po prawej stronie okręgów stanu kanału. Bezżelowy 8, 100 automatycznie zatrzyma się w celu zebrania ułamka w odstępie czasu określonym w metodzie. Gdy instrument zostanie zatrzymany w celu zebrania ułamków, pojawi się pole tekstowe informujące o tym, że nastąpiła pauza, a kręgi stanu zmienią kolor na żółty.

Wewnątrz wkładu między zbiornikami anody i katody doprowadzane jest stałe napięcie. Przy tym potencjale mieszanina białkowa jest napędzana elektroforetycznie z komory załadowczej do specjalnie zaprojektowanego odlewu precyzyjnego. Białka żelu najpierw układają się w ostrym pasmie w żelu do układania, a następnie rozpuszczają się na podstawie ich odpowiednich mas cząsteczkowych w żelu rozdzielczym.

Gdy białka wymywają się z żelu, są one uwięzione i skoncentrowane w fazie ciekłej. W komorze zbiorczej bezżelowy. Instrument jest następnie wstrzymywany.

Na podstawie wcześniej wybranych przedziałów czasowych i frakcji pobiera się za pomocą pipety. Następnie potencjał jest ponownie stosowany, aby nawiązać do końca uwięzienia drugiej interesującej nas frakcji masy cząsteczkowej. Proces ten jest następnie powtarzany, aż wszystkie pożądane frakcje zostaną zebrane.

Każdy wkład zawiera osiem niezależnych kanałów elektroforetycznych, dzięki czemu użytkownik może uruchomić tyle kanałów, ile potrzebuje, a nieużywane kanały zachować do wykorzystania w późniejszym terminie. Aby usunąć frakcje, otwórz pokrywę urządzenia, a następnie użyj pipety z kanałem wrodzonym. Przenieść 150 mikrolitrów cieczy z każdej z komór zbiorczych do probówek zbiorczych lub płytki wielodołkowej.

Po usunięciu frakcji należy dwukrotnie przemyć komorę zbiorczą buforem bezżelowym, dodając 100 mikrolitrów na kanał i dwukrotnie pipetując w górę iw dół. Po umyciu dodać 100 mikrolitrów żelowego buforu z powrotem do komór zbiorczych. Zamknij pokrywę i naciśnij przycisk wznawiania.

Żel bez 8, 100 będzie działał do następnego interwału czasowego. Całkowity czas pozostały do końca eksperymentu jest pokazany po prawej stronie ekranu. Naciśnij przycisk nad polem wyświetlającym czas, aby przełączać się między pozostałym czasem, który upłynął, a czasem pauzy.

Po zebraniu wszystkich frakcji można je natychmiast wykorzystać do dalszego przygotowania, takiego jak ogniskowanie izoelektryczne lub elektroforeza żelowa lub do analizy przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii mas lub powinowactwa immunologicznego. W tej demonstracji osiem próbek białek o wielkości 200 mikrogramów każda podzielono na 12 frakcji każda, co daje w sumie 96 frakcji. Aby zobrazować wyniki frakcjonowania i podwielokrotności każdej z 12 frakcji z próbki homogenatu wątroby bydlęcej, przeprowadzono ją następnie na standardowym żelu 1D i zabarwiono srebrem.

Jak pokazano na tym rysunku, próbka białka została pofrakcjonowana na 12 odrębnych frakcji o masie cząsteczkowej w zakresie od 3,5 kilodaltonu do 150 kilodaltonów. Pokazany tutaj żel podkreśla zdolność systemu Gel Free 8, 100 do frakcjonowania dużej ilości białka na różne frakcje o masie cząsteczkowej. Jest to niezwykle potężne narzędzie do proteomiki odgórnej i oddolnej przy użyciu spektrometrii mas, a także eksperymentów z powinowactwem immunologicznym, w których wymagana jest pojedyncza oczyszczona frakcja masy cząsteczkowej nienaruszonego białka.

To była przyjemność pokazać Ci, jak łatwo jest korzystać z bezżelowego systemu frakcjonowania 8, 100 do powtarzalnego dzielenia próbki na dyskretne frakcje o masie cząsteczkowej i osiągania wysokiego odzysku fazy ciekłej. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.