Wykorzystanie systemu frakcjonowania GELFREE 8100 do frakcjonowania w oparciu o masę cząsteczkową z odzyskiem w fazie ciekłej

Witam, nazywam się Jay Harkins. Jestem naukowcem w Protein Discovery. Dzisiaj zaprezentuję, jak łatwo jest korzystać z nowego systemu frakcjonowania gel free 8, 100, aby uzyskać frakcjonowanie oparte na masie cząsteczkowej z wysokim odzyskiem.

Korzystając z systemu GelFree, można nałożyć do 1 mg całkowitego białka na kanał i w sposób powtarzalny przeprowadzić frakcjonowanie do ośmiu próbek w około 90 minut. System obejmuje urządzenie, jednorazowy kartridż oraz wszystkie bufory niezbędne do przeprowadzenia eksperymentu. Przejdźmy zatem do pracy.

Rozpocznij procedurę od przygotowania i oznakowania do ośmiu probótek o pojemności 500 µL. Do każdej probówki dodaj do 1 mg próbki białka w objętości do 112 µL. Ilość białka w próbce zależy od stopnia jej złożoności.

W przypadku bardziej złożonych próbek, takich jak homogenat tkankowy użyty w tym pokazie, najlepsze wyniki uzyskamy przy zastosowaniu od 150 do 200 µg na kanał. Następnie należy dodać 30 µL pięciokrotnego buforu do próbek, który znajduje się w zestawie z kartridżem bezżelowym. Do każdej próbki białka należy dodać 8 µL 1 M DTT.

Następnie uzupełnić każdą próbkę wodą do objętości końcowej 150 µL. Następnie ogrzewać fiolki przez pięć minut w temperaturze 95 °C, aby zdenaturować próbkę. Pozostawić podgrzane próbki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej.

Wyjmij kartridż GelFree 8, 100 z foliowego opakowania. Zdejmij i wyrzuć uszczelniacz płytki. Usuń bufor do przechowywania z komór kartridża za pomocą pipety.

Jeśli używane będą wszystkie osiem komór wkładu, należy go odwrócić, aby odprowadzić bufor do przechowywania z przegród. Następnie do każdego z anodowych zbiorników buforu dodaje się 8 mL buforu do elektroforezy bezżelowej. Do każdego z katodowych zbiorników buforu dodaje się 6 mL, a do każdej z komór zbierających pipetuje się 100 µL.

Używając ośkanałowej pipety o objętości od 100 do 200 µL, należy usunąć i odrzucić cały bufor, który przepłynął z rezerwuaru buforu katodowego do komory ładowania próbek, a następnie niezwłocznie nanieść próbki do komór ładowania. Po naniesieniu próbek należy umieścić kartridż w stacji do frakcjonowania GelFree 8, 100. Następnie należy opuścić macierze elektrod i zamknąć pokrywę; korzystając z łatwego w obsłudze graficznego interfejsu użytkownika na ekranie dotykowym urządzenia, należy przejść do listy dostępnych zaprogramowanych metod.

Wybierz odpowiednią metodę, naciskając przycisk metody. Naciśnij przycisk pobierania i wprowadź numer żądanej zaprogramowanej metody. Używając klawiatury ekranowej, zatwierdź wybór przyciskiem OK. Następnie naciśnij przycisk zastosuj.

Zastosowana metoda pojawi się w dolnej części ekranu głównego. Każda z zaprogramowanych metod składa się z określonych napięć oraz przerw czasowych, zaprojektowanych w celu rozdzielenia białek w konkretnym zakresie mas cząsteczkowych. Po wybraniu odpowiedniej metody należy nacisnąć przycisk kanału na ekranie głównym.

Następnie należy wybrać kanały, które będą wykorzystywane podczas analizy. Aby wybrać wszystkie osiem kanałów, należy nacisnąć przycisk „wybierz wszystko”. Następnie należy nacisnąć przycisk „gotowe”.

Aby powrócić do ekranu głównego, należy upewnić się, że pokrywa zabezpieczająca jest zamknięta, a kontrolka na dole ekranu świeci na zielono. Następnie należy nacisnąć start, aby rozpocząć eksperyment; podczas pracy systemu kółka wyświetlane w ramce po lewej stronie ekranu obrazują status każdego kanału. Zielone kółko oznacza, że kanał jest aktywny.

