Name: Pobieranie oocytów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Naucz się pobierać oocyty i zarodki z myszy Peromyscus poprzez izolację jajowodów i wstrzyknięcie medium FHM do infundibulum. Ta metoda umożliwia badania ekspresji genów i prace transgeniczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chciałbym podziękować Mike'owi Deweyowi z Peromyscus Genetic Stock Center za pomoc, cierpliwość i wiedzę.

Pobieranie zarodka/oocytu
<ol>
<li>Przynajmniej na dwie godziny przed odzyskiwaniem embrionów/oocytów, pożywkę KSOM umieszcza się w inkubatorze CO2 w temperaturze 37ºC, a pożywkę FHM należy rozmrozić z -20°. Do przechowywania kropli KSOM w inkubatorze wykorzystuje się szklaną płytkę z trzema płytkimi, wklęsłymi wgłębieniami. Aby zapobiec dehydratacji, KSOM oraz płytkę umieszcza się w zamkniętym pojemniku z wodą na dnie. Urządzenie to zapobiega odparowywaniu bez konieczności stosowania oleju mineralnego. </li>
<li>Jajowody pobrane od owulującej samicy umieszcza się w pożywce FHM. Aby zapewnić odpowiednią orientację i nienaruszone lejkowate zakończenie jajowodu (infundibulum), wraz z jajowodem wycina się mały fragment jajnika oraz niewielki odcinek macicy. Do wypychania embrionów/oocytów z jajowodu używa się tępej igły o rozmiarze 30 G, wprowadzając ją do infundibulum. Odzyskiwanie embrionów musi odbywać się przez infundibulum, ponieważ światło jajowodu jest zbyt wąskie, aby przejść przez nie igła. W przypadku uszkodzenia infundibulum, jajowód należy rozciąć lub wycisnąć z niego embriony. </li>
<li>Embriony/oocyty odnajduje się w pożywce FHM, ustawiając ostrość mikroskopu na kropelkach tłuszczu, które opadły na dno szalki Petriego. Izolację embrionów/oocytów można przeprowadzić przy powiększeniu 20x, co zapewnia większe pole widzenia niż wysokie powiększenia. Embriony/oocyty wyglądają jak okrągłe kropelki tłuszczu z wyraźnym pierścieniem wokół nich. Do przenoszenia embrionów/oocytów do pożywki KSOM w celu inkubacji i dalszych manipulacji stosuje się pipetowanie ustne z użyciem wyciągniętej kapilary szklanej. </li>
</ol>
Procedura pobierania oocytów
Przygotowanie
<ol>
<li>Rozmrozić FHM i przygotować kSOM.</li>
<li>Kilka godzin wcześniej przelać kSOM do pojemnika na pobranie komórek jajowych, umieścić go w pudełku na końcówki z wodą na dnie, a następnie włożyć do inkubatora CO2.</li>
<li>Przenieść klatki do laboratorium i uśmiercić samice przeznaczonych do zbioru.</li>
<li>Wyciąć jajewódź, uważając, aby wyciąć również fragment jajnika oraz macicy, aby upewnić się, że nie odcięto części jajowodu.</li>
<li>Umieścić w pożywce FHM w małej płytce Petriego.</li>
<li>Nalać pożywkę FHM do kilku dodatkowych płytek Petriego, które będą służyć do płukania.</li>
</ol>
&nbsp;
Przepłukiwanie
<ol>
<li>Użyj igły do płukania (30G tępa) połączonej z igłą 1 ml z spiralnym zakończeniem.</li>
<li>Pobierz po jednym jajowodzie na raz i za pomocą igły wprowadź ją do lejka jajowodu znajdującego się w pobliżu pozostawionej części jajnika. Jeśli lejek jest zniszczony i nie można go wykorzystać, użyj dwóch pęset i przytrzymaj jeden koniec jajowodu. Drugą pęsetą delikatnie ściśnij jajowód, podobnie jak tubkę pasty do zębów, aby wypchnąć zarodki. Uwaga: spowoduje to znaczne zanieczyszczenie szalki Petriego, ponieważ wraz z zarodkami zostanie uwolnione dużo tkanki, dlatego po tej procedurze warto użyć innej szalki Petriego. </li>
<li>Aby dostrzec zarodki, ustaw ostrość mikroskopu na kawałkach tłuszczu i szukaj okrągłego „kawałka tłuszczu” z wyraźnym okręgiem wokół niego. Uwaga: Zarodki wyglądają tak samo jak tłuszcz, więc ich odnalezienie &nbsp;może być trudne. Zarodki opadają na dno, więc należy szukać ich w tym miejscu. </li>
<li>Wykonaj rozmazy pochwowe u samic biorców. Na tym etapie powinny one być w stanie pseudociąży.</li>
</ol>

W niniejszym artykule przedstawiamy metodę pobierania oocytów od myszy z rodzaju Peromyscus po indukowanej owulacji (superowulacji). Stosowanie superowulacji (w przeciwieństwie do naturalnego cyklu rujowego) jest powszechne ze względu na znacznie większą liczbę uzyskiwanych komórek. Należy jednak zachować ostrożność przy interpretacji wyników z wykorzystaniem takich oocytów/embrionów, ponieważ zarówno hormony stosowane do indukcji owulacji, jak i sam proces hodowli mogą wywierać wpływ na badane obiekty.

