Pozyskiwanie oocytów mysich

Nazywam się Amanda dli. Pochodzę z laboratorium dr. Paula Verany z University of California Irvine. Dzisiaj zaprezentuję Państwu procedurę pobrania oocytów.

Proces ten polega na wyizolowaniu videx z samicy. Po wyizolowaniu ovex wstrzykniemy medium FHM przez videx, co powinno spowodować wydostanie się cytes z macicy. Po wykonaniu tej czynności wyizolujemy cytes z medium i wykorzystamy je w dalszych eksperymentach.

Poza izolacją cytów, niniejszą procedurę można wykorzystać do izolacji embrionów w określonych punktach czasowych. Powodem, dla którego warto zapoznać się z tą procedurą w formacie wideo, jest fakt, że poszczególne części jajowodu mogą być bardzo trudne do rozpoznania. W tym filmie wskażę lejek jajowodu, w który należy wstrzyknąć podłoże FHM.

Narzędzia do sekcji, których będziesz używać, to dwa zestawy ostrych pincet oraz jedna para ostrych nożyczek. Przewody jajowe pobrane od samicy zostaną umieszczone w medium FHM w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkanek. Jaja zostaną pobrane za pomocą 30-milimetrowej igły stępowej przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml, a przewód zostanie ustabilizowany za pomocą ostrej pincety.

FHM to pożywka utrzymująca stosowana do zbierania cytów. KSOM to pożywka wykorzystywana do wzrostu cytów w inkubatorze w przypadku zapłodnienia. Po pobraniu komórek jajowych i embrionów z jajowodu, użyjemy szklanej pipety transferowej wykonanej z rurki kapilarnej, do której przyłączono odpowiednie przewody, a następnie za pomocą pipetowania ustnego przeniesiemy je do pożywki utrzymującej.

Do przechowywania embrionów i jaj wykorzystuje się szklaną płytkę z wgłębieniami. Próbki można umieszczać w poszczególnych wgłębieniach, aby znajdowały się w oddzielnych lokalizacjach, co ułatwia ich odnalezienie. Płytkę umieszcza się w tym pojemniku, co pozwala na wprowadzenie jej do inkubatora CO2 bez konieczności stosowania oleju.

Na pożywkę FHM lub KSOM, w zależności od rodzaju użytego medium, w podstawie umieszcza się wodę, zamyka kurek, aby ciecz pozostała na miejscu. Używa się 70% etanolu, aby zapobiec przemieszczaniu się włosów. Wykonuje się niewielkie nacięcie w okolicy brzusznej oraz nacięcie w jamie brzusznej.

Powiększymy nacięcie, aby odsłonić jamę brzuszną. Po wykonaniu tego kroku w celu odsłonięcia macicy, odsuniecie jelita, a następnie macica znajdzie się poniżej. Macica ma kształt litery Y i zostanie pobrana w części.

Po przecięciu jajowód przypomina spaghetti. Spróbuję pobrać fragment jajowodu. Pobiorę UCT oraz część jajników, które są otoczone tkanką tłuszczową.

Druga strona zostanie pobrana. W tym momencie ponownie chwycimy jajnik lub macicę. Chwytamy tutaj macicę i przecinamy poniżej punktu przyczepienia. W tym miejscu znajdują się przewody jajewodowe.

Pobiorę część jajnika OV. Następnie zostanie on umieszczony w pożywce. Macica wciąż się kurczy.

Macica składa się z mięśni gładkich, więc mimo że jest oddzielona od organizmu, neurony wciąż wykazują aktywność. Tutaj przedstawiono macicę. Choć przewód jajowodowy przypomina spaghetti, a jajnik znajduje się powyżej, przewód jajowodowy nie jest w rzeczywistości przytwierdzony do jajnika.

Choć na tym etapie pokazujemy tylko fragment jajnika, w mojej prawej ręce (dominującej) trzymam tępą igłę o rozmiarze 30 G. Używam jej jako pęsety do wyizolowania in fibula. Po wyizolowaniu wprowadzam tępą igłę do in fibula i wstrzykuję niewielką ilość płynu, który następnie wypłynie z macicy.

W lewej ręce trzymam ostre pęsety. Służą one do izolacji kości strzałkowej i utrzymania wszystkiego na miejscu. Tutaj izolowana jest w kształcie trąbki am dula.

Końcówka igły znajduje się w kości strzałkowej, która przebijała warstwę tkanki. Dobrze. Aby upewnić się, że wyizolowałam wszystkie embriony i jaja, delikatnie ściskam macicę, podobnie jak tubkę pasty do zębów. Po skupieniu uwagi na poduszkach tłuszczowych należy szukać struktur przypominających kropelki tłuszczu, które są idealnie symetryczne.

W tej chwili znajduje się jedno tuż po lewej stronie tej długiej warstwy tłuszczu. To jest pojedyncze jajo. To, co teraz zrobię, to użycie pipety ustnej, aby pobrać jajo i przenieść je do większej ilości pożywki holdingowej, abyśmy mogli wyizolować same jaja.

W dzisiejszym materiale zaprezentowałem sposób izolacji komórek z żeńskiego układu rozrodczego. Ponadto przedstawiłem różne struktury jajowodu, w szczególności lejka jajowodu, który jest jedyną strukturą, do której można wstrzyknąć podłoże FHM.

Używam igły o rozmiarze 30 G. Dzięki tej technice wyizolowałem cyty oraz wszelkie embriony, które znajdowały się w drogach rodnych samicy. Mogę je wykorzystać w badaniach nad ekspresją genów lub w pracach nad transgenami.