Przyłożone napięcia i natężenia prądu są wyświetlane po prawej stronie kół stanu kanału. Urządzenie gel free 8, 100 automatycznie zatrzyma pracę w celu zbierania frakcji w odstępach określonych w metodzie. Gdy instrument zostanie wstrzymany w celu zebrania frakcji, pojawi się pole tekstowe powiadamiające o przerwie, a koła stanu zmienią kolor na żółty.

Wewnątrz kartridża między zbiornikami anody i katody przyłożone jest stałe napięcie. Pod wpływem tego potencjału mieszanina białek jest przemieszczana elektroforetycznie z komory załadunkowej do specjalnie zaprojektowanej, precyzyjnej formy. Białka w żelu najpierw koncentrują się w postaci wąskiego pasma w żelu kondensującym, a następnie są rozdzielane w żelu rozdzielczym na podstawie ich masy cząsteczkowej.

W miarę jak białka eluują z żelu, są one wychwytywane i zagęszczane w fazie ciekłej. W komorze zbierającej znajduje się roztwór wolny od żelu. Następnie urządzenie zostaje zatrzymane.

Na podstawie wcześniej wybranych odstępów czasowych frakcje są pobierane za pomocą pipety. Następnie ponownie przyłożone zostaje napięcie, aby uwięzić drugą interesującą frakcję masy cząsteczkowej. Proces ten jest powtarzany do momentu zebrania wszystkich pożądanych frakcji.

Każdy kartridż zawiera osiem niezależnych kanałów elektroforetycznych, dzięki czemu użytkownik może wykorzystać taką liczbę kanałów, jaka jest mu potrzebna, a niewykorzystane kanały zachować do późniejszego użycia. Aby pobrać frakcje, należy otworzyć pokrywę urządzenia, a następnie użyć wbudowanej pipety do kanałów. Przenieś 150 µL cieczy z każdej z komór zbierających do probówek zbiorczych lub płytki wielodołkowej.

Po usunięciu frakcji należy dwukrotnie przemyć komorę zbierającą buforem do elektroforezy bezżelowej, dodając 100 µL na kanał i dwukrotnie pipetując roztwór w górę i w dół. Po przemyciu do komór zbierających należy ponownie dodać 100 µL buforu do elektroforezy bezżelowej. Następnie należy zamknąć pokrywę i nacisnąć przycisk wznowienia.

Urządzenie GelFree 8, 100 będzie pracować do następnego przedziału czasowego. Całkowity pozostały czas eksperymentu jest wyświetlany po prawej stronie ekranu. Naciśnij przycisk nad polem wyświetlającym czas, aby przełączać się między czasem pozostałym, czasem, który upłynął, a funkcją wstrzymywania.

Po zebraniu wszystkich frakcji można je natychmiast wykorzystać do dalszych etapów przygotowania, takich jak ogniskowanie izoelektryczne, elektroforeza w żelu lub analiza z wykorzystaniem chromatografii cieczowej, spektrometrii mas lub powinowactwa immunologicznego. W niniejszej demonstracji osiem próbek białek o masie 200 µg każda zostało podzielonych na 12 frakcji, co dało łącznie 96 frakcji. Aby zwizualizować wyniki frakcjonowania, alikwot z każdej z 12 frakcji próbki homogenatu wątroby bydlęcej naniesiono następnie na standardowy żel 1D i poddano barwieniu srebrem.

Jak pokazano na tej rycinie, próbka białka została rozdzielona na 12 odrębnych frakcji obejmujących zakres mas cząsteczkowych od 3,5 kilodaltonów do 150 kilodaltonów. Przedstawiony tutaj żel podkreśla zdolność systemu gel free 8, 100 do rozdzielania dużej ilości białka na wyraźne frakcje o różnej masie cząsteczkowej. Jest to niezwykle potężne narzędzie w proteomice top-down i bottom-up z wykorzystaniem spektrometrii mas, a także w eksperymentach z powinowactwem immunologicznym, gdzie wymagana jest pojedyncza, oczyszczona frakcja nienaruszonego białka o określonej masie cząsteczkowej.

Mamy nadzieję, że pokazanie, jak łatwo jest korzystać z systemu frakcjonowania gel free 8, 100 w celu powtarzalnego rozdzielenia próbki na dyskretne frakcje o określonej masie cząsteczkowej i uzyskania wysokiego odzysku fazy ciekłej, było dla Państwa pomocne. To wszystko na dziś. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.