<p class="...

<table><tbody><tr><td>Igła do płukania</td><td>Narzędzie</td><td>Zephyrtronics</td><td>ZT5-130-L</td><td>30 G tępa</td></tr><tr><td>Pinceta (2)</td><td>Narzędzie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Peromyscus</td><td>Zwierzę</td><td>Peromyscus Genetic Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Narzędzie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka FHM buforowana HEPES</td><td>Odczynnik</td><td>Specialty Media</td><td>MR-025-d</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli embrionów KSOM (5x 10 mL)</td><td>Odczynnik</td><td>Specialty Media</td><td>MR-020P-5F</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta ustna</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td>Wykonana z dociągniętych kapilar szklanych i przymocowana do gumowej rurki</td></tr><tr><td>Naczynie do trzymania oocytów</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td>Szklany pojemnik z wklęsłymi wgłębieniami</td></tr></tbody></table>

pozyskiwanie oocytów mysich

Retrieval of Mouse Oocytes

Do chwili obecnej jedynie nieliczne badania donosiły o udanych manipulacjach w embriogenezie lub biologii rozrodu rodzaju Peromyscus. Wspólnie z Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu) charakteryzujemy kluczowe różnice niezbędne do opracowania tego systemu. Głównym celem była optymalizacja procesu pozyskiwania oocytów oraz wczesnych embrionów.

Niniejszy protokół przedstawia technikę izolowania oocytów lub embrionów na wczesnym etapie rozwoju z jajowodu myszy. Umiejętność zidentyfikowania lejka jajowodu oraz wprowadzenia do niego igły z tępym końcem jest niezbędna do prawidłowego przeprowadzenia tej procedury.

Pozyskiwanie oocytów mysich

Do chwili obecnej tylko w kilku badaniach zgłoszono udane manipulacje embriogenezą lub biologią rozrodczą rodzaju *Peromyscus*. Wraz z *Peromyscus*...

Nazywam się Amanda dli. Pochodzę z laboratorium dr. Paula Verany z University of California Irvine. Dzisiaj zaprezentuję Państwu procedurę pobrania oocytów.Proces ten polega na wyizolowaniu videx z samicy. Po wyizolowaniu ovex wstrzykniemy medium FHM przez videx, co powinno spowodować wydostanie się cytes z macicy. Po wykonaniu tej czynności wyizolujemy cytes z medium i wykorzystamy je w dalszych eksperymentach.Poza izolacją cytów, niniejszą procedurę można wykorzystać do izolacji embrionów w określonych punktach czasowych. Powodem, dla którego warto zapoznać się z tą procedurą w formacie wideo, jest fakt, że poszczególne części jajowodu mogą być bardzo trudne do rozpoznania. W tym filmie wskażę lejek jajowodu, w który należy wstrzyknąć podłoże FHM.Narzędzia do sekcji, których będziesz używać, to dwa zestawy ostrych pincet oraz jedna para ostrych nożyczek. Przewody jajowe pobrane od samicy zostaną umieszczone w medium FHM w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkanek. Jaja zostaną pobrane za pomocą 30-milimetrowej igły stępowej przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml, a przewód zostanie ustabilizowany za pomocą ostrej pincety.FHM to pożywka utrzymująca stosowana do zbierania cytów. KSOM to pożywka wykorzystywana do wzrostu cytów w inkubatorze w przypadku zapłodnienia. Po pobraniu komórek jajowych i embrionów z jajowodu, użyjemy szklanej pipety transferowej wykonanej z rurki kapilarnej, do której przyłączono odpowiednie przewody, a następnie za pomocą pipetowania ustnego przeniesiemy je do pożywki utrzymującej.Do przechowywania embrionów i jaj wykorzystuje się szklaną płytkę z wgłębieniami. Próbki można umieszczać w poszczególnych wgłębieniach, aby znajdowały się w oddzielnych lokalizacjach, co ułatwia ich odnalezienie. Płytkę umieszcza się w tym pojemniku, co pozwala na wprowadzenie jej do inkubatora CO2 bez konieczności stosowania oleju.Na pożywkę FHM lub KSOM, w zależności od rodzaju użytego medium, w podstawie umieszcza się wodę, zamyka kurek, aby ciecz pozostała na miejscu. Używa się 70% etanolu, aby zapobiec przemieszczaniu się włosów. Wykonuje się niewielkie nacięcie w okolicy brzusznej oraz nacięcie w jamie brzusznej.Powiększymy nacięcie, aby odsłonić jamę brzuszną. Po wykonaniu tego kroku w celu odsłonięcia macicy, odsuniecie jelita, a następnie macica znajdzie się poniżej. Macica ma kształt litery Y i zostanie pobrana w części.Po przecięciu jajowód przypomina spaghetti. Spróbuję pobrać fragment jajowodu. Pobiorę UCT oraz część jajników, które są otoczone tkanką tłuszczową.Druga strona zostanie pobrana. W tym momencie ponownie chwycimy jajnik lub macicę. Chwytamy tutaj macicę i przecinamy poniżej punktu przyczepienia. W tym miejscu znajdują się przewody jajewodowe.Pobiorę część jajnika OV. Następnie zostanie on umieszczony w pożywce. Macica wciąż się kurczy.Macica składa się z mięśni gładkich, więc mimo że jest oddzielona od organizmu, neurony wciąż wykazują aktywność. Tutaj przedstawiono macicę. Choć przewód jajowodowy przypomina spaghetti, a jajnik znajduje się powyżej, przewód jajowodowy nie jest w rzeczywistości przytwierdzony do jajnika.Choć na tym etapie pokazujemy tylko fragment jajnika, w mojej prawej ręce (dominującej) trzymam tępą igłę o rozmiarze 30 G. Używam jej jako pęsety do wyizolowania in fibula. Po wyizolowaniu wprowadzam tępą igłę do in fibula i wstrzykuję niewielką ilość płynu, który następnie wypłynie z macicy.W lewej ręce trzymam ostre pęsety. Służą one do izolacji kości strzałkowej i utrzymania wszystkiego na miejscu. Tutaj izolowana jest w kształcie trąbki am dula.Końcówka igły znajduje się w kości strzałkowej, która przebijała warstwę tkanki. Dobrze. Aby upewnić się, że wyizolowałam wszystkie embriony i jaja, delikatnie ściskam macicę, podobnie jak tubkę pasty do zębów. Po skupieniu uwagi na poduszkach tłuszczowych należy szukać struktur przypominających kropelki tłuszczu, które są idealnie symetryczne.W tej chwili znajduje się jedno tuż po lewej stronie tej długiej warstwy tłuszczu. To jest pojedyncze jajo. To, co teraz zrobię, to użycie pipety ustnej, aby pobrać jajo i przenieść je do większej ilości pożywki holdingowej, abyśmy mogli wyizolować same jaja.W dzisiejszym materiale zaprezentowałem sposób izolacji komórek z żeńskiego układu rozrodczego. Ponadto przedstawiłem różne struktury jajowodu, w szczególności lejka jajowodu, który jest jedyną strukturą, do której można wstrzyknąć podłoże FHM.Używam igły o rozmiarze 30 G. Dzięki tej technice wyizolowałem cyty oraz wszelkie embriony, które znajdowały się w drogach rodnych samicy. Mogę je wykorzystać w badaniach nad ekspresją genów lub w pracach nad transgenami.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pobranie oocytów mysich

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Ten film opisuje izolację oocytów antralnych ze świeżo pobranych jajników myszy. Te antralne oocyty mogą być wykorzystane do dalszej charakterystyki i badań rozwojowych.

Izolacja oocytów antralnych myszy: metoda izolowania oocytów antralnych ze świeżo pobranych jajników myszy

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki oocytów antralnych myszy na podstawie organizacji jąder.

Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

Przedstawiono zoptymalizowany protokół, który umożliwia wyczerpanie cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy podczas metafazy I za pomocą lasera femtosekundowego bliskiej podczerwieni.

Wielofotonowa ablacja laserowa cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych ram do dokumentowania fizycznego wpływu cytoszkieletu na kształt jądra i wewnętrzne organelle pozbawione błony w układzie oocytów myszy. Struktura może być dostosowana do użycia w innych typach komórek i kontekstach.

Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

Ten protokół opisuje procedury dotyczące in vitro dojrzewania oocytów mysich, in vitro zapłodnienia i późniejszej kultury embrionów do etapu blastocysty.

Dojrzewanie in vitro komórek jajowych myszy, zapłodnienie i hodowlą zarodków przedimplantacyjnych

Ten film i protokół mają pomóc nauki transfer jądra.

Transfer jądra do komórki jajowej myszy

Naucz się pobierać oocyty i zarodki z myszy Peromyscus poprzez izolację jajowodów i wstrzyknięcie medium FHM do infundibulum. Ta metoda umożliwia badania ekspresji genów i prace transgeniczne.

Pozyskiwanie oocytów mysich

Przeglądaj więcej filmów